Thèse électronique Habiba ELATMANI

Université Victor Segalen Bordeaux 2
Année 2009
Thèse n°_4830
THÈSE
pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2
Mention : Biologie-santé
Option : Biologie cellulaire et physiopathologie
Présentée et soutenue publiquement
Le 17 Décembre 2009
Par Habiba ELATMANI
Née le 18 Septembre 1981 à Vernon (27)
Caractérisation du rôle d’Unr, une protéine de liaison à l’ARN,
dans les cellules souches embryonnaires murines
Membres du Jury
M CULLIN Christophe ........................................................................Président
Professeur de l’Université Bordeaux II
Mme MORELLO Dominique ..............................................................Rapporteur
Directeur de recherche CNRS, Université Toulouse III
M AVNER Philippe...............................................................................Rapporteur
Directeur de recherche CNRS, Institut Pasteur
M LE MENUET Damien ......................................................................Examinateur
Chargé de recherche INSERM, Université Paris XI
Mme JACQUEMIN-SABLON Hélène ................................................Directeur de thèse
Chargé de recherche INSERM, Université Bordeaux II
1
Abréviations
APAF-1 : Apopstic Protease-Activating Factor 1
ARE : AU-rich elements
ARE-BPs : ARE Binding Proteins
ARN : Acide RiboNucléique
ARNm (s) : ARN messager (s)
ARNt : ARN de transfert
CSD : Cold Shock Domain
CSPs : Cold Shock Proteins
DCC : Dosage Compensation Complex
Dcp1/2/S : Decapping protein 1/2/S
E : jour Embryonnaire
eEF1A : eukaryotic Elongation Factor A
eIF2 : eukaryotic Inition Factor 2
eIFs : eukaryotic Initiation Factors
Epi : Epiblaste
Epr : Endoderm primitif
ES : Embryonic Stem
IRES : Internal Ribosome Entry Site
ITAFs : IRES Trans Acting Factors
JAK : Janus Kinase
Kb : Kilobase
KDa : KiloDalton
LIF: Leukemia Inhibitory Factor
MCI : Masse Cellulaire Interne
miARN : microARN
mCRD : major Coding Region of Determinant of instability
miRNP (s) : miARN RiboNucleoProteic complex (s)
Msl-2 : Male specific lethal-2
PABP : PolyA Binding Protein
PAIBP1 : PABP Interacting Protein 1
PABPII : PolyA Binding Protein II
2
PAP : PolyA Polymérase
PARN : PolyA-specific RiboNuclease
pb: paire de base
pré-ARNm (s) : ARN pré-messager (s)
Pré-miARN (s) : précurseur miARN (s)
Pri-miARN (s) : miARN (s) primaire (s)
PTB: Polypyrimidine Tract Binding protein
PTH: Parathyroid Hormon
RBP: RNA Binding Protein
RISC: RNA Induced Silencing Complex
RRM: RNA Recognition Motif
SMG: Smaug
Sxl: Sex lethal
TE: Trophectoderme
unr: Upstream of N-ras (gène)
3’NT: Region 3’ Non Traduite
5’NT: Region 5’ Non Traduite
3
Sommaire
Introduction………………………………………………………………………………….6
I) Unr, une protéine de liaison à l’ARN impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle
de l’expression des gènes. ...................................................................................................... 7
1) Le gène unr code une protéine de liaison à l’ARN conservée au cours de l’évolution. 7
A) Découverte du gène unr: upstream of N-ras. ............................................................ 7
a) Historique. .............................................................................................................. 7
b) Le gène unr code une protéine à cinq domaines « cold- shock ». ......................... 8
B) Les protéines à domaine cold shock chez les procaryotes et les eucaryotes. ............ 8
a) Structure du domaine cold shock. .......................................................................... 8
b) Les protéines à domaine cold- shock chez les procaryotes.................................... 8
c) Les protéines à domaine cold-shock chez les eucaryotes. ..................................... 8
C) Unr, une protéine de liaison à l’ARN ubiquitaire et conservée au cours de
l’évolution. ................................................................................................................... 10
a) Rôle Fonctionnel et localisation subcellulaire de la protéine Unr. ...................... 10
b) Conservation d’unr au cours de l’évolution. ........................................................ 10
c) L’expression d’unr est ubiquitaire. ...................................................................... 10
2)
Unr participe à la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes. ..... 11
A) Introduction aux régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gènes
chez les eucaryotes. ...................................................................................................... 11
a) Vue générale des différents niveaux de régulation de l’expression des gènes. ... 11
b) Les régulations post transcriptionnelles de l’expression des gènes ..................... 12
B)
Le devenir des ARNms : traduction et dégradation. .......................................... 13
a) Modifications post-transcriptionnelles du pré- ARNm : ajout de la coiffe 5’ et de
la queue polyA. ........................................................................................................ 13
b) La traduction des ARNms. ................................................................................... 13
b1) L’initiation de la traduction coiffe dépendante. ................................................. 14
b2) La traduction dépendante d’IRES. ..................................................................... 15
c) Dégradation des ARNms...................................................................................... 15
c1) Enlèvement de la queue polyA. ......................................................................... 15
c2) Enlèvement de la coiffe 5’. ................................................................................ 16
C) Modes de régulation de la traduction et de la stabilité des ARNms. ...................... 17
a) Régulations post-transcriptionnelles par les microARNs. ................................... 17
b) Régulation post-transcriptionnelle par les éléments AU-rich .............................. 20
D) UNR régule la stabilité et la traduction d’ARNms. ................................................ 21
a) Régulation de la stabilité des ARNms. ................................................................ 21
b) Régulation traduction dépendante d’IRES........................................................... 23
4
c) Régulation de la traduction coiffe dépendante. .................................................... 23
E) Régulations post-transcriptionnelles et développement : Unr essentielle pour le
développement de la souris .......................................................................................... 25
a) Détermination des axes de l’embryon de drosophile par une succession
d’inhibition de traduction. ........................................................................................ 25
b) La protéine Unr est essentielle pour le développement embryonnaire de la
drosophile et de la souris. ......................................................................................... 26
b1) Unr et dosage génique compensatoire du chromosome X chez la drosophile. .. 26
b2) Le gène unr est essentiel pour le développement de la souris. .......................... 27
II) Développement embryonnaire précoce de la souris et cellules souches embryonnaires
murines. ................................................................................................................................ 30
1) Le développement embryonnaire précoce chez la souris. ........................................... 30
A) De la fécondation à la formation du blastocyste ..................................................... 30
a) Clivage de l’embryon, compaction et formation du blastocyste. ......................... 30
b) Spécification des premiers lignages cellulaires. .................................................. 32
b1) Ségrégation du trophectoderme et de la masse cellulaire interne ...................... 33
b2) Ségrégation de l’endoderme primitif et de l’épiblaste. ...................................... 34
B) De l’implantation à la gastrulation. ......................................................................... 36
a) Implantation et formation de l’œuf cylindre ........................................................ 36
b) La gastrulation: différenciation de l’épiblaste, formation des feuillets
primordiaux .............................................................................................................. 37
2)
Les cellules souches embryonnaires murines........................................................... 39
A) Description des cellules souches embryonnaires. ................................................... 39
a) Propriétés des cellules souches embryonnaires.................................................... 39
b) Culture des cellules ES murines. ......................................................................... 41
B) Etablissement, maintien et régulation de la pluripotence. ....................................... 41
a) Identification de gènes clés de pluripotence: oct4, sox2 et nanog. ...................... 41
a1) Oct4 .................................................................................................................... 41
a2) Sox2.................................................................................................................... 42
a3) Nanog. ................................................................................................................ 42
b) Circuit transcriptionnel de régulation de la pluripotence. .................................... 45
c) MicroARN et cellules ES ..................................................................................... 46
Objectifs……………………………………………………………………………………...48
Résultats……………………………………………………………………………………...49
Discussion…………………………………………………………………………………….76
Perspectives…………………………………………………………………………………..80
Bibliographie………………………………………………………………………………...82
5
Introduction
6
I) Unr, une protéine de liaison à l’ARN impliquée dans la
régulation post-transcriptionnelle
transcriptionnelle de l’expression des gènes.
1) Le gène unr code une protéine de liaison à l’ARN conservée au cours
de l’évolution.
A) Découverte du gène unr: upstream of N-ras.
a) Historique.
C’est au cours d’études intensives visant à caractériser le promoteur du gène Nras que le gène unr a été découvert. Deux équipes qui travaillaient
nt l’une chez le rat et
l’autre chez l’homme, ont simultanément mis en évidence une unité
transcriptionnelle active localisée immédiatement en amont du gène N-ras,
N
qui a été
nommée unr pour Upstream of N-ras(1, 2). Les locus unr et N-ras
N
constituent un
tandem de gènes transcrits
transcrit dans la même orientation chez l’homme et les rongeurs, la
distance intergénique étant particulièrement courte (150 pb chez l’homme et 130 pb
chez la souris). Le gène unr est transcrit en trois ARN messagers (ARNms) qui
diffèrent par leur extrémité 3’(1,
3’
2). En effet, trois séquences signal de
polyadénylation,
adénylation, A1, A2 et A3, sont situées
situées dans la région 3’non traduite (3’NT) à
1Kb, 450pb et 150pb respectivement du principal site d’initiation de la transcription
du gène N-ras (Figure
Figure 1). Ces éléments impliquent que le promoteur du gène N-ras
N
est en partie contenu dans le gène unr. L’expression
xpression ubiquitaire de ce tandem de
gènes, ainsi que la tendance des transcrits N-ras à être moins abondants
abondant que les
transcrits Unr, a conduit à l’hypothèse d’une interférence transcriptionnelle au sein
de ce locus. En d’autres termes, la transcription d’unr
d
limiterait l’accès de la région
promotrice du gène N-ras
N
à la machinerie de transcription. Cependant, il s’est avéré
que cette interférence était faible et ne constituait pas un mécanisme majeur de la
régulation transcriptionnelle de l’expression de N-ras(3).
N
Figure 1: Organisation du locus unr/N-ras(3).
7
b) Le gène unr code une protéine à cinq domaines « cold- shock ».
Le gène unr code chez l’homme une protéine présente sous deux isoformes, une
mineure et une majeure de 798 et 767 acides aminés respectivement, issues de
l’épissage alternatif de l’exon 5(4). Les formes majeure et mineure ont une masse
moléculaire respective d’environ 85 et 88 KDa.
Lors de la découverte du gène unr, l’alignement de sa séquence protéique contre
les bases de données n’a mis en évidence aucune homologie avec des protéines
connues(1, 2). Seule la recherche de motifs conservés et la modélisation de la
structure secondaire de la protéine Unr ont montré qu’elle appartient à la famille des
protéines à domaine « choc froid » ou cold-shock(5, 6). Ce domaine, très conservé au
cours de l’évolution est décrit chez les procaryotes et les eucaryotes, il constitue un
domaine de liaison aux acides nucléiques simples brins.
B) Les protéines à domaine cold shock chez les procaryotes et les eucaryotes.
a) Structure du domaine cold shock.
Le domaine cold shock (CSD) est un domaine de liaison aux acides nucléiques,
d’environ 70 acides aminés, très conservé au cours de l’évolution. La structure
secondaire du CSD correspondant à cinq feuillets β antiparallèles qui se replient dans
l’espace en un tonneau β(7, 8). Cette structure tridimensionnelle est semblable à celle
des domaines de liaison à l’ARN RRM (RNA Recognition Motif) présents dans de
nombreuses protéines de liaison à l’ARN (RBPs, RNA Binding Proteins). De plus, le
CSD renferme deux motifs conservés de liaison aux acides nucléiques simples brins,
RNP1 et RNP2 (huit et six acides aminés respectivement) caractéristiques des
domaines RRM(9-11).
b) Les protéines à domaine cold- shock chez les procaryotes.
Chez les bactéries (dont certaines archaebactéries), la majorité des protéines à
domaines cold shock sont induites suite à un choc froid. Elles constituent la famille
des protéines de choc froid ou CSPs (Cold Shock Proteins) qui possèdent toutes un
unique domaine CSD. Chez les bactéries, les protéines contenant un CSD constituent
10 % des protéines synthétisées après un choc froid. Elles permettent aux bactéries
de s’adapter à la baisse de température et de reprendre ainsi leur croissance. En effet,
le choc froid stabilise les structures secondaires de l’ARN et de l’ADN ce qui rend
difficile le travail des ARN et ADN polymérases. Les CSPs vont agir comme des
chaperonnes de l’ADN et de l’ARN, elles vont déstabiliser ces structures secondaires
et permettent ainsi la reprise de la réplication, de la transcription et de la
traduction(12).
c) Les protéines à domaine cold-shock chez les eucaryotes.
Chez les eucaryotes, à la différence des procaryotes, les protéines à CSD ne sont
pas induites à la suite d’un choc froid. Elles participent à des processus biologiques
divers tels que la prolifération, la résistance aux drogues et le développement. Chez
8
les eucaryotes, les
es protéines à CSD sont des protéines de liaison à l’ARN et pour
certaines constituent également des facteurs de transcription. Plusieurs familles de
protéines à CSD sont décrites chez les eucaryotes tels que la famille de protéine
Y-box, les protéines LIN28 (LIN28a et LIN28b),, les protéines riches en glycine chez
les plantes et Unr. Leur domaine CSD est associé à des domaines protéiques
additionnels, tels que des ilots basiques/aromatiques chez la famille des protéines
Y-box de vertébrés
és(13) ou des doigts de zinc dans la protéine LIN28 de
C.elegans(14) et dans un groupe de protéines
protéine riches en glycines chez les plantes(15).
plantes
Ces domaines complémentaires leur confèrent une plus grande spécificité
spécifi
de substrat
ou une fonction
tion enzymatique supplémentaire(16,
supplémentaire
17). Unr fait figure d’exception
dans cette famille protéique puisqu’elle possède cinq CSD (Figure
Figure 2).
Figure 2: Organisation
n modulaire des protéines à domaine cold-shock
cold
chez les eucaryotes(16).
Les protéines de la famille Y-box
Y box chez les vertébrés sont de loin les protéines à
CSD les plus étudiées. Elles ont été décrites à l’origine comme des facteurs de
transcription se liant à l’ADN sur les boîtes
bo tes Y présentes au niveau des régions
promotricess de gènes cibles(18).
cibles
. Depuis, leur implication dans le stockage, la
régulation de la demi-vie
demi
et de la traduction d’ARNms ont faitt l’objet de nombreuses
études. YB-11 est le membre de cette famille le plus étudié et se
se trouve être à ce jour
la protéine de liaison aux acides nucléiques la plus conservée au cours de l’évolution.
Cette dernière participe à des fonctions cellulaires variées telles que la prolifération
cellulaire, la résistance aux drogues, la réparation de l’ADN ou encore
l’épissage(19).
9
C) Unr, une protéine de liaison à l’ARN ubiquitaire et conservée au cours de
l’évolution.
a) Rôle Fonctionnel et localisation subcellulaire de la protéine Unr.
La protéine Unr appartient à la famille des protéines à CSD qui lient les acides
nucléiques simples brins. La capacité d’Unr à lier l’ADN et l’ARN simple brin a été
montrée in vitro. L’étude de sa localisation subcellulaire a révélé qu’Unr est
majoritairement cytoplasmique, en partie associée au réticulum endoplasmique.
Ces données ont conduit à proposer un rôle pour Unr dans le métabolisme des
ARNms cytoplasmiques et dans la régulation de la traduction(6, 20).
L’utilisation de la technique SELEX(21) a mis en évidence qu’Unr se lie
préférentiellement in vitro à des séquences riches en purines présentes dans des
régions non structurées de l’ARN : 5’-(A/g)5AAGUAA/g-3’ et 5’(A/g)7A/gAACG/a(A/gG/a)-3’(22). Depuis, plusieurs études ont montré
l’implication d’Unr dans la régulation de la stabilité et de la traduction d’ARNms.
Les exemples de régulation post-transcriptionnelles de l’expression des gènes
impliquant Unr seront abordés dans la section 2) D).
b) Conservation d’unr au cours de l’évolution.
A ce jour, l’existence d’unr a été mise en évidence chez de nombreux vertébrés
que ce soit les mammifères, les reptiles, les poissons ou les oiseaux, ainsi que chez la
drosophile (Drosophila melanogaster) et chez une espèce de moustique (Anopheles
gambiae). Il semblerait que ce gène soit apparu au plus tard il y a environ 400
millions d’années date d’apparition des premiers vertébrés, les poissons(20). La
séquence protéique d’Unr est très conservée. Par exemple, l’identité de la protéine
Unr murine comparée à celle du poisson zèbre (Danio rerio) et de la drosophile
(Drosophila melanogaster) est de 85,8% et 54,7% respectivement. Cette identité de
séquence est plus frappante chez les mammifères où la conservation de la séquence
protéique d’Unr est supérieure à 99% (Table1, données Homologene).
%
identité
prot.
Mus.
musculus
Mus.
musculus
Rattus.
norvegicus
Homo.
sapiens
100
100
99.8
Canis.
Lupus
familiaris
99.7
Equus.
caballus
Gallus.
gallus
Xenopus.
laevis
Danio.
rerio
Drosophila.
melanogaster
99.5
95,4
90.0
85.8
54.7
Table1: Identité protéique entre la protéine Unr murine et celles d’autres organismes.
c) L’expression d’unr est ubiquitaire.
Les études réalisées sur des tissus humains et murins montrent que le gène unr
est transcrit dans tous les tissus de l’organisme adulte, prolifératifs et différenciés
ainsi que dans de nombreuses lignées cellulaires humaines et murines
(hématopoïétiques, épithéliales, musculaires). Son expression en ARNm est
particulièrement élevée dans le muscle squelettique, le cerveau, le cœur et les
organes génitaux(1, 2) (base de donnée GEO profile). Les ARNms Unr sont
10
également détectés dans les cellules souches embryonnaires (confirmé au niveau
protéique) ainsi que dans le cœur et l’intestin grêle au cours du développement(3,
23). Quant à l’expression de la protéine Unr, les données du programme « Human
Protein Ressource »(24) qui réalise une étude du protéome humain
par
immunohistochimie montrent qu’Unr est exprimée modérément dans tous les tissus
testés à l’exception de la rate et du pancréas qui ne semblent pas l’exprimer et dans
de nombreuses lignées cellulaires (hématopoïétiques, cérébrales, épithéliales,
carcinome embryonnaire). L’expression d’unr est donc ubiquitaire chez les
mammifères. Plus récemment il a été montré que l’expression d’unr est également
ubiquitaire chez la drosophile et précoce au cours du développement(25).
2) Unr participe à la régulation post-transcriptionnelle de l’expression
des gènes.
A) Introduction aux régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gènes
chez les eucaryotes.
a) Vue générale des différents niveaux de régulation de l’expression des gènes.
L’expression des gènes codant les protéines implique une succession d’étapes.
Au départ, dans le noyau, la transcription conduit à la synthèse d’ARN prémessagers (pré-ARNm). Après maturation de ces précurseurs, les ARNms matures
sont exportés dans le cytoplasme où ils vont servir de support à la synthèse protéique
ou traduction. Enfin, la dégradation des ARNms et des protéines produites met un
terme à l’expression génique.
La cellule, soumise constamment à des stimuli environnementaux, doit être
capable d’adapter l’expression de ses gènes en réponse à ces signaux. C’est
pourquoi, chaque étape de l’expression génique est l’objet de multiples mécanismes
de régulation. La régulation transcriptionnelle contrôle l’expression génique,
c'est-à-dire la quantité de protéine produite au final, en modulant à la hausse ou à la
baisse l’efficacité de transcription d’un gène. Cependant, compte tenu des
nombreuses étapes entre la transcription et la production d’une protéine
fonctionnelle, ce niveau de régulation ne permet pas d’adapter de façon rapide et fine
la quantité de protéine nécessaire à la cellule à un instant et en un lieu donné.
Au cours de l’évolution d’autres niveaux de régulation, plus flexibles, se sont mis en
place. La cellule peut adapter le taux d’expression d’un gène dans un contexte
biologique donné en contrôlant le devenir des ARNms et des protéines à chaque
étape de leur vie cellulaire, ce qui constitue les régulations post-transcriptionnelles
(dont traductionnelles) et post-traductionnelles.
11
b) Les régulations post transcriptionnelles de l’expression des gènes
Les régulations post-transcriptionnelles contrôlent le devenir des ARNms par
l’intermédiaire d’interactions moléculaires complexes entre des composants
intrinsèques structuraux de l’ARNm, les éléments cis situés essentiellement dans la
région 3’NT des transcrits mais aussi dans la région codante et la région 5’ non
traduite (5’NT), et des facteurs trans-régulateurs spécifiques que constituent les
protéines de liaison à l’ARN (RBPs) et des petits ARN non codants, les microARNs
(miARNs).
Ces régulations peuvent être résumées de façon simple par les étapes suivantes :
la maturation du pré-ARNm (coiffage, épissage, polyadénylation), son export
nucléo-cytoplasmique, la vérification de son intégrité moléculaire ou surveillance de
l’ARN (qui est aussi nucléaire), le contrôle de sa demi-vie et de sa localisation
subcellulaire (incluant son stockage), enfin son efficacité de traduction (Figure 3).
La protéine Unr étant impliquée dans la régulation de la traduction et de la demi-vie
d’ARNms (stabilité), nous nous intéresserons plus particulièrement à ces
mécanismes (le stockage des ARNms ne sera pas abordé).
Figure 3: Schéma simplifié des régulations post-transcriptionnelles.
12
B) Le devenir des ARNms
ARNm : traduction et dégradation.
a) Modifications post-transcriptionnelles
transcriptionnelles du
d pré- ARNm : ajout de la coiffe 5’ et de la
queue polyA.
