Peptides et Protéines

Peptides et Protéines
I.
Introduction
 Association monomères d’AA : petit nombre : peptide / grand nombre = protéines
 Nombreuses fonctions biologiques :
o Enzymes :
anabolisme / catabolisme / site catalytique (kinase, décarboxylase)
(synthèse)
(dégradation) (galactosidase)
o Transport :
solubilisat° / protect° (transferrine = fer / céruléoplasmine = cuivre)
o Energie :
protéines à versant nutritionnel (albumine)
o Contraction : génération mouvement / modification de forme
(cellule : actine, tubuline / cytosquelette)
Tissu (complexe tertiaire : troponine I, T, C tropomyosine / cœur muscles)
Troponine Ic et Tc sont des isoformes cardiaques
o Structure :
soutien architecture tissulaire
tendons, cartilage : Collagène
Cheveux, ongles : kératine
o Défense :
Lutte contre agression d’autres espèces (ImmunoGlobuline G, M, A)
Phénomène allergique (Ig E)
Reco spé épitope (← permet de diff soi du non-soi) (Ag) par Ac
o Régulateur de l’expression génique : facteur de transcription
o Signalisation : Hormones, neurotransmetteurs, cytokines
 Signal lipidique : traverse la membrane, fixe un récepteur nucléaire
 Signal peptidique / protéique : récepteur membranaire qui va transmettre via
des second messagers, une réponse cellulaire
o Stockage : ferritine (cellulaire)
 Quatre types de Structure :
o IR : séquence d’AA sur une même chaine peptidique / protéique
o IIR : arrangement spatial (3D) d’une partie de la séquence en AA sur une même
chaine peptidique / protéique. Lui assurant une meilleure stabilité.
o IIIR : arrangement des éléments de structure IIR entre eux sur une chaine peptidique
/ protéique
o IVR : disposition entre les différentes chaines IIIR d’une protéine
 Deux types de protéines :
Rapport axial :
+ 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑑 𝑎𝑥𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡é𝑖𝑛𝑒
+ 𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡
o Globulaire : forme compacte / particules de forme sphérique en solution
Sphéroprotéines (albumine) / rapport axial (RA) < 10
o Fibreuse (fibrillaire) : Protéine à rapports axiaux élevés / scléroprotéines
(protéine de structure / kératine) / RA > 10
o Membranaire (Mb) : 1 ou plrs domaines Trans-Mb
 Dénomination :
o Selon le nombre d’AA : 2 – 20 = oligopeptide / 20 – 100 = polypeptide
> 100 = Protéine
o 1 seule chaine (sous-unité) = mono-unitaire
Plusieurs chaines (sous unité) = multi-unitaire
o Contient uniquement des AA : simples = holo-peptide / protéine
D’autres groupements : conjuguées (hétéroprotéines) avec grpt prosthétique (non protéiq)
Lipides / lipoprotéines
Glucides / glycoprotéines
Ions / métalloprotéines
 Taille et poids moléculaire variable :
~ 104 AA (cytochrome C humain) à 4536 AA (Apo B humain)
PM 13’000
PM 513’000
x 110
A. Définition / Nomenclature de la Structure IR
 Applicable peptides / protéines
 Définition : ordre d’enchainement / séquence des AA dans la molécule peptidique ou
protéique en application directe du code génétique
 1er AA : Fonction amine non engagée / partie NH2 terminale : NTER
Dernier AA : Fonction carboxylique non engagée / COOH terminale : CTER
 Lecture : NTER → CTER
 Colinéarité entre séquence nucléotidique et séquence AA
o Partie NH2 avec extrémité 5’
 Liaison entre AA : liaison peptidique / squelette molécule
B. Liaison Peptidique
 Définition : Combinaison entre groupement carboxylique d’un AA(n) et groupement amine
d’un AA suivant AA(n+1) avec expulsion d’une molécule d’eau.
 Liaison pseudo-peptidique (iso-peptidique) au sein du Glutathion
Liaison amide, mais pas carbone α du Glutarate.
