Mécanismes cellulaires de la réponse immune anti

Revue
Hématologie 2010 ; 16 (5) : 372-81
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Mécanismes cellulaires
de la réponse immune anti-FVIII
chez les patients hémophiles A
Cells mechanisms of factor VIII specific immune response
in hemophilia A patients
1*
Christopher Cayzac
Isabelle Diaz2*
Priscilla Lapalud1
Jean-Pierre Vendrell1
Christine Biron Andreani3
Jean-François Schved3
Géraldine Lavigne-Lissalde1,3
1
UMR 3145 SysDiag CNRS/Bio-Rad,
Cap Delta/Parc Euromédecine,
Montpellier
2
Institut pour la recherche
en biothérapie,
Saint-Eloi, Montpellier
3
Centre régional de traitement
de l’hémophilie,
Hôpital Universitaire Saint-Eloi,
Montpellier
<[email protected]>
* Ces auteurs ont contribué de façon
égale à ce travail.
Résumé. Le développement d’allo-anticorps (Acs) anti-facteur VIII (FVIII) est actuellement la complication majeure du traitement des patients atteints d’hémophilie
A (HA). Elle survient chez 25 à 30 % des patients traités par FVIII substitutif. Améliorer la prévention et tenter d’éradiquer ou de neutraliser ces anticorps anti-FVIII
sont des préoccupations constantes pour les cliniciens et les scientifiques. L’étude
de la réponse cellulaire et humorale qui détermine l’apparition d’inhibiteurs est un
outil indispensable à l’amélioration de la prédiction et du traitement des inhibiteurs. Différentes cellules sont impliquées dans la réponse spécifique anti-FVIII telles
que les macrophages, les cellules dendritiques, les lymphocytes B (LB) ou les lymphocytes T (LT). Cette revue a pour but de synthétiser les connaissances actuelles
des mécanismes cellulaires impliqués dans la réponse immune anti-FVIII chez les
patients HA traités.
Mots clés : hémophilie A, lymphocytes B, facteur VIII, ELISpot
Abstract. Nowadays, the development of anti-factor VIII (FVIII) antibodies (Abs) is
the main complication of the treatment of haemophilia A (HA) patients It concerns
25 to 30 % of patients treated by substituted FVIII. Improve the prevention and try to
eradicate or to neutralize these antibodies remain a challenge for both clinicians
and scientists. Many studies give a lot of information on the anti-FVIII immune
response. Different cells are implied in the anti-FVIII specific response such as
macrophages, dendritic cells, lymphocytes B (LB) or lymphocytes T(LT). This review
aims to summarize the current knowledge on the cellular mechanisms involved in
the anti-FVIII immune response of treated HA patients.
Key words: hemophilia A, B-cells, factor VIII, ELISpot 1
Tirés à part :
G. Lavigne-Lissalde
372
– les hémophilies sévères où le taux résiduel de l’activité coagulante du FVIII est
inférieur à 1 % ;
– les hémophilies modérées avec des
taux compris entre 1 et 5 % ;
– les formes mineures avec des taux
compris entre 5 et 40 %.
Le traitement repose sur les injections de
concentrés de facteur VIII plasmatique
ou recombinant. Les modalités thérapeuHématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
doi: 10.1684/hma.2010.0503
L’
hémophilie A (HA) est
une affection hémorragique héréditaire
transmise selon un
mode récessif lié au
chromosome X, due à un déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation. La sévérité clinique dépend de l’importance
du déficit en FVIII. On distingue
classiquement :
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tiques sont le traitement curatif à la demande lors de la survenue d’un épisode hémorragique ou le traitement prophylactique, traitement substitutif préventif par injections répétées de FVIII.
La complication iatrogène majeure la plus redoutée est actuellement l’apparition d’allo-anticorps (allo-Acs) anti-FVIII, appelés inhibiteurs, neutralisant l’activité procoagulante du FVIII et
rendant inefficaces les traitements substitutifs conventionnels.
Ces Acs inhibiteurs apparaissent chez 15 à 30 % des hémophiles A sévères [1], le plus souvent dans les 50 premiers jours
d’exposition aux concentrés de FVIII substitutifs (jours cumulés
en présence de l’antigène [JCPA]). Ces inhibiteurs sont des
Acs polyclonaux, majoritairement des immunoglobulines de
type G (IgG) [2, 3]. Les raisons pour lesquelles ce type de
réponse immune apparaît chez certains patients sont mal définies. Cependant, des facteurs de risque influençant le développement d’inhibiteurs ont été bien mis en évidence. Il s’agit de
facteurs intrinsèques propres au patient, ou extrinsèques
et donc dépendants des modalités de traitement choisies.
