Stratégie optimale et nouveautés dans le ganglion

Actualités sur le GAS
et intérêt de l’extemporané sur le GAS
Dr Cécile Bendavid‐Athias
Centre Eugène Marquis
Historique du GAS
• Avant : Curage axillaire systématique pour toutes les tumeurs infiltrantes du sein
• Le statut ganglionnaire était un facteur pronostic essentiel
• Complications trop élevées pour de nombreux curage négatif → GAS pour les tumeurs unique, de petite taille(moins de 2 cm)
• Analyse histologique HEC et IHC
• Résultats selon taille de métastases :
– Macrométastases : > 2mm
– Micrométastases : 0,2<‐< ou =2mm
– CTI : <0,2mm
• Résultats peu reproductibles et opérateur dépendant : relectures de lames pour études rétrospectives
Nouvelles recommandations pour le GAS
• Taille tumorale jusqu’à 5 cm
• Lésion unique
• Pas d’antécédents de chirurgie homolatérale
• Avant chimiothérapie néoadjuvante
• Indications de curage axillaire (CA) si macrométastase, micrométastase(mi) ou cellules tumorales isolées (i+)
Pourtant …..tendance à la désescalade thérapeutique
• Evolution des facteurs pronostiques : développement du profil moléculaire des cellules tumorales (luminal A, luminal B, Her2, basal like) et de leur profil histologique (RH; grade; index mitotique; Ki; Her2; embols)
• Place du ganglion dans le choix du traitement adjuvant systémique ?
Intérêt du CA devant une métastase occulte
• Récidive axillaire ?
• Valeur pronostique des mi et i+ : Survie sans récidive et survie globale ?
Récidive axillaire
Auteur
Nb
Suivi Médian
Nb Rec
Axill
% Rec
Axill
ITC
Micro Méta
Macro Méta
Guenther
46
32
0
0
23
16
7
Fant
31
30
0
0
0
27
4
Jeruss
73
28
0
0
Naik
210
25
3
1,4
Park
287
23
6
2
Hwang
196
30
0
0
67
90
39
Cox
69
20
1
1,4
44
25
0
Zakaria
86
30
0
0
0
69
17
26
Meretoja
48
37
0
0
Giuliano
436
75,6
8
1,8
22
0
160
199
Non précisé
66
Rôle des traitements adjuvants dans la récidive axillaire
• La plupart ont eu un traitement systémique
• Rôle de la radiothérapie externe sur le sein ?
• Avenir de ce risque avec la radiothérapie partielle ?
Faut‐il réaliser un CA devant toute micrométastase(mi) ou i+ ?
•
40% de mi ou i+ (Rutgers EJ., Sentinel node biopsy: interpretation and management of patients with immunohistochemistry‐positive sentinel nodes and those with micrometastases. J Clin Oncol. 2008 Feb 10;26(5):698‐702).
•
12 à 18% de GNS métastatiques retrouvés après CA pour mi ou i+ – 12% pour I+
– 18% pour mi
• Risque de méconnaitre une macrométastase sur GNS prélevé pour GAS I+ est inférieur au taux de FN de détection du GAS (1% contre 0 à 5%) •
Risque : méconnaitre atteinte GNS importante (4N+) qui modifierait la prise en charge adjuvante dont la radiothérapie ganglionnaire
→essai G. Houvenaegel
Modèles prédictifs d’atteinte des GNS: nomogramme ou score ?
Micro MSKCC MDA Degnim
Tenon Stanford
nomogram
score
nomogram
score
MLR
métastase
nomogram
Taille de la tumeur
X
X
X
X
X
X
Grade
X
Emboles
X
X
X
Nombre de GS prélevés
X
X
*
Nombre de GS+
X
Atteinte GS : macro/micro
X
X
X
*
X
X
X
X
Méthode de détection GS+
X
X
Type histologique
X
X
RO
X
Multifocalité
X
Atteinte GS extra capsulaire
* ratio
X
Inconvénients de ces modèles
• Intègrent à la fois macro, micro et i+
• Fiables pour les macrométastases mais peu pour les micrométastases en IHC
• Effectifs insuffisants
• Validation par groupe de patientes
Valeur pronostique des i+
• Pas de différence en terme de SSR et SG par rapport au N‐
–
Maibenco DC, Dombi GW, Kau TY, Severson RK. Significance of micrometastases on the survival of women with T1 breast cancer. Cancer. 2006 Sep 15;107(6):1234‐9.