→ Une liaison peptidique vraie et une pseudo
 Deux propriétés importantes d’une liaison peptidique :
o Lorsque l’on stimule cette liaison avec une lumière IR, elle absorbe.
o Un peptide / protéine soumis à de l’IR (1600-1700 cm-1) il absorbe ++
o On peut donc mesurer la teneur en protéines / peptides avec l’absorbance (dès qu’il y
a une liaison amide). Car plus la concentrat° est forte, plus l’absorbance est grande.
 Squelette de Protéine : liaison peptidique
Propriétés Physico-Chimiques : groupement R des AA
 R avec encombrement stérique : R de part et d’autre du squelette : isomérie TRANS.
 Propriétés de la liaison peptidique :
o Covalente
o Forme mésomérique / pseudo-ionisation / résonnance entre liaison simple et
double
Alternance simple / double liaison
→ liaison peptidique + grande qu’une double liaison, mais + petite qu’une simple
o Il existe une structure autour de la liaison peptidique
Assez rigide, on peut l’afficher dans un plan : structure plane
Stable
Destruction par hydrolyse : ébullition en solution aqueuse
Acide / Base forte
Enzymatique : protéase / peptidase
C. Principes d’étude de la Structure IR
 Multi Étapes :
Étape 1 : Obtention de protéines par séquençage
→ Quantité suffisante
 Purification : concentrer + enlever les molécules non protéiques
Dialyse / Lyophilisation / Ultrafiltration
 Séparation / Isolement :
o Chromatographie sur colonne (C L H P)
Gel filtration / Exclusion : Poids Moléculaire → sépare peptide / protéine
Echangeuse d’ions : Charge + ou –
Affinité : Ac-Ag / Enzyme-substrat → greffer sur la colonne, pour retenir
o Précipitation : sulfate d’ammonium / sulfate de sodium
o Électrophorèse : monodimensionnelle : gel d’agarose : électrophorèse des protéines
SDS (dodécyl sulfate de sodium → protéine -)
PAGE (Electrophorèse en gel de poly acrylamide = P.M.)
Bidimensionnelle : Selon Charge puis Poids Moléculaire
o Ultracentrifugation : constante de sédimentation (Svedberg)
 Obtention d’une Protéine recombinante : ADNc → Protéines (produite par bactéries)
Étape 2 : Protéine à 1 ou plusieurs chaines
 Principe : identification des groupes terminaux NH2 et COOH
1 chaine A : 1 groupement aminé / 1 groupement carboxylique
2 chaines A et B avec AA terminaux différents :
 2 groupements aminés / 2 groupements carboxyliques
Identification du NH2-term
 Chlorure de dansyle :
Protéine non réutilisable
N-term AA dansylé : fluorescence jaune (chromatographie / quantification)
 1 fluoro 2,4 dinitrobenzène : réaction de Sanger
Protéine non réutilisable
N-term AA-DNP (dinitrophényl Amino Acide) analysé et quantifier par Chromatographie
 Méthode enzymatique : exopeptidase
Agissent aux extrémités des peptides : aminopeptidase (N-term) et carboxypeptidase (C-term)
Endopeptidase = agit au sein de la protéine
Leucine aminopeptidase (enlève N-term AA sauf si proline)
Aminopeptidase M : toutes les N-term AA
 (Chimique) Phényl-Isothiocynate (PITC) : réaction d’Edman (séquençage)
PITC + Protéine 
Milieu alcalin
acide fort anhydre (acide trifluoro-acétique)
extraction solvant organique / traitement acide
N-term AA-PTH (Phényl-Thio-Hydantoïne)
Analyse HPLC / Chromatographie Gaz/Liquide
Intérêt : pas de dégradation protéique / réutilisation possible = séquençage possible
Identification du COOH-term
 Méthode enzymatique : exopeptidase
2 à profil non restrictif :
Carboxypeptidase C et Y
2 à profil restrictif :
Carboxypeptidase A : inactive si AAn-1 = Proline et si AAn = Arg / Lys