Le traitement des accidents hémorragiques survenant chez un
patient avec inhibiteurs pose de gros problèmes thérapeutiques et nécessite l’utilisation de produits court-circuitant
l’action du FVIII. Le traitement de fond est l’instauration d’une
induction de tolérance immune (ITI). L’ITI consiste en l’administration régulière de très fortes doses de FVIII pour neutraliser
l’inhibiteur et en obtenir la disparition attestée par la nondétection de l’inhibiteur et un taux de récupération normal du
FVIII lors des études cinétiques associée à une demi-vie
normale. Différents protocoles existent en fonction des doses
et du rythme d’injection [4-7]. Cependant, l’ITI est un traitement extrêmement contraignant (surtout chez le jeune enfant
avec un abord veineux plus difficile), très coûteux [8, 9] et
dont l’issue est associée à 30 % d’échecs [10, 11].
Les mécanismes immunologiques impliqués dans le développement d’inhibiteurs ou dans la modulation de cette réponse
immune par les protocoles d’ITI chez les HA traités sont, malgré
de nombreuses études, mal connus. L’identification des circonstances et des causes de développement d’un inhibiteur sont des
thèmes de travail importants dans le domaine de l’hémophilie.
La recherche des cellules impliquées dans la réponse immune
anti-FVIII a fait l’objet de nombreuses études qu’il s’agisse des
lymphocytes T (LT), des lymphocytes T régulateurs (LTreg), des
cellules dendritiques (CD), des macrophages et des lymphocytes B (LB) [12-18]. Des modèles murins d’hémophilie A sévère
(souris KO pour le gène du FVIII) ont permis d’étudier plus
facilement les mécanismes cellulaires impliqués dans la
réponse immune anti-FVIII [19, 20], les LB, et plus particulièrement les LB mémoires impliqués à différents niveaux dans la
physiopathologie.
Dans cette revue, nous étudierons successivement :
– les mécanismes généraux de la réponse immune dirigée
contre le FVIII ;
– les données expérimentales récentes issues de la littérature ;
– les moyens d’étude des cellules spécifiques de la réponse
immune anti-FVIII.
Liste des abréviations
Acs
Afssaps
BCR
CD
CPA
CTLA4
CMHII
ELISA
ELISpot
FVIII
HA
Ig
IL
ITI
JCPA
LB
LT
LTh
LTreg
TCR
TGF
TNF
UKHCDO
anticorps
agence française de sécurité sanitaire des
produits de santé
B cell receptor
cellule dendritique
cellule présentatrice de l’antigène
cytotoxic T lymphocyte associated protein 4
complexe majeur d’histocompatibilité de type II
enzym-linked immunosorbent assay
enzym link immunosorbent spot
facteur VIII
hémophile A
immunoglobuline
interleukine
induction de tolérance immune
jours cumulés en présence de l’antigène
lymphocyte B
lymphocyte T
lymphocyte T helper
lymphocyte T régulateur
T cell receptor
transforming growth factor
tumor necrosis factor
UK Haemophilia Centre Doctors’ Organization
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
Mécanismes cellulaires généraux
de la réponse immune anti-FVIII
Le développement d’allo-Acs dirigés contre le FVIII thérapeutique répondrait au mécanisme classique d’une réponse
humorale T dépendante dans le cas d’un antigène soluble.
Schématiquement, durant la réponse immune primaire, l’antigène est capté de façon non spécifique par une cellule
présentatrice d’antigène (CPA), qui présente celui-ci sous
forme de peptides exposés sur le complexe majeur d’histocompatibilité de type II (CMH II). Puis, après migration dans
un organe lymphoïde secondaire, le complexe CMHII-peptide
est présenté aux LT CD4+. La reconnaissance spécifique entre
le complexe CMHII-peptide et le récepteur TCR du LT CD4+
entraîne l’activation du LT CD4+ spécifique de l’antigène,
sa prolifération et sa différenciation en LT mémoire et en LT
helper (LTh) (figure 1). Le LTh est capable d’apporter les
signaux nécessaires à l’activation de LB spécifiques de l’antigène. L’activation du LB induit sa prolifération et sa différenciation d’une part en cellules sécrétrices d’Ig spécifiques de
l’antigène (plasmocytes) et, d’autre part, en LB mémoires
spécifiques. La réponse immune anti-FVIII suivrait ce schéma
simplifié [21] (figure 2).