–
Giuliano AE, Hunt KK, Ballman KV, Beitsch PD, Whitworth PW, Blumencranz PW, Leitch AM, Saha S, McCall LM, Morrow M.Anderson. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. JAMA. 2011 Feb 9;305(6):569‐
75.
–
Weaver DL, Ashikaga T, Krag DN, Skelly JM, Anderson SJ, Harlow SP, Julian TB, Mamounas EP, Wolmark
N. Effect of occult metastases on survival in node‐negative breast cancer. N Engl J Med. 2011 Feb
3;364(5):412‐21. Epub 2011 Jan 19.
–
Schmidt C. What to do about occult metastases in breast cancer? Standards shift, but doubts linger. J Natl Cancer Inst. 2011 May 18;103(10):784‐5. Epub 2011 May 6.
–
Andersson Y, Frisell J, Sylvan M, de Boniface J, Bergkvist L. Breast cancer survival in relation to the metastatic tumor burden in axillary lymph nodes. J Clin Oncol. 2010 Jun 10;28(17):2868‐73. Epub 2010 May 10.
Valeur pronostique des micrométastases :
• Plus discutable
• Mêmes études montrent une différence significative avec N‐
• Mais faible (p=0,03) (Weaver DL, Ashikaga T, Krag DN, Skelly JM, Anderson SJ, Harlow SP, Julian TB, Mamounas EP, Wolmark N. Effect of occult metastases on survival in node‐negative breast cancer. N Engl J Med. 2011 Feb 3;364(5):412‐21. Epub 2011 Jan 19).
→ intérêt d’étude prospective sur des groupe de population, entre autre les populations à faible risque moléculaire et histologique de la lésion tumorale
→ nord américain : pas de récidive axillaire, différence en terme de SSR et SG trop faiblement significative par rapport au coût…
Au total
• Les remises en questions ne portent probablement pas sur les tumeurs de type basal like et les luminal B mais sur les petites tumeurs luminal A • A ce jour : indications de CA quelle que soit la taille de la métastase ganglionnaire
• Impression que l’attitude va évoluer vers un désescalade thérapeutique mais nécessité de nouvelles études, prospectives, sur des groupes de populations (luminal A ?), effectifs importants et PRUDENCE
• Dans tous les cas, la micrométastase semblerait avoir une valeur prédictive sur la SSR et SG, donc guiderait dans la prise en charge adjuvante; GAS garde toute sa place
Place de l’extemporané
• Intérêt mise en évidence des macrométastases
• Intérêt mise en évidence des mi aujourd’hui selon les recommandations
• Bénéfice pour la patiente :
– Évite reprise chirurgicale
– Annonce dès le soir de l’intervention
– Délai de mise en route des traitements adjuvants plus court
Intérêt OSNA
• Résultat fiable et définitif en peropératoire
• Examen reproductible, non opérateur dépendant
• Quantification possible de l’atteinte • métastatique ganglionnaire en nombre de copies
Objectif du Club Utilisateur OSNA
• Mieux définir les cut off en fonction :
– des critères cliniques de la patiente : statut ganglionnaire axillaire non sentinelle
– De la carte moléculaire tumorale
• Créer des nomogrammes propre à la technique OSNA de façon à suivre l’évolution des prises en charges
OSNA (Sysmex
OSNA (Sysmex))
Analyse par biologie moléculaire des ganglions sentinelles dans la chirurgie des cancers du sein
Dr Florence Godey Département de Biologie Centre Eugène Marquis
27 mai 2011, La Baule
17
Comparaison de l’approche
conventionnelle et de la méthode OSNA
f Approche conventionnelle
f Examen extemporané
coupe congelée / empreinte:
(si réalisée)
f Faible sensibilité
( biais d’échantillonnage)
f Analyse définitive
Coupe en paraffine:
H&E + IHC
