Année 2013 Thèse n°2045 THÈSE pour le DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé Mention : Sciences, Technologie, Santé Spécialité : Neurosciences Présentée et soutenue publiquement Le 13 Décembre 2013 Par Julien Courtin Rôle des interneurones corticaux parvalbuminergiques dans les comportements de peur Membres du Jury M. Thomas Boraud (DR-CNRS Bordeaux) ............................................Président Mme Thérèse Jay (DR-INSERM Paris) ..................................................Rapporteur M. Bruno Poucet (DR-CNRS Aix-Marseille) .........................................Rapporteur M. Karim Benchenane (CR1-CNRS Paris) .............................................Examinateur M. François Georges (CR1-CNRS Bordeaux) ........................................Examinateur M. Cyril Herry (CR1-INSERM Bordeaux) .............................................Directeur de thèse Année 2013 Thèse n°2045 THÈSE pour le DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2 Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé Mention : Sciences, Technologie, Santé Spécialité : Neurosciences Présentée et soutenue publiquement Le 13 Décembre 2013 Par Julien Courtin Role of cortical parvalbumin interneurons in fear behaviour Membres du Jury M. Thomas Boraud (DR-CNRS Bordeaux) ............................................Président Mme Thérèse Jay (DR-INSERM Paris) ..................................................Rapporteur M. Bruno Poucet (DR-CNRS Aix-Marseille) .........................................Rapporteur M. Karim Benchenane (CR1-CNRS Paris) .............................................Examinateur M. François Georges (CR1-CNRS Bordeaux) ........................................Examinateur M. Cyril Herry (CR1-INSERM Bordeaux) .............................................Directeur de thèse INTRODUCTION L’identification des mécanismes neuronaux permettant le contrôle des comportements représente un des challenges les plus importants de la recherche en neurosciences. L’une des principales fonctions du cerveau est sa capacité à adapter le comportement en fonction de la nature des informations internes ou environnementales disponibles. Cette fonction est en partie soutenue par des processus d'apprentissage et de mémoire. Alors que les mécanismes cellulaires et moléculaires soutenant ces processus sont désormais relativement bien décrits, l'implication des circuits neuronaux et leurs éléments cellulaires contrôlant l'activité neuronale au cours de l'apprentissage et de la mémoire restent largement inconnus. Depuis de nombreuses années, le conditionnement auditif de peur de type Pavlovien est intensivement utilisé en laboratoire pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des apprentissages associatifs. Dans sa forme la plus couramment utilisée, ce conditionnement consiste à associer un son initialement neutre (le stimulus conditionnel, ou SC) à un stimulus aversif (le stimulus inconditionnel, ou SI, en générale un choc électrique périphérique). La présentation ultérieure du SC induit un ensemble de modifications comportementales et neurovégétatives (réponses conditionnées), en particulier une réaction d’arrêt comportemental (réponse émotionnelle conditionnée d'immobilisation ou «freezing») aisément quantifiable. A la suite du conditionnement auditif de peur, la présentation répétée du SC en l'absence du SI induit une diminution progressive des réponses conditionnées de peur, un phénomène appelé extinction de la peur (Myers et Davis, 2007). L’extinction résulterait de la mise en place d’un nouvel apprentissage au cours duquel les animaux apprennent que le SC n'est plus suivi de conséquences aversives ce qui inhiberait l’apprentissage initial du conditionnement de peur sans l’effacer (Pavlov, 1927). Cette hypothèse est soutenue par le fait que, à la suite de l'extinction, les réponses conditionnées de peur peuvent réapparaître avec le simple passage du temps (« spontaneous recovery ») (Quirk, 2002), un changement de contexte («renewal ») (Bouton et King, 1983), ou une réexposition au SI («reinstatement ») (Rescola et Heth, 1975). L'apprentissage de l'extinction peut conduire à la formation d’une mémoire d'extinction à court et long-terme dont le rappel dépend du contexte dans lequel la procédure d’extinction a eu lieu (Bouton et al., 2006; Herry et al., 2010). Ainsi, les mémoires de peur et d'extinction coexistent et interagissent pour réguler le comportement de la peur (Herry et al., 2008). Au cours des dernières décennies, l’étude des substrats neuronaux et des mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent les différentes phases du comportement de peur conditionnée a fait l’objet d’un nombre important de travaux (Johansen et al., 2011; Maren, 2001; pour revue voir Maren and Quirk, 2004). Ces travaux ont notamment démontré à l'aide de techniques variées que l’amygdale, une structure du lobe temporal médian, joue un rôle critique dans l’acquisition, l’expression et l’extinction des mémoires associatives de peur (Davis 2000; Herry et al., 2010; Johansen et al, 2011; LeDoux, 2000; Maren, 2001; Pape and Pare 2010). L'amygdale comprend plusieurs noyaux anatomiquement et fonctionnellement distincts dont les noyaux latéral (LA), basal (BA) (l'ensemble formant le complexe basolatérale de l'amygdale (BLA)) et central (CEA). Au cours du conditionnement de peur, le LA et le CEA sont considérés comme étant les sites privilégiés ou se mettent en place les phénomènes de plasticité neuronale qui sous-tendent l'acquisition du conditionnement (Ciocchi et al., 2010; Maren, 2001; Mckernan et ShinnickGallagher, 1997; Rogan et al., 1997; Schafe et LeDoux, 2008; Wilensky et al., 2006). A la suite de l'acquisition de la peur, de nombreuses données indiquent que les processus d'apprentissage de l'extinction impliquent le BLA et que les réponses de peur conditionnées sont contrôlées par les circuits du CEA (Cassell et Wright, 1986; Ciocchi et al., 2010; Herry et al., 2006, 2008, 2010; Hopkins et Holstege, 1978; Sotres -Bayon et al., 2007; Veening et al., 1984). Bien que la plupart des recherches se soient focalisées sur le rôle joué par les circuits neuronaux de l’amygdale dans le comportement de peur, certaines études ont également mis en évidence le rôle essentiel du cortex dans la régulation des mémoires de peur (Herry et al., 2010; Sotres-Bayon et Quirk, 2010; Quirk et Mueller, 2008; Weinberger, 2004). En effet, au cours de la dernière décennie, une quantité considérable d'études impliquent le cortex auditif (AC) et le cortex préfrontal médian (mPFC) dans les comportements de peur. En particulier, il a été montré que le AC joue un rôle important dans l'acquisition du conditionnement auditif de peur alors que le mPFC serait impliqué dans les phases de consolidation de l'apprentissage de l'extinction et d'expression des mémoires de peur et d'extinction (Sotres -Bayon et Quirk, 2010; Suga et Ma, 2003; Weinberger, 2004). En dépit de ces nombreux progrès, les caractéristiques anatomiques et fonctionnelles des différents circuits corticaux et de leurs éléments neuronaux qui sous-tendent les comportements de peur restent largement inconnus. Comme tous les cortex, le AC et le mPFC se composent principalement de neurones pyramidaux glutamatergiques (PN) et d'interneurones inhibiteurs GABAergiques (IN) distribués dans six couches corticales. Pour comprendre l’organisation anatomique et fonctionnelle du cortex, il est important de connaître les caractéristiques et spécificités des PNs et INs constituant les circuits corticaux. Les PNs, aussi appelés neurone principaux ou de projection représentent la vaste majorité des neurones corticaux (70-80%). Ils utilisent le glutamate comme neurotransmetteur et sont localisés dans les différentes couches corticales, à l’exception de la couche 1 (DeFelipe et Farinas, 1992). Les PNs représentent à la fois les principaux éléments de réception des afférences synaptiques extra-corticales et quantitativement la principale voie de sortie des