373
Peptides
FVIII
CPA
CMHII
LT
TCR
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+ Signaux de
danger
LT helper
Figure 1. Activation d’un LT CD4+ par une CPA. Interaction spécifique entre le CMHII-peptide d’une CPA ayant capté un antigène
et le TCR d’un LT CD4+ conduisant à l’activation du lymphocyte T.
Peptides
FVIII
CMHII
TCR
LT
helper
LB
Plasmocytes
LB mémoires
Figure 2. Activation d’un LB par une cellule T effectrice. Interaction spécifique entre le CMHII-peptide d’un LB ayant capté un antigène
et le TCR d’un LT CD4+ conduisant à l’activation du lymphocyte B.
Réponse immunitaire primaire anti-FVIII
Localisation et circonstance de la première rencontre
CPA/FVIII
374
LT mémoires
Les raisons de la forte immunogénicité du FVIII thérapeutique
comparé à d’autres protéines thérapeutiques sont encore
indéterminées. Le lieu et la circonstance de la première rencontre entre le FVIII et la CPA sont mal connus. Cette rencontre
pourrait s’effectuer sur le site de saignements répétés, comme
les articulations, zone d’inflammation chronique, favorisant le
recrutement et l’activation de CPA [22, 23]. Les CPA ayant
capté le FVIII pourraient alors initier la réponse immunitaire
spécifique dans les organes lymphoïdes secondaires. La rate
aurait un rôle potentiel dans cette première rencontre.
En effet, une accumulation majoritaire de FVIII au niveau de
la zone marginale de la rate apparaît après administration
de FVIII radio-marqué chez des modèles murins d’hémophilie
[19]. Les antigènes présents dans le sang circulant rencontrent au niveau de la rate les macrophages, CD et LB jouant
potentiellement un rôle de CPA. L’accumulation du FVIII au
niveau de la zone marginale de la rate pourrait favoriser sa
prise en charge par les CPA. De plus, il a été montré qu’une
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
d’Acs de haute affinité pour l’antigène et la commutation de
classe au travers de la sécrétion de cytokines dans l’environnement des LB situés dans les centres de germination des
organes lymphoïdes secondaires [26]. La génération d’Acs
inhibiteurs de la classe IgG nécessite l’aide de LTh CD4+ antigène spécifique [27]. De plus, la disparition des inhibiteurs
est corrélée à l’effondrement des LT CD4+ chez les patients
hémophiles infectés par le VIH déclarant le statut du sida [7].
Les LT CD4+ sondent, par l’intermédiaire de leur TCR, les
complexes CMHII-peptides présentés par les CPA. Cette interaction spécifique conduit à la formation d’une synapse immunologique, caractérisant le relais entre l’immunité acquise et
l’immunité adaptative spécifique d’un antigène. Dans cette
synapse immunologique, l’interaction entre le CMHII-peptide
de la CPA et le TCR du LT CD4+ est appelée signal 1 (figure 3).
Il s’ensuit le signal 2 ou signal de costimulation entre le CD40
(CD) et le CD40L (LT), puis le CD80/CD86 (CD) et le CD28
(LT). Les deux signaux induisent la sécrétion de cytokines par
les deux cellules (signal 3). Ces cytokines jouent un rôle de
médiateurs dans la réponse immunitaire. Il existe des cytokines
anti-inflammatoires et pro-inflammatoires qui orientent le type
de LTh impliqué dans une réponse immunitaire. Le polymorphisme génétique, notamment des régions promotrices des
gènes codant pour la cytokine pro-inflammatoire TNFα et
anti-inflammatoire IL10, influence le risque de développer
des inhibiteurs [28]. Un polymorphisme génétique dans le promoteur du gène de l’IL10 (allèle 134) a été démontré comme
facteur de risque génétique de développer un inhibiteur.
Les inhibiteurs sont rapportés chez 72,7 % des patients por-
splénectomie entraînait une réduction significative mais non
nulle de la réponse anti-FVIII. Ainsi, la rate jouerait un rôle
important dans l’élaboration de la réponse immune primaire
anti-FVIII [19].
