Peptides et Protéines

Peptides et Protéines
I. Introduction
 Association monomères d’AA : petit nombre : peptide / grand nombre = protéines
 Nombreuses fonctions biologiques :
o Enzymes : anabolisme / catabolisme / site catalytique (kinase, décarboxylase)
(synthèse) (dégradation) (galactosidase)
o Transport : solubilisat° / protect° (transferrine = fer / céruléoplasmine = cuivre)
o Energie : protéines à versant nutritionnel (albumine)
o Contraction : génération mouvement / modification de forme
(cellule : actine, tubuline / cytosquelette)
Tissu (complexe tertiaire : troponine I, T, C tropomyosine / cœur muscles)
Troponine Ic et Tc sont des isoformes cardiaques
o Structure : soutien architecture tissulaire
tendons, cartilage : Collagène
Cheveux, ongles : kératine
o Défense : Lutte contre agression d’autres espèces (ImmunoGlobuline G, M, A)
Phénomène allergique (Ig E)
Reco spé épitope (← permet de diff soi du non-soi) (Ag) par Ac
o Régulateur de l’expression génique : facteur de transcription
o Signalisation : Hormones, neurotransmetteurs, cytokines
 Signal lipidique : traverse la membrane, fixe un récepteur nucléaire
 Signal peptidique / protéique : récepteur membranaire qui va transmettre via
des second messagers, une réponse cellulaire
o Stockage : ferritine (cellulaire)
 Quatre types de Structure :
o IR : séquence d’AA sur une même chaine peptidique / protéique
o IIR : arrangement spatial (3D) d’une partie de la séquence en AA sur une même
chaine peptidique / protéique. Lui assurant une meilleure stabilité.
o IIIR : arrangement des éléments de structure IIR entre eux sur une chaine peptidique
/ protéique
o IVR : disposition entre les différentes chaines IIIR d’une protéine

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 Deux types de protéines :
Rapport axial : + 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑑 𝑎𝑥𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡é𝑖𝑛𝑒
+ 𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡
o Globulaire : forme compacte / particules de forme sphérique en solution
Sphéroprotéines (albumine) / rapport axial (RA) < 10
o Fibreuse (fibrillaire) : Protéine à rapports axiaux élevés / scléroprotéines
(protéine de structure / kératine) / RA > 10
o Membranaire (Mb) : 1 ou plrs domaines Trans-Mb
 Dénomination :
o Selon le nombre d’AA : 2 – 20 = oligopeptide / 20 – 100 = polypeptide
> 100 = Protéine
o 1 seule chaine (sous-unité) = mono-unitaire
Plusieurs chaines (sous unité) = multi-unitaire
o Contient uniquement des AA : simples = holo-peptide / protéine
D’autres groupements : conjuguées (hétéroprotéines) avec grpt prosthétique (non protéiq)
Lipides / lipoprotéines
Glucides / glycoprotéines
Ions / métalloprotéines
 Taille et poids moléculaire variable :
~ 104 AA (cytochrome C humain) à 4536 AA (Apo B humain)
PM 13’000 PM 513’000
A. Définition / Nomenclature de la Structure IR
 Applicable peptides / protéines
 Définition : ordre d’enchainement / séquence des AA dans la molécule peptidique ou
protéique en application directe du code génétique
 1er AA : Fonction amine non engagée / partie NH2 terminale : NTER
Dernier AA : Fonction carboxylique non engagée / COOH terminale : CTER
 Lecture : NTER → CTER
 Colinéarité entre séquence nucléotidique et séquence AA
o Partie NH2 avec extrémité 5’
 Liaison entre AA : liaison peptidique / squelette molécule

B. Liaison Peptidique
 Définition : Combinaison entre groupement carboxylique d’un AA(n) et groupement amine
d’un AA suivant AA(n+1) avec expulsion d’une molécule d’eau.
 Liaison pseudo-peptidique (iso-peptidique) au sein du Glutathion
Liaison amide, mais pas carbone α du Glutarate.
→ Une liaison peptidique vraie et une pseudo
 Deux propriétés importantes d’une liaison peptidique :
o Lorsque l’on stimule cette liaison avec une lumière IR, elle absorbe.
o Un peptide / protéine soumis à de l’IR (1600-1700 cm-1) il absorbe ++
o On peut donc mesurer la teneur en protéines / peptides avec l’absorbance (dès qu’il y
a une liaison amide). Car plus la concentrat° est forte, plus l’absorbance est grande.
 Squelette de Protéine : liaison peptidique
Propriétés Physico-Chimiques : groupement R des AA
 R avec encombrement stérique : R de part et d’autre du squelette : isomérie TRANS.
 Propriétés de la liaison peptidique :
o Covalente
o Forme mésomérique / pseudo-ionisation / résonnance entre liaison simple et
double
Alternance simple / double liaison
→ liaison peptidique + grande qu’une double liaison, mais + petite qu’une simple
o Il existe une structure autour de la liaison peptidique
Assez rigide, on peut l’afficher dans un plan : structure plane
Stable
Destruction par hydrolyse : ébullition en solution aqueuse
Acide / Base forte
Enzymatique : protéase / peptidase
C. Principes d’étude de la Structure IR
 Multi Étapes :
Étape 1 : Obtention de protéines par séquençage
→ Quantité suffisante
 Purification : concentrer + enlever les molécules non protéiques
Dialyse / Lyophilisation / Ultrafiltration