B : inactive si AAn-1 = Proline et si AAn ≠ Arg / Lys
Étape 3 : Nécessaire seulement si plusieurs chaines → Séparation
 Coupure Pont disulfure :
Séparation des sous-unités (chaines) liées par liaison disulfure
Disparition de conformation native de protéine
o Oxydation par Acide Performique :
Cystine (S-S) → Acide Cystéique (CH2-SO3H)
Réaction avec méthionine → méthionine sulfone
Destruction noyau indole du Tryptophane
o
Réduction par 2 mercapto-éthanol ou dithiothréitol (dithioréythritol : réactif de Cleland)
Stabilisation de S-S en SH isolés par acétylation (iodo –acétate) [= stabilisation groupements SH]
 Coupure autres liaisons :
Dénaturation par urée + chaleur / guanidium / dodécylsulfate de Sodium (SDS)
 Isolation selon la masse : SDS-PAGE
Chromato gel filtration / exclusion
Étape 4 : Composition en AA
 Hydrolyse
o Acide : HCl 6N / 100-120°C / 10-100h / sous vide / contre oxydation AA
o Basique : NaOH 2-4N / 4-8h / Température Ambiante
o Enzymatique : mélange endo et exopeptidase
Pronase : ensemble protéases de Streptomyces griseus
< 1% du poids de la Prot à cliver, sinon elle s’auto détruit : contamination
 Analyse en AA
o Dérivation : 1fluoro 2,4 dinitro-benzène
Chlorure de dansyle
Phényl-isothiocyanate
o-phtalaldéhyde + 2 mercapto-éthanol
o Séparation : chromatographie HPLC ou échangeuse d’ions
Pic : temps d’élution (identité en AA) et volume pic : quantité en AA.
Étape 5 : Séquence en AA
 Directe si < 100 AA, technique d’Edman (bloquée par glycosylation / acétylation)
On enlève via enz les sucres, acétyl …
 Après hydrolyse : si > 100 AA
Fragmentation avec différents type de coupure dont on connait le site.
Séquençage des fragments obtenus
Analyse informatique : croisement des différentes séquences obtenues
o Hydrolyse Chimique :
Bromure de Cyanogène (NCBr)
HCl 0-1N / Acide Formique 70%
Rupture spécifique CTER du résidu méthionine (Met – AA)
Hydroxylamine (Asn – Gly)
o Hydrolyse enzymatique : Endopeptidase (origine pancréas / bactérie)
(AAn-1)NH2-CO-N-C(AAn)

Chymotrypsine : coupure si AAn-1 = hydrophobe encombrant (Phe, Trp, Tyr)
Et AAn = Leu, Phe, Trp, Tyr

Trypsine : coupure si AAn-1 = Arg / Lysine
Et AAn ≠ Pro

Pepsine : coupure si AAn-1 différent de Proline
Et AAn = Leu, Phe, Trp, tyr

Clostripaïne : coupure sur Arg

Lys-Endopeptidase : (achromobacter) sur Lys / y compris Lys-Pro
 Regroupement
Combinaison de différentes hydrolyses et différentes séquences informatiques
# Nouvelles technique d’étude de la séquence primaire
 Protéomique / Peptidomique
(Electro Bi-dim + analyse par spectro. Masse)
MALDI (Matrix – Assisted laser desorption ionisation) TOF (time of fly)
1- L’échantillon de protéine cristallisé dans une matrice est ionisé par un laser
2- Un champ électrique accélère les ions
3- Les ions les plus légers arrivent en premiers sur le détecteur
Le temps de vol (TOF) dans le champ électrique est une mesure de la masse (masse/charge)
Protéolyse de la protéine par la Trypsine → mélange de peptides
Analyse en SM Maldi-Tof
Carte peptidique massique
Comparaison à un profil dans les bases de données
Protéine identifiée par le cadre peptidique
 Carte peptidique / Finger Print
Hydrolysat protéique entre protéine connue et inconnue (proximité des protéines)
Peptide → migration et séparation par :
- Electrophorèse ; SDS PAGE
- Chromato sur papier / silice
Mise en évidence des peptides différents entre les deux protéines
Séquençage des peptides différents
Application du Finger Print : Drépanocytose (anémie falciforme + Thrombose)
