Immunogénicité du C1 inhibiteur: De l’hémophilie aux angioedèmes en passant par le PTT… Laurent GILARDIN 12 Avril 2013 INSERM UMRS 872, Equipe 16 Immunopathologie et Immunointervention Thérapeutique Centre de Recherche des Cordeliers Paris Immunogénicité ? = Capacité à induire une réponse immunitaire (humorale ou cellulaire) Réponse immunitaire: –Auto-Immune –Allo-Immune Facteur VIII et Hemophilie A @#%! Rare inherited hemorragic X linked disease 1 boy birth out of 5000 Recurrent Bleedings: joints, muscles, GI tractus, brain Deficiency in functional factor VIII Facteur VIII et Hemophilie A @#%! Facteur VIII et Hemophilie A FVIII Replacement therapy = intravenous injection of plasma-derived or recombinant FVIII Or By-Pass ing agents (activated FVII…) Facteur VIII et Hemophilie A FVIII In 5-30% of the patients, anti-FVIII immune response, with anti-FVIII antibodies Immunogénicité du Facteur VIII thérapeutique chez les patients hémophiles A Répertoire « Soi » des hémophiles: Facteur VIII thérapeutique ou = AlloImmunogénicité Immunogénicité du FVIII? • administré en intraveineux • en quantité relativement faible • en l’absence d’adjuvant ou FVIII as seen by the organism under physiological conditions Life cycle of FVIII Liver sinusoidal endothelial cells vWF vWF FVIII aFII TrashCan et al, 2006 Lenting Blood 1998 FVIII as seen by the immune system in physiology Natural anti-FVIII IgG (IVIg) Immunoprecipitation of FVIII fragments 0,6 Bound / Total C2 Inhibitory activity 0,4 FVIII 16 BU/mg 0,2 A2 0, 0 0,001 0,1 10 Anti-FVIII IgG (µg) NH2 A1 A2 B A3 C1 C2 COOH Moreau Blood 2000 FVIII as seen by the immune system in physiology Natural anti-FVIII IgG and anti-idiotypic antibodies Neutralization of inhibitory activity by IVIg Anti-FVIII alloantibodies Bul Dup Ric Neutralization (%) + IVIg Anti-FVIII autoantibodies Bes Gra Cer Gui 37 44 0 Neutralization (%) + IVIg 76 92 83 0 Rossi Clin Exp Immunol 1988 FVIII as seen by the immune system in physiology Natural anti-FVIII T lymphocytes Stimulation Index 10 Healthy donors Inhibitor-positive patients 5 Inhibitor-negative patients 0 PBMC Reding Thromb Haemost 1999 Reding Thromb Haemost 2000 Reding Thromb Haemost 2003 Reding Thromb Haemost 2004 Misra Thromb Haemost 2003 FVIII as seen by the immune system in physiology Natural anti-FVIII T lymphocytes and T regulatory cells + FVIII T cell - FVIII - FVIII + FVIII T regs CD4+CD25HI Kamate JTH 2007 Natural FVIIIspecific B cells B cell Y Y Y Y Natural anti-idiotypic IgG Y Y Y Y Y Y B cell Y B cell Natural anti-FVIII IgG FVIII Y Natural/induced regulatory T cells T regs T regs T cell Natural FVIIIreactive T cells T regs T cell T cell T cell T cell Lacroix-Desmazes Blood 2008 FVIII as seen by the organism in hemophilia A Life cycle of FVIII in patients with hemophilia A vWF vWF FVIII aFII Lenting Blood 1998 Réponse Immunitaire anti Facteur VIII thérapeutique Plasma cell BCR FVIII AP C TCR CD4+ MHC T cell B cell Memory B cell . Internalization of FVIII by AgPCs . "Immunogenic" presentation of FVIII to naive CD4+ T cells . Activation and differentiation of FVIII-specific naive B cells . Inhibition of therapeutic FVIII by anti-FVIII IgG Interruption of life cycle of FVIII by FVIII inhibitors vWF vWF FVIII aFII Inhibition of therapeutic FVIII by