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Les CPA du FVIII
Les CD sont capables de capter et présenter le FVIII aux LT
[12]. L’équipe de Pfistershammer a montré que l’activation
primaire d’un LT CD4+ spécifique du FVIII nécessitait son
interaction avec une CD mature [13]. La maturation d’une
CD nécessite des signaux de danger tels que des produits
dérivés de pathogènes ou des cytokines inflammatoires.
Le FVIII ne pourrait pas induire à lui seul une réponse immunitaire adaptative primaire par l’intermédiaire des cellules
dendritiques.
Les LB ont un rôle potentiel de CPA : ils sont capables de présenter un antigène et de délivrer le signal de costimulation au
LT naïf [14, 15].
Les macrophages, capables de capturer les antigènes, sont
également potentiellement impliqués dans la présentation du
FVIII [13].
Une fois internalisé par une CPA, le FVIII est protéolysé en
peptides de 9 à 14 résidus et apprêté sur les molécules de
CMHII exprimées à la surface des membranes [24]. Ces CPA
matures sont alors capables de migrer dans les organes
lymphoïdes secondaires.
Mise en place de l’immunité adaptative : rôle des LT
L’implication des LT a été démontrée dans la réponse immune
anti-FVIII [17, 18, 25]. Les LT CD4+ régulent la production
Signal 2
CD80/86
CD28
Signal 1
CPA
CMHII
TCR
CD40
CD40L
Signal de costimulation
LT CD4+
Cytokines : signal 3
Signaux 1, 2 et 3
Cytokines : signal 3
Activation du LT CD4+
Figure 3. Synapse immunologique. Interaction entre une CPA ayant capté un antigène et un LT CD4+ spécifique de l’antigène.
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
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teurs de l’allèle 134 dans le promoteur du gène IL10 et chez
seulement 37,5 % des patients non porteurs. Concernant le
polymorphisme du gène TNFα, la présence d’inhibiteurs est
retrouvée chez 72,7 % des patients avec le génotype SNIP
TNFA-308 A/A contre 39,7 % des patients TNFA-308 G/G
et 46,9 % des patients TNFA-308 G/A (étude sur 78 familles
d’hémophiles A). Le génotype SNIP TNFA-308 A/A du gène
TNFα semble donc être un facteur de risque de développer
des inhibiteurs anti-FVIII [29].
L’activation du LT CD4+ induit une prolifération clonale et leur
différenciation en LTh et LT mémoires (figure 3).
La catégorie des LTh générés est notamment définie par le
type de cytokines qu’elles sont capables de sécréter [30, 31].
Les Th1 sécrètent de l’IFNγ et de l’IL2, cette catégorie de
cellules T effectrices étant associée à une immunité de type
cellulaire. Les Th2 sécrètent de l’IL4 et de l’IL10, et ils sont
associés à une immunité de type humorale et aux réactions
allergiques. Chez l’homme, une réponse de type Th1 induit
majoritairement le développement d’IgG1 et IgG3, soustypes d’Ig qui lient le complément. Une réponse de type Th2,
conduit au développement d’IgG4, sous-classe d’IgG qui ne
lie pas le complément. Ainsi, en analysant le profil des IgG,
il est possible de déterminer le type de LTh impliqué dans la
réponse immune anti-FVIII [32]. Les Th17 impliqués dans
certaines maladies auto-immunes et inflammatoires produisent
l’IL17, cytokine aux propriétés pro-inflammatoires [33, 34].
La régulation et les fonctions de ces Th17 ne sont pas encore
claires. Les Treg peuvent être classés en deux groupes : adaptatifs et naturels [35, 36]. Les Treg naturels sont originaires
du thymus. Les Treg adaptatifs sont induit en périphérie
après exposition à l’antigène dans des circonstances favorisant la tolérance (costimulation limitée par l’IL10 ou molécules
immuno-suppressives, par exemple). Ces cellules régulatrices
induites semblent jouer leur rôle suppresseur par production
d’IL10 et de TGFβ [37]. Les Treg naturels sont des cellules qui
expriment constitutivement le cytotoxic T lymphocyte associated protein 4 (CTLA4) leur permettant d’inhiber les cellules
effectrices [37]. Le polymorphisme C/T-318 du gène codant
pour la région promotrice du CTLA-4 a été associé à une
surexpression du CTLA-4 rapporté comme ayant un effet
protecteur significatif face à la formation d’inhibiteurs antiFVIII [38]. Les LTreg semblent jouer un rôle important dans
l’immunité impliquant le FVIII.
