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RD-100i
OSNA® – Une technologie de pointe
au service de l'analyse du ganglion
sentinelle dans le cancer du sein
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RD-100i
OSNA® – Une technologie de pointe au service de l'analyse
du ganglion sentinelle dans le cancer du sein
La biopsie du ganglion sentinelle (GS) s’est rapidement
imposée comme une méthode minimalement invasive
pour les patientes atteintes d'un cancer de stade précoce
et N0 clinique. L’examen extemporané du ganglion
sentinelle (GS) était jusqu’à aujourd’hui effectué par coupes
congelées ou appositions avec une coloration rapide à
hématoxyline et éosine (H&E). La sensibilité de ces
méthodes histopathologiques est faible car seul un petit
pourcentage du ganglion sentinelle peut être étudié en
peropératoire. Par conséquent, il existe un risque
considérable de faux négatifs ne pouvant être identifiés
que lors d’une analyse histologique définitive ultérieure.
La méthode OSNA® (One Step Nucleic Acid Amplification,
ou amplification d’acide nucléique en une étape) est une
approche diagnostique récente et déjà bien établie qui, pour
la première fois, permet d’analyser la totalité du ganglion
sentinelle en peropératoire. Le résultat OSNA® guide le
clinicien dans son geste chirurgical évitant ainsi de procéder
à une seconde intervention chirurgicale ou des analyses
histopathologiques extensives.
Études de validation clinique et résultats
L’étude japonaise a démontré que la spécificité de la
méthode OSNA® chez les patientes pN0 (144 ganglions
lymphatiques analysés) était de 100 % (Tableau 1).
Analyse histologique
n =144
OSNA
®
positif
négatif
macro
micro
–
(++)
0
0
0
(+)
0
0
0
(–)
0
0
144
Spécificité : 100 % (95 % C.I. : 0,935 ~ 0,993)
Tableau 1 Analyse de 144 ganglions lymphatiques provenant de 60 patientes
pN0 établissant une spécificité de 100 %
275 – 300
250 – 275
225 – 250
200 – 225
175 – 200
150 – 175
125 – 150
96.7 %
100 – 125
Spécificité
50 – 75
95.6 %
75 – 100
Sensibilité
25 – 50
96.5 %
Valeur cut-off
0 – 25
Taux de concordance
Résultats de l’étude spécificité
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ND
En conclusion, 2 313 ganglions lymphatiques ont été
analysés et ont présenté les caractéristiques suivantes :
Le nombre de copies d’ARNm de la CK19 des ganglions
lymphatiques négatifs analysés dans cette étude de
spécificité s’est avéré considérablement plus faible que la
valeur du seuil défini pour la méthode OSNA®, indiquant
clairement que les risques de résultats faux positifs peuvent
être exclus (Fig. 4).
Nombre de ganglions lymphatiques
La méthode OSNA® a été évaluée dans plusieurs études
multicentriques menées dans différents pays [1–5]. Toutes
ces études ont comparé la méthode OSNA® à une analyse
histopathologique très approfondie. Les ganglions lymphatiques ont été découpés, à l’aide d’un dispositif de coupe
spécial, en 4 tranches d’1 ou 2 mm d’épaisseur. Ces tranches
ont été affectées de manière alternative à l’analyse OSNA®
ou à une histologie multi-niveaux sur des sections
permanentes. Les sections provenaient de 5 niveaux,
avec des rubans d’intervalle de 100, 200 ou 250 μm.
ARNm CK19 (copies/μL)
Fig. 4 Distribution du nombre de copies d’ARNm CK19 de 144 ganglions
lymphatiques provenant de 60 patientes pN0
Les résultats de toutes les évaluations cliniques indiquent
que l’ARNm de la CK19 est un excellent marqueur moléculaire pour la détection des métastases au niveau des
ganglions lymphatiques de patientes atteintes de cancer
du sein. Pour conclure, l’analyse OSNA® peut être utilisée
comme outil de diagnostic pour la détection rapide des
métastases dans les ganglions sentinelles de patientes
atteintes d’un cancer du sein.