anti-FVIII IgG II. Immune complexes Y APC Y Y Y YYY Y Y Y Y FVIII FX YY YY Y aFIX PL Y Y YY Y III. IgG-mediated hydrolysis Y vWF aFII Y Y I. Steric hindrance Réponse Immunitaire anti Facteur VIII thérapeutique Plasma cell BCR FVIII AP C TCR CD4+ MHC T cell B cell Memory B cell . Internalization of FVIII by AgPCs . "Immunogenic" presentation of FVIII to naive CD4+ T cells . Activation and differentiation of FVIII-specific naive B cells . Inhibition of therapeutic FVIII by anti-FVIII IgG "Immunogenic" presentation of FVIII to naive CD4+ T cells MHCII TcR Naive FVIII-specific T cell Signal 1 Regulatory T cell "Immunogenic" presentation of FVIII to naive CD4+ T cells Cytokines: TNF-α α IL-10 MHCII TcR Signal 3 Naive FVIII-specific T cell Signal 1 Signal 2 Co-stimulatory molecules: CD40 <-> CD40L CD80/CD86 <-> CD28 anti-CD40L IgG CTLA4-Ig Activated FVIII-specific T cell Importance of CD4+ T lymphocytes for the anti-FVIII immune response in hemophilia A FVIII-deficient mice + FVIII-/- anti-CD40L IgG Germinal centers - Activation of CD4+ LT - Primary B cell response - Stimulation memory B - CTLA4-Ig FVIII-/- CD86-/- Qian EJI 2000 Qian Blood 2000 Rossi Blood 2001 Reipert TH 2001 Hausl Blood 2004 "Immunogenic" presentation of FVIII to naive CD4+ T cells Cytokines: TNF-α α IL-10 MHCII TcR Signal 3 Naive FVIII-specific T cell Signal 1 Signal 2 Inflammation ? Co-stimulatory molecules: CD40 <-> CD40L CD80/CD86 <-> CD28 Activated FVIII-specific T cell Activation and differentiation of FVIII-specific naive B cells Cytokines: IL-4 IL-10 IFN-γγ TH17 … Y BcR FVIII-specific naive B cell MHCII TcR Signal 3 Activated FVIII-specific T cell Signal 1 Signal 2 Y memory B cell Plasmocyte YY Y YY Y YY Y Co-stimulatory molecules: CD40 <-> CD40L CD80/CD86 <-> CD28 Y Y Réponse Immunitaire anti Facteur VIII thérapeutique Plasma cell BCR FVIII AP C TCR CD4+ MHC T cell B cell Memory B cell . Internalization of FVIII by AgPCs . "Immunogenic" presentation of FVIII to naive CD4+ T cells . Activation and differentiation of FVIII-specific naive B cells . Inhibition of therapeutic FVIII by anti-FVIII IgG Internalization of FVIII by scavenger cells Scavenger cell HSPGs: heparan sulfate proteoglycans vLDLR ASGPR: Asialoglycoprotein receptor LRP: Low density lipoprotein receptorrelated protein HSPGs CD91/ LRP ASGPR LDLR Endocytosis and degradation of FVIII Lenting JBC 1999 Saenko JBC 1999 Sarafanov JBC 2001 Bovenschen Blood 2003, 2005 Bovenschen JTH 2005 Internalization of FVIII by AgPCs Antigen presenting cell vLDLR HSPGs CD91/ LRP ASGPR LDLR ? Endocytosis and activation of immune system Internalization of FVIII by AgPCs Human monocyte-derived dendritic cells vLDLR HSPGs CD91/ LRP ASGPR LDLR Activation of a human T cell clone (D9E9) Dasgupta PNAS 2007 Dasgupta Haematol 2008 Internalization of FVIII by AgPCs Human monocyte-derived dendritic cells MMR/ CD206 Récepteur Mannose Activation of a human T cell clone (D9E9) Dasgupta PNAS 2007 Dasgupta Haematol 2008 Conclusion 1 Reasons for immunogenicity of FVIII I. Risk factors related to the patient Ø Ø Ø Ø Ø Ø Severity of hemophilia A Type of mutation Ethnic group Familial history of inhibitor Age at first FVIII infusion HLA type II. Risk factors related to the method Ø Method of inhibitor detection Ø Frequency