symptome biochimique

Enzymologie
Intéret de lʼenzymologie :
Activité enzymatique dʼun liquide biologique :
- symptome biochimique (lyse cellulaire) : les enzymes sont intracellulaires
- surveillance dʼune maladie
- explication pathogénique de la maladie
- détection de la présence dʼune enzyme
Outil analytique permettant le dosage dʼun substrat.
I- Définition- Nomenclature
Définitions : cʼest un catalyseurs biologiques qui a une vitesse de réaction élevée et une
spécificité qui va lui permettre dʼéliminer la formation de sous-produits. Pratiquement
toutes les réactions biochimiques sont catalysées par les enzymes.
Classification et nomenclature :
Par le substrat de lʼenzyme :
- Amidon
Amylase
- Lipides
Lipase
- Protéines
Protéases
Par le type de réaction catalysée :
- Déshydorgénases
- Oxydases
- Décarboxylases
Classification internationale (UIBBM)
Classe 1 : oxydo-réductases (un substrat va sʼoxyder et une autre molécule va se réduire
et inversement : réaction dʼoxydo-réduction)
Classe 2 : transférases (enzymes qui vont transférer des groupements chimiques)
Classe 3 : hydrolases (hydrolyse dʼun substrat, intervention de lʼeau)
Classe 4 : lyases (enzymes qui vont enlever au substrat un groupe et vont créer une
double liaison et inversement)
Classe 5 : isomérases (transformation dʼun substrat en son isomère)
Classe 6 : ligaes (liaisons C-S, C-C, C-N, C-O)
Ces classes sont divisées en sous-classes et en sous-sous-classes.
EX : Créatine Kinase : CK
Réaction catalysée :
ATP + Créatine ADP + Créatine phosphate
Enzyme : ATP Créatine Phosphotransférase (EC 2 7 3 2) CK
2 : classe des transférases
7 : sous classe des phosphotransférases
3 : sous classe des phos fonctionnant avec un accepteur azoté (la créatine)
2 : numéro de lʼenzyme à lʼintérieur de la sous-sous classe
L-lactate deshydrogénase : LDH
Réaction catalysée :
S-lactate + NAD+ pyruvate + NADH + H+
Enzyme : L-lactate desyhdrogénase (EC 1 1 1 27) ldh
1 : classe des oxydoréductases
1 : agissant sur les groupe : CH-OH
1 : sous sous classe fonctionnant avec la NAD+ (NADP+) comme accepteur
27 : numéro de lʼenzyme à lʼintérieur de la sous-sous classe
II- Constitution dʼune enzyme
Enzyme entièrement protéiques (ribunucléase)
Enzyme formées en deux partie :
- Apoenzyme (nature protéique)
- Coenzyme (nature non protéiqueApoenzyme + coenzyme = holoenzyme
Coenzyme :
Second substrat :
- Récation stoechiométrique entre substrat et coenzyme
- Physiologie : la réaction avec le coenzyme est souvent plus importante que celle avec le
substrat
Les sites de fixation du substrat
/HVLWHFDWDO\WLTXHGHO¶HQ]\PH
Les sites de fixation du substrat - Le site catalytique de lʼenzyme
$%&'(#')!#*+,-.+/+0#
!"#
Il faut que ces molécules se rencontrent donc quʼelles soient solubles dans lʼeau.
III- Propriétés générales des enzymes
Lʼactivité enzymatique
EX : Une mole de catalase décompose 5 000 000 moles de H2O2 en une minute et à 0°C.
Anhydrase carbonique : CO2 + H2O H2CO3
Catalyse enzymatique : 10^7 fois plus rapide
La catalyse enzymatique
Energie libre du système
La catalyse enzymatique
%DUULqUHpQHUJpWLTXHG¶DFWLYDWLRQ
Energie libre
G¶DFWLYDWLRQ
de la réaction
non
Catalysée
Energie libre
G¶DFWLYDWLRQ
de la réaction
catalysée
A
Gi
Etat initial
S
Modification
JOREDOHG¶pQHUJLH
libre 'G
B
P
Gf
(WDWILQDOjO¶pTXLOLEUH
Avancement de la réaction
$%&'(#')!#*+,-.+/+0#
!"#
On va fournir au système moins dʼénergie.