f Seul 5% du ganglion est analysé
(dépendant de la méthode
utilisée)
f Pas de standardisation
f Reprise chirurgicale si
Faux négatif en
extemporané
f Méthode OSNA
f Analyse peropératoire du
ganglion entier
f Haute sensibilité
(pas de biais d’échantillonnage)
f Pas d’analyse postopératoire nécessaire
f Possibilité de conserver une
partie du tissu pour analyse
histologique conventionelle
f Une seule chirurgie
(biopsie sentinelle +
curage axillaire)
18
OSNA = One Step Nucleic Acid Amplification
Automate/réactifs
Le RD-100i : analyseur qui amplifie les ARNm CK19 selon la méthode RT-LAMP
(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification)
OSNA permet de statuer sur la présence ou
l’absence de métastases dans le ganglion
sentinelle en 30 minutes
19
Marqueur = Cytokeratine 19 (CK19)
• Spécifique des cellules épithéliales normalement non présentes
dans les ganglions lymphatiques
• Niveau d‘expression élevé dans les cellules tumorales mammaires
Æ Donc des niveaux d‘expression différents dans les ganglions envahis
ou non. 20
mRNA expression ratio
between HE(+) and HE (-)
sample
Les marqueurs doivent avoir un niveau d’expression très
différent dans les échantillons +/‐
1.0E+04
1.0E+03
CEA
CK19
MUC1
MGB1
1.0E+02
Taux d’expression relatif pos/neg
CK18
1.0E+01
CK20
ß-actin
1.0E+00
HE(+) sample
mRNA expression level in
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59
Molecular ID
1.0E+08
1.0E+07
1.0E+06
1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03
1.0E+02
1.0E+01
1.0E+00
CEA CK19
MUC1
Taux d’expression dans les ganglions positifs
CK18
ß-actin
CK20
MGB1
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59
Molecular ID
21
Procédure OSNA
Homogenisation
Centrifugation
Amplification
GS
5 min
1 min
16 min; 65°C
Pour 1 analyse deux réactions d’amplification sur échantillon pur et dilué (1/10) 4 amplifications en simultané + 1 contrôle positif + 1 contrôle négatif
22
Amplification ARNm CK19 par RT LAMP
(Reverse Transcription Loop‐mediated Isothermal Amplification)
• Haute spécificité et sensibilité
• Utilisation de 6 amorces
• Pas d’amplification d’ADN génomique
• Amplification rapide (16 min)
• Pas d’extraction d’ARNm
• Réaction isothermique à 65°C (pas besoin de thermocycleur)
• Amplification totalement automatisée RD100i
23
Détection OSNA
Le temps d'élévation correspond à l'instant auquel la réaction d'amplification de l‘ARNmCK19 progresse rapidement et la turbidité générée par l'amplification dans l'échantillon atteint un seuil prédéfini. Un temps d'élévation court traduit une forte concentration de l‘ARNmCK19
Détection du pyrophosphate
Détermination du Temps d’élévation
Détermination de la quantité d’ARN
Pyrophosphate
de magnésium
Libération de phosphate lors de l‘intégration des nucléotides: réaction avec le magnésium
Æ pyrophosphate de magnésium qui trouble le milieu
24
Suivi en temps réel
La concentration de l‘ARNm CK19 est calculée selon la courbe d'étalonnage générée par la détermination du temps d'élévation d'un jeu de trois calibrants de concentration connue en ARNm CK19.
25
CK19 mRNA
800000
6000
Cancer cell number
5000
cancer cell number/section
CK19 copy number/section
700000
600000
4000
500000
3000
400000
300000
2000
200000
1000
100000
0
CK19 mRNA (copy number/section)
Le nombre de cellules cancéreuses est
corrélé au nombre de copies d’ARNm de CK19
0
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65
Section No.