of inhibitor investigation transitory inhibitors Ø Definition of strong/weak responder Ø Presence of associated autoAb or antiphospholipid Ab III. Risk factors related to the product IV. Risk factors related to the administration Ø Purity of FVIII Ø Method of industrial production Ø Method of viral inactivation Ø Associated medication (vaccination, IFNγγ, …) Ø Ø Ø Ø Ø Increase of the dose Type of bleeding Change in FVIII used for treatment Surgical procedure Associated infection/inflammation ISTH sub-committee 2003 Conclusion 1 Reasons for immunogenicity of FVIII I. Way FVIII is seen by the immune system: Intrinsic immunogenicity of FVIII Binding of FVIII to anti-FVIII IgG => B cell epitopes Binding of FVIII to MHC molecules and TcR => T cell epitopes Binding of FVIII to endocytic receptors => specific structural patterns II. Genetic background of the patient Binding of IgG to FVIII Binding of MHC to FVIII peptides Binding of TcR to FVIII Inflammatory status of the patient => V genes implicated in FVIII recognition => preferential HLA haplotypes => V genes implicated in FVIII recognition => polymorphism in immune genes III. Inflammatory status of the patient at the time of FVIII administration Recurrent bleeding, surgery Inflammatory role of FVIII => local/systemic inflammation => pro-inflammatory role of generated thrombin IV. Immune status of the patient at the time of FVIII administration Absence of B cell/antibody regulation Absence of T cell regulation Options for rendering FVIII less immunogenic 1 Protein engineering Modification of: . Dominant T- and B-cell epitopes . Moieties involved in uptake by AgPCs “Demannosylated” hrFVIII 2 Control of inflammatory state of the patient . Suppress pro-inflammatory cytokines (TNF-α α inhibitors, …) . Trigger endogenous antiinflammatory mechanisms 3 Immuno-intervention . General immunosuppression (Rituximab) . Eliminate / Educate FVIII-specific immune cells: Immune tolerance induction (ITI) Hémophilie acquise? = AutoImmunogénicité 1,5 Cas/Million/An (femmes incluses), augmente avec l’âge+++ Facteur VIII > autres facteurs de coagulation 50% cas = idiopathiques, asso. cancers (15%), autres MAI, postpartum, médicaments Symptomatique+++, Mortalité élevée IgG1 & 4 = switch, même épitope B que HA avec inhibiteurs (domaines A2, A3 et C2) Prédisposition HLA? Traitement: - Agents « Bypassants » - Corticoïdes, Endoxan, Rituximab, Immunoabsorption Hypothèses: Déséquilibre populations lymphocytaires? Immunisation « Bystander » PTT et ADAMTS13? PTT et ADAMTS13 E. Moschcowitz, 1924 Maladie rare (4 nouveaux cas/million/an) 15% Mortalité, Morbidité +++, coût +++ Maladie autoimmune liée à des anticorps dirigés contre la protéine ADAMTS 13 Microthrombis Thrombopénie et anémie Défaillances d’organes E. Moschcowitz, 1924 PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Maladie rare (4 nouveaux cas/million/an) 15% Mortalité, Morbidité +++, coût +++ Maladie autoimmune liée à des anticorps dirigés contre la protéine ADAMTS 13 FW Bas poids moléculaire FW Haut poids moléculaire ADAMTS13 E. Moschcowitz, 1924 PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Maladie rare (4 nouveaux cas/million/an) 15% Mortalité, Morbidité +++, coût +++ Maladie autoimmune liée à des anticorps dirigés contre