‡ Spécificité
de réaction
Spécificité
:
- Spécificité de la réaction
- Spécificité de substrat
R
NH 2
CH
CO OH
: Spécificité de réaction (décarboxylase et désaminase)
Spécificité de substrat :
Etroite : trypsine
$%&'(#')!#*+,-.+/+0#
!"#
Large : pronase
Stéréospécificité :
- Acides aminés de série L ou D
- Saturation des doubles liaisons (cis ou trans) (Fumarase : catalyse lʼhydratation de
lʼacide fumarique (trans) en acide L-malique, inactive sur lʼacide maléique (isomère cis
de lʼacide fumarique))
Les unités :
Dans les conditions optimales de réaction :
- Unité usuelle : U = μmole/min
- Lʼunité internationale : 1 kat = 1 mole/seconde
- Lʼactivité spécifique : activité / mg de protéine. Plus lʼactivité sera élevée plus lʼenzyme
sera à lʼétat pur.
Cinétique
Cinétique
enzymatique :enzymatique
E + S ES → E + P
(6ļ(6ĺ(3
$%&'(#')!#*+,-.+/+0#
!"# va augmenter, on a donc bien eu
Au cours du temps
le substrat va diminuer et le produit
un complexe enzyme-substrat, et ce complexe se dissocie pour revenir à lʼétat initial.
Cette réaction doit etre rapide et la plus faible possible. La réaction enzyme-substrat est
réversible, on va donc avoir un équilibre.
Influence de la température
Influence de la température :
(Vitesse de la réaction)
Dénaturation
Activation
(enzyme = protéine)
Quand on augmente la température, lʼagitation moléculaire du milieu augmente, augmente
donc les chances de collision entre enzyme et substrat et sa va passer par un maximum
qui sera la température optimale de la réaction. A un moment donné on a une dénaturation
de la protéine, lʼenzyme perd son activité,
donc la courbe de la vitesse de la réaction à!"#
$%&'(#')!#*+,-.+/+0#
partir de cette température va décroitre.
On observe la résultante de ces 2 courbes (phénomène dʼactivation et de dénaturation).
Influence du pH
Influence du pH
Influence des concentrations:
enzyme
réactif:
pH dʼarret qui va stopper
la réaction.
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
Conditions optimales,
= constante
Influence des concentrations
: réactif :[S]
enzyme
Conditions optimales : pH optimum et T optimale
Les réactifs sont le substrat et $%&'(#')"#*+,-.+/+0#
lʼenzyme. Concentration en substrat!"#constante. On va faire
varier la concentration en enzyme. Le produit P en fonction du temps. Pour une première
Influence
des
concentrations:
concentration en enzyme E1 on a
une première
courbe si on double la concentration en
enzyme la courbe est haute,réactif:
si on triple substrat
... On considère quʼau temps t0 on a aucun
produits formés, donc la vitesse initiale est proportionnelle a la concentration en enzyme.
Conditions optimales, [E] = constante
Influence des concentrations : réactif : substrat
Lorsquʼon double la concentration
substrat la pente de la réaction!!"va augmenter au fur et
#$%&'"&()"*+,-.+/+0"
à mesure que la concentration augmente. La vitesse est proportionnelle a la concentration
substrat. Lʼasymptote correspond a la vitesse maximum, on sera alors à une concentration
saturante, on peut donc évaluer la concentration en enzyme.
Hypothèse de Michaelis
Hypothèse de Michaelis
k1
k2
k-1
Dans le milieu on a lʼenzyme et le substrat. A partir des lois dʼactions de masse on peut
déterminer la formule
ci dessus. La constante de Michaelis
traduit lʼaffinité de lʼenzyme
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
pour son substrat. Elle sʼexprime dans les mêmes termes que la concentration substrat,
elle sera dʼautant plus élevée que la dissociation du complexe enzyme substrat est élevée
et queDétermination
lʼaffinité sera faible. expérimentale de la
constante de Michaelis
Détermination expérimentale de la constante de Michaelis
Courbe de Michaelis-Menten
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"# la vitesse max la divisée par
Une fois que la vitesse max
est déterminée, on peut prendre
deux, et la concentration de substrat est égale au Km. Grace a Vi on peut aussi retrouver
Equation
de
Michaelis
cette valeur.
Equation de Michaelis
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
Détermination de Km en coordonnées
double inverse
Détermination de Km en coordonnées double inverse
Représentation dite de
Lineweaver - Burck
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
Signification de la constante de Michaelis
Km caractérise lʼaffinité enzyme-substrat.
Les concentrations physiologiques en substrat sont voisines des Km.