Dans le noyau, les
l pré-ARNms néo-synthétisés vont subir, entre autres, deux
modifications post-transc
transcriptionnelles
riptionnelles essentielles au niveau de leurs extrémités.
Une 7-methylguanosine
methylguanosine ou coiffe est incorporée co-transcriptionnellement
co transcriptionnellement en 5’,
5’
et après clivage de l’extrémité 3’, une queue polyA
A (polymère d’adénosines) est
ajoutée en 3’ par la PolyA Polymérase (PAP) en aval du signal de
polyadénylation(26-28)
28). Ces structures stabilisent les ARNms.. La coiffe 5’ les
protège des activités 5’3’
5’ 3’ exoribonucléasiques cellulaires et facilite le transport
nucléo-cytoplasmique
mique des transcrits. Laa queue polyA au cours de sa synthèse est
masquée par la PolyA
A Binding Protein
rotein II (PABPII). Dans le cytoplasme, la PABPII
est remplacé par la PABP (PolyA
(
Binding Protein). Les PABPs confèrent à la queue
polyA une protection efficace vis-à-vis
vis des enzymes de déadénylation (déadénylases)
et par conséquent protègent
protège les transcrits de la dégradation 3’5’
5’ (26-28). Enfin, ces
modifications post-transcriptionnelles
transcriptionnelles sont cruciales pour l’initiation de
d la traduction
(coiffe 5’) et son efficacité (queue polyA).
Tout système jouant sur l’association coiffe/queue polyA conditionne le devenir
des ARNms, que ce soit au niveau de la traduction ou de la stabilité (demi-vie)(2628).
b) La traduction des ARNms.
La traduction est le mécanisme qui permet la synthèse d’une protéine, par le
ribosome, en utilisant comme support informationnel l’ARNm. Elle peut être
résumée en trois étapes principales: l’initiation, l’élongation
l’élongation et la terminaison.
L’initiation, est une étape critique et de loin la plus régulée, elle est décrite en détail
dans la section b1).
L’initiation constitue l’ensemble des mécanismes qui permettent le recrutement
de la sous-unité 40S
0S du ribosome au niveau
au du codon d’initiation (AUG).
Elle nécessite l’intervention de nombreux facteurs protéiques principalement les eIFs
(eukaryotic Initiation Factors). L’élongation,
L’
, consiste en la création par le ribosome
80S d’une chaine polypeptidique conforme
conforme à la séquence codante de l’ARNm.
Enfin, la terminaison de la traduction s’effectue quand le ribosome arrive sur le
codon stop (ou codon terminaison), ce qui provoque la dissociation des sous-unités
sous
ribosomaless et le relargage de la protéine néo-synthétisée(29,
néo
30) (Figure
(
4).
Figure 4:: Illustration de la traduction chez les eucaryotes.
13
b1) L’initiation de la traduction coiffe dépendante.
L’initiation débute par la formation d’un complexe ternaire constitué de l’ARNtl’ARNt
met (ARN de transfert chargé d’un amino-acyl
amino
méthionine) et de la protéine eIF2
(eukaryotic Initiation
on Factor 2) liée au GTP. Celui-ci
ci associé à d’autres facteurs
d’initiation (eIF3, eIF5, eIF1 et eIF1A) et à la sous-unité
sous unité ribosomale
riboso
40S forme le
complexe de pré-initiation
initiation 43S. Cet assemblage macro-moléculaire
moléculaire se lie à
l’extrémité 5’ du transcrit via l’interaction d’eIF3 avec le complexe protéique eIF4F
qui s’associe à la coiffe 5’ (Figure 5). Le complexe eIF4F est composé d’eIF4E, qui
interagit physiquement avec la structure de la coiffe 5’, d’eIF4A, une ARN hélicase
qui déroule les structures secondaires de la région 5’NT et facilite la lecture de
l’ARNm et enfin, d’eIF4G qui fonctionne comme une protéine d’échafaudage en
interagissant avec eiF4E, eIF4A et eIF3. Le complexe 43S ainsi recruté au niveau de
la coiffe 5’, démarre la lecture de la région 5’NT jusqu’au codon AUG pour former
le complexe,, stable, d’initiation 48S. L’hydrolyse du GTP lié à eIF2 permet à la
grande sous-unité
unité ribosomâle
riboso
(60S) de s’associer à la sous-unité
ité 40S. Le relargage
des eIFs du complexe 48S met fin à l’étape d’initiation de la
traduction(29-31) (Figure
Figure 5).
Chez les eucaryotes supérieurs l’interaction d’eIF4G avec la PABP (via la
PAIBP1 ou PABP Interacting
nteracting Protein
rotein 1) et eIF4E, permet le rapprochement des deux
extrémités de l’ARNm. Cette
C
structure en boucle
le fermée stabiliserait la fixation du
complexe eIF4F au niveau de la coiffe et faciliterait le recyclage de la sous-unité
sous
ribosomale 40S au niveau de l’extrémité 5’ de l’ARNm afin d’augmenter le taux de
traduction(31, 32). Les ARNms activement traduits peuvent s’associer à de
nombreux ribosomes portant chacun une chaine polypeptidique. Ces structures sont
appelées polysomes.
Figure 5:: Mécanisme d’association du complexe de pré-initiation
pré initiation 43S à la coiffe 5’ (29).
14
b2) La traduction dépendante d’IRES.
L’initiation coiffe dépendante
dépen
est le mécanisme général d’initiation de la
traduction. Cependant, pour certains ARNms cellulaires,, l’initiation de la traduction
peut se produire par un mécanisme alternatif, qui ne nécessite pas l’utilisation
d’eIF4E (qui lie physiquement la coiffe). Ces transcrits possèdent dans leur
leu région
5’NT un site interne d’entrée du ribosome ou IRES (Internal
(
Ribosome
ibosome Entry Site)
qui correspond généralement à une région structurée riche en GC. L’IRES permet,
indépendamment de la coiffe 5’, le recrutement de la sous-unité
unité 40S du ribosome à
proximité
ximité du codon AUG en utilisant la machinerie d’initiation de la traduction (à
l’exception d’eIF4E)(33-35).
d’eIF4E)
Bien que les mécanismes de fonctionnement soient
soi
différents entre les IRES, le plus souvent, des protéines
protéines cellulaires spécifiques sont
nécessaires: les IRES
RES Trans Acting Factors (ITAFs)(33-35) (Figure
Figure 6). L’IRES
permet à certains ARNms
ARNm cellulaires d’échapper à l’inhibition globale de la
traduction induite, par un stress
str
tel qu’une infection virale ou un stress du réticulum
endoplasmique,, par l’apoptose
l’
ou plus généralement en réponse à des traitements
cytotoxiques(33-36). D’ailleurs les picornavirus qui possèdent des IRES inhibent
inhi
globalement l’initiation coiffe dépendante de la traduction afin de détourner la
machinerie de traduction à leur profit(36)
profit
.
Figure 6:: Mécanisme d’initiation de la traduction dépendant d’IRES.
RNms.
c) Dégradation des ARNms
Dans la cellule, les ARNms ont une durée de vie limitée. Ils sont principalement
dégradés par l’extrémité
extrémité 5’ ou par l’extrémité 3’. Nous avons vu précédemment que
les extrémités 5’ et 3’ des ARNms sont protégées
protégé s de la dégradation par la coiffe et la
queue polyA respectivement (voir section B)a)).
). En pratique, des enzymes
spécifiques vont enlever
enl
ces structures et conduire à la dégradation rapide des
transcrits par diverses exonucléases(28).
exonucléases
c1)) Enlèvement de la queue polyA.
La dégradation des ARNms chez les eucaryotes commence le plus souvent par
un raccourcissement de la queue polyA ou déadénylation dans le cytoplasme. Cette
étape est limitante et détermine en grande partie la vitesse de dégradation de
l’ARNm.
ation est réalisée par trois grands types de déadénylases qui ont une
La déadénylation
activité exoribonucléase 3’5’.
3’ 5’. Les protéines Ccr4 et Pop2 (aussi appelée Caf1)
agissent au sein d’un complexe multiprotéique dont l’activité est inhibée
i
par la
PABP qui protège la queue polyA(27).
polyA
La PolyA-specific
specific RiboNuclease (PARN)
dégrade de façon efficace la queue polyA, son interaction avec la coiffe 5’ est
15
nécessaire à son activité. Les déadénylases Pan2/Pan3 ont plutôt un rôle dans le
contrôle de la taille de la queue polyA au niveau nucléaire(27).
Dans certains cas,
cas la queue polyA peut être ré-adénylée
adénylée mais quand la taille de
celle-ci
ci est réduite environ de moitié, les
l ARNms s’engagent vers une dégradation
irréversible. Après déadénylation complète, ils peuvent être dégradés
dégradé par un
complexe protéique contenant des exonucléases 3’5’,
3’
l’exosome
l’exosome(26,
28)
(Figure 7).
c2) Enlèvement de la coiffe 5’.
5’
Le plus souvent, la déadénylation des ARNms est suivie du décoiffage
déco
de
l’extrémité 5’. L’enlèvement de la coiffe 5’ est l’étape initiatrice de la dégradation
5’3’ du corps des ARNms, elle constitue le principal mode de dégradation des
transcrits. L’hydrolyse de la coiffe est catalysée par un complexe protéique constitué
des protéines Dcp1 et Dcp2 (Decapping
(
protein 1 et 2),, Dcp2 possédant l’activité
« deccaping »(26,
(26, 28).
28)
Dans le cas de figure où les
l ARNms ont subi au préalable une dégradation 3’5’
3’
(par l’exosome), la coiffe
coiffe est hydrolysée par la protéine DcpS (Scavenger Dcp).
Après décoiffage des ARNms, le corps des ARNms n’étant plus protégé par
l’extrémité 5’, ils sont rapidement dégradés par l’exoribonucléase 5’3’
5’
Xrn1(26,
28) (Figure 7).
Figure 7: Modes de dégradation des ARNms(28).
16
C) Modes de régulation de la traduction et de la stabilité des ARNms.
La régulation de la traduction et de la stabilité des ARNms fait intervenir des
interactions entre des éléments cis présents dans la séquence de l’ARNm et des
facteurs trans-régulateurs comme les protéines de liaison à l’ARN ou RBPs et les
miARNs qui agissent le plus souvent au sein de complexes multiprotéiques(29, 30).
C’est précisément le fait que ces interactions directes ou indirectes entre les
facteurs cis et trans ne soient pas figées dans le temps qui permet une régulation fine
de l’expression génique: les voies de signalisation intracellulaire en réponse à un
contexte biologique donné, peuvent favoriser ou inhiber l’association des facteurs
trans-régulateurs avec les ARNms cibles, pour conduire à une adaptation rapide de la
synthèse protéique. Cette flexibilité implique une régulation du niveau
d’expression ou de l’activité des facteurs trans.
La régulation de l’activité de ces facteurs peut se faire au niveau, d’une part, de leur
localisation, par séquestration des ARNms cibles et des facteurs trans dans un même
compartiment ou dans des compartiments subcellulaires différents et d’autre part,
par des modifications de leurs propriétés biochimiques qui vont moduler leur
capacité d’interaction avec les ARNms cibles ou avec des cofacteurs protéiques.
Bien qu’en principe la modulation de la traduction et de la stabilité des ARNms
puisse réguler positivement ou négativement la synthèse protéique, la majorité des
mécanismes décrits à ce jour sont inhibiteurs(29).
Deux modes de contrôle de la traduction peuvent être envisagés : un contrôle
global qui affecte la majorité des ARNms cellulaires, et un contrôle qui cible des
ARNms spécifiques sans modifier le statut traductionnel du transcriptome dans son
ensemble. La régulation globale de la traduction est induite le plus souvent par un
stress cellulaire (infection virale, carence en acides aminés, traitements cytotoxiques)
mais également au cours de la mitose et ne sera pas abordée(29, 36).
Les mécanismes de régulation de la stabilité des ARNms sont variés, ils reposent
souvent sur le recrutement de la machinerie de dégradation des ARNms par des
facteurs trans-régulateurs spécifiques. Un ARNm dont la vitesse de dégradation est
élevée est dit instable et inversement, un ARNm dont la vitesse de dégradation est
lente est dit stable.
a) Régulations post-transcriptionnelles par les microARNs.
Les microARNs (miARNs) sont des petits ARNs non codants, de 20 à 24 nt.
Décrits chez les animaux et les plantes, ils régulent de nombreux processus
physiologiques tels que la prolifération cellulaire et le développement. Les miARNs
inhibent la synthèse protéique en réprimant la traduction ou en conduisant à la
dégradation des ARNms cibles(37). Chez les animaux, il est communément admis
que les miARNs agissent en s’hybridant sur une séquence complémentaire au niveau
des ARNms cibles, localisée dans la région 3’NT. Cependant, des données récentes
de la littérature montrent qu’ils peuvent aussi s’hybrider à la région codante
d’ARNms. De plus, des cas d’activation de la traduction par des miARNs ont été
décrits, certains faisant intervenir la région 5’NT(38).
La moitié des ARNms cellulaires seraient la cible de régulations posttranscriptionnelles par les miARNs. Un gène peut être la cible de plusieurs miARNs,
de même un miARN peut cibler plusieurs ARNms.
17
Les miARNs
Ns sont synthétisés sous forme d’un long ARN, le pri-miARN
pri
(miARN primaire). Les pri-miARNs
pri
sont transcrits à partir de gènes organisés en
« cluster » sous la forme d’ARNs polycistroniques qui donneront des miARNs
différents ou bien à partir d’introns de gènes hôtes. Le pri-miARN
miARN va subir deux
clivages séquentiels catalysés par des enzymes de la famille des RNasesIII afin de
produire des miARNs fonctionnels. Au départ, la protéine Drosha va cliver dans le
noyau, le pri-miARN
miARN en précurseurs d’environ 70 nt, les pré-miARNs.
miARNs. Après export
dans le cytoplasme ils seront clivés par la protéine Dicer en un duplex d’ARN
d’environ 20 pb qui contient le miARN mature et son brin complémentaire
(miARN*) qui sera dégradé(37,
dégradé
39 )((Figure 8).
Figure 8: Biogénèse des microARNs(37).
18
Les miARNs matures s’associent à une protéine Argonaute (AGO 1 à 4 chez les
mammifères) au sein du complexe ribonucléoprotéique RISC
RISC (RNA Induced
Silencing Complex) pour former un complexe appelé miRNP (miRNA
RiboNucleoProteic complex). Les miARNs serviraient à recruter le miRNP au
niveau de l’ARNm cible(37,
cible
39, 40). Le degré de complémentarité
ité du miARN vis-àvis
vis de la séquence de l’ARNm cible va déterminer le devenir de l’ARNm. Une
complémentarité imparfaite conduit à une inhibition de la traduction alors qu’une
complémentarité parfaite conduit à la dégradation de celui-ci(37,
celui (37, 39, 40).
40)
Laa majorité des études montre que le complexe miARN/RISC bloque l’initiation
de la traduction en prévenant l’association d’eIF4E avec la coiffe 5’ ou le
recrutement de la sous-unité
sous
ribosomale 60S au niveau du codon AUG
AU (se référer à
la section 2)B)c)).
). Cependant, d’autres mécanismes d’action ont été décrits tels
qu’une inhibition de l’élongation du polypeptide ou une dégradation de celui-ci
celui au
cours de sa synthèse(37
(37-40) (Figure 9).
Figure 9:: Schéma hypothétique d’inhibition de la traduction par les miARNs:
a) ARNm traduit en absence de miARN
miAR
b) Inhibition de la reconnaissance de la coiffe par eIF4E
c) Inhibition du recrutement de la sous-unité
sous
ribosomâle 60S
d) Inhibition de l’élongation
e) Dégradation du polypeptide en cours de synthèse
Concernant la dégradation des ARNms induite par les miARNs, elle serait la
conséquence du recrutement par le miRNP des déadénylase
énylase Ccr4 et Pop2.
La déadénylation dess ARNms cibles est suivie par leur décoiffage et leur dégradation
5’3’
3’ par l’exonucléase Xrn1. Les ARNms peuvent aussi être clivés
clivé par la protéine
Argonaute qui possède une activité endoribonucléase(37,
endoribonucléase
39).
19
b) Régulation post-transcriptionnelle par les éléments AU-rich
Des protéines de liaison à l’ARN (RBPs) vont jouer un rôle central dans la
régulation de la traduction et la stabilité d’ARNms spécifiques grâce à leur capacité à
lier les ARNms sur des séquences régulatrices et à former de nombreuses
interactions protéine-protéine. L’exemple le plus connu et le plus étudié est celui des
protéines de liaison aux éléments AU-Rich (AREs, AU-rich Elements) ou ARE-BPs
(ARE Binding Proteins).
Les AREs sont des séquences cis-régulatrices (de 50 à 150 nt) riches en adénine
(A) et en uridine (U) localisées dans la région 3’NT de nombreux ARNms cellulaires
qui le plus souvent, codent des protéines exprimées transitoirement dans la cellule
comme des cytokines ou des facteurs de croissance. La plupart du temps, les AREs
par leur présence, induisent la déstabilisation des ARNms qui les portent, cependant
en fonction du contexte, la présence d’un ARE peut aussi stabiliser les ARNms ou
inhiber leur traduction.
Trois classes d’AREs ont été décrites : la classe I est caractérisée par la présence
du motif pentamérique AUUUA à proximité d’une séquence riche en U, la classe II
contient seulement le motif pentamérique répété plus de deux fois et la classe III
contient exclusivement une séquence riche en U(41).
La fonctionnalité des AREs est régulée par les protéines qui s’y lient, les AREBPs. Une ARE-BP peut lier plusieurs ARNms et cela ne semble pas dépendre de la
classe d’AREs qu’ils portent. Parmi les ARE-BPs connues certaines déstabilisent les
ARNms qui portent un ARE comme TTP, d’autres comme HuR vont au contraire les
stabiliser. D’autres ARE-BPs comme AUF1 existent sous plusieurs isoformes
pouvant stabiliser ou déstabiliser les ARNms. Ces ARE-BPs se distinguent aussi par
leur localisation subcellulaire, TTP est cytoplasmique alors que HuR et AUF1 sont
principalement nucléaires et peuvent faire la navette entre le noyau
et le cytoplasme(42).
La dégradation des ARNms induite par les AREs commence par une étape de
déadénylation qui est suivie le plus souvent de l’enlèvement de la coiffe. Deux
modes de dégradation du corps des ARNms portant des AREs ont été décrits, une
dégradation 3’ 5’ par l’exosome et / ou 5’3’par l’exonucléase Xrn1(43). Il a été
montré que les ARE-BPs peuvent recruter directement ou indirectement la
machinerie de dégradation des ARNms. Par exemple, AUF1 interagit avec
l’exosome et TTP avec la déadénylase CCR4, les enzymes de decapping et
l’exosome (26).
Les mécanismes de régulation de la stabilité des ARNms par les AREs sont peu
connus. Il semblerait que la proportion entre les ARE-BPs stabilisatrices et
déstabilisatrices dans le cytosol puisse réguler le devenir des ARNms contenant un
ARE. Il a été montré qu’HuR peut entrer en compétition avec AUF1 pour la liaison à
certains ARNms. Ainsi dans des conditions où la liaison d’HuR aux ARNms est
favorisée, les ARNms seraient stabilisés(44).
La fonctionnalité des AREs peut être régulée en réponse à des signaux
cellulaires. Les voies de signalisation des kinases P38MAPK (P38 Mitogen
Activated Protein Kinase), ERK (Extracellular signal Regulated Kinase) et JNK (Jun
N-terminal Kinase) peuvent moduler la stabilité des ARNms contenant des AREs.
Elles phosphorylent les ARE-BPs ce qui a pour conséquence une diminution de leur
20
affinité pour leur cible ou le recrutement de protéines cofacteurs qui vont modifier
leur fonction(26).
Enfin un nombre croissant d’études semble indiquer que le métabolisme des
ARNms par les ARE-BPs et les miARNs est lié. Ces deux modes de régulation de la
traduction et de la stabilité des ARNms pourraient dans certains cas entrer en
compétition ou agir de concert pour favoriser la dégradation d’ARNms contenant un
ARE. Il a été montré qu’ HuR peut lever l’inhibition de la traduction d’un ARNm
contenant un ARE induite par un miARN(45). La protéine TTP quant à elle
favoriserait l’interaction d’un miARN avec son ARNm cible contenant un ARE en
interagissant avec des protéines de la famille Argonaute(46). Cependant les liens
entre ces deux modes de régulation sont peu clairs puisqu’ ils peuvent aussi
fonctionner indépendamment l’un de l’autre(47).
D) UNR régule la stabilité et la traduction d’ARNms.
Depuis la découverte du gène unr, les études réalisées semblent indiquer que la
protéine Unr est un acteur la régulation de la stabilité et de la traduction d’ARNms.
Unr se lie à ses ARNms cibles sur des séquences riches en purines et agit
majoritairement en s’associant à d’autres protéines. Les cibles d’Unr connues à ce
jour sont impliquées dans des fonctions biologiques diverses comme l’apoptose, la
prolifération cellulaire, la réplication virale et le développement.
a) Régulation de la stabilité des ARNms.
La protéine Unr a été impliquée dans la régulation de la stabilité des ARNms
PTH (codant l’hormone parathyroïdienne), des ARNms c-Fos.
Unr stabilise in vivo les ARNms PTH, probablement via son interaction avec la
protéine AUF1 qui se lie à un ARE présent dans la région 3’NT(48). La
déstabilisation des ARNms c-Fos a fait l’objet de nombreuses études, elle fait
intervenir plusieurs protéines dont Unr, qui joue un rôle central.