la protéine ADAMTS 13 FW Bas poids moléculaire FW Haut poids moléculaire Fortement thrombogène ADAMTS13 Peu thrombogène E. Moschcowitz, 1924 PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Maladie rare (4 nouveaux cas/million/an) 15% Mortalité, Morbidité +++, coût +++ Maladie autoimmune liée à des anticorps dirigés contre la protéine ADAMTS 13 FW Y Y Haut poids moléculaire ADAMTS13 Y Y Fortement thrombogène PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Y FW Haut poids moléculaire Y ADAMTS13 Y Y Hyperagrégabilité plaquettaire PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Y FW Haut poids moléculaire Y ADAMTS13 Y Y Hyperagrégabilité plaquettaire Thrombus 90-180 dyn/cm2 PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Y FW Haut poids moléculaire Y ADAMTS13 Y Y Thrombus Anémie hémolytique mécanique Thrombopénie Défaillances d’organes 90-180 dyn/cm2 PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Y FW Haut poids moléculaire Y ADAMTS13 Y Y 90-180 dyn/cm2 PTT, ADAMTS13 et Facteur Willebrand (FW) Y FW Haut poids moléculaire Y ADAMTS13 Y Y YY Y Y IgG anti-ADAMTS13 Commutation isotypique Coopération T/B 90-180 dyn/cm2 Réponse immunitaire anti ADAMTS13 Anticorps anti-ADAMTS13 Polyclonaux IgG : 90% d’IgG4 (32% seules) , 52% IgG1, 50% IgG2 et 33% IgG3 Epitope B immunodominant = domaines « riche en Cys » et « Spacer » Y Y Y 28% 64% TS P-1 TS P-1 TS P-1 TS P-1 TS P-1 TS P-1 TS P-1 Do ma CU ines B TS Do P -1 ma e n in cy e ri sté ch Do ine e ma ine sp ac er D dé om sin ai teg ne ri n e D ca om ta ain lyt iq e ue op P ep S tid e = Pr ADAMTS13 100% Y 56% Y 20% = Glycoprotéine monocaténaire de 150/190 kDa soit 1427 aa Réponse immunitaire anti ADAMTS13 Restriction HLA HLA DRB1*11 = Facteur de susceptibilité au PTT Coppo et al. JTH 2010 Scully et al. JTH 2010 62% vs 22% - p=10-7 44% vs 12% p=0,0024 John et al. Abstract ISTH 2011 48 vs 23% - p=0,003 Suggère l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la pathogenèse Second « HIT » et Facteurs environnementaux Facteur déclenchant infectieux? 30% PTT - 70% MAT ADN-Histones & MPO (PNN) Douglas et al. J. Clin. Aph. 2010 Fuchs et al. Blood 2012 Second « HIT » et Facteurs environnementaux Facteur déclenchant infectieux? 30% PTT - 70% MAT ADN-Histones & MPO (PNN) Variation Saisonnière Park et al. Transfusion 2012 Douglas et al. J. Clin. Aph. 2010 Fuchs et al. Blood 2012 Second « HIT » et Facteurs environnementaux Facteur déclenchant infectieux? 30% PTT - 70% MAT ADN-Histones & MPO (PNN) Variation Saisonnière Park et al. Transfusion 2012 Rôle du complément? Ruiz-Torres et al. TH 2007 Réti et al. JTH 2012 Cataland et al. ASH 2012 Douglas et al. J. Clin. Aph. 2010 Fuchs et al. Blood 2012 Réponse immunitaire anti-ADAMTS13 au cours du PTT acquis Y YY YY Y Y ADAMTS13 Y Y CPA LyB U CPA LyT Agent Infectieux? Réponse immunitaire anti-ADAMTS13 au cours du PTT acquis Y YY YY Y Y ADAMTS13 ADAMTS13 Y Y CPA LyB U CPA A 13 LyT PTT Objectif : Etude de la réponse T CD4+ anti-ADAMTS 13 chez les patients Rémission dans 90% des cas 40-60% des patients rechutent Traitements immunosuppresseurs prolongés Facteurs pronostics? Adaptation thérapeutique? Lymphocytes T? Réponse immunitaire anti ADAMTS13 Lymphocytes B et Rituximab Efficace en phase aigue: réduction durée normalisation