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RD-100i
OSNA® – Une technologie de pointe
au service de l'analyse du ganglion
sentinelle dans le cancer du sein

La biopsie du ganglion sentinelle (GS) s’est rapidement
imposée comme une méthode minimalement invasive
pour les patientes atteintes d'un cancer de stade précoce
et N0 clinique. L’examen extemporané du ganglion
sentinelle (GS) était jusqu’à aujourd’hui e ectué par coupes
congelées ou appositions avec une coloration rapide à
hématoxyline et éosine (H&E). La sensibilité de ces
méthodes histopathologiques est faible car seul un petit
pourcentage du ganglion sentinelle peut être étudié en
peropératoire. Par conséquent, il existe un risque
considérable de faux négatifs ne pouvant être identifi és
que lors d’une analyse histologique défi nitive ultérieure.
La méthode OSNA® (One Step Nucleic Acid Amplifi cation,
ou amplifi cation d’acide nucléique en une étape) est une
approche diagnostique récente et déjà bien établie qui, pour
la première fois, permet d’analyser la totalité du ganglion
sentinelle en peropératoire. Le résultat OSNA® guide le
clinicien dans son geste chirurgical évitant ainsi de procéder
à une seconde intervention chirurgicale ou des analyses
histopathologiques extensives.
RD-100i
OSNA® – Une technologie de pointe au service de l'analyse
du ganglion sentinelle dans le cancer du sein

Les résultats de toutes les évaluations cliniques indiquent
que l’ARNm de la CK est un excellent marqueur molécu-
laire pour la détection des métastases au niveau des
ganglions lymphatiques de patientes atteintes de cancer
du sein. Pour conclure, l’analyse OSNA® peut être utilisée
comme outil de diagnostic pour la détection rapide des
métastases dans les ganglions sentinelles de patientes
atteintes d’un cancer du sein.
Elle est parfaitement conforme aux exigences relatives
aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro et par
conséquent pleinement approuvée pour une utilisation
diagnostique dans l’UE.
Études de validation clinique et résultats
La méthode OSNA® a été évaluée dans plusieurs études
multicentriques menées dans diérents pays [1–5]. Toutes
ces études ont comparé la méthode OSNA® à une analyse
histopathologique très approfondie. Les ganglions lympha-
tiques ont été découpés, à l’aide d’un dispositif de coupe
spécial, en 4 tranches d’1 ou 2 mm d’épaisseur. Ces tranches
ont été aectées de manière alternative à l’analyse OSNA®
ou à une histologie multi-niveaux sur des sections
permanentes. Les sections provenaient de 5 niveaux,
avec des rubans d’intervalle de 100, 200 ou 250 m.
En conclusion, 2 313 ganglions lymphatiques ont été
analysés et ont présenté les caractéristiques suivantes :
L’étude japonaise a démontré que la spécificité de la
méthode OSNA® chez les patientes pN (144 ganglions
lymphatiques analysés) était de 100 % (Tableau 1).
[1] Tsujimoto M et al. (2007): One-Step Nucleic Acid Amplification for
Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer
Patients. Clin Cancer Res 13(16). 4807.
[2] Visser M et al. (2008): Intra-operative rapid diagnostic method based on
CK mRNA expression for the detection of lymph node metastases in
breast cancer. Int. J. Cancer. 122.2562.
[3] Schem C et al. (2009): One Step Nucleic Acid Amplification – a molecular
method for the detection of lymph node metastases in breast cancer
patients; results of the German study group. Virchows Arch. 454.203.
[4] Tamaki Y et al. (2009): Molecular detection of lymph node metastases
in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step
nucleic acid amplification assay. Clin Can Res. 15 : 2879 – 84.
[5] Snook KL et al. (2010): Multicentre evaluation of intraoperative
molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma.
Br J Surg, DOI: 10.1002/bjs.7347.
[6] Le Frère-Belda MA et al. (2012): Diagnostic performance of one-step nucleic
acid amplification for intraoperative sentinel node metastasis detection
in breast cancer patients. Int J Cancer. 2012 May 15 : 130(10) : 2377 – 86.
Références des publications
Le nombre de copies d’ARNm de la CK des ganglions
lymphatiques négatifs analysés dans cette étude de
spécificité s’est avéré considérablement plus faible que la
valeur du seuil défini pour la méthode OSNA®, indiquant
clairement que les risques de résultats faux positifs peuvent
être exclus (Fig. 4).
Taux de concordance . 
Sensibilité . 
Spécificité . 
Tableau 1 Analyse de 144 ganglions lymphatiques provenant de 60 patientes
pN établissant une spécificité de 100 %
n =144
OSNA®
Analyse histologique
positif
macro
(++)
(+)
(–)
micro
négatif
–
Spécificité : 100 % (95 % C.I. : 0,935 ~ 0,993)
Fig. 4 Distribution du nombre de copies d’ARNm CK de 144 ganglions
lymphatiques provenant de 60 patientes pN
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ND
0 – 25
25 – 50
50 – 75
75 – 100
100 – 125
125 – 150
150 – 175
175 – 200
200 – 225
225 – 250
250 – 275
275 – 300
Nombre de ganglions lymphatiques
Valeur cut-o
ARNm CK19 (copies/μL)
Résultats de l’étude spécificité