o Recherche des AA différents dans hémoglobine anormale
Globules rouges (Erythrocytes) :
- Hb normale majoritaire : HbA (α2β2)
-
Hb anormale : HbS
(drépanocytose)
solubilité réduite en absence d’oxygène
Précipitation dans GR
Destruction + rapide du GR (anémie)
Coupure HbS et HbA en 28 peptides via Trypsine
Séparation Electrophorèse SDS / Chromato descendante sur papier
Identification de la place des fragments par ninhydrine (chauffage 80°C)
Peptides même position
 Composition en AA identique
Peptides position différente  Composition en AA différente
1 peptide différent sur 28, séquençage du peptide :
HbA : Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys
NTER
CTER
HbS : Val – His – Leu – Thr – Pro – Val – Glu – Lys
Mutation du 6e codon GTC (Val) remplace un GAG (Glu) au sein de la chaîne
→ Interactions hydrophobes entre Val de β et Phe 85 ou Leu 88 de l’autre chaine β
Lorsqu’il n’y a pas d’O2, cette interaction réduit la solubilité de la désoxyHbS
→ Obstruction des Capillaires et formation de Thromboses
D. Intérêt de la Connaissance d’une Structure IR
 Caractéristique structurale commune : appartenance à une famille
 Lien fort entre structure IR et IIIR
 Orientation des fonctions et de la localisation des protéines :
o Présence de séquence signal NTER
 Permet le contrôle de l’export protéique
 Permet l’adressage intercellulaire
 Notion de protéines homologues : liées d’un point de vue de l’évolution
o Présence même séquence AA à un endroit défini : résidus invariants
o Présence séquence différente en AA à un endroit défini : résidus variable
 Permet d’étudier le taxonomie (lien entre différentes espèces)
+ AA proches, plus espèces proches
AA complètement différents + propriétés fonctionnelles différentes : non conservatrice
AA différents sont de même type + fonctions identiques : substitution conservatrice
II.
Structure tridimensionnelle des Protéines
A. Structure IIR
Orientation spatiale entre 2 AA adjacents au sein d’un peptide / protéine
1) Principes
 Effet mésomérique de la liaison peptidique :
o CO-NH dans un plan rigide avec O et N en TRANS sur le Carbone
o Squelette protéique : succession de groupes peptidiques au sein de
plans rigides liés entre eux
 Rotation au niveau des autres liaisons :
Degré de liberté entre Cu → C : angle de torsion de liaison ψ
N → Cα : angle de torsion de liaison Φ
 Ψ et Φ : peuvent prendre toutes les valeurs entre -180° et +180°, mais, valeur prohibée par
encombrement stérique
Vont définir une configuration à énergie minimale (représentation de Ramachandran)
2) Différents types de Structure IIR
Présence simultanée au sein d’une même séquence d’AA
Hélice alpha (α) :
 Disposition + simple d’une chaine polypeptidique (α-Kératine Pauling et Carey en 1951)
 Définition : squelette polypeptidique enroulé autour d’un axe longitudinal avec groupement
R des AA à l’extérieur du squelette hélicoïdal (aspect tire-bouchon)
 Pour les AA de type L :
o Pas droit
o Tour de l’hélice : 5,6 Å
o 3,6 AA par tour
o
o
o
o
Cœur compact (liaison hydrophobe)
Ψ : -45° à -50° et Φ : -60°
Stabilisation par liaison H : entre CO du résidu n et NH et du résidu (n + 4)
Hélice moyenne : environ 12 à 13 résidus : 18 Å
Hélice II (la + compacte : 4,4 AA / tour) – (la + étirée : 3 AA / tour)
Brin et Feuillet β :
 Définition : squelette à structure étirée en zig-zag avec des groupements R dans des
directions opposées à l’axe principal du zig-zag. C’est un structure périodique de deux AA.