des plaquettes Réponse immunitaire anti ADAMTS13 Lymphocytes B et Rituximab Prévention des rechutes? Scully et al. Blood 2011 Réponse immunitaire anti ADAMTS13 Lymphocytes B et Rituximab Prévention des rechutes? Froissart et al. Crit Care 2012 Détermination de l’épitope T in silico puis in vitro CPA LyT Génération d’Hybridomes T murins restreints au HLA DRB1*11 spécifiques d’ADAMTS 13 ADAMTS13 ADAMTS13-/CMH II -/Tg DRB1*11 Immunisation des souris Récupération des splénocytes Fusion des LyT CD4+ avec des cellules partenaires LyT LyT LyT LyT Hyb T Obtention d’Hybridomes T CD4+ Criblage des hybridomes les plus spécifiques Identification et validation des épitopes T immunodominants Etude de la réponse T CD4+ anti-ADAMTS 13 chez les patients Etape 1: Génération de tétramères HLA II Chargés avec le peptide candidat HLA DRB1*11 Etude de la réponse T CD4+ anti-ADAMTS 13 chez les patients Etape 2: Utilisation des tétramères HLA II HLA DRB1*11 LyT PATIENT S DU CNR { - Au diagnostic - En rémission - En rechute Suivi longitudinal selon traitement Génération de clones T Etude de la réponse T CD4+ anti-ADAMTS 13 chez les patients Retombées: HLA DRB1*11 LyT Profils Th1, Th2, Th17, Treg Cytokines Signature de la réponse T anti ADAMTS13 Utilisation des clones T spécifiques d’ADAMTS 13 Etudes au niveau cellulaire des clones T CD4+ spécifiques d’ADAMTS13: Ly Ly TTLy Ly TLyT T Profil d’expression génique, protéique…. Meilleure compréhension de l’autoimmunité U Ly Ly TTLy Ly LyT T T Y YY YY LyB ADAMTS13r ? CPA Rôle des lymphocytes B à la phase aigue et mécanisme d’action du Rituxiamb Prédiction rechute Adaptation thérapeutique Immunogénicité de l’ADAMTS 13 recombinante thérapeutique? Modification par génie génétique Déficit d’origine génétique Some d’Upshaw-Schulman C1 inhibiteur? AO Héréditaires C1 inhibiteur = 478 AA, chro 11, 50000-105000 Da Partie Cterm = domaine SERPIN, conservé Partie Nterm = non fonctionnel mais… …fortement glycosylé (AA 1-120) Bock, Biochemistry, 1986 Ac naturels existent, faible titre, non/peu neutralisants, IgA, IgM et IgG (réaction thymo-indépendante?) C.Drouet, com. personnelle Lymphocytes T? Lymphocytes B? Alloimmunogénicité: existe-t-elle vraiment? Intérêt à la rechercher? AO acquis ++ Rare: prévalence 1/100000, Age > 40 ans Type II = Par Ac anti C1inhibiteur, isotype IgG1, épitope = centre réactif Type I = 0 Ac, consommation-absorption (par cellules lymphoïdes / si hyperactivation voie classique du complément) Association > 60% à des MGUS ou à des hémopathies lymphoïdes (bas grade), maladies autoimmunes, cancers solides Mécanisme: évolution anormale d’une réaction immunitaire? clone thymo- indépendant ? Etude lymphomagénèse post-germinative Traitement: - crise: Forte dose C1inh? Agents « bypassants » si résistance - Fond: = traitement de l’hémopathie (chimio, splénectomie), Rituximab, autres? AO acquis Proposition de colliger les cas au sein du CREAK (registre) Delphine GOBERT / Olivier FAIN Hôpital Jean Verdier, Bondy [email protected] + Création d’une Biothèque (30mL de sang sur tube hépariné) / Tumorothèque? Après avis CPP (recueil consentement pour études génétiques) et financement Laurent GILARDIN Centre de recherche des cordeliers, Paris [email protected] 0619245520 Merci pour votre attention