informations corticales (DeFelipe and Farinas, 1992, Nieuwenhuys, 1994, Spruston, 2008). De façon intéressante, la répartition de leurs entrées synaptiques au niveau leurs compartiments dendritiques, somatiques ou encore axonales dépend de la nature de l'entrée. En particulier, les entrées synaptiques excitatrices contactent préférentiellement les épines dendritiques (DeFelipe et Farinas, 1992; Nieuwenhuys, 1994; Spruston, 2008), tandis que les entrées inhibitrices locales émanant des différentes sous-populations d'interneurones ciblent différentiellement les compartiments sub-cellulaires. Le cortex contient également des INs qui peuvent se trouver dans toutes les couches corticales et qui représentent environ 20-30% des neurones corticaux (DeFelipe et Farinas, 1992). Les INs, aussi appelé neurones non-pyramidaux, inhibiteurs ou locaux sont généralement dépourvus d’épines dendritiques et libèrent l'acide gamma-aminobutyrique (GABA). Mis à part quelques exceptions, leurs axones ne quittent pas le cortex et sont limités à un environnement local (Gonchar et al., 1995; Letinic et al., 2002). Il existe une grande diversité d’INs qui peuvent être classés en plusieurs types sur la base de critères anatomiques, neurochimiques et électrophysiologiques (Ascoli et al., 2008; DeFelipe et al., 2013; Gupta et al., 2000; Markram et al., 2004). En utilisant des techniques anatomiques, les INs peuvent être groupés en fonction de leurs profiles somato-dendritiques (Ascoli et al., 2008; Markram et al., 2004). De façon intéressante, certains INs sont spécialisés dans l’inhibition sélective des différents compartiments sub-cellulaires des PNs ou d’autres types d’INs. Au niveau neurochimique, plusieurs catégories de molécules sont utilisées pour distinguer les différent types d’INs (Ascoli et al., 2008; Burkhalter, 2008; DeFelipe, 1997; Markram et al., 2004). Ils en est de même leurs propriétés électrophysiologiques (Cauli et al., 1997; Markram et al., 2004; Sugino et al., 2006; Toledo-Rodriguez et al., 2004). Il est important de noter qu’aucun de ces critères ne permet à lui seul de classer les différents INs. Par conséquent, la combinaison de plusieurs critères représente la solution privilégiée pour identifier les sous-types d’INs spécifiques (Cauli et al., 1997; Markram et al., 2004; Sugino et al., 2006; Toledo-Rodriguez et al., 2004). En raison de leur grande diversité, il est désormais admis que les différents types d’INs supportent des fonctions distinctes et que chacun régulent différemment l'activité corticale. Ainsi, la connaissance détaillée des fonctions des différents INs est une condition indispensable pour comprendre l'organisation fonctionnelle des circuits neuronaux corticaux. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont notamment démontré le rôle important joué par une sous-population d’INs dans la régulation de l’activité de sortie des PNs. C’est INs sont spécialisés dans l’inhibition des compartiments somatiques et axonaux des PNs, ils présentent une fréquence de décharge élevée et expriment la parvalbumine (INs PV). Alors que les propriétés anatomiques et électrophysiologiques des INs PV corticaux sont bien décrites, leur rôle fonctionnel dans l'acquisition et l'expression de la mémoire de peur conditionnée est largement inconnue. Dans ce contexte, l’objectif de mes travaux de thèse a été de définir le rôle des INs PV corticaux dans l’acquisition et l’expression des réponses conditionnées de peur. Pour cela, nous avons utilisé une combinaison d’approches comportementales, pharmacologiques, électrophysiologiques d'enregistrements extracellulaires et optogénétiques chez l’animal vigile au cours des différentes phases du comportement de peur. RESULTATS 1er partie : Rôle des circuits inhibiteurs du cortex auditif contrôlant l’acquisition des réponses de peur conditionnées Pendant les premiers mois de ma thèse, en collaboration avec le groupe du Dr Andreas Lüthi, à Bâle, en Suisse, nous avons évalué le rôle des INs PV du AC dans