Le gène c-fos est un proto-oncogène surexprimé dans de nombreux cancers et
impliqué dans de nombreux processus cellulaires comme la prolifération et
l’apoptose. Dans les cellules normales, son expression est très régulée, notamment au
niveau post-transcriptionnel. Elle est induite transitoirement en réponse à différents
stimuli extracellulaires. Des dérégulations de son expression conduisent à son
pouvoir transformant. Les ARNms c-Fos ont une durée de vie très courte, ils sont
rapidement dégradés grâce à la présence d’un ARE dans la région 3’NT et d’un
second motif déstabilisateur riche en purines présent dans la séquence codante, le
mCRD (major Coding Region Determinant of instability)(49). Le mCRD induit la
dégradation déadénylation dépendante des ARNms c-Fos selon un mécanisme
étroitement couplé à la traduction et impliquant Unr. Les expériences qui ont conduit
à ce modèle ont été réalisées in vitro(50, 51).
21
En absence de traduction des ARNm c-Fos, un complexe multiprotéique se met
en place au niveau du mCRD.
mCRD. Ce complexe est composé des protéines suivantes :
Unr ; AUF1, une ARE-BP;
ARE
la PAIP-1(PABP Interacting Protein1)
rotein1), une protéine de
liaison à la PABP et NSAP-1,
NSAP une protéine de liaison à l’ARN. La protéine Unr joue
un rôle central dans ce complexe:
complexe elle lie le motif mCRD et interagit avec la PABP
qui lie la queue polyA,
polyA avec AUF1 et NSAP1. La PAIP-11 interagit avec la PABP.
Cet ensemble formerait
rait une sorte d’échafaudage qui permettrait de relier le motif
mCRD à la queue polyA en absence de traduction des ARNms c-Fos
c
(Figure
10a)(51). En dehors d’Unr, le rôle des autres protéines dans ce complexe
com
est moins
clair, elles pourraient interagir avec la PABP par l’intermédiaire
l’intermédiaire de la PAIP-1.
PAIP Lors
de la traduction des ARNms c-Fos,
c
pendant la phase d’élongation, il semble que le
ribosome durant
ant sa lecture déstructure ce complexe en arrivant au niveau du motif
mCRD. La queue polyA n’étant plus protégée par la PABP, elle est rapidement
dégradée par la polyA-nucléase
polyA
CCR4 (Figure 10b)(50).. Cette déadénylation
conduit à la dégradation des ARNms c-Fos.
c
Ce mécanisme pourrait permettre aux
ARNms c-Fos d’être traduits tout au plus une seule fois(52).
Figure 10:: Modèle de déstabilisation des ARNms c-Fos
c Fos couplée à la traduction.
22
b) Régulation traduction dépendante d’IRES.
d’IRES
La majorité des études concernant la protéine Unr montre qu’elle joue un rôle
d’ITAF dans la régulation de la traduction dépendante d’IRES (voir section
2)B)b)b2)).
)). Unr régule positivement ou négativement la traduction d’ARNms
cellulaires et ARNs viraux possédant des IRES en collaboration avec d’autres
protéines/ ITAFs.
La protéine Unr stimule in vitro et in vivo la traduction des ARNs viraux du
Poliovirus et du Rhinovirus en se liant à leur IRES. Dans le cas du Rhinovirus elle
agit en synergie avec la protéine PTB (Polypyrimidine
(
Tract Binding
B
protein)(53,
54). L’interaction d’Unr avec l’IRES est nécessaire
aire au recrutement de PTB, Unr
maintiendrait l’IRES dans une structure tertiaire adéquate(55).
Selon un mécanisme similaire, Unr et PTB stimulent in vitro et in vivo la traduction
des ARNms APAF-11 (Apoptotic
(
Protease-Activating Factor 1) qui codent la protéine
de même nom, impliquée
impliqué dans l’induction de l’apoptose(56)..
Enfin,, les ARNms Unr possèdent un IRES. Les études montrent que la protéine
Unr associée à PTB régule négativement la traduction de ses propres ARNms(57,
ARNms
58).
c) Régulation
égulation de la traduction coiffe dépendante.
dépendante
Récemment, deux études réalisées chez la drosophile ont montré qu’Unr est
impliquée dans l’inhibition de la traduction des ARNms Msl-2
Msl qui codent une
protéine essentielle dans le dosage génique compensatoire du chromosome X(25,
X
59). Ces études est la première qui implique Unr dans la régulation de la traduction
coiffe dépendante.
Le dosage génique compensatoire du chromosome X est le processus qui permet
d’égaliser l’expression des gènes liés à l’X chez les espèces où les mâles et les
femelles possèdent un nombre différent de chromosome X. Chez les mammifères,
un des chromosomes X est inactivé chez les femelles. En revanche, chez
ch les femelles
drosophiles (XX), chaque chromosome X est transcriptionnellement actif tandis que
chez les mâles (XY),
(XY) la transcription des gènes du chromosome X est augmentée
d’environ deux fois(60)
(60) (Figure 11).
Figure 11: Mécanismes de dosage génique compensatoire chez les mammifères et chez la drosophile.
23
Chez la drosophile, les
l facteurs nécessaires à ce processus induisent
induisen une létalité
spécifique des mâles
les quand les gènes correspondants
corre
sont mutés.
mutés Ces facteurs
forment un complexe appelé DCC (Dosage Compensation Complex)
omplex) qui est recruté
au niveau du chromosome X mâle et qui comprend entre autres,, la protéine Msl-2
( Male Specific Lethal
ethal-2) qui est le composant limitant dans son assemblage. Chez
les femelles, afin d’éviter la formation du DCC qui est létalee, la traduction des
ARNms Msl-22 est inhibée par les
l protéines Sxl (Sex lethal) et Unr.
U La protéine Sxl
est exclusivement exprimée chez les femelles,
femelles l’assemblage du DCC est de facto
inhibé uniquement chez les drosophiles de ce sexe(60).
Le modèle d’inhibition de la traduction des ARNms Msl-2 chez les femelles
fe
est
le suivant: auu départ, la
l protéine Sxl se lie à des séquences riches en
e U sur la région
3’NT des ARNms Msl-2.
Msl
Par la suite, Sxl recrute la protéine Unr
U qui interagit
également avec les ARNms Msl-2
Msl (Figure 12, (1)). Enfin, Unr inhibe le recrutement
du complexe de pré-initiation
pré initiation de la traduction 43S au niveau de la
coiffe 5’ (Figure 12,, (2)).
(
Figure 12:: Modèle d’inhibition de la traduction des ARNms Msl-2
Msl 2 chez la drosophile(25,
drosophile
59).
Un second mécanisme d’inhibition de la traduction des ARNms Msl-2
Ms existe au
cas où le premier échoue. Il ne fait intervenir que la protéine Sxl.
S Celle-ci se fixe
aussi sur une séquence riche en U sur la région 5’NT,
5’
ce qui a pour conséquence
d’inhiber la lecture de la région 5’NT par le complexe d’initiation 43S. Ce double
mécanisme prévient l’expression toxique de la protéine Msl2 chez la femelle.
femelle Les
ARNms Msl-22 sont traduits chez les mâless puisqu’ils n’expriment pas Sxl
S et que la
protéine Unr seule ne peut pas inhiber la traduction des
de ARNms Msl2(25,
Msl2
59).
Les mécanismes d’inhibition de l’initiation de la traduction par Unr/Sxl
U
sont peu
connus, il semble qu’ils soient indépendants de la coiffe et de la queue polyA et font
certainement intervenir d’autres
d’a
facteurs protéiques(25,
(25, 61).
61) Des études de
mutagénèse dirigée ont montré que le domaine CSD1 d’Unr
d’Unr est nécessaire et
suffisant pour son interaction avec la protéine Sxl
S et les ARNms
Msl-2(61). Trois
acides aminés (Lysine, Acide aspartique, Tyrosine)
yrosine) du CSD1 sont nécessaires à cette
interaction et l’étude de la cristallisation du domaine CSD1 dee la protéine UNR
humaine montre que ces résidus sont exposés à la surface
surface du tonneau β (61).
L’inhibition de l’initiation de la traduction
tr
des ARNms Msl-22 par Unr nécessite les
domaines CSD1 et CSD2 ainsi qu’une région riche en glutamine présente dans la
région N terminale de la protéine Unr de drosophile et absente chez les
mammifères(61).
24
E) Régulations post-transcriptionnelles et développement : Unr est essentielle pour le
développement de la souris
Les régulations post-transcriptionnelles jouent un rôle important au cours du
développement, elles permettent le contrôle dans le temps et dans l’espace de
l’expression de gènes spécifiques. La majorité des études réalisées ont montré
l’importance de régulations traductionnelles dans la formation des axes de l’embryon
chez la drosophile ou dans la maturation des ovocytes et le développement
embryonnaire précoce chez le xénope avant que le génome du zygote ne soit
transcriptionnellement actif.
a) Détermination des axes de l’embryon de drosophile par une succession d’inhibition
de traduction.
Chez la drosophile, pendant l’ovogénèse et l’embryogénèse précoce,
l’expression asymétrique de protéines et la localisation des ARNms va définir les
axes de l’embryon. Les ARNms maternels codants les protéines qui déterminent les
axes sont dormants dans les ovocytes, leur traduction est inhibée, ils sont activés
juste après la fecondation des ovocytes. Il semble que ces ARNms sont incorporés
dès leur synthèse dans le noyau des ovocytes, dans des complexes ribonucléiques qui
inhibent leur traduction. Ces complexes sont transportés dans le cytoplasme et la
traduction des ARNms est activée par différents mécanismes quand ils sont
correctement localisés et au moment opportun(62-64).
La formation de l’axe antéropostérieur a été très étudiée. Le développement
postérieur nécessite l’inhibition de la traduction des ARNms Hunchback dans la
région postérieure de l’embryon. De la même manière, le développement antérieur
dépend de l’inhibition de la traduction des ARNms Caudal dans la région antérieure
(Figure 13a)(63).
Les protéines Nanos, Pumillo et Brat répriment la traduction postérieure des
ARNms Hunchback(63). Pumillo lie la région 3’NT de ces ARNms et recrute Nanos
et Brat. Ceci n’est possible que parce que l’expression de Nanos est elle-même
restreinte à la région postérieure. La protéine Smaug (SMG) lie la région 3’NT des
ARNms Nanos et recrute la protéine CUP qui entre en compétition avec eIF4G pour
la liaison à eIF4E et inhibe la traduction des ARNms Nanos dans la région antérieure
(Figure 13b)(62, 63). Cette répression traductionnelle est levée dans la région
postérieure par la protéine Oskar elle aussi restreinte à la région postérieure, Oskar
active la traduction des ARNms Nanos(62, 63)
De façon similaire, la protéine Bicoïd, restreinte à la région antérieure, va inhiber
la traduction des ARNms Caudal à ce niveau et permettre d’établir l’axe antérieur.
Bicoïd lie la région 3’NT des ARNms Caudal et interagit avec la protéine eIF4E et
entre en compétition avec eIF4G (Figure 13a et b)(62-64).
25
Figure 13: Formation de l’axe antéropostérieur chez la drosophile par de multiples mécanismes
d’inhibition traductionnelle
traductionnell (62-64): a) Expression restreinte dans l’espace des protéines impliquées
dans la formation des axes.
axes b) mécanismes d’inhibition de la traduction des ARNms Nanos et caudal
dans la région antérieure et des ARNms Hunchback
Hu
dans la région postérieure.
b) La protéine Unr est essentielle pour le développement embryonnaire de la
drosophile et de la souris.
b1) Unr et dosage génique compensatoire du chromosome X chez la drosophile.
drosophile
Nous avons vu précédemment (section 2)D)c))
)) que la protéine Unr est essentielle
chez la drosophile pour le dosage génique compensatoire du chromosome X. En
effet, Unr inhibe la traduction des ARNms Msl2 chez les femelles(25,
femelles
59). La
protéine Msl22 étant le composant limitant de l’assemblage du DCC, complexe qui
permet chez les mâles d’augmenter environ d’un
un facteur deux la transcription du
chromosome X. L’expression forcée de Msl2
M 2 chez les femelles provoque
l’assemblage DCC au niveau de chaque chromosome X et conduit à la létalité(60).
L’expression chez la drosophile d’une forme tronquée en c-terminal
c
de la
protéine Unr conduit à une létalité précoce des mâles et à une létalité périnatale chez
les femelles(65).. Chez celles-ci l’expression de cette forme mutée conduit à
l’assemblage partiel du DCC au niveau des chromosomes X, cette forme tronquée
étant suffisante pour inhiber en grande partie l’expression de la protéine Msl2,
Msl2 ce qui
concorde avec une étude précédente montrant que la partie n-terminale
n terminale d’Unr
d’Un est
suffisante pour inhiber la traduction des ARNms Msl2(61).
Msl2
Chez les mâles qui
expriment la forme mutée d’Unr, la formation du DCC est altérée, tous les
composants de ce complexe sont exprimés mais ne parviennent
parviennent pas à s’assembler au
niveau du chromosome X(65).
X
. Cette étude montre qu’Unr interagit in vivo avec deux
petits ARNs non codants Rox1 et Rox2 qui sont nécessaires à l’assemblage du DCC.
Unr permettrait le recrutement de ces ARNs au niveau du chromosome X et
l’assemblage du DCC chez
c
les mâles(65). Dans cette même étude, la surexpression
26
d’Unr de deux fois conduit à la létalité précoce des mâles et des femelles. Unr est
donc essentielle pour le développement de la drosophile. De plus son expression doit
être régulée au cours du développement. Ce qui est en concordance avec le fait
qu’Unr régule négativement la traduction dépendante d’IRES de ses propres
ARNms(57, 58).
b2) Le gène unr est essentiel pour le développement de la souris.
Afin d’étudier la fonction biologique du gène unr, son invalidation a été réalisée
chez la souris en 1997(3) par notre équipe. Une cassette portant le gène de résistance
à la néomycine (neo), a été insérée par recombinaison homologue dans la région
promotrice du gène unr de la lignée R1 (fond génétique 129sv) de cellules souches
embryonnaires (ES). Cette insertion a conduit à la délétion d’un fragment d’environ
8,5 Kb comprenant 300pb en amont de l’exon1, l’exon 1 et environ 400pb dans
l’intron 1 (Figure14).
Figure 14: Invalidation du gène unr chez la souris par délétion
d’un fragment de 8,5 Kb dans la région promotrice.
Des clones de cellules ES unr+/- ont été sélectionnés dans un milieu contenant du
G418. Ils ont été injectés dans des blastocystes (fond génétique C57BL6) puis
implantés dans l’utérus de souris pseudo-gestantes pour générer une lignée de souris
chimères hétérozygotes pour la mutation nulle (voir section II)1) et II)2)). Les souris
unr+/- sont fertiles et ont un phénotype apparent normal bien qu’une étude détaillée
du phénotype de ces souris n’ai pas été faite. Le croisement des souris unr+/- n’a pas
permis d’obtenir de souris homozygote unr-/-. Il s’est effectivement avéré que la
mutation nulle du gène unr est létale(3). Les embryons unr-/- meurent à mi-gestation
(entre 9,5 et 10,5 jours post-coïtum, données non publiées). Le gène unr est donc
essentiel au développement embryonnaire de la souris.
27
Les défauts phénotypiques les plus visibles des embryons mutants sont : i) une
petite taille (Figure 15, données non publiées), ii) une absence de fermeture du tube
neural qui est la structure qui va former le futur système nerveux (Figure 15, voir
flèche, comparer les embryons unr-/- et unr+ /+ : les deux « lèvres » dorsales n’ont pas
fusionné chez les embryons mutants homozygotes à E9,5, données non publiées)
ainsi que l’absence de battements cardiaques à E9,5 (normalement le cœur des
embryons bat à ce stade de développement, données non publiées). Aucune étude
approfondie des défauts phénotypiques des embryons unr-/- n’a été publiée à ce jour.
Figure 15: Photographie d’un embryon sauvage et nul pour unr à 9,5 jours de gestation.
Des clones de cellules ES sauvages, hétérozygotes et nuls pour la mutation du gène unr
ont été isolés à partir d’embryons au stade blastocyste issus de croisements de souris unr+/(53) (voir section sur les cellules souches II)2)). Une étude réalisée sur les cellules ES
unr-/- a montré qu’elles présentent une résistance accrue à l’apoptose induite par
irradiation γ. Par contre l’extinction d’unr par ARN interférence dans la lignée
cellulaire HuH7 issue d’un carcinome hépatocellulaire induit l’apoptose même en
absence d’irradiation γ. Il semble que la protéine Unr puisse réguler positivement ou
négativement l’apoptose en fonction du statut cellulaire différencié (HuH7) ou
pluripotent (ES) respectivement (66) (voir section sur les cellules souches II)2)).
28
Nous avons vu dans cette première partie qu’Unr est une protéine de liaison à
l’ARN impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des
gènes. Unr semble réguler la stabilité et la traduction d’ARNms. Cependant, peu de
cibles d’Unr ont été identifiées à ce jour et la majorité des études publiées ont été
réalisées in vitro. De plus, le rôle biologique de la protéine Unr reste mal connu.
Il apparaît tout de même qu’Unr est essentielle pour le développement de la
drosophile et de la souris. Enfin, des études réalisées in cellulo suggèrent qu’Unr est
un régulateur de l’apoptose.
Le but de cette thèse a été de mieux comprendre la/les fonction(s) biologique(s)
d’Unr au cours du développement de la souris. La seconde partie de cette
introduction est consacrée d’une part au développement précoce de la souris et
d’autre part aux cellules souches embryonnaires murines. Nous verrons à travers les
données de la littérature en quoi les cellules souches embryonnaires représentent un
outil de choix pour étudier les mécanismes qui régulent le développement précoce de
la souris bien qu’elles ne puissent se substituer à l’étude proprement dite du
développement des embryons.
29
II) Développement embryonnaire précoce de la souris et cellules
souches embryonnaires murines.
1) Le développement embryonnaire précoce chez la souris.
Le développement embryonnaire est un processus unidirectionnel (de la
fécondation à la naissance) très régulé. Chez la souris la période de gestation dure
environ 21 jours. Elle peut être divisée en quatre grandes phases. La première débute
après la fertilisation et conduit à la formation du blastocyste (E 0 à E4,5; E: jours
embryonnaires), la seconde phase comprend l’implantation de l’embryon, la
gastrulation et l’organogénèse précoce (E4,5 à E10,5), l’organogénèse proprement
dite constitue la troisième phase (E10 à E14) et enfin la dernière et quatrième phase
correspond à la phase de croissance et développement du fœtus (E14 à E21)(67).
Nous nous intéresserons plus particulièrement à la formation du blastocyste
puisque c’est à ce stade que sont isolées les cellules souches embryonnaires.
La seconde phase sera brièvement décrite.
A) De la fécondation à la formation du blastocyste
Chez les mammifères et notamment chez la souris, les ovocytes contiennent peu
de réserves énergétiques. C’est pourquoi 24h après la fertilisation, au stade 2 cellules,
la transcription du génome zygotique est activée et l’œuf se prépare très tôt à
l’implantation. En effet, la ségrégation des lignages cellulaires embryonnaires et
extraembryonnaires qui vont former respectivement le futur fœtus et les annexes
embryonnaires qui assurent sa nutrition se fait dès les premières différenciations
cellulaires(67, 68).
a) Clivage de l’embryon, compaction et formation du blastocyste.
Après la fécondation, l’œuf, tout en gardant le même volume (entouré de la zone
pellucide) va subir trois clivages successifs pour former huit cellules ou blastomères
identiques morphologiquement (Figure 16A). A ce niveau, les blastomères sont
équivalents et peuvent former à la fois des tissus embryonnaires et
extraembryonnaires, ils sont dits totipotents(67, 68).
Rapidement, les 8 blastomères renforcent les contacts cellules-cellules et
simultanément se polarisent. Ils acquièrent un domaine apical et un domaine
basolatéral. Les contacts cellules-cellules semblent nécessaires à la polarisation des
blastomères(67-70). Cette phase de compaction et polarisation donne à l’embryon
une forme de mûre ce qui correspond au stade morula (Figure 16A)(67).
Au cours des divisions cellulaires du stade 8 cellules à 16 cellules, les cellules à
l’extérieur de l’embryon vont maintenir le caractère polarisé alors que les cellules
localisées à l’intérieur vont le perdre et devenir morphologiquement apolaires
(Figure 16A)(70, 71). Ainsi au stade 16 cellules l’embryon est composé de deux
types de cellules qui différent par leur position et leur caractère polaire ou non.
30
Jusqu'à ce stade, la séparation et le mélange des blastomères conduit à la formation
d’embryons qui se développent normalement et produisent des souris
ouris fertiles(72,
fertiles
73).
Figure 16:
1 De la fertilisation à la Formation de la Morula
A) Clivage de l’embryon, compaction ett polarisation des blastomères (70).
La ségrégation entre cellules polarisées et non polarisées s’effectue par des
divisions cellulaires symétriques (selon l’axe externe-interne)
externe interne) et asymétriques
(perpendiculaire à l’axe externe-interne).
externe interne). Au stade 8 cellules, un blastomère en se
divisant asymétriquement génère une cellule fille polaire (qui hérite du domaine
apical) qui se maintiendrait
maintien
t à la surface et une cellule fille apolaire qui serait
se
maintenue dans une position interne. La division symétrique de blastomères produit
deux cellules
lules filles polarisées qui seraient
s
maintenues dans une position externe
(Figure 16B)(69,
(69, 70).
70) Une seconde vague de divisions symétriques et asymétriques
conduit au stade 32 cellules (morula
(
tardive, 2,5 jours embryonnaires
ryonnaires ou E2,5).
E2,5
Figure 16:
1 De la fertilisation à la Formation de la Morula
B) Clivage symétrique et asymétrique des blastomères. E: jours embryonnaires (70).