Elle est parfaitement conforme aux exigences relatives
aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro et par
conséquent pleinement approuvée pour une utilisation
diagnostique dans l’UE.
Références des publications
[1] Tsujimoto M et al. (2007): One-Step Nucleic Acid Amplification for
Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer
Patients. Clin Cancer Res 13(16). 4807.
[4] Tamaki Y et al. (2009): Molecular detection of lymph node metastases
in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step
nucleic acid amplification assay. Clin Can Res. 15 : 2879 – 84.
[2] Visser M et al. (2008): Intra-operative rapid diagnostic method based on
CK19 mRNA expression for the detection of lymph node metastases in
breast cancer. Int. J. Cancer. 122.2562.
[5]Snook KL et al. (2010): Multicentre evaluation of intraoperative
molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma.
Br J Surg, DOI: 10.1002/bjs.7347.
[3] Schem C et al. (2009): One Step Nucleic Acid Amplification – a molecular method for the detection of lymph node metastases in breast cancer patients; results of the German study group. Virchows Arch. 454.203.
[6] Le Frère-Belda MA et al. (2012): Diagnostic performance of one-step nucleic acid amplification for intraoperative sentinel node metastasis detection in breast cancer patients. Int J Cancer. 2012 May 15 : 130(10) : 2377 – 86.
Technologie de pointe
La méthode OSNA® est une méthode de diagnostic moléculaire automatisée qui repose sur une technologie d’amplification rapide de l’acide nucléique (RT-LAMP*) pour la
détection du niveau d’expression des ARNm de la cytokératine 19 (CK19). La cytokératine 19 est un marqueur de
cellules épithéliales et qui est normalement, non exprimé
par les cellules lymphatiques. Le niveau d’expression des
ARNm de la cytokératine 19 (CK19) dépend de la taille des
foyers métastatiques. L’évaluation des résultats de la
patiente est déterminée à partir d'une courbe de calibration
avec trois étalons différents.
Sélection du marqueur
Lors du développement de la méthode OSNA®, Sysmex a
sélectionné 45 ARNm marqueurs potentiels dans une
base de données publique d’expression du génome humain.
Les critères de sélection étaient les suivants : un niveau
d’expression élevé des ARNm dans les tissus de la
glande mammaire et une expression minimale ou nulle
dans le tissu ganglionnaire sain. Le ratio d’expression de
ces ARNm marqueurs a été évalué à l’aide de ganglions
lymphatiques positifs et négatifs d’un point de vue
histopathologique (Fig. 1 a+b).
Analyse de 45 gènes marqueurs potentiels
Lors d’une seconde étape, les sept marqueurs potentiels les
plus prometteurs présentant une expression d’ARNm élevée
dans les ganglions métastatiques et une expression minimale
au niveau des ganglions négatifs ont été soumis à une
évaluation approfondie sur un plus grand nombre de ganglions
lymphatiques (Fig. 2).
Finalement, l’ARNm de la CK19 a été identifié comme le
marqueur le plus adapté, présentant des niveaux d’expression
élevés dans les ganglions lymphatiques métastatiques et des
niveaux d’expression faibles dans les ganglions lymphatiques
non métastatiques, permettant ainsi une sensibilité élevée
et la distinction des ganglions lymphatiques métastatiques
et non métastatiques.