 Ψ : +90° et Φ : -120°
 Distance : entre 2 structures de 2 AA : 3,5 Å
entre 2 groupements identiques sur un même brin : 7 Å
 Stabilisation par liaisons H
 Brin : impossibilité de rester isolé car non stabilisé des liaison H internes, se stabilise
via assemblage des Brins β en Feuillet β
 2 types selon orientation des chaines interagissant :
Feuillet Béta parallèle ou antiparallèle (brins β dans un sens opposé → + stable)
Coude / Courbure β (font souvent le lien entre deux Brins β)
Boucle 
3) Exemple de Structure IIR
Collagène : environ 30 variétés (osef) / 25% masse totale protéique extracellulaire
Formé d’hélice α à pas gauche → 3 chaines de 350 AA
Super hélice à pas droit : fibrillaire de 300nm de long / 1,5 nm de diamètre / 1050 AA
(Tropocollagène)
 12 à 14% de 3, 4 ou 5 OH-Proline (interactions avec eau en périphérie)
Transformation Proline → OH-Proline (Proline hydroxylase)

Nécessite Vit C / si absence : fragilité du collagène → scorbut
Problèmes avec les ongles, cheveux, dents qui tombent …
 Réticulation (resserré en interne) du collagène (pontage entre triple hélice) :


LO
1 chaine Lys 
1 chaine Lys 
Concerne les résidus de Lysine
Intervention de Lysyl-Oxydase (LO)
1 chaine allysine
1 chaine allysine


pontage
aldolique
allysine
aldol
Réact° entre Lys CTER d’une triple hélice et Lys NTER d’une autre triple hélice
Origine insolubilité aqueuse / 50nm de ø
(pas de dispersions, mais interactions)
 Déficit de fonctionnement de lysyloxydase (LO) : Collagène + Elastine
 Anomalie génétique : Syndrome d’Ehlers-Danlos
Hyper extensibilité des Articulations / de la Peau
 Ostéolathyrisme :
Ingestion de graines de pois sucré (Lathyrus Odoratus)
Présence de β-aminoproprionitrile : inhibiteur LO
→ anomalies os, articulation, vaisseaux sanguins
B. Structure IIIR
1) Généralités
 Association des éléments de structure IIaire
 Prise en compte de l’ensemble des AA et non pas des AA adjacents (Iaires)
 Mise en évidence expérimentale :
diffraction rayons X
RMN multidimensionnelle
 Destruction structure IIIaire : dénaturation
 Irréversible (+++) / réversible (+)
 Par : chaleur : cassure des interactions faibles (albumine, blanc d’œuf, …)
pH extrême : modif électrostatiques → Répulsion des AA entre eux
phénol, alcool, acétone, urée, guanidium ou détergents = rupture des liaisons
hydrophobes
 Renaturation : reprise structure IIIR
 Possible (preuve expérimentale sur la Ribonucléase in vitro)
 In vivo : spontané
Intervention protéines aidant la protéine à se replier correctement
 Protéines Chaperonnes / Chaperonines
Membre de la famille des HSP
Protéines présentes lors de la synthèse protéique pour éviter l’agrégation
non spécifique / repliement inadéquat
2) Différents types de structure IIIR
# MOTIF :
Structure Super Secondaire
 Groupement d’éléments structuraux IIaires formant un ensemble stable
 Simple : βαβ : 2 feuillets β séparés par une hélice α
 Complexe : 4 résidus de Cystéine ou deux de Cystéine + 2 Histidine sur un Zinc
(retrouvé dans les facteurs de transcription : LXR, récepteur nucléaire qui interagit
avec le promoteur du gène dont il régule la transcription en repérant une zone cible
LXRE)
# DOMAINE :
 Unité structurelle indépendante dans une protéine isolable ayant des caractéristiques proches
d’une petite protéine globulaire