31
Après le stade 32 cellules, une cavité se forme à l’intérieur de l’embryon, ce qui
correspond au début de la formation du blastocyste (Figure 16A et 17). Plus tard, au
stade blastocyste précoce (E 3,5), les cellules polaires externes formeront un
épithélium, le trophectoderme (TE, composé de cellules trophoblastiques, les
trophoblastes)) qui est le premier lignage
lignage différencié de l’embryon, les cellules
apolaires
internes
formeront
la
masse
cellulaire interne (MCI)
(Figures 16A et 17)(67,
(67, 70, 71).
71) Le trophectoderme renferme la cavité blastocélique
et la MCI qui va produire deux tissus distincts dans les heures suivantes:
suivantes une masse
de cellules, l’épiblaste (Epi) qui est recouvert d’un épithélium, l’endoderme
primitif (Epr, aussi appelé endoderme extraembryonnaire ou hypoblaste) qui le
sépare de la cavité
ité blastocélique (Figure 17).
Figure 177:: Formation et composition tissulaire du blastocyste.
TE: trophectoderme, MCI:: masse cellulaire interne,
Epr: Endoderme primitif, Epi: épiblaste. (70)
Ainsi, au moment de l’implantation à E4,5 quand la zone pellucide se fragmente,
fragmente
le blastocyste tardif est constitué de trois tissus distincts: i) le trophectoderme à sa
surface qui est essentiel pour l’implantation, il formera la partie embryonnaire du
placenta, ii) à la surface de la cavité blastocélique, l’endoderme primitif dont les
tissus dérivés, l’endoderme pariétal et viscéral vont former une grande
g
partie du sac
vitellin ou poche embryonnaire,
embryonnaire iii) l’épiblaste est constitué de cellules
pluripotentes qui vont produire tous les types cellulaires du fœtus et de l’adulte y
compris les cellules germinales (Figure 17).
La spécification du trophectoderme
trophectoderme et de l’endoderme primitif au stade blastocyste
constitue les premiers événements de différenciation cellulaire dee l’embryon(67, 6971).
b) Spécification
pécification des premiers lignages cellulaires.
cellulaire
Les
es mécanismes de spécification des lignages sont peu connus.
connus La position des
cellules (externes ou interne)
interne semble jouer un rôle important. Des
es changements dans
le programme d’expression des gènes sont également impliqués dans la spécification
des lignages(69,
(69, 70, 74).
74)
32
b1) Ségrégation du trophectoderme et de la masse cellulaire interne
L’identité trophoblastique est fixée entre les stades 32 et 64 cellules,
cellules au début de
la formation du blastocyste.
blastocyste Elle peut-être
re visualisée grâce à l’expression sélective du
facteur de transcription Cdx2 dans les cellules externes(75,
(75, 76).
76) De même,
l’expression des protéines Oct4 et Nanog est restreinte aux cellules internes,
internes mais
seulement après la formation du blastocyste (Figure 18)(75,
(75, 77, 78).
78) Il est intéressant
de noter que ces protéines sont exprimées simultanément dans toutes les cellules
internes et externes de l’embryon jusqu’au stade 16 cellules,, ce qui illustre la
complexité des mécanismes de régulation(75).
régulation
Les
es embryons nuls pour cdx2 meurent avant l’implantation(79)
(79). Leur analyse au
stade blastocyste a montré qu’ils possèdent un épithélium polarisé au caractère
trophoblastique à leur surface.
sur
Cependant, celui-ci perd rapidement son identité
trophoblastique,, il ne parvient pas à exprimer des gènes spécifiques du
trophectoderme (TE).
(TE) Cdx2 est donc nécessaire au maintien de l’identité
trophoblastique(76,
76, 79).
79) De plus, dans les blastocystes nuls pour cdx2, les cellules
externes expriment les gènes Oct4 et Nanog qui sont spécifiques de la MCI (76, 79).
Le rôle de Cdx2 dans la spécification du TE serait de réprimer l’expression de
d gènes
spécifiques de la MCI dans les cellules externes du blastocyste et d’activer
l’expression de gènes spécifiques du TE(76,
TE
79). Les mécanismes de cette
répression ont été en partie clarifiés in vitro. Elle
lle semble induite par la liaison au
niveau du promoteur d’oct4
d’
d’un complexe répresseur formé de Cdx2 et Oct4(80).
Bien que la spécification du TE soit compromise dans les blastocystes nuls pour
cdx2, ils forment tout de même un épithélium polarisé à leur surface. Il semble donc
que l’initiation de la formation du TE se fasse indépendamment de Cdx2(76, 79).
Des études récentes ont mis en évidence que la restriction de l’expression de Cdx2
dans les cellules externes de la morula tardive seraitt une conséquence
de leur polarisation(75,
(75, 76, 81) (Figure 18 A). Des voies de signalisations,
notamment la voie Ras-MapK
Ras
induirait une forte expression de Cdx2 dans les
cellules
ules externes de la morula(69,
morula
81). L’autorégulation positive de Cdx2 permettrait
ensuite la répression de gènes de la MCI, notamment d’Oct4 et le maintien de
l’identité trophoblastique(80)
trophoblastique
(Figure 17).
Il semble que dans les cellules internes au stade blastocyste,
blastocyste une répression
réciproque de cdx2 par Oct4, combinée à l’autorégulation positive d’Oct4 permettrait
de spécifier la MCI(80,
(80, 82) (Figure 17B).
Figure 18: Ségrégation du Trophectoderme
Trophectode
et de la Masse Cellulaire
ellulaire Interne(69).
33
b2) Ségrégation de l’endoderme primitif et de l’épiblaste.
Au stade blastocyste tardif (à E4,5), l’épiblaste (Epi) est séparé de la cavité
blastocélique par l’endoderme primitif (Epr, Figure 19C), leur morphologie est
clairement distincte. Jusque récemment, il était considéré que les cellules de la MCI
étaient homogènes/équivalentes au stade blastocyste précoce à E3,5. Il avait été
proposé que les cellules à la surface de la MCI, le long de la cavité blastocélique se
spécifieraient en endoderme primitif, et le reste de la MCI en épiblaste. La position
des cellules dans la MCI déterminerait donc leur devenir(68).
Récemment, de nouveaux éléments ont permis de mieux comprendre comment
l’épiblaste et l’endoderme primitif sont spécifiés. La spécification des cellules
internes du blastocyste en épiblaste a été visualisée par l’expression du facteur de
transcription Nanog(83). L’expression du facteur de transcription Gata6 ou Gata4 a
permis de visualiser la spécification de l’endoderme primitif(83, 84).
L’analyse de blastocystes à différents stades a montré que les précurseurs de
l’Epr (Gata6 positif) proviennent non seulement de la surface mais aussi de
l’intérieur de la MCI. En effet, la MCI des blastocystes à E3,5 est hétérogène,
composées de cellules exprimant soit Nanog, soit Gata6 de manière mutuellement
exclusive, qui sont mélangées « en poivre et sel »(83) (Figure 19B). Des expériences
de traçage cellulaire ont montré que les cellules de la MCI à E3,5 sont déjà
déterminées en Epi ou en Epr. En effet, lorsqu’une cellule de la MCI à E3,5 est
marquée par la GFP ( par injection d’un plasmide codant la GFP) puis agrégée avec
une morula et réimplantée dans l’utérus d’une souris pseudogestante, elle produit des
cellules qui contribuent exclusivement à l’Epi ou à l’Epr(83).
Ces résultats ont été confirmés par l’analyse du profil d’expression des gènes de
cellules uniques de la MCI à E3,5. Il s’avère qu’il existe deux populations distinctes
de cellules dans la MCI à E3,5, enrichies en expression de gènes spécifiques de l’Epi
ou de l’Epr(85). Les précurseurs de l’Epi et de l’Epr sont donc déjà présents dans la
MCI à E3,5, leur positionnement respectif à l’intérieur et à la surface de la MCI
serait une conséquence de leur spécification (Figure 19B,C)(83).
Récemment Plusa et al.(84) ont confirmé les résultats cités ci-dessus et ont
permis de mieux comprendre la ségrégation des deux lignages de la MCI. Cette étude
a montré que les cellules internes des morulas tardives expriment toutes Gata6 et
Nanog (Figure 19A) et que dans le blastocyste précoce (E3,5), certaines cellules de
la MCI les co-expriment encore (Figure 19B), avant que leur expression
mutuellement exclusive ne soit établie dans le blastocyste tardif (E4,5) (Figure 19C).
De plus, ils ont utilisé des lignées de souris existantes qui expriment l’histone H2B
fusionnée à la GFP sous la dépendance du promoteur du récepteur alpha du PDGF
(PDGFRα). L’expression du PDGFRα est fortement induite dans les précurseurs de
l’Epr(85, 86). Ils ont utilisé ce système pour suivre par vidéo-microscopie la
ségrégation de l’Epr et de l’Epi. Cette étude a montré qu’au cours de la formation du
blastocyste, l’expression de la GFP devient hétérogène, certaines cellules l’exprimant
fortement et d’autres faiblement avec une répartition en « poivre et sel ». Au stade
blastocyste tardif à E4,5, les cellules qui l’expriment fortement sont toutes
positionnées à la surface de la MCI.
En effet, les cellules qui étaient déjà
positionnées à la surface de la cavité s’y maintiennent, par contre celles qui étaient à
l’intérieur de la MCI se positionnent à la surface de la cavité blastocélique ou sont
éliminées par apoptose(84). Il semble qu’une partie des cellules atteignent la surface
34
de manière passive au cours de l’expansion de la cavité blastocélique(84).
blastocélique
Les
propriétés d’adhérence des cellules de l’Epr participeraient également(69,
également
70, 83,
84). Le positionnement à la surface semble également jouer un rôle important pour
compléter ou renforcer la spécification des cellules de l’Epr. Ceci est en accord avec
une étude qui montre que les cellules acquièrent pleinement leur identité épithéliale
épi
lorsqu’elles se positionnent à la surface de la cavité blastocélique(87)
blastocélique(87). Ces nouveaux
éléments réconcilient donc l’ancien modèle et le nouveau (Figure
Figure 19B, C).
Figure 19:: Ségrégation de l’épiblaste
l’épibl
et de l’endoderme primitif (69).
(69)
Les mécanismes permettant l’expression mutuellement exclusive
exclusi de Nanog et
Gata6 sont peu connus.
connus Celle-ci
ci semble se produire de manière aléatoire dans la MCI
puisque au départ de nombreuses cellules les co-expriment(75,
co
(75, 84).
84) Il semble que la
voie de signalisation Grb2-MAPK
Grb2
soit impliquée. Grb2 est un adaptateur de la voie
de signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase. Les blastocystes mutants
pour grb2, ne forment pas d’Epr, Gata6 n’est pas exprimé, toutes les
le cellules de la
MCI expriment Nanog et acquièrent une identité épiblastique(83,
(83, 88).
88) Cette voie de
signalisation serait requise pour la spécification de l’endoderme primitif soit en
activant l’expression de Gata6 soit en réprimant l’expression de Nanog(69, 83, 88)
(Figure 19).
L’invalidation de gata6 in vivo permet tout de même la formation de l’Epr, il
semble en effet que Gata6 possède des fonctions redondantes avec Gata4. Les
embryons mutants cependant meurent après l’implantation (E5,5) à cause de
problèmes de fonctionnement
nctionnement et/ou de différenciation de l’endoderme viscéral(89)
viscéral
qui dérive de l’endoderme primitif et joue un rôle essentiel dans la nutrition de
l’embryon
embryon avant que le placenta soit fonctionnel (voir ci-dessous)..
35
B) De l’implantation à la gastrulation.
a) Implantation et formation de l’œuf cylindre
Dans le blastocyste tardif, le trophectoderme qui recouvre la cavité blastocélique
est appelé trophectoderme mural. Celui qui recouvre l’épiblaste est appelé
trophectoderme polaire. Celui-ci entre en contact avec l’utérus au moment de
l’implantation (Figure 20). Le blastocyste va alors subir des modifications
morphologiques importantes qui conduisent à la formation de l’œuf cylindre (E6)
(Figure 20)(67, 68, 90).
Le trophectoderme mural se différencie en cellules géantes qui recouvrent la
partie externe de l’embryon. Le trophectoderme polaire va proliférer pour former
deux structures: i) le cône ectoplacental au site d’implantation qui va envahir la
paroi utérine. Il constitue le pôle supérieur de l’embryon(67, 68, 90); ii) l’ectoderme
extraembryonnaire qui prolifère, il recouvre l’épiblaste et le repousse vers le pole
distal de l’embryon(67, 68, 90).
Ces deux structures vont former la partie
embryonnaire du placenta (Figure 20, 21).
L’endoderme primitif va proliférer et se différencier en endoderme pariétal et
viscéral. L’endoderme pariétal migre le long la cavité blastocélique où il est contact
avec le trophectoderme mural, il va sécréter une matrice qui forme la membrane de
Reichert qui filtre les nutriments du milieu environnant. Le trophectoderme mural,
l’endoderme pariétal et la membrane de Reichert forment le sac vitellin
pariétal(67, 68, 90) (Figure 20, 21).
L’endoderme viscéral prolifère et reste en contact avec l’épiblaste et l’ectoderme
extraembryonnaire. Il forme un épithélium d’absorption essentiel pour la nutrition de
l’embryon avant que le placenta soit fonctionnel(67, 68, 90) (Figure 20, 21).
L’épiblaste va également proliférer et acquérir une morphologie de type
épithéliale, à ce stade il est aussi appelé ectoderme primitif. Quelques jours plus tard
au moment de la gastrulation, il va différencier pour former les feuillets primordiaux
de l’embryon d’où dérivent toutes les cellules du fœtus et de l’adulte (voir section
suivante). Il est entouré par l’endoderme viscéral et recouvert au dessus de
l’ectoderme extraembryonnaire. L’endoderme viscéral envoie des signaux à
l’épiblaste et à l’ectoderme extraembryonnaire qui induisent la formation d’une
cavité au centre de l’embryon(67, 68, 90) (Figure 20).
36
Figure 20:: Implantation et structure de l’embryon au stade œuf cylindre(69).
cylindre
b) La gastrulation: différenciation de l’épiblaste, formation des feuillets primordiaux
La gastrulation
astrulation est un processus complexe qui va permettre la différenciation de
l’épiblaste pluripotent pour former les feuillets primordiaux de l’embryon :
l’éctoderme, l’endoderme définitif et le mésoderme (Figure 21).
Ces deux derniers dérivent d’un précurseur
précurseur commun, le mesendoderme(67,
mesendoderme
68, 90,
91). C’est également au cours de la gastrulation que l’axe antéro-postérieur
antéro
de
l’embryon est établi(67,
(67, 68, 90, 91).
91) L’épiblaste va aussi produire le mésoderme
extraembryonnaire qui va se glisser le long de la face interne
interne de l’endoderme viscéral
pour participer aux annexes embryonnaires. L’endoderme viscéral et le mésoderme
extraembryonnaire forment le sac vitellin viscéral, qui estt essentiel pour la nutrition
de l’embryon avant que le placenta soit fonctionnel (≈E11)
(
(Figure
Figure 21)(67,
2
68, 90).
L’initiation de la gastrulation dépend de signaux émis par les annexes
embryonnaires, l’endoderme viscéral
viscéral et l’ectoderme extraembryonnaire (Figure
(
20).
La différenciation des feuillets primordiaux est accompagnée de mouvement
cellulaires(67, 68, 90--92).
Chaque feuillet primordial de l’embryon va former des tissus
tiss du fœtus et de
l’adulte. L’endoderme définitif va principalement donner le foie, l’intestin, le
pancréas, les poumons,
poumons les tissus épithéliaux d’une façon générale. Le mésoderme va
former entre autres le cœur, les vaisseaux, les cellules hématopoïétiques,
hématopoïétiques les
vertèbres, les muscles,
muscles les reins et les cellules germinales. L’ectoderme
ectoderme va donner les
tissus du système nerveux et la peau(67) (Figure 21).
37
38
Figure 21: Récapitulatif de la différenciation des lignages embryonnaire et extraembryonnaires.
2) Les cellules souches
ches embryonnaires murines.
L’utilisation des cellules souches embryonnaires (ou cellules ES) facilite l’étude
in vitro et in vivo des mécanismes moléculaires qui régulent le développement des
mammifères. Elles sont dérivées des cellules pluripotentes des
des blastocystes avant
implantation(93, 94)..
A) Description des cellules souches embryonnaires.
embryonnaires
a) Propriétés des cellules souches embryonnaires.
Les cellules souches embryonnaires (ES) sont pluripotentes,
pluripotentes elles ont la
capacité de différencier pour produire tous les types cellulaires (ou lignages) du
fœtus et de l’adulte (Figure 22) (93, 94). Lorsqu’elles
orsqu’elles sont cultivées dans des
conditions appropriées,
appropriées elles vont proliférer indéfiniment sous leur état non
différencié,, elles vont s’autorenouveler(95, 96) (elles forment des colonies,
colon
Figure
22). L’autorenouvellement
autorenouvellement des cellules ES correspond à leur
eur état pluripotent.
Dans ces conditions elles
elles prolifèrent rapidement, leur temps de doublement est
d’environ 12 heures.
Les cellules ES sont donc maintenues in vitro dans un état qui est transitoire
in vivo(95, 96).
Figure 22: Capacités d’autorenouvellement et de différenciation des cellules ES.
39
Les cellules ES peuvent être cultivées pendant de longues périodes et maintenir
leur potentiel développemental(97,
développemental
98).. En effet, quand elles sont agrégées avec des
morulas ou injectées dans des blastocystes, après réimplantation
ation de ces embryons
dans des souris pseudogestantes, les cellules ES vont différencier et coloniser tous
les tissus dérivés des trois feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et
ectoderme)
toderme) ainsi que la lignée germinale et former des souris chimères fertiles (97,
98). Les
es cellules ES sont de ce fait utiliséess pour la production de souris
transgéniques(67,
(67, 99) (Figure 23).
Les cellules ES lorsqu’elles sont injectées en sous-cutanée
sous cutanée dans
da des souris
immunodéficientes vont former des tumeurs bénignes appelées tératomes.
Ces tumeurs sont composées de tissus différenciés dérivés des trois lignages
primordiaux ainsi que de cellules non différenciées(67,
différenciées
94) (Figure
Figure 23).
2
Figure 23: Propriétés des cellules ES(100).
ES
Les
es cellules ES peuvent également être agrégées et cultivées en suspension pour
former des sphères appelées corps embryoïdes
em
qui récapitulent les premières étapes
du développement. En effet, les corps embryoïdes au bout de cinq jours de culture
forment une structure similaire à l’embryon au stade œuf cylindre(101,
cylindre
102) (voir
section II)1)B)a), Figure 23).
2 . Un épithélium d’endoderme primitif se forme à leur
surface qui se différencie
rencie en endoderme viscéral au bout de huit jours de culture
(aisément visible après 10 jours de culture)(102,
culture)
103). A l’intérieur les corps
embryoïdes sont constitués d’un épithélium proche de l’épiblaste après implantation
(102) qui va pouvoir différencier vers les trois lignages primordiaux. Lorsque les
corps embryoïdes sont ensuite cultivés dans des conditions adhérentes,
adhérentes leur structure
s’ouvre, les cellules libérées vont différencier en de nombreux types cellulaires
(cellulescardiaques, nerveuses, glandulaires…)(101, 102). Il convient de noter qu’in
qu’
vivo dans les embryons chimériques, les cellules ES sauvages ne colonisent pas
40
l’endoderme primitif et ses dérivés (endoderme viscéral et pariétal) bien qu’elles
aient la possibilité de différencier vers ce lignage in vitro(97, 98, 102, 103).
Du fait de ces propriétés, les cellules ES représentent un outil de choix pour
l’étude du développement des mammifères in vivo et in vitro(100).
Les premières cellules souches embryonnaires humaines ont été isolées en
1998(104). Leur utilisation en thérapie cellulaire représente un grand espoir pour la
médecine(105, 106). C’est pourquoi ces dernières années de nombreux protocoles
visant à induire de façon homogène la différenciation des cellules ES (murines et
humaines) dans un type cellulaire particulier ont vu le jour(105, 106).
b) Culture des cellules ES murines.
Lors de leur isolement, les cellules ES étaient cultivées sur un coussin de
fibroblastes embryonnaires (mitomycinés ou irradiés). Ceux-ci sécrètent un facteur
soluble qui inhibe la différenciation spontanée des cellules ES(93, 94).
Depuis ce facteur soluble a été identifié. Il s’agit d’une cytokine, le LIF
(leukemia inhibitory factor)(96). L’état pluripotent des cellules ES murines est le
plus souvent maintenu en culture via l’utilisation de LIF. Il inhibe la différenciation
spontanée des cellules ES(96). La fixation du LIF sur son récepteur (LIFR) entraine
le recrutement du récepteur gp130. La partie intracellulaire de ces récepteurs est
associées aux kinases JAK (Janus associated kinase)(95). L’héterodimérisation de
ces récepteurs conduit à la phosphorylation croisée et activation des kinases JAK. In
fine, cette voie de signalisation conduit à la phosphorylation et activation du facteur
de transcription STAT3(107). L’expression d’une forme dominante négative de
STAT3 dans les cellules ES conduit à la perte de l’autorenouvellement et à la
différenciation des cellules ES(107). Cependant, il s’avère que le LIF n’est pas
nécessaire in vivo pour la formation et le maintien des cellules pluripotentes. Les
embryons n’exprimant pas le récepteur gp130 meurent entre E12,5 et la
naissance(108), ceux n’exprimant pas le récepteur LIFR meurent après la
naissance(109).
B) Etablissement, maintien et régulation de la pluripotence.
a) Identification de gènes clés de pluripotence: oct4, sox2 et nanog.