Induction de LB mémoires
376
Les LTh sont capables d’activer spécifiquement un LB ayant
internalisé son antigène spécifique. Le LB reconnaît le FVIII
par l’intermédiaire de son BCR (IgD ou IgM membranaire) et
après protéolyse du FVIII, les peptides sont exposés à la surface
cellulaire sur le CMHII. Le LTh sonde le complexe CMHIIpeptide des LB avec son TCR. Une interaction spécifique
conduit à l’activation du LB. Cette activation induit alors la
formation d’un centre de germination dans l’organe lymphoïde
secondaire avec prolifération clonale du LB éventuellement des
commutations de classes, et différenciation en LB mémoires et
plasmocytes sécréteurs d’anticorps spécifiques du FVIII.
Réponse immunitaire secondaire anti-FVIII
Les LB et LT mémoires générés lors de la réponse immunitaire
primaire jouent un rôle prépondérant chez les patients atteints
d’HA. En effet, lors d’une nouvelle exposition au FVIII, ces
cellules s’activent et sont capables d’une prolifération et
d’une différenciation rapide rendant la réponse plus efficace
[39]. Les LB mémoires activés prolifèrent, générant de
nouveaux LB mémoires et des plasmocytes sécrétant des Ig
plus affines pour leur antigène et donc plus efficaces pour
neutraliser le FVIII thérapeutique (figure 4).
Données expérimentales issues
de la littérature
L’étude des mécanismes immunologiques à l’origine du
développement d’un inhibiteur chez certains patients et de
la modulation de cette réponse par les protocoles d’ITI a fait
l’objet de nombreux travaux. Cependant, beaucoup d’inconnues persistent. La faible incidence de la maladie et du
développement d’inhibiteurs, ainsi que la complexité d’une
étude des mécanismes cellulaires, rendent les études cliniques
difficiles.
Les perturbations des mécanismes immunologiques normaux
de tolérance semblent jouer un rôle important dans le
développement d’Acs dirigés contre le FVIII. En effet, le
risque de développer un inhibiteur est plus important si l’anomalie génétique ne permet pas la synthèse du FVIII, et donc
l’incapacité de développer une tolérance centrale [39].
Par ailleurs, l’ARNm du FVIII est présent dans le thymus de souris
non HA indiquant potentiellement un rôle dans une tolérance
centrale pour le FVIII. Il a également été montré qu’une injection de FVIII intrathymique chez une souris knock-out pour le
FVIII induisait une tolérance vis-à-vis de celui-ci [40, 41].
Ces données suggèrent qu’en situation « normale », c’està-dire chez un individu non hémophile ou chez un hémophile
A sans inhibiteur, les cellules B et T autoréactives vis-à-vis du
FVIII sont éliminées par le mécanisme de tolérance centrale.
L’implication des LTreg dans la réponse immunitaire anti-FVIII
fait l’objet de nombreux travaux. Reipert et al. ont émis l’hypothèse qu’une exposition chronique au FVIII dans des conditions de « non-danger » (sans stimulus additionnel tel que
des agonistes pour certains TLR nécessaires au développement d’une réponse immunitaire effective) chez des patients
HA pourrait induire la création de cellules Treg spécifiques du
FVIII capables de supprimer l’activité de LT effecteurs dirigés
contre le FVIII et ainsi la réponse humorale anti-FVIII médiée
par les LB [42] (figure 5). Par ailleurs, cette équipe suggère un
rôle potentiellement important de stimuli pro-inflammatoires
encore indéterminés qui permettraient le développement de
la réponse immunitaire contre le FVIII.
Les IgG4 sont principalement retrouvés chez les patients
présentant un fort titre d’inhibiteurs probablement résultant
des expositions répétés au FVIII substitutif [32]. La présence
d’IgG4 témoigne de l’implication des Th2 dans la réponse
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
Réponse immunitaire
primaire
T
Cellules B mémoires
Cellules T mémoires
B
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Réexposition au FVIII
Prolifération clonale
B
B
B
B
B
Plasmocytes
B
Figure 4. Réponse immunitaire secondaire. Les LT et LB mémoires s’activent rapidement suite à une réexposition au FVIII.