26
Définition du niveau seuil OSNA
Taille
Taille de la métastase
de la métastase
Macrométastase
Macrométastase
ARNm
ARNm CK19
CK19
++
++
5.000
copies/ µl
Micrométastase
Micrométastase
++
250
copies/ µl*
ITC
ITC // bruit
bruit de
de fond
fond
--
*Calcul du niveau seuil :
1 cellule épitheliale = taille de 10‐20 µm = ~ 1.000 copies CK19 mRNA
Foyer tumoral de 0,2 mm³ (micrométastase) = ~ 8.000 cellules = ~ 8.000.000 copies
~ 5.000 cellules (OSNA cut‐off) = 5.000.000 copies (dilution 1:20.000 → 250 copies /µl)
27
Interprétation des résultats OSNA
Nombre de copies ARNm CK19/µl
Résultats
RD‐100i Sysmex
Interprétation du résultat
pur ≥250 et <5000
(+)
Micrométastase
pur ≥ 5000
(++)
Macrométastase
Dilution ≥ 250
Pur <250
(+) i
Métastase non
quantifiée
Etudes de validation OSNA
• Sur coupes alternées de ganglions: analyse histologique versus analyse moléculaire
• Résultats poolés des études de concordance japonaises, allemandes, hollandaises, anglaises et française sur plus de 2000 GS
Æconcordance à 96,5% après analyse de discordance, sensibilité 95,6% et spécificité 96,%
Procédure pour l’analyse des GAS avec méthode OSNA
•
Les GAS sont immédiatement préparés pour l’analyse moléculaire par le chirurgien et transmis au technicien du laboratoire qui se déplace au bloc opératoire
•
Les GAS sont transportés sur glace jusqu’au laboratoire (3mn)
•
Le technicien broie les ganglions et prépare le lysat pour l’analyse moléculaire au laboratoire (5mn/GAS)Æ analyse la totalité de chaque GAS
•
L’amplification moléculaire est réalisée sur le lysat (16mn+2mn par GAS)
•
Le technicien ou biologiste communique par téléphone le résultat au chirurgien L’automate pour l’analyse moléculaire doit être calibré avant le début du
programme opératoire: – décongélation des réactifs (30mn)
– calibration de l’automate (20mn)
Résultats OSNA •
GAS OSNA au CEM: actuellement plus de 600 patientes •
Analyse statistique (SAS statistical analysis System) 367 procédures GAS OSNA
– Temps d’analyse OSNA
– Résultats GAS OSNA en fonction facteurs pronostiques classiques
• taille tumorale
• Grade SBR • Ki67
• RH
• statut HER2
– Résultats GAS OSNA et analyse des ganglions de curage axillaire – Résultats GAS OSNA et GAS selon méthode de référence (cohorte historique 355 patientes)
Nombre d’analyses OSNA
Temps de réalisation
• 810 GAS (901 analyses)
• 2,219 GAS/patients (2,468 analyses/patients)
• Temps d’analyse
– Pour 1 GAS Æ 32,9mn
– Pour 2 GAS Æ 36,4mn
– Pour 3 GAS Æ 41,6mn
– Pour 4 GAS Æ 48,5mn
(n=88)
(n=132)
(n=81)
(n=34)
Patientes
OSNA total
Cohort
OSNA
Restricted
Cohort
258
56.8
Historical
Cohort
367
56.8 years
Ductal invasive
carcinoma
Lobular invasive
carcinoma
In situ carcinoma
Other
248
212
313
46
42
Tumour size
1a
1b
1c
2
Missing values
21
104
148
50
44
19
93
146
16
125
214
SBR Grade
1
2
3
Missing values
94
171
68
34
Hormones receptor
status
Estrogen/progesterone +
300
Estrogen/progesterone HER2 +
Triple Negative
51
21
29
Number of patients
Medium age of patients
Tumour histology
60
Æ
355
56.9
43
16
GAS + OSNA Facteurs pronostiques habituels
N
% patients
SLN + OSNA
Age
< 40
40-50
50-60
60-70
>70
25
87
107
108
40
40
26.4
21.5
26.9
30
Size of primary tumour
T1a
T1b
T1c
T2
21
102
148
50
14.3
18.6
29
48
Hormone receptor Status
Estrogen/progesterone+
Estrogen/progesterone -
300
51
27.7
25.5
NS
Bloom-Richardson grade
1
2
3
94
171
68
22.3
27.5
35.3
NS
Ki67 < 20%
Ki67 >20%
135
56
25.2
39.3
0.05
HER2 +