Les gènes oct4, nanog et sox2 codent des facteurs de transcription qui jouent un
rôle clé dans la formation ou le maintien de l’épiblaste pluripotent in vivo. Ils sont
aussi nécessaires au maintien de l’état pluripotent des cellules ES in vitro.
a1) Oct4
Nous avons vu précédemment que le gène Oct4 est impliqué dans la
spécification de la MCI au stade blastocyste précoce (voir section II)A)1)b)a1).
En effet, l’invalidation d’oct4 chez la souris conduit à une létalité péri-implantatoire.
41
L’analyse des blastocystes nuls pour oct4 à E3,5 montre qu’ils possèdent une
morphologie normale mais ne forment pas de MCI. Après culture in vitro des
blastocyste oct4-nuls, seules des cellules de type trophoblastiques sont présentes
(Table 2A). De même aucune lignée de cellules ES nulles pour oct4 n’a pu être
isolée de ces embryons. Le gène oct4 est donc essentiel à la spécification de la MCI
et notamment pour la formation de l’épiblaste pluripotent in vivo (78).
Des modifications du niveau d’expression d’Oct4 dans les cellules ES, en
présence de LIF (qui maintient l’état pluripotent) conduisent à une perte de l’état
pluripotent.
La surexpression d’Oct4 de plus de 2 fois dans ces cellules semble conduire à leur
différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif(110) (voir section
sur le blastocyste) (Table 2B). Ceci est en accord avec le rôle supposé d’Oct4 dans la
spécification de l’endoderme primitif in vivo. Son expression in vivo est
transitoirement, fortement induite dans l’endoderme primitif au cours de sa
formation, puis s’éteint après l’implantation du blastocyste(111).
Une diminution de l’expression d’oct4 de plus de 2 fois dans les cellules ES, induit
leur différenciation vers le lignage trophoblastique, qui est accompagnée d’une
induction de l’expression de Cdx2 (voir section sur le blastocyste)(110). De même
l’expression ectopique de Cdx2 dans les cellules ES conduit à leur différenciation
trophoblastique(80) (Table 2B). Ces expériences sont à l’origine de l’hypothèse
selon laquelle la répression réciproque d’Oct4 et Cdx2 permettrait la spécification de
la MCI et du trophectoderme in vivo (80). Oct4 est donc essentiel au maintien de
l’état pluripotent des cellules ES, et son niveau d’expression doit être étroitement
régulé. Oct4 prévient la différenciation des cellules ES vers les lignages
extraembryonnaires que sont le trophectoderme et l’endoderme primitif. Cette
différenciation est considérée illégitime puisque les cellules ES sont isolées des
blastocystes après la spécification de ces lignages(112).
a2) Sox2
Les embryons nuls pour sox2 meurent après l’implantation (E7,5).
La morphologie des blastocystes semble normale jusqu'à l’implantation. Cependant,
leur culture ne produit que des cellules de types trophoblastiques (Table 2A) et
quelques cellules qui ressemblent aux dérivés de l’endoderme primitif (endoderme
pariétal). Le rôle de Sox2 est plus difficile à déterminer puisque l’expression de la
protéine Sox2 maternelle persiste jusque l’implantation, ensuite les embryons
dégénèrent. Il semble que Sox2 soit au moins nécessaire au maintien de l’épiblaste
pluripotent puisqu’aucune lignée de cellules ES nulles pour sox2 n’a pu être
isolée(113).
L’extinction de Sox2 dans les cellules ES conduit à leur différenciation vers le
lignage trophoblastique en présence de LIF(114) (Table 2B). Sox2 est donc essentiel
pour le maintien de l’état pluripotent des cellules ES; comme Oct4, il prévient leur
différenciation illégitime vers le lignage trophoblastique.
a3) Nanog.
Nous avons vu précédemment que le facteur de transcription Nanog intervient
dans la spécification de l’épiblaste au stade blastocyste précoce (E3,5) (voir section
II)A)1)b)b2). En effet, les embryons nuls pour nanog meurent après l’implantation à
E5,5. A ce stade les embryons présentent une structure désorganisée qui ne semble
pas présenter d’épiblaste(77). Les blastocyste précoce nanog -/- isolés à E3,5
42
présentent une morphologie apparente normale. Cependant lorsqu’ils sont cultivés in
vitro, la MCI ne parvient pas à proliférer et aucune lignée de cellules ES nanog-/- n’a
pu être isolée(77). Dans une étude récente l’examen plus étroit de ces embryons a
montré qu’en absence de Nanog au stade blastocyste précoce, les cellules de la MCI
ne parviennent pas à former un épiblaste pluripotent(115). Les cellules dégénèrent
progressivement entre E3,5 et E4,5, elles acquièrent un caractère trophoblastique ou
meurent par apoptose (Table 2A)(115). De manière inattendue, il semble que les
embryons mutants forment un endoderme primitif mais qu’il dégénère rapidement.
Ceci suggère qu’un apport paracrine de l’épiblaste est nécessaire à sa survie(115).
Nanog est donc essentiel pour la formation de l’épiblaste pluripotent in vivo.
La surexpression permanente de Nanog dans les cellules ES permet leur
autorenouvellement constitutif en absence de LIF. D’ailleurs dans ce contexte les
cellules ES ne parviennent pas à différencier (Table 2B)(116).
L’invalidation in vitro de nanog dans les cellules ES conduit
à une différenciation massive en endoderme primitif en présence de LIF(77, 117)
(Table 2B). Cependant, les cellules ES nulles pour nanog parviennent tout de
même à former des colonies non différenciées (mais difficilement), leur capacité
de différenciation multi-lignage dans les tératomes est conservée et elles contribuent
à tous les tissus somatiques adultes mais pas à la lignée germinale lors de la
formation de souris chimériques. Les cellules ES nanog-/- sont donc pluripotentes et
Nanog est requis pour la formation des cellules germinales in vivo. Nanog n’est pas
essentiel au maintien de l’état pluripotent des cellules ES, cependant il le stabilise
fortement en inhibant la différenciation spontanée vers le lignage endodermique
primitif(117).
L’expression de Nanog et de Gata6 dans les cellules de la MCI au stade
blastocyste permet la spécification de l’épiblaste et de l’endoderme primitif
respectivement (voir section II)A)1)b)b2). Il s’avère que l’expression ectopique de
Gata4 ou Gata6 dans les cellules ES induit leur différenciation en endoderme
primitif(118, 119). Gata6 et Gata4 pourraient autoréguler positivement et de manière
croisée leur expression puisque dans ce contexte l’activation des deux gènes
endogènes est induite. De même, la différenciation des cellules ES nulles pour nanog
est accompagnée par l’induction des gènes Gata6 et Gata4(117). Il a en effet été
montré que Nanog réprime l’expression de Gata6 dans les cellules ES(120). De
même, l’activation de la voie Grb2/MEK (voir section II)A)1)b)b2) dans les cellules
ES induit une sous-régulation négative de l’expression de Nanog et une
différenciation en Epr. Ces données sont en accord avec le modèle d’expression
mutuellement exclusive de Nanog et Gata6 lors de la ségrégation de la MCI en
épiblaste et en endoderme primitif et avec le rôle de Grb2 dans ce contexte.
Enfin, l’expression de Nanog est hétérogène dans les cellules ES. En culture les
cellules expriment individuellement des niveaux différents de Nanog. Il s’avère que
son expression fluctue constitutivement entre un état où il est fortement exprimé
(Hight Nanog, HN) et un état ou il est faiblement exprimé (Low Nanog, LN)(117,
120, 121). L’utilisation de cellules ES exprimant la GFP sous la dépendance du
promoteur endogène de nanog à permis de trier les cellules selon leur niveau
d’expression de la GFP et d’étudier leur comportement. Les cellules dans l’état LN
lorsqu’elles sont triées et cultivées finissent par régénérer la distribution d’origine
(LN et HN)(117, 121). Cependant, dans l’état LN les cellules ont de plus grande
chance de différencier qui s’accompagne d’une augmentation de l’expression de
Gata6. Tandis que dans l’état HN elles ont plutôt tendance à s’autorenouveler. Il
43
semble donc qu’en fonction du niveau d’expression de Nanog, les cellules soient
prônes à l’autorenouvellement ou à la différenciation(117, 121).
Cette fluctuation de l’expression de Nanog représenterait une opportunité de
différenciation en présence de signaux adéquats(117, 121, 122). Elle pourrait refléter
in vivo l’expression stochastique de Gata6
Gata6 et de Nanog dans les cellules de la MCI
avant que leur
eur expression mutuellement exclusive ne soit établie(117,
établie
122). Nanog
ne fait pas figure d’exception
d’
; récemment d’autres gènes impliqués dans la
régulation de la pluripotence et dont l’expression fluctue ont été décrits(123).
décrits
L’extinction de l’expression d’Oct4, Sox2 et Nanog est induite in vivo et in vitro
quand l’épiblaste et les cellules ES respectivement s’engagent en différenciation(124,
différenciation
125).
A)
B)
Table2: A) Phénotype des embryons et des cellules ES n’exprimant pas Oct4, Sox2 ou Nanog
B) Phénotypes des cellules ES après sur-expression d’Oct4, Cdx2, Nanog, Gata6 ou Gata4
44
b) Circuit transcriptionnel de régulation de la pluripotence.
Récemment, plusieurs études à grande échelle ont permis de mieux comprendre
les mécanismes qui régulent la pluripotence des cellules ES. La plupart ont en
commun l’utilisation de la technique d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP)
pour identifier les promoteurs de gènes liés par Oct4, Sox2 et Nanog entre autres. De
plus, le réseau d’interactions protéiques de ces facteurs de transcription à été en
partie dessiné(126, 127).
Il semble qu’Oct4, Sox2 et Nanog peuvent agir comme répresseur ou activateur
de la transcription de gènes cibles(128, 129).
D’une part, Oct4, Sox2 et Nanog agiraient au sein d’un complexe multiprotéique
pour activer la transcription de gènes nécessaires au maintien de l’état pluripotent.
Masui et al. ont montré qu’Oct4 et Sox2 interagissent directement pour activer la
transcription de gènes cibles impliqués dans le maintien de l’état pluripotent
notamment oct4, sox2 et nanog(114). Il semble que Nanog aussi autorégule
positivement son expression(128). Les études de ChIP ont montré qu’Oct4, Nanog
et Sox2 co-occupent les promoteurs d’un certain nombre de gènes (qui varie en
fonction des études) dont leurs propres promoteurs(128-132).
Ces régions
génomiques se trouvent être enrichies en histone H3 tri-méthylées sur la lysine 4
(H3K4me3)(131, 132), cette marque épigénétique est associée aux gènes
transcriptionnellement actifs(133). Pour la plupart les cibles potentielles identifiées
sont fortement exprimées dans les cellules ES et régulées négativement au cours de
la différenciation, ce qui est aussi le cas de Nanog, Oct4 et Sox2(126, 130, 131).
Dans l’ensemble ces différentes études ont permis d’identifier de nouvelles cibles
potentielles d’Oct4, Sox2 et Nanog ainsi que des gènes dont le rôle dans le maintien
de la pluripotence des cellules ES avait déjà été vérifié expérimentalement.
D’autre part, individuellement Oct4, Nanog et Sox2 semblent réprimer la
transcription de gènes inducteurs de différenciation. En effet, les gènes liés par un
seul de ces facteurs de transcription ont tendance à être peu exprimés ou inactifs dans
les cellules ES et fortement induits au cours de la différenciation(131, 132). De plus,
ces régions génomiques sont enrichies en histone H3K27 tri-methylée(131, 132), qui
est associée aux gènes transcriptionnellement inactifs(133).
L’ensemble de ces études dessine un circuit transcriptionnel complexe composé
de boucles de régulations positives et négatives(125). Ce réseau permettrait le
maintien de l’état pluripotent des cellules ES et générerait en même temps la
flexibilité nécessaire pour permettre à ces cellules de différencier(125, 134) (Figure
24).
Les régulations épigénétiques sont également nécessaires à la différenciation des
cellules ES. Néanmoins, les gènes impliqués dans ces régulations ne semblent pas
nécessaires au maintien de l’état pluripotent(122, 125).
Récemment, les microARNs ont été intégrés au réseau transcriptionnel qui
régule la pluripotence des cellules ES(135)(Figure 24).
45
c) MicroARN et cellules ES
Des études récentes ont montré l’importance des microARNs dans la régulation
de la prolifération et de la différenciation des cellules ES(136).
La protéine Dicer est impliquée dans la maturation des microARNs (voir section
I)2)C)a)). Son absence dans les cellules ES conduit à une diminution importante de
leur prolifération(137, 138) qui s’accompagne d’une perte de leur capacité de
différenciation multi-lignage. En effet, elles ne forment pas de tératomes ni de souris
chimères(137).
La protéine DCGR8 est également impliquée dans le métabolisme de miARNs.
Elle participe à la maturation des pri-miARNs en pre-miARNs (voir section
I)2)C)a)). Son absence dans les cellules ES conduit à un allongement du temps de
prolifération et à une accumulation des cellules en phase G1 du cycle cellulaire.
Il s’avère qu’effectivement des miARNs spécifiques (de la famille mir-290)
favorisent la transition entre la phase G1 et S du cycle cellulaire(139). Ces cellules
parviennent tout de même à former des tératomes, qui cependant sont principalement
composés de tissus non différenciés. Cette incapacité à différencier serait due à un
défaut d’extinction des gènes clés de pluripotence entre autres Oct4, Sox2 et Nanog
quand la différenciation est induite(140).
Dans ce sens, une étude récente a montré que des miARNs (mir-134, mir-296 et mir470) régulent négativement la traduction des ARNms Nanog, Oct4 et Sox2 au cours
de la différenciation des cellules ES. Ils sont faiblement exprimés dans les cellules
ES et induits au cours de la différenciation(141).
Enfin, les données de ChIP suggèrent qu’Oct4, Nanog et Sox2 activent la
transcription de gènes codant des miARNs spécifiques des cellules ES et
inversement, répriment l’expression de gènes codant des miARN tissuspécifiques(135).
Dans l’ensemble, l’impact des régulations post-transcriptionnelles sur le
maintien de l’état pluripotent et la différenciation des cellules ES reste peu exploré.
46
Figure 24:: Réseau de régulation de la pluripotence des cellules ES murines(135).
murines
47
Objectifs
Nous avons vu dans l’introduction que le gène unr est essentiel au développement de la
souris puisque son invalidation conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation. Dans la
mesure où le rôle biologique d’Unr est peu clair, l’objectif principal de cette thèse a été de
mieux caractériser son rôle au cours du développement de la souris.
Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au défaut phénotypique le plus frappant
des embryons mutants homozygotes qui est leur petite taille. Elle pourrait refléter un retard de
croissance au cours du développement qui pourrait être dû d’une part à un défaut précoce de
nutrition de l’embryon, c’est à dire à un problème au niveau des annexes embryonnaires et
d’autre part à un problème de différenciation/prolifération précoce au cours du
développement.
Dans ce but, nous avons décidé de mettre en œuvre deux approches qui sont
complémentaires.
1) La première approche, qui est la plus simple, a été de mieux caractériser le rôle d’unr
dans les cellules ES, ce qui jusque là n’avait pas été fait. Comme nous avons vu dans
l’introduction, ces cellules de part leurs propriétés représentent un outil simple pour étudier
les mécanismes qui régulent le développement précoce des embryons et plus particulièrement
l’aspect différenciation et prolifération. De plus, cet outil était déjà disponible puisque des
lignées de cellules ES sauvages, hétérozygotes et homozygotes pour la mutation du gène unr
avaient déjà été isolées dans notre équipe.
2) La seconde approche, qui est plus compliquée, a été d’étudier l’expression de la
protéine Unr au cours du développement et de mieux caractériser les défauts phénotypiques
des embryons nuls pour unr. Dans ce but, nous avons récemment établi des collaborations et
mis en place des techniques d’histochimie et d’immunohistochimie sur embryons de souris à
E9,5 et E8,5 (collaborateurs : Pierre Costet, Bordeaux; Nathalie Dugot-Senan, Bordeaux;
Lucille Miquerol, Marseille).
Mon travail de thèse s’inscrit dans ce contexte. En examinant les cellules ES unr -/- plus
étroitement, nous avons remarqué qu’elles ont tendance à différencier spontanément en
présence de LIF. En routine, les cultures de cellules ES Unr-nulles sont mixtes, elles
contiennent des colonies de cellules ES non différenciées et environ 25% de cellules
morphologiquement différenciées qui sont stellaires et réfractives. Sur la base de ces
éléments, nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait stabiliser l’état pluripotent (prolifératif
et non différencié) des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée. Unr pourrait
directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation ou en
régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous nous sommes également demandés si
ce phénotype pouvait entrainer un biais dans la capacité de différenciation multi-lignage des
cellules ES Unr-nulles.
La finalité de ce travail de thèse a été d’essayer de relier l’étude phénotypique des cellules
ES unr-/- à la petite taille des embryons unr-/- afin de mieux comprendre le rôle biologique
d’Unr au cours du développement de la souris.
48
Résultats
49
Introduction et résumé de l’article
La protéine de liaison à l’ARN Unr stabilise l’état pluripotent des cellules souches
embryonnaires murines en prévenant leur différenciation vers le lignage
endodermique primitif.
Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui
régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr
chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum,
jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus
frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc.
Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au
cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches
embryonnaires (ES).
Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade
blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’autorenouveler c’est à dire proliférer
indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou
différencier vers tous les types cellulaires adultes dérivés des feuillets primordiaux
(endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux
propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité.
Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier
spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans
un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules
ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées.
Nos travaux montrent en effet, qu’elles s’engagent en différenciation vers le lignage
endodermique primitif qui forme in vivo une grande partie de la poche de l’embryon.
Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond
génétique différent par déplétion stable d’Unr. De plus, la restauration de l’expression
d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr
contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur
différenciation spontanée en endoderme primitif (Epr). Cependant, nos données
montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité
de différenciation multi-lignages quand celle-ci est induite par la formation de tératomes.
Enfin, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait
l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui
inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes
qui l’induisent. Nos données indiquent qu’Unr agit en aval du facteur de transcription
Nanog qui inhibe in vitro la différenciation des cellules ES en Epr. Nous avons par la
suite identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée
de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une
autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr.
Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement ou indirectement déstabiliser les
ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en
endoderme primitif.
50
Article
The RNA-binding protein Unr stabilizes pluripotent state of mouse embryonic stem cells
by preventing differentiation toward the primitive endoderm lineage.
Habiba Elatmani1, Virginie Dormoy-Raclet2, Nathalie Dugot-Senant1, François Dautry3
and Hélène Jacquemin-Sablon*1
INSERM U889, Bordeaux, France; Université Victor Segalen Bordeaux2, France; CNRS
UPR 1983, Institut André Lwoff, Villejuif, France;
Address: 1INSERM U889, Bordeaux, France; Université Bordeaux2, France2, Department of
Biochemistry, McGill University, Montreal, Canada3, CNRS UPR 1983, Institut André
Lwoff, Villejuif, France;
* Corresponding author [email protected]
51
Abstract
Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock
domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential
to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report
that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal
spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was
reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr
rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is
dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to
produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms
underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts
downstream of Nanog. Our data also show that Unr destabilizes Gata6 mRNAs in wild-type
ES cells. We propose that the repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a
post-transcriptional level contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state.
52
Introduction
unr (upstream of N-ras) was identified as a transcription unit located immediately
upstream of N-ras in the genome of several mammalian species1, 2. The Unr protein is a
member of the family of proteins that contain a conserved nucleic acid-binding domain
termed cold shock domain (CSD)3. All characterized members of the CSD protein family bind
DNA (Y-box factors) and/or RNA (bacterial cold shock proteins (CSPs), Y-box factors, Lin
28 and Unr, proteins with CSD are involved in transcriptional and post-transcriptional control
of gene expression. The unr gene has been identified in many vertebrates (birds, reptiles, fish
and mammals)4, and in Drosophila. The mammalian Unr proteins (mouse, rat and human) are
highly similar, sharing 99% amino acid identity (Homologene data). Conservation of Unr in
multiple species suggested an important role for this cytoplasmic RNA-binding protein
(RBP).
Unr is a cytoplasmic RNA binding protein which, in vitro, binds preferentially to
purine-rich motifs5, 6 and has been characterized as a post-transcriptional regulator of gene
expression. In mammals, Unr has been implicated in the destabilization of c-fos mRNA7, 8 and
activation of translation driven by the IRESs of several transcripts, including rhinovirus and
poliovirus9, 10, and the pro-apoptotic factor Apaf-111. These few known Unr targets suggested
the implication of Unr in the control of cell proliferation and death. In Drosophila, Unr is a
key component in the X chromosome dosage compensation process12, 13. Unr has a dual role,
promoting dosage compensation complex (DCC) assembly on the male X chromosome, and
repressing DCC formation in females12-14. In agreement with this dual role, Unr is essential
for viability and development of both males and females14.
To investigate the biological role of Unr, we disrupted the unr gene in mouse by gene
targeting. While adult heterozygous unr+/- mice are viable and fertile, homozygous disruption
of the unr gene leads to embryonic lethality at midgestation15. Unr therefore plays an essential
role during mouse development. We generated unr knock-out ES cells lines from E3.5
blastocysts issued from unr+/- heterozygous mice intercrosses. In a previous study, we
determined that Unr acts as a positive regulator of apoptosis in gamma-irradiated ES cells16.
In the course of this study, we noted the presence of morphologically differentiated cells in
unr-/- ES cell cultures in the presence of LIF. This prompted us to further characterise the role
of Unr in mouse ES.
We report here that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that
sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage.