Lors d’une seconde étape, les sept marqueurs potentiels les
plus prometteurs présentant une expression d’ARNm élevée
dans les ganglions métastatiques et une expression minimale
au niveau des ganglions négatifs ont été soumis à une
évaluation approfondie sur un plus grand nombre de ganglions
lymphatiques (Fig. 2).
Finalement, l’ARNm de la CK a été identifi é comme le
marqueur le plus adapté, présentant des niveaux d’expression
élevés dans les ganglions lymphatiques métastatiques et des
niveaux d’expression faibles dans les ganglions lymphatiques
non métastatiques, permettant ainsi une sensibilité élevée
et la distinction des ganglions lymphatiques métastatiques
et non métastatiques.
* RT-LAMP = Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplifi cation ;
licence d’utilisation régie par l’accord avec Eiken Chemical CO., LTD
Technologie de pointe
La méthode OSNA® est une méthode de diagnostic molécu-
laire automatisée qui repose sur une technologie d’amplifi -
cation rapide de l’acide nucléique (RT-LAMP*) pour la
détection du niveau d’expression des ARNm de la cytokéra-
tine  CK. La cytokératine  est un marqueur de
cellules épithéliales et qui est normalement, non exprimé
par les cellules lymphatiques. Le niveau d’expression des
ARNm de la cytokératine  CK dépend de la taille des
foyers métastatiques. L’évaluation des résultats de la
patiente est déterminée à partir d'une courbe de calibration
avec trois étalons di érents.
Sélection du marqueur
Lors du développement de la méthode OSNA®, Sysmex a
sélectionné 45 ARNm marqueurs potentiels dans une
base de données publique d’expression du génome humain.
Les critères de sélection étaient les suivants : un niveau
d’expression élevé des ARNm dans les tissus de la
glande mammaire et une expression minimale ou nulle
dans le tissu ganglionnaire sain. Le ratio d’expression de
ces ARNm marqueurs a été évalué à l’aide de ganglions
lymphatiques positifs et négatifs d’un point de vue
histopathologique (Fig. 1 a+b).
Analyse de 45 gènes marqueurs potentiels
Fig. 1a Rapport des taux d’expression d’ARNm entre les ganglions
lymphatiques histopathologiquement positifs ou négatifs
Fig. 1b Expression de chaque ARNm marqueur dans des ganglions
lymphatiques histopathologiquement positifs
Fig. 2 Expression des ARNm marqueurs dans des ganglions lymphatiques
histopathologiquement positifs ou négatifs
FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (SAM pointed domain containing ETS transcription
factor), CEA (carcinoembryonic antigen), TACSTD2 (tumor associated calcium signal
transducer2), MGB1 (mammaglobin1), MUC1 (mucin1)
CK FOXA SPDEF CEA MGB TACSTD MUC
+ – + – + – + – + – + – + –

Technologie RT-LAMP
La technologie d’amplification innovante « RT-LAMP » est
une procédure isothermique rapide qui ore plusieurs
avantages par rapport aux méthodes PCR classiques. La
réaction d’amplification se produit en 16 min et ne nécessite
aucune extraction d’ARN au préalable. Les conditions de
préparation de l’échantillon et la conception spécifique des
amorces sont définies pour garantir une haute spécificité et
éviter des résultats faux positifs.
Six amorces diérentes sont utilisées dans le cadre de la
technologie RT-LAMP. Ces amorces ont été spécialement
conçues pour éviter l’amplification des pseudogènes de la
CK ou de leurs transcrits, mais également pour accélérer
la réaction d’amplification.
Amorces LAMP
Toute amplification involontaire d’ADN génomique est
évitée par d’une part le caractère isothermique de la
réaction (65 °C) et d’autre part par l’utilisation d’un réactif
à pH acide (3,5) pour la préparation de l’échantillon et
dans lequel l’ADN précipiterait.
Le processus est suivi en temps réel par le système de
détection et d’amplification automatisé RDi. Les
résultats sont disponibles en 30 à 45 minutes en fonction
du nombre de GS analysés (Fig. 3).
Tous les réactifs sont prêts à l’emploi.
Les solutions colorantes bleues ou les substances
colloïdales marquées par un radio-isotope utilisées
pour l’identification des GS n’interfèrent pas avec la
réaction OSNA®.
n Procédure isothermique à 65 °C
n Réaction très rapide (16 min)
n Pas d’extraction d’ARN nécessaire
nAucune amplification involontaire de
pseudogènes ni d’ADN génomique
n Haute spécificité grâce à 6 amorces
Fig. 3 Suivi de la réaction en temps réel
B1
5’
3’
F1
F2
B2
3’
5’
ARN
ADNc
5’3’
L1 L2
L1: Amorce boucle 1
L2: Amorce boucle 2
ou : Domaine ADN
ou : Domaine ADN
complémentaire
F1: Amorce sens 1
F2: Amorce sens 2
B1: Amorce reverse 1
B2: Amorce reverse 2