Peptides
FVIII
TCR
CMHII
CPA
LT
LTreg
+ Signaux de
danger
LT helper
Peptides
FVIII
CMHII
LB
Plasmocytes
TCR
LT mémoires
LT
helper
LB mémoires
Figure 5. Implication des LTreg dans la réponse immunitaire anti-FVIII. Inhibition de l’activation d’un LT CD4+ spécifique du FVIII
par un LTreg.
immune développée contre le FVIII. Récemment, il a été
montré que l’IL4 produite par les LTh2 prévient la formation
de LTreg en inhibant la régulation effectuée par le facteur de
transcription FOXP3 [43]. La molécule FOXP3 joue un rôle
déterminant dans le développement et le fonctionnement des
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
LTreg. Des mutations du gène codant pour FOXP3 sont
responsables chez l’homme de maladies auto-immunes
sévères [44, 45]. Il apparaît ainsi cohérent que l’échec d’ITI
chez ces patients avec inhibiteurs d’isotype IgG4 soit plus
fréquent [46].
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L’analyse des sous-classes d’IgG sur une cohorte de patients
atteints d’HA congénitale a montré que le succès d’une ITI
était corrélé à une prédominance d’une réponse immunitaire
Th1 (lymphocytes TH1 responsables de la formation d’anticorps de sous-classe IgG1 et IgG3), tandis que les patients
développant une réponse anamnestique importante contre le
FVIII thérapeutique présentaient une réponse Th2 conduisant
à la formation d’IgG4 principalement [32]. Leurs résultats
montrent par ailleurs que la réponse Th1 prédomine chez les
patients présentant un faible titre en inhibiteurs après ITI ou
traitement immunosuppresseur. Ainsi, la réponse Th1 serait
impliquée dans le maintien à long terme de la réponse antiFVIII, tandis que la réponse Th2 serait impliquée dans une
réponse forte contre le FVIII.
L’interaction entre les CPA et les LT CD4+ semble être un
événement cellulaire au centre de la réponse immunitaire
développée contre le FVIII chez les patients HA traités.
En effet, l’utilisation d’Acs anti-CD40L, anti-CD80 ou antiCD86 bloque le signal de costimulation et prévient ponctuellement la formation d’Acs anti-FVIII dans le cadre d’une
réponse immune secondaire ou primaire chez des souris
naïves pour le FVIII [47, 48].
Le contexte dans lequel est présenté le FVIII par les CPA aux LT
CD4+ peut s’avérer être un élément important sur le développement d’inhibiteurs. Ce contexte comprend les conditions et
l’environnement dans lequel la CPA capte le FVIII et la présentation des peptides du FVIII sur le CMHII. Récemment, Dimitrov
et al. ont montré que l’induction d’une enzyme, aux propriétés
anti-inflammatoire (Heme oxygenase-1), avant administration
de FVIII chez des souris HA réduisait significativement la
réponse immunitaire humorale contre le FVIII et était associée
à une diminution de l’expression du CMHII par les CPA de la
rate. Ainsi, induire une réponse anti-inflammatoire endogène avant administration de FVIII pourrait être une nouvelle
stratégie thérapeutique pour éviter le développement d’inhibiteurs [20].
L’influence exercée par le type de concentrés de FVIII utilisés
(plasmatique ou recombinant) reste un sujet largement discuté
[49]. L’origine ethnique africaine ou afro-américaine accentue
le risque de développer des Acs anti-FVIII [50, 51]. Certaines
variations génétiques ou polymorphismes concernant le FVIII
pourraient contribuer à cette prédisposition [52]. La façon
dont les peptides du FVIII sont présentés par le CMHII pourrait
jouer un rôle dans le développement d’inhibiteurs.
Moyens d’étude
des cellules spécifiques
de la réponse immune anti-FVIII
378
La réponse immune anti-FVIII obéit au schéma immunologique
classique d’une réponse humorale. Ainsi, chez un patient HA
avec inhibiteur, donc sensibilisé au FVIII, il y a production
d’Acs spécifiques du FVIII par des cellules sécrétrices d’Ig.