This phenotype was observed in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr
depletion, and was partially suppressed upon re-expression of Unr. However, unr knockout
ES cells remained pluripotent, as shown by their capacity to produce differentiated teratomas.
We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES
to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show
that Unr destabilizes Gata6 mRNAs in wild-type ES cells. We propose that the repression by
Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level contributes to the
stabilization of ES cells pluripotent state. In summary, these results establish that Unr
participates in the maintenance of the ES cell pluripotent state, by preventing their
differentiation commitment to the primitive endoderm lineage.
53
Results
Unr-null ES cells undergo spontaneous differentiation to the primitive endoderm lineage
unr knockout ES cells cultures are composed of at least two cell populations based on
their morphology: undifferentiated ES colonies and a great proportion (20%-25%) of
refractive epithelial-like cells with cytoplasmic extensions which are reminiscent of primitive
endoderm (also named extraembryonic endoderm17. Furthermore, this differentiation
phenotype is maintained in long term ES cell culture in the presence of leukemia inhibitory
factor (LIF). In contrast wild type ES cells only form undifferentiated colonies (fig1A and
1B). Since, unr -/- ES cells continuously undergo spontaneous differentiation along passages,
we were unable to separate these two populations, thus all experiments were performed with
the entire Unr-deficient cell population.
In order to characterize this phenotype, we used reverse transcription with quantitative
polymerase chain reaction (qRT-PCR) to quantify the expression level of markers of the
primitive endoderm (PrE) lineage and visceral endoderm (VE) as well as markers of the
mesoderm, mesendoderm, ectoderm and trophectoderm lineages in two unr-/- ES cell clones
(named B and D) relative to one unr+/+. Both Unr-deficient ES cells clones exhibit a strong
induction (p<0,01) of PrE marker genes (Gata4,10-fold; Gata6, >50-fold; Dab2, 20-fold;
Sox7, 5-fold; CoupTF-1, >3-fold; FoxA2, >17-fold and PDFRα, >18-fold; 17) as compared to
wild type (fig1C left panel). The visceral endoderm marker gene Afp was not detected. These
genes are strongly expressed in XEN cells which are extraembryonic endoderm stem cells
isolated from blastocysts 17. The most induced transcripts in Unr-deficient cells were Gata6
which is a key inducer of ES cell differentiation to PrE18-20, Dab2 which is a Gata4 and Gata6
target gene21 required in vivo for proper positioning of PrE derivatives (parietal and visceral
endoderm;Yang, dev boil 2002) and PDGFRα which is in vivo early expressed in the nascent
PrE layer of the early blastocysts22. Most of the genes however that are expressed in the
primitive endoderm are also expressed in definitive endoderm. Goosecoid expression has
been used to establish the definitive endoderm identity of differentiated ES cells, and to
discriminate it from primitive endoderm23. Goosecoid transcripts were undetectable in both
wild type and unr knock out ES cells populations (fig1C right panel), indicating that unr
knockout ES cells did not differentiate into the definitive endoderm. The mesoderm markers
Brachyury, Gata2 and Flk1 appeared slightly up-regulated in unr-/- ES cell clones (p<0,01)
but to a much lesser extent (≤ 2-fold) as compared to the PrE marker (fig 1C, right panel). The
trophectoderm marker Eomes displayed a weak induction as well, but considering the
induction of other mesodermal genes, it might reflect its mesoderm related function 24. Taken
together these data strongly suggest that unr-/- ES cells undergo differentiation to primitive
endoderm lineage. Furthermore, both unr-/- ES cells clones (B and D) tested exhibited similar
phenotypes, allowing us to exclude an artifact of clonal deviation.
To ascertain if there were corresponding increase in expression of PrE proteins in unr
knockout ES cells, a co-immunofluorescent staining of Gata6 (nuclear, green) and Dab2
(cytoplasmic, red) was performed. The co-expression of the Dab2 and Gata6 proteins has
been previously used to assess the primitive endodermal identity18, 20. As expected, Dab2 and
Gata6 proteins were strongly expressed in the stellate ‘PrE-like’ cells present in the unr-/- cell
cultures (fig1E), whereas in both wild-type and unr knockout ES cells undifferentiated
colonies, Dab2 and Gata6 were either undetectable (Dab2) or barely detectable (Gata6, data
not shown). Similar expression patterns were observed after Gata4 and Dab2 coimmunostaining (data not shown).
ES cells differentiation results in loss of self-renewal capacity and is accompanied by a
decrease of proliferation rate25, 26. Because of the differentiation phenotype of unr knockout
ES cells, we examined whether their proliferation rate was affected. As illustrated in Fig. 1E,
54
unr-/- cells (clone D) displayed a slower proliferation rate as compared to the wild-type ES
cells at low cellular density. By day 6, there was a 30% reduction in the total cell number for
Unr-null ES cultures, (p<0,001). This difference in total cell number did not result from
apoptosis, since we previously showed that, in absence of stress, unr knockout ES cells did
not display increased apoptosis as compared to wild-type ES cells16.
Taken together, these results show that unr knockout ES cells spontaneously undergo
differentiation to primitive endoderm lineage in the presence of LIF. To avoid ambiguity in
the rest of the study, cells with a primitive endoderm-like morphology present in unr-/- ES cell
cultures will be referred as PrE-like cells, to discriminate them from undifferentiated
cells /colonies also present in the cultures.
Downregulation of Unr in E14Tg2A ES cells induces differentiation to the primitive
endoderm lineage
The unr+/+ and unr-/- ES cell lines used in this study were isolated from blastocysts
generated by intercrosses of unr+/- mice. Consequently, the genetic background of these cell
lines consisted mainly of C57/Bl6 strain. To exclude the possibility that the primitive
endoderm differentiation phenotype observed in unr knockout ES cells cultures was
dependent on the inactivation procedure and/or genetic background, we investigated the
consequences of stable Unr depletion in E14Tg2a ES cell line (129sv genetic background). A
lentivirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) delivery was used for long term silencing of
Unr. E14Tg2a ES cells were transduced with either plKO.1-shUnr (shRNA-E6) or control
plKO.1-shCtl lentiviruses, to generate E14shCtl and E14shUnr ES cell populations,
respectively. Transduced cells were selected in puromycin containing medium for 48h, as
described in material and methods. Unr depletion was quantified by qRT-PCR (Fig 2A) and
western blot (Fig 2B). We determined that E14shCtl ES cells exhibited a 70% reduction of
Unr transcript levels, and a ~ 60% reduction in Unr protein levels relative to control ES cells.
Differentiation was not initially apparent in E14shUnr ES cell cultures. After 8-9 days,
differentiated cells with a PrE-like morphology appeared, at however, a lower frequency than
in unr knockout cell cultures. Furthermore, E14shUnr ES cells maintained the ability to
differentiate toward PrE lineage along passages, in prolonged culture periods (4 weeks).
In contrast, E14shCtl ES cells only formed typical colonies with undifferentiated morphology
(Fig2C). At the molecular level, as expected, all PrE marker genes analyzed except coupTF-1
were strongly up-regulated in E14shUnr cells relative to E14shCtl cells, even though it was to
a lesser extent than in unr knockout ES cells (16- versus 50-fold for Gata6, compare Fig2D
with Fig 1C). Interestingly, there was a 5 fold increase in Gata6 mRNA levels in E14shUnr
ES cells as early as 5 days after viral transduction, at a time where the differentiation
phenotype was not yet evident. In contrast, there was only a weak induction (<2) of Flk1 and
Nodal (mesoderm and mesendoderm markers, respectively) in E14shUnr ES cells relative to
E14shCtl cells (Fig2D). Moreover, Goosecoid transcripts which were detectable in E14shCtl
cells, were not induced in E14shUnr ES cells. Thus, E14shUnr ES cells express a set of
markers of the primitive endoderm, but not of the definitive endoderm lineage. Collectively,
these results show that a stable 60% depletion of Unr in E14Tg2a ES cells is sufficient to
induce differentiation toward the PrE lineage. This induction is quantitatively less pronounced
in E14shUnr ES cells than in unr knockout ES cells (percentage of PrE-like cells and PrE
markers expression), probably because of the incomplete Unr extinction. These data therefore
show that unr inactivation in ES cells promotes differentiation toward the PrE lineage,
whatever the background of ES cells or the extinction strategy used. They suggest that Unr
acts in a dose-dependent manner to prevent PrE differentiation of ES cells.
55
Restoration of Unr expression in unr knockout ES cells limits their capacity to differentiate
into PrE
As described above Unr-deficient cells have enhanced ability to undergo differentiation
to PrE in LIF containing medium. To confirm that this phenotype is indeed a consequence of
unr targeted disruption, a rescue of unr-/- ES cells was performed. unr-/- ES cells (clone D)
were transduced with either MigR2-GFP (Dmg2 ES cells) or MigR2-GFP-FlagUnr (Dmg2Unr ES cells) retroviruses. Transduced ES cells were selected for GFP expression by FACS,
leading to the isolation of cell populations transduced at 92%. Western blot analysis revealed
that the expression of Unr protein is restored to approximately 35% the wild type level
(Fig.3A). Visual inspection of the cultures indicated that differentiated PrE-like cells still
appeared in Dmg2-Unr ES cells cultures, but to a lesser extent as compared to control Dmg2
ES cells (not shown). We then used qRT-PCR to quantify the expression of PrE markers in
transduced cell populations. A down-regulation of most of the tested PrE markers in Dmg2Unr cells relative to the control Dmg2 cells was obvious (Fig. 3B). The reduction in PrE
marker expression is in the range of 60%, reflecting an incomplete reversion at the molecular
level. Thus, in agreement with the visual observations, a partial reversion of the PrE
differentiation phenotype was observed in unr-/- ES cells re-expressing Unr. Although the
remaining 8% non-transduced cells in the cultures could contribute to the partial reversion,
the most plausible explanation relies on the lower Unr expression driven from the retroviral
construct as compared to the endogenous Unr expression. These results are consistent with
those presented above, suggesting that Unr acts in a dose dependent manner to prevent
differentiation of ES cells to the PrE lineage.
Differentiation potential of unr-/- ES cells
Embryonic stem cells when aggregated as embryoid bodies (EBs) differentiate toward
the three germ layers and the primitive endoderm lineage. A primitive endoderm layer forms
on the EBs surface which further differentiates to visceral endoderm 27, 28. Since Unr-deficient
ES cells display the capacity to spontaneously differentiate to PrE, we hypothesized that the
induction of the primitive endoderm layer at the surface of unr-/- EBs could be accelerated
and/or more efficient as compared to wild-type EBs. unr-/- and unr+/+ ES cells were
aggregated as hanging drops, and after 2 days, the collected EBs were then cultured for 2, 6 or
10 days in differentiation medium. unr-/- ES cells retained capacity to form EBs; however,
unr-/- EBs exhibited an irregular surface forming protrusions, strikingly different from the
round shape of wild type EBs (Fig4A). This was suggestive of a defect in organization of the
endodermal outer layer, possibly resulting from an accelerated differentiation of the PrE layer.
To confirm this observation, we measured by qRT-PCR the expression of a set of PrE
endoderm markers at different time-points of EBs culture. Strikingly, the differential
expression of the PrE genes between unr+/+ and unr-/- cells still increased in the course of EB
culture. As shown in Figure 4B, all the tested endoderm genes showed a higher induction in
unr-/- than in unr+/+ EBs, between days 4 and 12 (Gata6, Dab2, PDGRFα and Sox7), and
between days 8 and 12 (FoxA2 and the VE gene AFP). By day 12 of culture, the levels of
Gata6, Dab2, Sox7 and PDGFRα transcripts were 2-, 3- 5- and 4- fold higher, respectively, in
unr-/- than in unr+/+ EBs. A 2.5- and 4- fold up-regulation of FoxA2 and AFP transcripts was
also observed, with however a delay in induction (Fig.4B). The data indicate an accelerated
differentiation of the PrE layer on the EBs surface, in the absence of Unr.
The ability of unr-/- ES cells to differentiate toward the PrE lineage could result in a bias
of differentiation toward the three germ derivatives. To study their differentiation potential in
vivo, we generated teratomas by subcutaneously injecting unr knockout and wild- type ES
cells into immunodeficient mice. Both ES cell types formed teratomas within one month, in
all injected mice. Differentiation profiles of the teratomas were assessed by histological
56
examination (Fig. 4C). Both wild-type and unr knockout ES cells produced teratomas
containing tissues representative of the three germ layers, with cells of ectodermal lineage
(neuronal structures), mesodermal lineage (muscles, bones) and endodermal lineage
(epithelia).
These data establish that the absence of Unr does not impair the multi-lineage
differentiation potential of ES cells. They are consistent with the ability of unr-/- mouse
embryos to develop up to the gastrulation stage.
Oct4 expression in ES cells remains unchanged in the absence of Unr
Having demonstrated that Unr is important to prevent differentiation toward the PrE
lineage of ES cells, we attempted to investigate the underlying mechanism. The most
plausible mechanism, based on the known Unr functions, is the post-transcriptional regulation
of one or several key genes that repress or induce commitment of ES cells to the PrE lineage
(Fig. 5A). Unr could either negatively regulate expression of key genes that promote PrE
differentiation (Oct4, Gata4, Gata6) or positively regulates expression of genes that repress
PrE differentiation (Nanog). Since unr-/- cell population comprise two cell types,
undifferentiated and PrE-like differentiated cells, gene expression measurements were
performed first on the whole cell population, using qRT-PCR and immunoblotting, and
second, in individual cells, using immunofluorescence analysis.
We first examined whether Unr regulates Oct4 expression. Oct4 is a transcription factor
essential for pluripotency of ES cells. During development, the Oct4 gene is transiently upregulated in the nascent primitive endoderm of the late blastocyste, at an even higher level
than in pluripotent cells, prior to extinction29. The regulation of Oct4 expression level in ES
cells is critical, since a >2 fold increase in Oct4 protein induced differentiation of ES cells
into extra-embryonic endoderm (Niwa genes and dev 2000). As measured by qRT-PCR, there
was a weak induction (less than 1,5 fold) of Oct4 transcripts in the two unr-/- ES cells clones
B and D, as compared to unr+/+ cells (fig5B). However, immunoblotting indicated that there
was no significant induction (p<0,01) of the Oct4 protein in the unr-/- clones B and D (fig5C).
Finally, immunofluorescent staining analysis revealed that, in unr-/- cultures, both
undifferentiated colonies and differentiated PrE-like cells expressed Oct4, with, as expected, a
weaker staining of differentiated cells (Gata6+ , Fig. 5D). The remaining Oct4 protein
expression in PrE-like unr-/- cells suggests that these cells are not fully differentiated Gata6
positive/Oct4 negative cells, but rather are early committed to the PrE lineage.
Unr acts downstream of Nanog
We then examined whether Unr regulates Nanog expression. In the early blastocyst
(E3.5), the segregation of the two lineages of the inner cell mass (ICM) is achieved by
mutually exclusive expression of Nanog and Gata6 transcription factors in a salt and pepper
pattern, which determinates primitive endodermal and epiblastic cell fate, respectively at the
late blastocyst stage (E3,5) prior to implantation22, 30. In a transient state, some ICM cells that
are Nanog+ and Gata6+ are detected, prior to the salt and pepper segregation. In ES cells, the
homeoprotein Nanog was shown to stabilize the pluripotent state, and invalidation the nanog
gene in ES cells results in differentiation toward the primitive endoderm lineage 31, 32.
By qRT-PCR, we determined that the Nanog transcript levels did not differ between
unr+/+ and unr-/- (clones B and D) ES cells (Fig.5E). Immunoblotting confirmed that,
globally, Nanog protein levels were not altered in the two unr-/- clones B and D (Fig 5F). This
was unexpected, since, at least the PrE-like cells, in unr-/- cultures should exhibit down57
regulation of Nanog. We then examined Nanog expression in cellulo, using
immunofluorescence staining. In both wild type and unr-/- ES cells colonies, a similar nuclear
and heterogeneous Nanog staining was observed (Fig. 5G). This is consistent with previously
reported heterogeneous Nanog expression in ES cells31, 33. Interestingly, PrE-like unr-/- cells
were found to express both Nanog and Gata6, the staining however for Nanog appearing
cytoplasmic and diffuse (Fig. 5H). The Nanog cytoplasmic localization was surprising, having
never been reported, and thus being specific of the unr knockout cells. This cytoplasmic
localization was not an artefact since in undifferentiated colonies, a normal nuclear
localization was observed (Fig. 5G). These results showing that the Nanog transcripts and
protein levels in unr-/- ES cell populations are unchanged, indicate that Nanog mRNAs are not
direct Unr-targets. Furthermore, co-expression of Gata6 and Nanog suggest that PrE-like unr/are early committed. Together, these data impliy that downregulation of Nanog expression
is not a prerequisite for primitive endoderm differentiation engagement of unr-/- ES cells.
Gata6 mRNA are stabilised in unr-/- ES cells.
unr-/- ES cell population expresses high levels of Gata4 and Gata6 transcripts (Fig.1C).
Previous studies have demonstrated that forced expression of Gata6 or Gata4 in ES cells is
sufficient to induce their differentiation into extra-embryonic endoderm lineage, 19 and that
Gata6 and Gata4 invalidation prevents the formation of a PrE layer at the surface of EBs18, 21.
A direct Unr-mediated repression of Gata6 and/or Gata4 expression in ES cells should prevent
their differentiation toward PrE (see Fig. 5), and, consequently, unr invalidation should
induce differentiation into PrE.
We focused our study on Gata6 which has been shown to be an upstream regulator of
Gata421 and Gata6 mRNAs are more than 50 fold induced in unr-/- cell cultures (Fig.1C).
Gata6 immunostaining were used for each immunoflurecence experiments cited above to
detect unr-/- PrE-like cells. We found that Gata6 was hardly detectable in unr+/+ cells, as well
as in the unr-/- cells undifferentiated colonies (Fig.5G). In contrast, a strong nuclear staining
was observed in PrE-like unr-/-cells (Fig.5D,5H). However, it has been suggested that a weak
induction of Gata6 expression in ES cells may result in their differentiation into PrE, because
of Gata6 ability to autoactivate it own promoter19.
Thus we considered the possibility of a post-transcriptional regulation of Gata6
expression by Unr in ES cells. Mouse Gata6 mRNA contain a long (1153 nucleotides)
3’untranslated region (3’ UTR), that could mediate control of Gata6 mRNA turnover and / or
translation. Moreover, the inspection of Gata6 mRNA 3’ UTR revealed the presence of two
purine-rich motifs, located at positions + 2869-2886 and 2978-2987 of the mouse Gata6
cDNA sequence. These potential Unr-binding motifs6 suggest that Unr could directly regulate
Gata6 mRNA stability through its interaction with these motifs. In order to determine the
half-life of Gata6 mRNA, we performed actinomycin D chase experiments in unr+/+ and unr-/ES cells. Cells were treated with actinomycin D as described in the legend of Fig.6, and total
RNA were isolated at various time intervals and analysed for Gata6 mRNA levels by using
qRT-PCR. As shown in Fig.6, the Gata6 half-lives in unr+/+ and unr-/- ES cells were
approximately 124 min. and 154 min., respectively. Of note, in another ES cell line (MC1), a
recent study estimated the Gata6 mRNA half-life at 114min, a value close to our estimation in
wild type ES cells 34. Since unr-/- ES cultures are mixed (undifferentiated and PrE-like cells),
the increased Gata6 mRNA half-life could simply be a consequence, and not a cause, of their
differentiation engagement. However, the following observation do not support this
hypothesis: In E14-shUnr ES cells, 6 days after lentiviral transduction, at a time where Unr
expression was down-regulated by 70%, and before the appearance of morphologically
differentiated cells in the cultures, a 5- fold induction in Gata6 transcript levels relative to
58
E14-shcontrol cells occurred (not shown). It is thus likely that stabilization of Gata6 mRNAs
occured in unr-/- ES cells prior to the acquisition of the stellate differentiated morphology.
Finally, Gata6 mRNAs appear as potential direct targets of Unr.
These results show that Gata6 mRNA stability depends on Unr expression in ES cells.
They also uncover an unanticipated level of control of Gata6 expression, through the control
of Gata6 mRNA turnover. It could be possible that Unr prevents ES cell differentiation
toward the primitive endoderm lineage through direct or indirect negative regulation of Gata6
mRNA stability.
59
Discussion
In the present study, we demonstrate that unr-knockout ES cells spontaneously
differentiate into primitive endoderm. These cells express, under culture conditions that allow
self-renewal, high levels of a set of PrE markers, including Gata4 and Gata6, which are
strongly up-regulated (20- to 50- fold) in unr-/- cells. The unr-/- cell cultures consist in two
morphologically distinct cell populations, with undifferentiated ES typical colonies and
refractive cells with stellate morphology, reminiscent of primitive endoderm cells. The coexpression in these cells of Gata6 and Dab2 confirmed that the differentiated cells arising in
unr-knockout ES cell cultures were of the primitive endoderm type. Moreover, during their in
vitro culture, unr-/- EBs exhibited a marked accelerated differentiation into PrE, as compared
to wild-type EBs.
ES cell differentiation results in loss of selfrenewal and decreased proliferation rate25, 26,
35
. Our results show that the proliferation rate of unr-/- ES is only slightly affected. A
reduction in the total cell number is observed at the later times, and it likely that the slower
growth rate of unr knockout cells is a secondary effect of the higher proportion of
differentiated cells in the cultures. Indeed, in a previous study, we did not detect cell-cycle
alterations in unr-/- ES cells, at early time (24h) after seeding cells16.
The role of Unr in preventing PrE differentiation is not restricted to a genetic background
since shRNA-mediated Unr depletion in ES E14Tg2a ES cells line also triggered
differentiation into PrE. Moreover, this shRNA approach suggests a dose-effect of Unr, a
~60% reduction in Unr expression being sufficient to induce differentiation into PrE, with
however a lower efficiency. Rescue experiments in which Unr expression was partially
restored in unr-/- ES cells also support the dose-dependent effect of Unr, since the proportion
of differentiated cells and the expression of PrE markers were reduced, but not abolished, in
the Unr-transduced ES cells population.