 Séparation / Isolement :
o Chromatographie sur colonne (C L H P)
Gel filtration / Exclusion : Poids Moléculaire → sépare peptide / protéine
Echangeuse d’ions : Charge + ou –
Affinité : Ac-Ag / Enzyme-substrat → greffer sur la colonne, pour retenir
o Précipitation : sulfate d’ammonium / sulfate de sodium
o Électrophorèse : monodimensionnelle : gel d’agarose : électrophorèse des protéines
SDS (dodécyl sulfate de sodium → protéine -)
PAGE (Electrophorèse en gel de poly acrylamide = P.M.)
Bidimensionnelle : Selon Charge puis Poids Moléculaire
o Ultracentrifugation : constante de sédimentation (Svedberg)
 Obtention d’une Protéine recombinante : ADNc → Protéines (produite par bactéries)
Étape 2 : Protéine à 1 ou plusieurs chaines
 Principe : identification des groupes terminaux NH2 et COOH
1 chaine A : 1 groupement aminé / 1 groupement carboxylique
2 chaines A et B avec AA terminaux différents :
 2 groupements aminés / 2 groupements carboxyliques
Identification du NH2-term
 Chlorure de dansyle :
Protéine non réutilisable
N-term AA dansylé : fluorescence jaune (chromatographie / quantification)
 1 fluoro 2,4 dinitrobenzène : réaction de Sanger
Protéine non réutilisable
N-term AA-DNP (dinitrophényl Amino Acide) analysé et quantifier par Chromatographie
 Méthode enzymatique : exopeptidase
Agissent aux extrémités des peptides : aminopeptidase (N-term) et carboxypeptidase (C-term)
Endopeptidase = agit au sein de la protéine
Leucine aminopeptidase (enlève N-term AA sauf si proline)
Aminopeptidase M : toutes les N-term AA
 (Chimique) Phényl-Isothiocynate (PITC) : réaction d’Edman (séquençage)
PITC + Protéine  acide fort anhydre (acide trifluoro-acétique)
Milieu alcalin extraction solvant organique / traitement acide
N-term AA-PTH (Phényl-Thio-Hydantoïne)
Analyse HPLC / Chromatographie Gaz/Liquide
Intérêt : pas de dégradation protéique / réutilisation possible = séquençage possible

Identification du COOH-term
 Méthode enzymatique : exopeptidase
2 à profil non restrictif :
Carboxypeptidase C et Y
2 à profil restrictif :
Carboxypeptidase A : inactive si AAn-1 = Proline et si AAn = Arg / Lys
B : inactive si AAn-1 = Proline et si AAn ≠ Arg / Lys
Étape 3 : Nécessaire seulement si plusieurs chaines → Séparation
 Coupure Pont disulfure :
Séparation des sous-unités (chaines) liées par liaison disulfure
Disparition de conformation native de protéine
o Oxydation par Acide Performique :
Cystine (S-S) → Acide Cystéique (CH2-SO3H)
Réaction avec méthionine → méthionine sulfone
Destruction noyau indole du Tryptophane
o Réduction par 2 mercapto-éthanol ou dithiothréitol (dithioréythritol : réactif de Cleland)
Stabilisation de S-S en SH isolés par acétylation (iodo –acétate) [= stabilisation groupements SH]
 Coupure autres liaisons :
Dénaturation par urée + chaleur / guanidium / dodécylsulfate de Sodium (SDS)
 Isolation selon la masse : SDS-PAGE
Chromato gel filtration / exclusion
Étape 4 : Composition en AA
 Hydrolyse
o Acide : HCl 6N / 100-120°C / 10-100h / sous vide / contre oxydation AA
o Basique : NaOH 2-4N / 4-8h / Température Ambiante
o Enzymatique : mélange endo et exopeptidase
Pronase : ensemble protéases de Streptomyces griseus
< 1% du poids de la Prot à cliver, sinon elle s’auto détruit : contamination