Les mécanismes cellulaires conduisant à la synthèse d’inhibiteurs impliquent les différentes cellules décrites précédem-
ment. Certaines sont dites non spécifiques comme par exemple les CD qui vont reconnaître l’antigène et initier la réponse
en le présentant aux cellules spécifiques représentées par les
LB et LT essentiellement. La réponse immune mise en place est
donc adaptée à l’antigène. L’étude des cellules spécifiques du
FVIII s’est développée ces dernières années dans le but de
mieux comprendre les mécanismes de la réponse immune
chez les patients avec inhibiteurs. Les LT, LB et LB mémoires
spécifiques du FVIII semblent jouer un rôle essentiel mais leur
étude nécessite la détection de cellules rares et spécifiques
d’un antigène, or peu de moyens sont actuellement disponibles. Les techniques de cytométrie en flux permettent de détecter et de trier des cellules circulantes, parfois présentes à des
taux très faibles à partir de leurs marqueurs membranaires ;
cependant à l’intérieur d’une population de LT, LB ou de LB
mémoires, il n’est pas encore possible de détecter quelques
cellules spécifiques d’un antigène. L’ELISpot (enzyme link
immunosorbent spot) est une technique développée il y a quelques années et utilisée pour dénombrer des cellules rares
humaines à partir du sang périphérique. Elle semble être
actuellement le système le plus adapté pour étudier les cellules
spécifiques de l’immunité.
La technique ELISpot
L’ELISpot est utilisé depuis de nombreuses années en infectiologie afin de détecter et dénombrer des LT et LB spécifiques
par exemple de l’hépatite B, du virus de l’immunodéficience
humaine (VIH), de la tuberculose, permettant par exemple
d’évaluer un réservoir viral (HIV), la présence de cellules
impliquées dans l’immunité vaccinale (hépatite B) [54–56].
Elle a été récemment utilisée dans le domaine de l’hémophilie
pour dénombrer les LB mémoires spécifiques du FVIII chez les
patients HA ayant développé un inhibiteur [42].
Le système est basé sur la capacité d’une cellule à sécréter une
molécule spécifique, comme par exemple des molécules virales
du VIH ou l’Interféron γ pour les LTCD4+, des Ig spécifiques
d’un antigène pour les plasmocytes. Concrètement, les cellules
sécrétrices sont déposées en nombre défini sur une membrane
de nitrocellulose sensibilisée par des Acs ou des antigènes permettant de fixer la molécule d’intérêt qui doit être sécrétée.
Après un temps d’incubation défini, les cellules sécrétrices
sont éliminées et il reste localement les produits de sécrétion
fixés à la membrane. Après une étape de révélation (réaction
colorée ou marquage fluorescent), ces produits de sécrétion
apparaissent sous forme « d’immunospots » visibles au
microscope. Chaque immunospot correspond à une cellule
sécrétrice de la molécule d’intérêt. Ainsi, la technique ELISpot
permet de détecter et de dénombrer des cellules spécifiques
(figure 6).
Les LB mémoires sont, des cellules quiescentes. Leur dénombrement par ELISpot nécessite donc une étape supplémentaire
consistant à stimuler les cellules afin qu’elles se différencient
en cellules sécrétrices d’Ig (plasmocytes, plasmablastes).
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
1) Anticorps de capture (anti-lgG, anti-lgA ou anti-lgM)
Membrane de nitrocellulose
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2) Dépôt des cellules B isolées, après activation : sécrétion d'immunoglobulines
Fixation des lg
3) Révélation des lg spécifiques du FVIII
Un spot = une cellule B mémoire
spécifique du FVIII
Facteur VIII marqué
Membrane de nitrocellulose
Figure 6. Principe de l’ELISpot. Trois grandes étapes : sensibilisation de la membrane ; capture des sécrétions cellulaires ; révélation.