After injection in nude mice, unr-/- ES cells induce the formation of teratoma that
contained tissues of ectodermal, endodermal and mesodermal origin. These findings indicate
that Unr is not required for the maintenance of pluripotency, and are consistent with the early
development of unr-/- embryos, which survive until mid-gestation15.
How does Unr act to prevent differentiation of ES cells to PrE? The most plausible
mechanism, based on the known Unr functions, is the post-transcriptional regulation of one or
several key genes involved in differentiation of ES cells to PrE. In vitro, Nanog depletion in
ES cells, or forced expression of Gata4 or Gata6 induces differentiation of ES cells into
PrE19, 20, 31, 32. A limited increase in Oct4 is sufficient to induce PrE differentiation36. Oct4,
Nanog and Gata6/Gata4 were therefore potential Unr-target candidates. Oct4 was eliminated
as an Unr target, since its expression was not significantly modified in unr-/-. It was also
unlikely that Unr functions upstream of Nanog. Indeed, loss-of-function phenotypes in ES
cells are quite similar, but inactivation of Nanog results in massive ES cells differentiation to
primitive endoderm31, 32, and Nanog deficient ES cells still form undifferentiated colonies but
are difficult to maintain in culture 31. Consistent with these data, we did not highlight
modifications in global Nanog expression, either at the RNA (qRT-PCR), or protein (western
blot) level, in unr-/- ES cells. Very interestingly, in the PrE-like cells present in the unr-/- ES
cell cultures Nanog expression was not nuclear, but cytoplasmic. A cytoplasmic localization
of Nanog has never been described and likely represents a non functional form of this
transcription factor. Whether the cytoplasmic localization of Nanog reflects the early
differentiation engagement of unr-/- ES cells toward PrE, or is specific to the unr-/- PrE-like
cells remains to be determined. A previous report showed that following SOCS-3 invalidation,
ES cells committed to PrE without Nanog downregulation as a prerequisite, however costaining of PrE-like cells with Nanog and Gata6 antibodies were not performed37. In vivo
60
Gata6 and Nanog are expressed in a salt and pepper pattern during epiblast and primitive
endoderm specification. Thus, an attractive hypothesis is that the unr-/- PrE-like cells, which
are Gata6 positive (and with a nuclear localization) and express Nanog in the cytoplasm
represent an intermediate step in the PrE differentiation process, which is consistent with Oct4
protein expression in those cells. It could possibly reflect mechanisms achieving mutually
exclusive expression of Nanog and Gata6 during ES cells differentiation into PrE. Noticeably,
a recent study indicated that, during ES cells differentiation, the activity of the pluripotency
gene Sox2 is negatively regulated by its cytoplasmic localization. Export from the nucleus
requires acetylation of a lysine residue in the nuclear export signal of Sox2, which is then
subjected to ubiquitination and proteasomal degradation38. In conclusion, it is possible that the
Nanog cytoplasmic localization is not a cause, but reflects the early PrE differentiation
engagement of unr knockout ES cells.
We finally asked whether Gata4 and Gata6, which are highly induced in unr-/- ES cells
and in the course of unr-/- EBs culture, are direct Unr targets. We focused our investigations
on Gata6 which is strongly induced in unr-deficient cell cultures and has been shown to be
an upstream regulator of Gata421. Two lines of evidence indicate that Gata-6 mRNAs are Unrtarget candidates. First, an up-regulation of Gata6 mRNAs was detected in Unr-depleted
E14tg2a ES cells prior to the appearance of differentiated PrE-like cells in the cultures, which
indicates that Gata6 induction is not a consequence of differentiation. Second, the presence of
two potential Unr-binding motifs located within the 3’ UTR of mice Gata6 mRNAs suggested
that Unr could directly regulate Gata6 mRNA stability through its interaction with these
motifs. Subsequently, we determined that Gata6 mRNAs half-life is increased in unr-/- ES
cells (~ 25%). Although this effect is not impressive, it could be sufficient to induce the Gata6
positive auto-regulatory loop, which play an essential role during Gata6-induced
differentiation of ES cells into extraembryonic endoderm cells19, 20. The kinetics of Gata6
expression during EBs culture suggest that the control of Gata6 mRNA stability is maintained
in the endoderm layer at the surface, and could contribute to the accelerated Gata6 induction
in unr-/- EBs. Further studies, such as reporter gene assays, co-immunoprecipitation and gelmobility shift assays, are required to determine whether Unr indeed binds to the consensus
sequences in the gata6 3’ UTR to regulate their expression.
Nevertheless, Unr-deficient ES cells cultures are mixed. Indeed, unr-/- ES cells keep their
selfrenewal ability, although they exhibit a pronounced tendency to undergo differentiation to
the PrE lineage. How to explain this phenotype? If Gata6 induction in unr-/-ES cells is
determinant for their PrE differentiation engagement, it seems to be no sufficient to trigger the
differentiation of the entire Unr-deficient ES cells population. An attractive hypothesis raised
by recent reports is that ES cells exhibit a high degree of heterogeneity, reflected in the
fluctuating expression of the pluripotent genes Nanog, Stella or Rex131, 39, 40. An elegant study
has linked this heterogeneity of Nanog with the propensity of ES cells to differentiate. The
authors found that two cell populations are in a dynamic equilibrium in ES cells cultures, one,
stable, with high expression of Nanog (HN), and another with low levels of Nanog (LN),
which is highly unstable and prone to differentiate31, 41. Moreover, in the LN state, ES cells
exhibit an upregulation of Gata6 transcripts31, 33, 41. According to this heterogeneity of ES
cells, we postulate that either the LN state render unr-/- ES cells prone to differentiate into
PrE. In this view, we propose a hypothetical model in which additional effect of Gata6
mRNA upregulation and stabilization during the LN state in unr-/- ES cells could induce
Gata6 expression to reach the threshold necessary to activate Gata6 positive auto-regulatory
loop and trigger differentiation to PrE (fig7).
The trio Sox2, Oct4, and Nanog constitute the core of the gene regulatory network
(GRN) that maintains the pluripotent state of ES cells and generates flexibility to allow
differentiation in response to external cues26, 31, 33, 42-47. There is emerging evidence that posttranscriptional regulations of gene expression control ES cells self-renewal and
61
differentiation. The requirement of micro-RNAs in maintenance of the pluripotent state was
initially demonstrated by genetic studies. ES cells with deletions in members of the microRNA processing machinery such as Dicer and DGCR8 exhibit reduced proliferation and show
defective differentiation48-50. Significant progress has been made in elucidating the
mechanisms of action of microRNAs in ES cells. A connection between Micro-RNAs and the
GNR has been established, since micro-RNA transcription is regulated by the trio Sox2, Oct4,
Nanog51.
Very few studies have reported a role of RNA-binding proteins regulating mRNA
turnover and translation, in the control ES cells self-renewal and differentiation. These studies
include the translation factor p97/DAP552, the mRNA destabilizing factor Brf1 (Zfp36L1) 53
and the nucleolin regulator Ly-154. Unr, as reported here, participates to the maintenance of
the ES cells pluripotent state by preventing their spontaneous differentiation toward the
primitive endoderm lineage.
62
Bibliography
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3.
4.
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Material and Methods
Embryonic stem cell culture
"The genetic background of the mouse unr+/+ (clone L) and unr-/- (clones B and D) ES cell
lines that we generated (Boussadia et al.) consisted of a mixture of C57/Bl6 and 129/Sv
strains". These cell lines as well as the E14Tg2A ES cell line (from ATCC) were cultured on
a monolayer of mitomycinC-inactivated mouse embryonic fibroblasts at 15.103 cell /cm2 in
ES medium composed of in Dulbecco’s modified Eagle culture medium/Glutamax,
supplemented with 15% heat-inactivated fetal calf serum (FCS, invitrogen), 150µM of
monothioglycerol (Sigma), 1X penicillin/streptomycin (invitrogen) and 1,000 U of leukaemia
inhibitory factor (LIF) per ml (Chemicon). ES cell were passaged every two days and the
medium was changed every day. In all experiments cells used were within three-fifteen
passages of initial thawing. All cultures were maintained at 37°C wtith 5% CO2.
For gene expression determinations (quantitative RT-PCR, immunoblotting), ES cells were
washed with phosphate-buffered saline (PBS), trypsinized, and depleted of feeders by
incubation for 1 hour in 100 mm gelatinized dishes. ES cells were then cultured for two days
on gelatine (0,2%) coated tissue culture dishes at 15.103 cell /cm2 before RNA or whole cell
lysate preparations.
Proliferation Assays
For quantitative proliferation assays at low density, 3.103 cells were seeded on 12-well
gelatine-coated tissue culture plates in triplicates and were cultured for 2,3,4,5 or 6 days in ES
cell medium (as describe above) which was daily changed. The number of cell per well was
counted every day with a cell coulter (Beckman Z2 Coulter).
Embryoid Body Formation Assay
Prior to aggregation ES cells were cultured on gelatinized culture dishes as described above
and one day before the medium was changed by Iscove modified Dubelcco’s Medium
(IMDM) supplemented with 15% heat-inactivated FCS, 1X penicillin/streptomycin and 1000
U/ml of LIF. At day 0, ES cells were trypsinized and aggregated in hanging drops (200 cells
per drop) on the lid of a non adherent culture dish to form EBs. After 2 days, EBs were
cultured in bacterial Petri dishes for ten additional days, in the same media without LIF.
Teratoma Formation
5.106 unr+/+ or unr-/- ES cells were injected (without feeders elimination) subcutaneously into
each flank of the recipient nude mice (Jackson Laboratory). The formed teratomas were
allowed to grow 3 to 5 weeks. Hematoxylin and eosin staining were performed on sections, in
accordance with institutional guidelines.
Retroviral infections and cell sorting.
The bicistronic, murine stem cell-virus-based retroviral vector MigR2, expressing enhanced
green fluorescent protein (eGFP) has been described previously (142). To generate MigR2FlagUnr retroviral vector, the murine unr cDNA was amplified by PCR from mES cell RNA
using the following primers: 5'-GAAGATCTTCCATGGACTACAAAGACGATGACG
ACAAGAGCTTTGATCCAAACCTTCTC-3' (sens, Flag epitope italicized, BglII site
underlined) and 5'-TCCGTTAACGGTTAGTCAATGACACCAGC3', (antisens, Hpa1 site
underlined). The resulting PCR product was digested with BglII and Hpa1 and ligated into the
same restriction sites of MigR2. The resulting Migr2-FlagUnr vector encoded full-length
murine Unr, fused to a N-terminal Flag tag. Cloning was confirmed by restriction digestions
and nucleotide sequencing.
For generation of retrovirus, 293T cells were transiently transfected by calcium
phosphate-mediated coprecipitation with 10µg of the packaging plasmid pCMVR8.2
plasmid , 5 µg of VSV-G envelope plasmid and 12 µg of either pMigR2 or pMigR2-FlagUnr
retroviral plasmids.. 24 hours later, viral supernatants were collected and concentrated by
66
ultracentrifugation. The stocks were produced and titered at the Vectorology Platform,
University Bordeaux2, France. Wild-type and unr-/- mouse ES cells were transduced at a
multiplicity of infection of 5 or 10 with MigR2 or MigR2-FlagUnr retroviral stocks.
ES cells for infection were washed, trypsinized, and depleted of feeders by incubation on
gelatinized plates as previously described (53). They were then seeded at a density of 2.5 x
104 cells per well in 24-well pre-gelatinized plates, in ES cells medium supplemented with
2µg/mL protamine sulphate (Sigma). Retroviral supernatants were immediately added, and
after 18 hours, infection medium was removed and replaced with ES medium. After one
passage on feeders, the eGFP-positive ES cells were sorted by flow cytometry using a
FACSAria cell sorter (BD Biosciences, San Jose, CA). Sorted cells were expanded on feeders
for 3 days before analysis.
Generation of mES cells with stable knockdown of Unr.
Four shRNA pLKO.1-based lentiviral vectors that contain stem-loop cassettes encoding
shRNAs targeting sequences of the murine unr mRNA (TRCN0000-181609 (shE4), -182514
(shE5), -198576 (shE6) and -181610 (shE7) and the pLKO.1 empty vector (RHS4080,
shcont) were purchased from Open Biosystems (Huntsville, AL). The pLKO.1 drives shRNA
expression from the U6 promoter, and carries a puromycin resistant gene allowing for
selection of infected cells. VSVG-pseudotyped lentiviral particles were produced by
cotransfection of 293T cells with the pLKO.1 lentiviral vectors and the packaging plasmids
pMD.G and pCMVDR48.91, using the same protocol as for Migr2 retrovirus production.
Transductions of ES cells were performed as described for Migr2 retroviral particles.
Selection for infected cells was initiated 24 hours after infection by addition of 2 µg/ml
puromycin (Sigma, P8833). Puromycin resistant cells were then expanded on feeders without
drug for 3 days before analysis.
Sequence targeted by shE6: GAAGAACGAATGAACGGACAA (+752-+772) target
sequence for
Immunofluorescence. Cells were fixed in 4% paraformaldehyde, washed with PBS, and
permeabilized with 0.5% Triton X-100 diluted in PBS during 5min and blocked for 1 hour in
blocking buffer containing 2% FCS and 2% BSA diluted in PBS. All antibodies were diluted
in blocking buffer. Primary antibodies used were anti-DAB2 (BD Transduction Laboratories,
1/200), anti-Gata4 (Santa Cruz, 1/100), anti-Gata6 (R&D Systems, 1/100), anti-Nanog
(Abcam, 1/50) and anti-Oct4 (Abcam, 1/300) and incubated for 2h at room temperature.
Secondary Alexa Fluor-conjugated antibodies (Invitrogen) were used at a dilution of 1/200
and incubated 1h at room temperature. DNA was visualized using DAPI (0.5 µg/ml).
Quantitative Polymerase Chain reaction
Total RNA was prepared from ES cells and embryoid bodies using the Qiagen RNeasy midi
kit (Qiagen, Santa Clarita, CA). Two micrograms of RNA were reverse transcribed with
oligo-dt using the Superscriptase III Revere transcription kit according to the manufacturer
protocol. 100 nanogramms of cDNA were used to measure gene expression by Quantitative
Polymerase Chain Reaction. Reaction were performed in 25µl reactional volume containing
2µM of sens and anti-sens primers and 12,5µl of Quanta SYBR Green supermix. Annealing
was performed at 60°C. Reactions were performed during 40cycles.
67
Legends
Figure 1: unr-/- ES cells undergo spontaneous differentiation towards primitive
endoderm lineage. (A), Phase-contrast images of unr+/+ and unr-/- ES cells, showing
morphological differentiation of unr-/- ES grown in ES cell media containing LIF. Arrow and
arrow head indicate differentiated and non differentiated ES cells, respectively. Scale bar:
50µm. (B) Immunoblotting a showing loss of Unr protein in two unr-/- ES cells clones (B and
D); β Actin was used as loading control. (C) qRT-PCR analysis showing the consequences of
unr invalidation on the expression of lineage-specific markers: endoderm (Endo, left panel),
mesendoderm, mesoderm, ectoderm and trophectoderm (Mesendo., Meso., Ecto., and Troph.,
respectively, right panel). Transcript levels were measured in two unr-/- ES cell clones (B and
D) relative to unr+/+. All values were normalised to Gapdh and are represented as mean of 4
experiments. Error bars are standard deviation (sd). (D) Immunofluorescence of unr-/- ES
cells for the co-expression of Gata6 (green) and Dab2 (red), as indicated. DAPI was used to
stain nuclei. Images were acquired by confocal microscopy and representative field is shown.
(E) Proliferation rate of unr+/+ and unr-/- ES cells plated at low density. ES cells (≈ 3 x 103)
were seeded in 12-well gelatinized plates and cultured in ES cell media for the indicated
periods. Cells were counted every day after trypsinisation and the media was changed for the
remaining plates. For each time point, values are represented as mean of 3 experiments
performed in triplicates +/- sd.
Figure 2. Stable Unr depletion in E14Tg2a ES cells induces differentiation to primitive
endoderm lineage. (A) qRT-PCR analysis of Unr mRNA depletion in E14shUnr ES cells
relative to E14shCtl. Values were normalised to Gapdh (B) Immunoblot analysis showing
Unr protein downregulation in E14shUnr ES cells as compared to E14shCtl, β Actin was used
as loading control. (C) Phase-contrast images of E14Tg2a ES cells transduced with either
pLKO.1 (E14shCtl) or pLKO-shUnr (E14shUnr) lentiviruses coding respectively scramble
shRNA and shRNA directed against Unr mRNA. Scale bar represents 50µm. (D) qRT-PCR
analysis for markers of endoderm, mesendoderm, mesoderm, ectoderm and trophectoderm
lineages, in E14shUnr ES cells relative to E14shCtl. Values were normalised to Gapdh.
Figure 3. Restoration of Unr expression partially rescues the primitive endoderm
differentiation capacity of unr-/- ES cells. (A) Immunoblot analysis of Unr protein
expression in unr-/- ES cells transduced with either MigR2-GFP (Dmg2) or MigR2-GFPFlagUnr (Dmg2-Unr) retroviruses. β Actin was used as loading control. (B) qRT-PCR
analysis of endoderm markers expression in Dmg2-Unr ES cells relative to Dmg2. Values
were normalised to Gapdh and are represented as means of 3 experiments +/- sd. The
normalized expression levels of each gene in Dmg2 cells were taken as 1.
Figure 4. Differentiation potential of unr-/- ES cells in vitro and in vivo. (A) Phase- contrast
images of unr+/+ and unr-/- embryoid bodies (EBs) cultured for 12 days. Arrows indicate the
extra-embryonic endoderm layer formed on the EBs surface. x10 (upper panel) and x30
(lower panel) objectives were used. (B) qRT-PCR analysis of extra-embryonic endoderm
markers expression during unr+/+ and unr-/- EBs differentiation. EBs were cultured as
described above for the indicated periods. For each time point total RNA were prepared from
EBs and transcript levels were normalized to Gapdh. The normalized expression levels of
each gene were taken as 1 at day 0. Averages of three measurements are presented (C)
Hetatoxylin and eosin staining of teratomas generated from unr+/+ and unr-/- (clone B) ES
cells, 4 weeks after injection. Differentiated tissues of the three germ layers are indicated:
endoderm (En), mesoderm (Me) and ectoderm (Ec).
68
Figure 5. unr -/- ES cells do not downregulate Oct4 and Nanog expression. (A) Potential
Unr target genes, involved in the control of ES cells differentiation into PrE (B) qRT-PCR
analysis of Oct4 mRNA expression level in unr-/- ES (B and D clones) cells relative to unr+/+
by quantitative Each values were normalized to Gapdh and are represented as means of four
experiments +/- sd. (C) Immunoblot blot showing representative Oct4 protein expression level
in unr+/+ and unr-/- (clone B and D) ES cells; β Actin was used as loading control.
(D) Immunofluorescence analysis for the co-expression of Oct4 and Gata6 , in unr-/- PrE-like
cells and in undifferentiated unr-/- colonies. DAPI was used to stain nuclei. (E) qRT-PCR
analysis of Nanog mRNA expression level in unr-/- ES (B and D clones) cells relative to
unr+/+ by quantitative Each values were normalized to Gapdh and are represented as means of
four experiments +/- sd. (F) Immunoblot blot showing representative Nanog protein
expression level in unr+/+ and unr-/- (clone B and D) ES cells; β Actin was used as loading
control (G) Immunofluorescence analysis for the co-expression of Nanog (red) and Gata6
(green), in unr+/+ (top row) and unr-/- (bottom row) ES cell colonies. DAPI was used to stain
nuclei. (H) Immunofluorescence analysis for the co-expression of Nanog and Gata6 , in PrElike unr-/- ES cells. DAPI was used to stain nuclei. Images were acquired by confocal
microscopy and representative fields are shown (F and G).
Figure 6. unr -/- ES cells exhibit increased Gata6 mRNA stability. Time course analysis of
Gata6 mRNA degradation in unr+/+ and unr-/- ES cells. Cells were treated with actinomycin D
(5µg/ml), and at the indicated times total was prepared. Gata6 (left) and Gapdh (right) mRNA
levels were quantified by qRT-PCR. The values shown a representative experiment.
Figure 7. Model for the prevention by Unr of ES cells differentiation toward PrE.
69
Figures
Figure 1
70
Figure 2
71
Figure 3
72
Figure 4
73
Figure 5
74
Figure 6
Figure7
75
Discussion
L’objectif de cette thèse était de mieux comprendre le rôle biologique de la protéine Unr
au cours du développement de la souris. Notre première approche a été d’utiliser les outils
dont nous disposions, les cellules souches embryonnaires sauvages et nulles pour unr.
Au cours de ce travail nous avons fait une observation importante: en présence de LIF les
cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément en cellules stellaires et réfractives
qui ressemblent à des cellules d’endoderme primitif (fig1A). Dans la mesure où des cellules
ES unr-/- différencient en permanence, nous n’avons pas pu séparer ces deux populations,
l’ensemble de ce travail a donc été réalisé sur une population mixte.
Dans un premier temps, il était nécessaire d’identifier vers quel lignage cellulaire les
cellules ES s’engagent en différenciation en absence d’Unr. La mesure par RT-PCR
quantitative de l’expression de gènes marqueurs de tous les lignages embryonnaires
(endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) et extraembryonnaires (endoderme primitif et
trophectoderme) suggérait que les cellules ES unr-/- différencient en endoderme primitif (Epr,
fig1B,C). Les résultats d’immunofluorescence ont confirmé que les cellules unr-/- stellaires et
réfractives expriment les protéines Gata6 et Dab2 qui sont des marqueurs de l’Epr (fig1D).