l'acquisition du conditionnement auditif de peur. Dans un premier temps, nos collaborateurs ont démontré à l'aide d’inactivations réversibles et ciblées, que le AC est nécessaire à l’acquisition du conditionnement de la peur lorsque les SC mis en jeu sont des sons complexes (Letzkus et al., 2011). Puis, en utilisant de l'imagerie calcique chez l’animal anesthésié ils ont observé que la grande majorité des INs du cortex auditif de la couche 1 (L1) étaient fortement activés lors de la présentation des chocs électriques. Ils ont ensuite montré que l’activation des INs L1 dépend des afférences cholinergiques provenant du cerveau basal antérieur, une des principales sources d’acétylcholine dans le cerveau. Dans un deuxième temps, ils ont évalué l’impact de l’activation des INs L1 sur l’activité des microcircuits locaux. En utilisant des approches pharmacologiques, ils ont notamment démontré que l'activation des INs L1 entraîne une forte inhibition de la majorité des INs parvalbuminergiques (INs PV) des couches corticales 2/3 (L2/3). L'ensemble de ces résultats montrent qu’au cours du conditionnement, la présentation des chocs électriques induit l'inhibition des INs PV L2/3 ce qui a pour conséquence de désinhiber les PNs L2/3. Enfin, en utilisant des approches optogénétiques au cours du conditionnement auditif de peur ils ont pu montrer que l’activation optique des INs PV L2/3 pendant les présentations des SI bloque l’acquisition du conditionnement de peur. Ma contribution à ce travail a consisté à évaluer si le mécanisme désinhibiteur dépendant des INs PV était également observé chez l’animal vigile. En utilisant des enregistrements électrophysiologiques unitaires chez la souris vigile, nous avons montré qu’au cours de l'acquisition du conditionnement auditif de peur, la présentation des SI (qui consiste à une stimulation électrique de la paupière) est associée à une forte inhibition des INs PV présumés ainsi qu’à la désinhibition des PNs présumés des couches superficielles du AC. 2ème partie : Rôle des circuits préfrontaux inhibiteurs dans le contrôle de l’expression des réponses de peur conditionnées Le deuxième objectif de ma thèse était de déterminer le rôle des INs corticaux dans l'expression de la mémoire de peur conditionnée. Etant donné que de nombreuses études indiquent que le mPFC, en particulier sa portion dorsale, est fortement impliqué dans l'expression de la mémoire de peur, nous nous sommes concentrés sur l’étude des INs de cette structure neuronale. En utilisant des enregistrements électrophysiologiques unitaires chez la souris libre de se comporter, nous avons caractérisé les changements d'activité des neurones préfrontaux évoqués par la présentation du stimulus conditionné (le SC+, associé au SI au cours de conditionnement). Nous avons par la suite corrélé ces changements d’activité à l'expression du comportement de peur, c’est-à-dire le freezing. De façon intéressante, nous avons identifiés deux sous-populations d’INs présentant des patrons de décharge antagonistes lors de la présentation des SC+. En particulier, alors que les INs de la première population, que nous avons nommé IN de Type 1, sont fortement activés à la suite de la présentation des SC+, les INs de la deuxième population, les INs de Type 2, sont fortement inhibés. Le patron de décharge opposé des INs de Type 1 et 2 suggère qu’ils pourraient être fonctionnellement connectés et que l’inhibition des INs de Type 2 pourrait être induite localement par les INs de Type 1. Nous avons confirmé cette hypothèse par la mise en œuvre d’analyses de connectivité fonctionnelle et d’analyses des latences d'apparition des réponses évoquées par le son conditionné. Des analyses plus poussées nous ont permis de montrer par la suite que les modifications d’activité neuronale des INs de Type 2 précèdent et prédisent les réponses comportementales de peur des animaux. Ces données suggèrent donc que les modifications d'activité neuronales qui se produisent au sein de la population d’IN