HER2 -
21
302
47.6
26.2
0.033
Triple negative
Yes
No
29
310
20.7
28.1
NS
Augmentation significative GAS+:
-taille tumorale (14% T1a; 48% T2)
-Ki67 (25,2% Ki67<20 ; 39,3% Ki67>20)
-HER2+ (26,2% HER2-; 47,6% HER2+)
NS
0,0009
GAS + : quel est le % de ganglions de curage métastatiques
% ganglions non sentinelles envahis dépend de la taille de la métastase dans le
GAS :
-33 à 40% si macrométastase
-11 à 17% si micrométastase
% of patients
SLN+ OSNA
OSNA result
patient SLN+
% Patients with
lymph node
metastasis in ALND
Correlation between
lymph node metastasis in
ALND and SLN+ OSNA
Ductal invasive
carcinoma
27.8%
(69/248)
30 Macrometastasis
26 Micrometastasis
13 Metastasis with inhibition
33,3% (10/30)
11,5% (3/26)
7,6% (1/13)
P<0.0001
P= 0.0129
NS
Lobular invasive
carcinoma
30.0%
(18/60)
10 Macrometastasis
6 Micrometastasis
2 Metastasis with inhibition
40%
(4/10)
16,6% (1/6)
(0/2)
P=0.002
% GAS métastatiques (Tumeurs <2cm) OSNA versus Histologie
24,2% GAS+ avec OSNA 24,8% GAS+ avec histologie conventionnelle (avec Cellules tumorales isolées)
22,8% GAS+ avec histologique conventionnelle (sans Cellules tumorales isolées)
Pas de différence significative 21,8
lobular invasive breast tumour
28,5
23,81
Ductal invasive breast tumour
29,5
28,5
26,6
T1c
25
24,3
22,7
T1b
24,2
24,8
22,8
T1a
OSNA Cohort
historical Cohort including ITC
17,7
21,6
19,2
Historical Cohort
Invasive breast tumour
0
10
20
30
15,8
0
0
0
20
40
P value
La technique OSNA Le débat actuel: comment faut‐il traiter
les patientes avec GAS métastatique?
•
Controverse actuelle repose sur plusieurs publications:
– l‘analyse des GAS est histologique plus au moins intensive pas toujours bien décrite ni
standardisée. – pas d‘analyses exhaustives des GAS (impossibles car trop coûteuses si l‘on doit réaliser des coupes fines et une analyse imunohistochimique)
– les mêmes auteurs (D. Weawer) qui débattent de l‘intérêt de rechercher une métastase occulte, avaient au préalable largement discuté la difficulté de trouver une méthode
standardisée et fiable pour mieux comprendre la signification des micrométastases.
•
OSNA
– Possibilité d‘analyser de manière fiable et standardisée la totalité du ganglion sentinelle en peropératoire
– nombre copies ARNm CK19 reflète la totalité du volume tumoral dans le GAS: • sortir du concept macrométastases, micrométastases, cellules tumorales isolées
• Prendre en compte le nombre de copies d‘ARNm CK19 détectées dans les GAS, les caractéristiques
tumorales, les contraintes opératoires pour choisir la meilleure stratégie thérapeutique pour la prise
en charges des patientes Æ opportunité qu‘il faut évaluer (nomogrammes)
37
Conclusion
OSNA: technique fiable et standardisée permettant l’analyse de tout le ganglion
OSNA pas seulement une analyse extemporanée: fait aussi bien que l’analyse histologique définitive, l’extemporanée +++ avec les nouvelles recommandations tumeurs <5cm
OSNA a sa place dans le débat actuel : pour faire les curages axillaires et/ou les traitements adjuvants à bon escient
Implication importante de tout le personnel médical et paramédical pour la mise en place de la technique OSNA
Remerciements :
aux Dr C.Bendavid‐Athias, Dr S. Rouquette, Dr F. Foucher, Pr J. Levêque, Dr J. Blanchot, Dr J. Vialard, Dr V.Quillien, Dr G.Gandon, Dr P. Tas, Dr O. Coué,
Dr. N.Heresbach, À l’équipe du bloc opératoire,
aux techniciens de l’analyse moléculaire , M. Marty, S. Moiteaux, G. Duval