Application à l’exploration
des LB mémoires spécifiques du FVIII
On sait aujourd’hui que les LB mémoires peuvent être retrouvés
dans le sang circulant. Ils sont spécifiques d’un antigène,
quiescents et à longue durée de vie. Ils participent de manière
prépondérante à la réponse immune secondaire et jouent un
rôle essentiel dans le maintien de la réponse immune spécifique. Ainsi, après réexposition à l’antigène (par exemple,
l’injection de FVIII thérapeutique) les cellules mémoires sont
capables d’une prolifération et d’une différenciation rapide
apportant une réponse de plus en plus efficace contre l’antigène cible. Les LB mémoires représentent 15 à 40 % des LB
totaux circulants chez un adultes soit moins de 0,1 % des
cellules totales du compartiment circulant [53]. La plupart
des données de la littérature concernant les LB mémoires
sont issues d’études réalisées à partir de modèles murins
d’hémophilie A sévère. Chez la souris, il a tout d’abord été
montré la persistance de cellules sécrétrices d’Acs anti-FVIII
dans la rate et la moelle osseuse après traitement par du
FVIII humain [57]. Plus récemment, un travail a rapporté que
de fortes doses de FVIII chez la souris pourraient inhiber la
restimulation des LB mémoires spécifiques du FVIII et leur différenciation en cellules sécrétrices d’Acs anti-FVIII [58]. Il existerait in vivo et in vitro un seuil d’inhibition de la réponse spécifique des LB mémoires anti-FVIII. L’inhibition est rapportée
Hématologie, vol. 16, n° 5, septembre-octobre 2010
comme étant irréversible et faisant potentiellement intervenir
la voie des caspases (enzymes impliquées dans les voies de
signalisation de l’apoptose). Ainsi l’éradication de LB mémoires spécifiques du FVIII pourrait être un événement précoce
important de l’ITI [58]. Dans un article de revue à paraître
en 2010, Reipert et al. ont étudié les mécanismes d’activation
et d’inhibition des LB mémoires à de fortes concentrations de
FVIII. L’utilisation de cellules CD138- issues de rate de souris
hémophiles traitées par FVIII a été pratiquée pour étudier la
restimulation et la différenciation des LB mémoire in vitro.
Les auteurs ont testé la modulation de l’activation de la
réponse immune cellulaire par les agonistes des récepteurs
Toll-like (TLR) 2, 3,4, 5, 7 et 9. Les ligands pour les récepteurs
TLR7 et 9 ont été les plus efficaces. Le ligand, CpG, un ligand
pour TLR 9, a exprimé des effets biphasiques. Il amplifie la
réponse B mémoire à de faibles concentrations de FVIII et
s’avère capable d’inhiber la réponse B mémoire à de fortes
concentrations de FVIII. Les deux activités de stimulation et
d’inhibition du CpG résultent d’interactions spécifiques avec
le récepteur TLR9. Ces données permettront d’améliorer les
études de la réponse mémoire chez l’homme et plus particulièrement chez le patient hémophile [59]. En effet, il existe
encore trop peu de données sur le rôle et les mécanismes
d’activation et d’inhibition des LB issues d’études chez
l’homme. Une seule étude est actuellement disponible dans
laquelle la technique ELISpot a été utilisée pour étudier les LB
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380
mémoires chez des patients HA sévères [46]. Les résultats ont
montré la présence de cellules sécrétrices d’IgG anti-FVIII
dans le sang circulant de patients avec inhibiteurs alors qu’aucune cellule sécrétrice d’IgG anti-FVIII n’était détectée chez les
patients sans inhibiteur ou traités avec succès par ITI. Ceci
suggère une disparition ou une anergie des LB mémoires
spécifiques du FVIII après traitement par ITI.
La difficulté d’une étude des mécanismes cellulaires (travail sur
du sang total, cultures cellulaires, manque de reproductibilité et
difficulté d’activation) associée à la rareté des cellules étudiées
rend les essais chez l’homme très difficiles, c’est pourquoi
la majorité des données sont issues de modèles animaux.
Des études supplémentaires chez l’homme sont nécessaires
afin de confirmer ces résultats et d’essayer de préciser le rôle
de ces LB mémoires tant dans la réponse immune que dans l’ITI.
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Conclusion
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dendritic cells. Thromb Haemost 2006 ; 96 : 309-16.
Le développement d’inhibiteurs chez les patients hémophiles
A sévères traités par du FVIII substitutif reste une complication
iatrogène redoutable. De nombreuses études s’attachent
à comprendre les mécanismes immunologiques impliqués
dans la réponse immune anti-FVIII dans le but de mieux prendre en charge, voire de prévenir le développement d’inhibiteurs. L’éradication des inhibiteurs par des protocoles d’ITI
consistant à administrer de fortes doses de FVIII reste un
phénomène mal compris. De récents progrès ont permis de
mettre en évidence les différentes cellules impliquées, à partir
notamment de modèles murins d’hémophilie A. L’importance
des LT et des LB mémoire à la fois dans le développement de
la réponse immune mais également dans la modulation de
cette réponse dans l’ITI apparaît de plus en plus évidente
mais de nouvelles approches biologiques seront nécessaires
pour mieux comprendre les mécanismes impliqués. ■
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patients hémophiles traités par FVIII ou IX d’origine plasmatique
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