de Type 2 contrôlent précisément l’expression de la peur conditionnée. En plus de leur apparent rôle fonctionnel dans l’expression de le peur conditionnée, les INs de Type 2 présentent une fréquence de décharge élevée et une activité neuronale fortement modulée par les oscillations thêta (gamme de fréquence comprise entre 4 et 12 Hz). Ces propriétés suggèrent fortement que les INs de Type 2 correspondent aux interneurones à forte fréquence de décharge exprimant la parvalbumine largement décrit dans la littérature (Markram, 2004). En utilisant une combinaison d’enregistrements électrophysiologiques unitaires couplés à des approches optogénétiques qui permettent la manipulation en temps réel à la hausse ou à la baisse de l’activité neuronale, nous avons démontré que les INs de Type 2 inhibés par le SC+ sont effectivement des INs PV. Par ailleurs, nous avons montré de façon causale que l'inhibition des INs PV de Type 2 induisait l’expression de la peur conditionnée. Nous avons identifiés deux mécanismes principaux par lesquels les INs de Type 2 régulent l’expression des réponses conditionnées de peur: un premier mécanisme de désinhibition des PNs préfrontaux qui résulte d’une levée de l’inhibition exercée par les INs de Type 2 lorsqu’ils sont inhibés au cours de la présentation des SC+, et un deuxième mécanisme de réinitialisation de la phase des oscillations thêta (phénomène de resetting de phase) qui permet notamment la synchronisation de l’activité de décharge des PNs préfrontaux désinhibés. De plus, nous avons démontré par l’utilisation d’approches d’inactivation pharmacologiques du septum médian et de manipulation optogénétiques des INs PV de Type 2, que ce phénomène de réinitialisation de la phase des oscillations thêta était un phénomène local ayant pour origine l’inhibition des INs de Type 2. Dans une dernière expérience, nous avons démontré en utilisant des stimulations extracellulaires que les PNs désinhibés ciblent préférentiellement le BLA, une structure fortement impliquée dans la régulation des réponses émotionnelles de peur. Nos résultats mettent en évidence deux mécanismes neuronaux complémentaires dépendant des INs PV préfrontaux qui coordonnent et organisent avec précision l’activité neuronale des neurones pyramidaux du préfrontal pour contrôler l'expression de la peur. Ces résultats sont résumés dans le schéma ci-dessous. a b IN IN présmé de Type 1 PV IN de Type 2 PN projetant sur le BLA CS+ PV PN -400 IN c PN PN 0 400 -400 0 400 Time (ms) -400 0 400 SC+ dmPFC LFP (8 – 12 Hz) PV PN IN Type 1 PV IN Type 2 IN PN projetant sur le BLA BLA 100 ms Circuit désinhibiteur préfrontal contrôlant l’expression de la peur conditionnée. a, Résumé schématique du circuit désinhibiteur préfrontal composé d’INs de Type 1 (marron) contactant les INs PV de Type 2 (rose) et les cibles de ces derniers, les PNs projetant dans le BLA (gris). b Schéma représentants la désinhibition des PNs préfrontaux pendant des états comportementaux de peur élevée. c, Principes de désinhibition et synchronisation des PNs projetant dans le BLA via l'inhibition des INs PV de Type 2 et la réinitialisation des oscillations thêta locales. CONCLUSIONS Au cours de mes travaux doctoraux, nous avons pu montrer que le AC et le mPFC contiennent chacun un microcircuit désinhibiteur impliquant les INs PV qui permet respectivement l'acquisition et l'expression de la mémoire de peur conditionnée. Dans leur ensemble, ces données mettent en évidence que la désinhibition joue un rôle important dans les comportements de peur en permettant l’association entre des informations comportementalement pertinentes, en sélectionnant les éléments spécifiques du circuit et en orchestrant l'activité neuronale des neurones pyramidaux. Des études supplémentaires seront néanmoins nécessaires pour comprendre avec précision les mécanismes neuronaux permettant l’émergence et la réinitialisation de la phase des oscillations thêta locales au cours de l’expression des réponses conditionnées de peur.