Ces résultats ci-dessus ont été observés dans deux clones indépendants de cellules ES unr-/- (B
et D, données d’immunofluorescence non montrées pour le clone B), ce qui a permis
d’exclure l’hypothèse d’une déviation clonale. Pour confirmer la différenciation de cellules
ES nulles pour unr, nous nous sommes intéressés à la prolifération des cellules dans ces
cultures. En effet, les cellules ES ont un temps de doublement rapide d’environ 12h qui est dû
à leur cycle cellulaire atypique dont la phase G1 est particulièrement courte. Quand elles
différencient, leur temps de doublement augmente du fait de l’acquisition d’un cycle cellulaire
classique qui s’accompagne d’un allongement de la phase G1(143). D’après ces éléments la
différenciation de cellules ES nulles pour unr devrait s’accompagner d’une réduction
mesurable du nombre totale de cellules dans ces cultures. Au bout de six jours de culture à
densité clonale, nous observons effectivement une réduction de 30% environ du nombre total
de cellules unr-/- par rapport aux cultures de cellules sauvages (fig1E). Une étude précédente
réalisée par notre équipe a montré que l’absence d’Unr dans les cellules ES n’induit pas
d’apoptose, ni de modification du cycle cellulaire au bout de 24h de culture (66). Néanmoins,
nous ne pouvons pas exclure que cette différence de prolifération soit dû a l’ensemencement
de cellules différenciées (qui prolifèrent plus lentement que les cellules ES) au début de ces
expériences. Cependant, celles-ci ont été réalisées à densité clonale et les cellules
différenciées sont minoritaires dans les cultures de cellules nulles pour unr, cette hypothèse
est de ce fait peu probable. Il semble donc que cette réduction du nombre de cellules unr-/soit due à l’accumulation au cours du temps de cellules différenciées dans ces cultures.
L’ensemble des résultats ci-dessus indiquent que les cellules ES unr-/- (fond génétique
majoritairement C57BL6) différencient en endoderme primitif.
Ensuite, nous avons montré que la déplétion stable d’Unr à hauteur de 60% dans une
autre lignée de cellules ES (E14-Tg2A, fond génétique 129sv) est suffisante pour reproduire
ce phénotype, bien qu’il soit moins prononcé probablement à cause de l’extinction incomplète
d’unr (fig2). La reproductibilité de ce phénotype dans deux lignées de cellules ES de fonds
génétiques différents suggère qu’Unr inhibe la différenciation des cellules ES en Epr. Pour
confirmer cette hypothèse, nous avons tenté de restaurer l’expression d’Unr dans les cellules
ES unr-/- (clone D). Nos données montrent qu’une restauration partielle (environ 30%) de
l’expression d’Unr limite fortement la différenciation en Epr (fig.3). Pour les expériences de
restauration, le vecteur retroviral MigR2 a été choisi dans la mesure où celui-ci avait déjà été
utilisé dans une étude précédente(142) sur les cellules ES et qu’il a été mis à notre disposition
76
par l’équipe de Françoise Sainteny (INSERM 790, Villejuif). L’utilisation de ce vecteur s’est
révélé être une erreur puisqu’il ne permet qu’une restauration partielle de l’expression d’Unr.
Cependant, il a tout de même permis d’éviter une situation de surexpression d’Unr dont l’effet
inconnu (puisque cette étude n’a jamais été réalisée) aurait pu entrainer des difficultés dans
l’interprétation des résultats. Les données ci-dessus montrent qu’Unr inhibe la différenciation
spontanée des cellules ES en Epr. De plus, elles suggèrent qu’Unr agit de manière dosedépendante.
Il semble qu’Unr puisse aussi réguler négativement la différenciation des cellules ES en Epr
quand celle-ci est induite par la formation de corps embryoïdes, ce qu’illustre l’accélération
de l’induction des gènes marqueurs de l’Epr au cours du temps dans les corps embryoïdes
nuls pour unr (fig.4).
Concernant la pluripotence des cellules ES unr-/-, l’étude des tératomes montre qu’en
absence d’Unr, les cellules ES maintiennent leur capacité de différenciation multi-lignage
(fig.4). Les cellules ES Unr-nulles sont donc considérées pluripotentes.
Cette première partie de ce travail montre que la protéine Unr n’est pas essentielle à la
pluripotence des cellules ES. Cependant, Unr stabilise l’état pluripotent (prolifératif et non
différencié) des cellules ES en inhibant leur différenciation spontanée en Epr.
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action de la
protéine Unr. Celle-ci ayant décrite comme un régulateur de la stabilité et de la traduction
d’ARNms cibles, nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait réguler positivement ou
négativement l’expression de gènes décrits dans la littérature comme inhibiteurs ou inducteurs
de la différenciation des cellules ES en Epr respectivement. Nos résultats indiquent qu’Unr
agit en aval de Nanog (fig.5), qui est connu pour inhiber in vitro la différenciation des cellules
ES en Epr(77, 117), ce qui est cohérent avec le fait que les cellules ES unr-/- ne différencient
pas massivement en Epr, contrairement aux cellules ES nulles pour nanog qui sont de ce fait
difficiles à maintenir en culture (77, 117). Néanmoins, par western-blot (fig5F) nous nous
attendions à observer une diminution même modérée de l’expression de Nanog qui reflète son
extinction dans les cellules unr-/- différenciées (voir section II)2) de l'introduction). Les
expériences d’immunofluorescence ont montré que les cellules unr-/- qui expriment fortement
Gata6 et qui sont stellaires et réfractives expriment toujours Nanog bien que sa localisation
soit cytoplasmique (fig5H). Nous avons suggérer que cette situation inattendue pourrait
refléter un des mécanismes permettant in vitro d’établir l’expression mutuellement exclusive
de Nanog et Gata6 au cours de la différenciation des cellules ES en Epr (voir introduction
section II)2). Serait-il possible qu’Unr inhibe la différenciation des cellules ES en Epr en
favorisant la localisation nucléaire de Nanog? Si c’était le cas, nous nous attendrions à
observer une localisation cytoplasmique de Nanog dans toutes les cellules nulles pour unr
(différenciées et non différenciées) qui aurait pour conséquence une différenciation massive
des cellules ES unr-/- en Epr. Cependant la localisation de Nanog est nucléaire dans les
colonies de cellules ES unr-/- (fig5G). De plus, les cellules différenciées sont minoritaires en
culture (environ 25%). Cette hypothèse semble donc peu probable. La localisation
cytoplasmique de Nanog serait plutôt une conséquence de l’engagement en différenciation des
cellules ES unr-/-. Cette observation n’a pas été décrite dans la littérature, cependant nos
expériences ont été réalisées au bout de deux jours de culture (western blot et
immunofluorescence, voir matériels et méthodes) alors que dans la littérature elles ont été le
plus souvent réalisées après 5/6 jours de culture(118, 119). Il est probable que de ce fait nous
ayons observé une étape intermédiaire dans le processus de différenciation des cellules ES en
Epr qui n’ai pas été décrite précédemment.
77
L’expression ectopique du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES, induit leur
différenciation en Epr(118, 119). Il a été suggéré du fait des propriétés d’autorégulation
positive de Gata6, qu’une faible augmentation de son expression au-delà d’un certain seuil
pourrait suffire à induire la différenciation des cellules ES en Epr. Nous avons identifié deux
sites potentiels de fixation d’Unr dans la région 3’NT des ARNms Gata6. De plus, nos
résultats montrent que la demi-vie des ARNms Gata6 est augmentée de 25% dans les cellules
unr-/-. La protéine Unr pourrait inhiber la différenciation des cellules ES en Epr en
déstabilisant les ARNms Gata6. Bien que cette augmentation de la demi-vie des ARNms
Gata6 soit faible, elle cohérente attendu que les cellules différenciées sont minoritaires dans
les cultures de cellules unr-/-. Si, cette augmentation avait été importante, nous nous
attendrions à observer une différenciation massive des cellules
ES unr-/- en Epr.
-/Cependant, les cultures de cellules ES unr contiennent ~25% de cellules différenciées, ce
qui suggère qu’une sous-population s’engage préférentiellement en différenciation. Donc, si
Unr agit en déstabilisant les ARNms Gata6, il semble qu’en son absence l’expression de
Gata6 n’atteigne le seuil nécessaire pour induire la différenciation que dans une sous
population de cellule ES.
Il se trouve que Nanog inhibe la différenciation en Epr en réprimant l’expression de
Gata6 dans les cellules ES(120). Cependant, l’expression de Nanog fluctue constitutivement
entre un état où il est fortement exprimé et un état ou il est faiblement exprimé(117, 121).
Quand le niveau d’expression de Nanog est faible, l’expression de Gata6 augmente mais n’est
pas suffisante pour induire la différenciation des cellules ES(117). Nous avons donc proposé
un modèle selon lequel en absence d’Unr, les ARNms Gata6 seraient plus stables et le niveau
d’expression de Gata6 atteindrait le seuil suffisant pour induire la différenciation en Epr
quand le niveau d’expression de Nanog est faible. En d’autres termes, les cellules ES unr-/s’engageraient préférentiellement en différenciation lorsque le niveau d’expression de Nanog
est faible (fig7). Bien sûr il ne s’agit là que d’un modèle, il permet cependant d’expliquer
pourquoi une partie seulement de la population de cellules ES unr-/- différencie en endoderme
primitif et un certain nombre d’expériences doit être réalisé pour démontrer la validité de ce
modèle (décrites dans les perspectives).
Quels sont les autres mécanismes d’action d’Unr possibles? Unr pourrait déstabiliser
indirectement les ARNms Gata6 en régulant positivement ou négativement l’expression d’une
cible qui elle-même pourrait déstabiliser ou stabiliser les ARNms Gata6 respectivement.
Selon un même scénario Unr pourrait réguler directement ou indirectement la traduction des
ARNms Gata6. Au cours de notre étude nous avons privilégié Gata6 comme cible potentielle
d’Unr au lieu de Gata4 dans la mesure où les ARNms Gata6 sont plus fortement induits
(environ 50 fois) que les ARNms Gata4 (environ 10 fois) en absence d’Unr (fig1C).
Cependant, nous pouvons aussi envisager Gata4 comme cible possible d’Unr bien que nous
n’ayons pas trouvé de motif potentiel de liaison d’Unr sur ces ARNms. Il serait possible
qu’Unr régule négativement la demi-vie ou la traduction des ARNms Gata4 directement ou
indirectement. Enfin, toujours selon un schéma similaire Unr pourrait agir en régulant
l’expression de cibles non décrites dans la littérature, pouvant induire ou inhiber la
différenciation des cellules ES en Epr.
Unr stabilise l’état pluripotent des cellules ES. Qu’en est-il de la régulation de son
expression dans les cellules ES ? Une étude récente a montré par ChIP que les facteurs de
transcription clés de la pluripotence Oct4, Sox2 et Nanog se lient au promoteur d’Unr dans les
cellules ES(132). Les promoteurs liés par ces trois protéines ont tendance à être
trancriptionnellement actifs. Le gène unr est donc une cible potentielle de ces trois facteurs de
transcription dans les cellules ES. Il serait intéressant d’éteindre l’expression de ces trois
facteurs de transcription dans les cellules ES et de voir si effectivement cela induit une
diminution de l’expression de la protéine Unr.
78
Que nous apprend cette étude sur le rôle d’Unr in vivo au cours du développement ?
L’expression mutuellement exclusive de Nanog et Gata6 dans les blastocystes
à E3,5 permet la spécification de l’épiblaste (Epi) et de l’endoderme primitif (Epr)
respectivement(83, 84). Les phénotypes induits par l’extinction de Nanog et l’induction de
Gata6 dans les cellules ES reflètent donc in vitro leur rôle respectifs in vivo. Notre étude
suggère qu’Unr pourrait inhiber la différenciation spontanée des cellules ES en Epr en
régulant négativement l’expression de Gata6. Selon cette hypothèse, il serait possible qu’in
vivo, Unr contribue à établir l’expression mutuellement exclusive de Gata6 et Nanog. Nos
données impliquent qu’Unr agit en aval de Nanog. In vivo, au début de la spécification de
l’épiblaste et de l’endoderme primitif à E 3,5, des cellules co-expriment Gata6 et Nanog avant
que leur expression mutuellement exclusive ne soit établie (84). Unr pourrait à ce stade
réguler négativement l’expression de Gata6 dans les cellules précurseurs de l’épiblaste.
Alternativement, Unr pourrait inhiber l’expression de Gata6 une fois que l’expression
mutuellement exclusive est établie pour la renforcer. Dans ce contexte, l’absence d’Unr au
stade blastocyste à E3,5 pourrait conduire à un biais dans la ségrégation de l’Epi et de l’Epr.
Les cellules de la masse cellulaire interne pourraient préférentiellement se spécifier en
endoderme primitif. L’épiblaste étant le tissu qui va former le futur fœtus, un tel biais
pourrait-il être responsable de la petite taille des embryons unr-/-?
Il serait intéressant
d’étudier de plus près les embryons unr-/- au stade blastocyste. Dans un premier temps, des
co-immunomarquages des protéines Nanog et Gata6 dans des blastocystes unr+/+ et unr-/permettraient de mettre en évidence un éventuel biais de ségrégation des lignages de la MCI.
Nous avons d’ailleurs la possibilité de réaliser cette étude en collaboration avec le Dr Claire
Chazaud (INSERM UMR384) dont les travaux sont à l’origine du modèle de ségrégation des
lignages de la MCI.
Notre travail suggère qu’Unr inhibe in vitro la différenciation des cellules ES en Epr de
manière dose dépendante. Serait-il possible que le seuil d’expression d’Unr nécessaire pour
inhiber la différenciation des cellules ES en Epr soit fixé à 50% du niveau d’expression des
cellules ES sauvages? Il serait intéressant d’étudier de plus près le phénotype des cellules ES
unr+/-. Ont-elles un phénotype intermédiaire ou normal? Les souris hétérozygotes pour la
mutation nulle du gène unr sont viables et fertiles. Si Unr joue un rôle dans la ségrégation des
lignages de la MCI in vivo, l’extinction de son expression de moitié ne semble pas avoir de
conséquences majeures au cours du développement de la souris.
A notre connaissance, cette étude est une des très rares qui montre qu’une protéine de
liaison à l’ARN, impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des
gènes, contribue au maintien de l’état pluripotent des cellules ES (en dehors des protéines
impliquées dans le métabolisme des microARNs). Nos résultats suggèrent qu’Unr pourrait
inhiber la différenciation des cellules ES en Epr en déstabilisant les ARNms Gata6
directement ou indirectement.
Ce travail de thèse nous a permis de mieux comprendre le rôle d’Unr dans les cellules ES.
Il suggère également un rôle possible pour Unr in vivo dans la ségrégation de l’épiblaste et de
l’endoderme primitif au stade blastocyste. Le modèle que représentent les cellules ES atteint
cependant sa limite. Pour mieux comprendre le rôle d’Unr au cours du développement de la
souris, il sera nécessaire de poursuivre l’étude du phénotype des embryons unr-/- et de
l’expression de la protéine Unr au cours du développement, ce que constitue la seconde
approche que nous avons commencé à mettre en place telle qu’elle est décrite dans les
objectifs de la thèse.
79
Perspectives
Dans notre étude, nous avons proposé un modèle selon lequel Unr pourrait inhiber la
différenciation spontanée des cellules ES en Epr en régulant négativement l’expression de
Gata6, et les cellules unr-/- pourraient préférentiellement s’engager en différenciation
quand l’expression de Nanog est faible.
Afin de confirmer le rôle de Gata6 dans ce modèle, il serait intéressant de montrer
que quand le niveau d’expression de Nanog est faible, Gata6 est plus fortement induit
dans les cellules ES unr-/- (non différenciées) que dans les cellules ES sauvages.
La cytométrie en flux apparaît alors être un outil de choix. En effet, elle permettra de
mesurer de manière quantitative des différences d’expression de protéines même
modérées tout en prenant en compte les caractéristiques morphologiques des cellules, afin
de distinguer les cellules non différenciées des cellules différenciées. En réalisant des comarquages des protéines Gata6 et Nanog, nous nous attendons dans la population de
cellules nulles pour unr à distinguer trois sous-populations : i) une population 1 de
cellules non différenciées exprimant fortement Nanog mais pas Gata6,
ii) une population 2 de cellules non différenciées exprimant faiblement Nanog avec une
induction modérée de Gata6, iii) une population 3 de cellules différenciées (stellaires)
exprimant faiblement Nanog et fortement Gata6. Pour les cellules ES sauvages, nous
nous attendons à observer les populations 1 et 2. Selon notre modèle, la population 2 de
cellules nulles pour unr devrait présenter une induction de Gata6 plus forte que la
population 2 de cellules ES sauvages.
Pour tester la capacité d’Unr à déstabiliser les ARNms Gata6 nous proposons de
montrer i) qu’Unr lie in vivo les ARNms Gata6 (co-immunoprécipitation protéine/ARN),
ii) la capacité d’Unr à réguler négativement l’expression du gène reporteur luciférase
fusionné à la région 3’-non traduite du gène gata6, mutée ou non sur les motifs potentiels
de fixation d’Unr. Après transfection des constructions dans les cellules ES unr+/+ et
unr-/-, l’activité de bioluminescence de la luciférase sera mesurée sur lysats totaux en
utilisant un luminometre. Parallèlement, l’expression des ARNms luciférase sera mesurée
par qRT-PCR. Enfin la demi-vie des ARNms reporteurs mutés ou non pourra être
mesurée dans les différentes conditions par chasse à l’actinomycine D.
Afin de déterminer si Unr lie directement les ARNms Gata6 sur les motifs potentiels
identifiés, des expériences de retard sur gel pourront être réalisées. Elles permettront de
montrer que la protéine Unr est capable de se lier directement à des sondes ARN
contenant les motifs potentiels de fixation d’Unr identifiés dans la région 3’NT des
ARNms Gata6.
Selon notre modèle, les cellules ES Unr-nulles s’engagent préférentiellement en
différenciation quand le niveau d’expression de Nanog est faible. Il a été montré que
l’utilisation d’inhibiteur de la protéine MEK1 induit une expression homogène de Nanog
dans les cellules ES(144). Selon notre modèle, l’inhibition de cette voie de signalisation
cellulaire dans les cellules ES unr-/- pourrait inhiber leur engagement en différenciation
vers le lignage endodermique primitif.
Notre étude a été réalisée en parallèle dans les cellules ES unr+/+ et unr-/-.
Nos données suggèrent qu’Unr inhibe la différenciation des cellules ES en Epr de façon
dose-dépendante. Nous possédons au laboratoire des cellules ES unr+/-. Une des suites de
ce travail sera d’étudier de plus près le phénotype de ces cellules.
80
Enfin, pour caractériser le potentiel développemental des cellules ES unr-/-, nous
avons prévu d’étudier in vivo la capacité des ces cellules à coloniser des embryons. Dans
ce but nous allons générer des lignées de cellules ES mutantes et sauvages qui expriment
de façon stable la GFP (transduction lentivirale). Ces cellules seront agrégées in vitro
avec des embryons sauvages au stade morula (32 cellules) qui n’expriment pas la GFP.
Ces embryons chimériques seront ensuite réimplantés dans des souris pseudogestantes.
Après 12 jours de gestation, les embryons chimériques seront récupérés et la colonisation
de l’embryon par les cellules ES différenciées sera appréciée par détection de la GFP
sous un microscope à épifluorescence. Cette approche présente un double avantage.
D’une part, c’est la seule façon de montrer sans équivoque le potentiel développemental /
la pluripotence des cellules ES unr-/-. D’autre part, cela nous permettra également de
déterminer si in vivo les cellules ES Unr-nulles peuvent coloniser les tissus dérivés de
l’endoderme primitif que sont l’endoderme pariétal et viscéral. Normalement, les cellules
ES sauvages ne peuvent pas coloniser ces tissus. Cependant, dans la mesure où les
cellules ES unr-/- différencient in vitro en endoderme primitif, il semble légitime de se
poser cette question.
Dans le but d’identifier de nouvelles cibles d’Unr, une étude comparative du
transcriptome des cellules ES unr+/+ et unr-/- (microarrays) a été réalisée au laboratoire
par Virginie Dormoy-Raclet. Les résultats de cette étude bien qu’informatifs sont
cependant à traiter avec prudence. En effet, au cours de ma thèse nous nous sommes
rendu compte que des fibroblastes nourriciers (qui servent à entretenir les cultures de
cellules ES) ont contaminé les échantillons qui ont servi pour extraire les ARNs. C’est
pourquoi au cours de ma thèse, nous avons été amenés à modifier les conditions de
culture des cellules ES en réalisant des passages sur gélatine avant chaque expérience afin
de contourner ce problème (voir la partie matériel et méthode de l’article). De plus,
l’étude du transcriptome a été réalisée sur une population mixte de cellules unr-/- et la
majorité des gènes marqueurs de l’Epr (dont gata6) qui sont induits en absence d’Unr
(fig1C de l’article) ne le sont pas dans les résultats des microarrays. Pour identifier de
nouvelles cibles d’Unr dans les cellules ES, il serait intéressant de recommencer cette
étude en utilisant des cellules cultivées sur gélatine et traitées avec un inhibiteur de la
protéine MEK1. En effet, si celui-ci en permettant une expression homogène de Nanog
(voir ci-dessus) inhibe la différenciation des cellules ES unr-/-, son utilisation permettra
de travailler sur une population homogène de cellules ES exprimant un niveau homogène
de Nanog.
81
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Université Victor Segalen Bordeaux 2
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ELATMANI Habiba
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