+
–
CK19
+
–
FOXA1
+
–
SPDEF
+
–
CEA
+
–
MGB1
+
–
TACSTD2
+
–
MUC1
FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (SAM pointed domain containing ETS transcription
factor), CEA (carcinoembryonic antigen), TACSTD2 (tumor associated calcium signal
transducer2), MGB1 (mammaglobin1), MUC1 (mucin1)
Fig. 2 Expression des ARNm marqueurs dans des ganglions lymphatiques
histopathologiquement positifs ou négatifs
* RT-LAMP = Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification ;
licence d’utilisation régie par l’accord avec Eiken Chemical CO., LTD
Fig. 1a Rapport des taux d’expression d’ARNm entre les ganglions
lymphatiques histopathologiquement positifs ou négatifs
Fig. 1b Expression de chaque ARNm marqueur dans des ganglions
lymphatiques histopathologiquement positifs
Technologie RT-LAMP
La technologie d’amplification innovante « RT-LAMP » est
une procédure isothermique rapide qui offre plusieurs
avantages par rapport aux méthodes PCR classiques. La
réaction d’amplification se produit en 16 min et ne nécessite
aucune extraction d’ARN au préalable. Les conditions de
préparation de l’échantillon et la conception spécifique des
amorces sont définies pour garantir une haute spécificité et
éviter des résultats faux positifs.
Le processus est suivi en temps réel par le système de
détection et d’amplification automatisé RD-100i. Les
résultats sont disponibles en 30 à 45 minutes en fonction
du nombre de GS analysés (Fig. 3).
Six amorces différentes sont utilisées dans le cadre de la
technologie RT-LAMP. Ces amorces ont été spécialement
conçues pour éviter l’amplification des pseudogènes de la
CK19 ou de leurs transcrits, mais également pour accélérer
la réaction d’amplification.
Amorces LAMP
Toute amplification involontaire d’ADN génomique est
évitée par d’une part le caractère isothermique de la
réaction (65 °C) et d’autre part par l’utilisation d’un réactif
à pH acide (3,5) pour la préparation de l’échantillon et
dans lequel l’ADN précipiterait.
Fig. 3 Suivi de la réaction en temps réel
Tous les réactifs sont prêts à l’emploi.
Les solutions colorantes bleues ou les substances
colloïdales marquées par un radio-isotope utilisées
pour l’identification des GS n’interfèrent pas avec la
réaction OSNA®.
B1
B2
5’
3’ ARN
3’
5’ ADNc
F2
F1
L1
F1: Amorce sens 1
F2: Amorce sens 2
B1: Amorce reverse 1
B2:Amorce reverse 2
3’
5’
L1: Amorce boucle 1
L2: Amorce boucle 2
ou :Domaine ADN
ou : Domaine ADN
complémentaire
L2
n
Procédure isothermique à 65 °C
n
Réaction très rapide (16 min)
n
Pas d’extraction d’ARN nécessaire
Aucune amplification involontaire de
pseudogènes ni d’ADN génomique
n
n
Haute spécificité grâce à 6 amorces
Spécifications techniques
Instrument
Détecteur d’amplification génique RD-100i
Méthode
OSNA® (One Step Nucleic Acid Amplification)
(amplification d’acide nucléique en une étape)
Paramètre
ARNm de CK19
Technologie
RT-LAMP (Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification)
(trancription inverse et amplification isothermique médiée par des boucles)
Détection
modification de la lumière transmise provoquée par la précipitation du
pyrophosphate de magnésium en fonction du niveau de la réaction
Paramètres affichés
CK19 Q (résultat qualitatif de la CK19)
CK19 (temps d’élévation de la CK19)
CK19 C (concentration en ARNm de CK19)
Capacité de traitement
4 échantillons par analyse
Plage de poids du tissu par
échantillon
50 à 600 mg
Volume de l’échantillon
2 μL
Réactifs
réactif d’homogénéisation LYNORHAG
réactif d’amplification LYNOAMP BC
tous les réactifs sont prêts à l’emploi
Stockage de données
2000 échantillons
Contrôle qualité
témoins positifs et négatifs
180 points de données par fichier
Interfaces
connexion à l’ordinateur hôte (RS232, réseau local)
connexion pour imprimante (USB)
Poids de l’analyseur
environ 66 kg
Dimension de l’analyseur
(l x h x p)
596 x 548 x 622 mm
En option, accompagnement technique et service d’accès à distance
Distributeur en France : Sysmex France S.A.S.
© Copyright 2015 – Sysmex Europe GmbH
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est un produit de santé réglementé qui porte, au titre de cette réglementation, le marquage CE. Lire attentivement les instructions
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