 Regroupant 1 à plusieurs motifs (identiques ou différents)
 Taille : 40 – 400 AA
 1 Domaine : souvent codé par un exon
 1 Protéine peut contenir plusieurs domaines différents
 1 Domaine doté d’une fonction spé biologique dans la protéine
Ex : Récepteur Nucléaire aux Rétinoïdes (RAR)
NTER
CTER
A/B
Domaine de transcription
ligand indépendant (AF1)
C
D
E/F
Domaine de transcription
ligand indépendant (AF2)
Domaine fixation ADN (2 feuillets β, 1 hélice α
de 10 AA contact grand sillon ADN)
2 doigts de Zinc
Fixation hélice
Structure tertiaire et pathologie : le prion
 Encéphalopathie spongiforme :
Tremblante du Mouton (scrapie)
Encéphalopathie spongiforme bovine (ESB)
Kuru (homme)
Maladie de Creutzfeldt Jacob (homme)
>> démence, coma, décès
 Maladie de Creutzfeld Jacob : Protéine prion PrP
 Forme héréditaire
 Forme Transmissible ATNC (Agent Transmissible Non Conventionnel) par
alimentation, greffe tissu contaminé, chirurgie touchant des patients atteints…
 Découvert en 1996
 PrPc (cellular) : protéine normale Facilement soluble
Facilement dégradée (protéase)
Forme d’hélice α et de boucle
 PrPsc (scrapie) : protéine anormale insoluble / non dégradée (protéase)
Formée feuillet β
Dépôt intracérébrale : mort cellulaire neuronale
 Maladie de Creutzfeld Jacob : Protéine prion PRP
 Héréditaire : Anomalie dans séquence AA (20 mutations)
Moins stable donc se met en conformation feuillet β
Mise en conformation PrPsc
Mauvais repliement → Dépôt Amyloïde (dépôt Prot insolubles ds tissus)
 Transmissible : Apport PrPsc
Même séquence Iaire en AA
Transformation des PrPc en PrPsc
(hélice α en feuillet β)
Formation de dépôts amyloïdes
Mort Cellulaire
Neurodégénération
Début de signes Cliniques (→ mort)
C. Structure Quaternaire
 Applicable quand protéine composée de plusieurs chaines et sous-unités identiques ou
différentes
 Définition : niveau d’organisation, de différentes sous-unités entre elles
 Stabilisation des différentes sous-unités : liaison H +++
Pont disulfure (parfois)
 Protéine formée : - de nombre pair ou impair de sous-unités
- de sous-unités identiques : protéine oligomérique
→ Chaque sous-unité identique est appelée Protomère
Ex : Hémoglobine α2β2 : Oligomère à 2 Protomères
 2 types de fonctionnement des sous-unités entre elles :
 Indépendantes
 Coopératives : activité d’une sous-unité dépendant d’une autre
-
Positive :
Fixation d’un ligand sur une sous-unité
Fixation du ligand favorisée sur les autres-sous unités
-
Négative :
Fixation d’un ligand sur une sous-unité
Fixation du ligand inhibée sur les autres-sous unités
-
Allostérique : Capacité des sous-unités de bouger les unes par rapport aux autres
et/ou de changer de conformation spatiale
o Mineure : hémoglobine : capable de prendre des conformations différentes
(réversibles et voisines) en fonction de la fixation ou non de l’oxygène
o Majeure : régulation enzymatique
Protéine Kinase A :
(PKA)
2 sous unités régulatrices ® sensibles à AMPc
2 sous unités catalytiques ©
Fixation AMPc sur sous unité R → libération des sous-unités C
 Enzyme inactive vers active → Phosphorylation protéines cibles (Ser, Thr, Tyr)
 Complexe supramoléculaire : association de plusieurs protéines formées de plusieurs sousunités
Ex : Kératine → Macrofibrille → Cheveu
Hélice α → Super-hélice → Protofilament → Microfibrille → cheveu