- Modifications des vitesses de voies métaboliques entières
- Modification des Km par des effecteurs (activateurs ou inhibiteurs)
IV- Les activateurs de la cinétique enzymatique
- Les ions métalliques (capable de phosphoriler, réactions qui vont exiger de lʼénergie, ces
kinases sont activés par Mg2+ par exemple, la trypsine par le calcium ..., ils doivent etre
trouvés dans lʼalimentation)
- Activation des pro-enzymes (coagulation : cascade enzymatique dʼun produit qui va
déclenché une première réaction puis une deuxième ... fabrication de la fibrine) : ils sont
sécrétés sous forme de pro-enzymes activés par dʼautres enzymes
- Fixation covalente dʼun groupe chimique (la sérine par ex groupement hydroxyle qui peut
etre phosphoriler ou desphophoriler on va retrouver cette réaction dans le métabolisme
du glycogène)
V- Les inhibiteurs de la cinétique enzymatique
(notions d'irréversibilité ou réversibilité de la réaction) perte des propriétés catalytiques de
lʼenzyme
- Modification de la conformation spatiale de lʼenzyme
- Interaction au niveau du site actif de lʼenzyme : il va y avoir une compétition entre
lʼinhibiteur et lʼactiveur qui veulent se fixer sur le site actif de lʼenzyme
>͛ŝŶŚŝďŝƚŝŽŶĐŽŵƉĠƚŝƚŝǀĞ!
1- Lʼinhibition compétitive
Inhibition COMPETITIVE
Compétition entre I et S / site actif
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
Sans inhibiteur le substrat se fixe sur le site actif : complexe enzyme substrat. Si on met
un inhibiteur, il a une portion de sa molécule qui peut venir se loger dans le site actif,
compétition avec le substrat : complexe enzyme inhibiteur.
Les inhibiteurs compétitifs
Les inhibiteurs compétitifs
S
ES
I
EI
E+P
E
$%&'(#')"#*+,-.+/+0#
!"#
Cette réaction est réversible, si on augmente la concentration en substrat on retrouve une
vitesse de réaction
quasi-normale.
Traduction
graphique de
O¶LQKLELWLRQFRPSpWLWLYH
Traduction graphique de lʼinhibition compétitive
Avec inhibiteur
Sans inhibiteur
‡Km augmente
‡Vmax ne change pas
‡Réversible
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
Avec un inhibiteur le Km va augmenter mais la vitesse maximale ne change pas (par
contre on mettra un temps plus important pour atteindre cette vitesse maximale), réaction
réversible.
>͛ŝŶŚŝďŝƚŝŽŶŶŽŶĐŽŵƉĠƚŝƚŝǀĞ!
2- Lʼinhibition
non compétitive
Inhibition NON COMPETITIVE
)L[DWLRQGHO¶LQKLELWHXUVXUVLWHz site actif
)L[DWLRQGHO¶LQKLELWHXUVXU(OLEUHRXVXU(6
#$%&'"&()"*+,-.+/+0"
!!"
On va modifier la structure de lʼenzyme. En absence dʼinhibiteur on a lʼenzyme et le
substrat : affinité Km. Si on met lʼinhibiteur, il va se loger sur son site de fixation différent
du site actif, quand le substrat arrive on a un complexe qui va comprendre a la fois le
substrat et lʼinhibiteur. Le fonctionnement de lʼenzyme va etre perturbé parce que
lʼinhibiteur est présent. Le Km ne change pas.
Les inhibiteurs non compétitifs
Les inhibiteurs non compétitifs
Avec inhibiteur
Sans inhibiteur
‡Km ne change pas
‡Vmax diminue
‡Irréversible
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
!"#
La vitesse maximum diminue en revanche lʼaffinité du substrat pour lʼenzyme nʼa pas
changé.
VI- Les effecteurs allostériques
Ils vont agir ailleurs sur dʼautres sites. Les cinétiques observées ne sont plus des
cinétiques michaeliennes. On parlera de constante apparente. Ce sont des petites
molécules qui vont moduler lʼactivité de lʼenzyme. Ils vont servir de régulateurs de
réactions métaboliques. La petite molécule qui est fabriquée en fin de chaine va servir de
régulateur : effecteur allostérique. Si la petite molécule est produite en grosse quantité,
elle va venir se fixer sur le premier enzyme et la chaine métabolique va sʼarreter. La petite
molécule nʼétant plus sur le premier enzyme il va reprendre son activité. Ces enzymes ont
une structure quaternaire.
1- Activateurs allostériques
La conformation de lʼenzyme va etre modifiée. Le site actif va aussi subir une modification,
on aura une diminution de la constante apparente ce qui va traduire une augmentation de
lʼaffinité de lʼenzyme pour son substrat.
2- Inhibiteurs allostériques
La conformation de lʼenzyme sera modifiée. Le site actif sera modifié dʼune manière
défavorable du site actif, on aura une augmentation de la constante apparente et une
diminution de lʼaffinité.
3- Schéma dʼune transition allostérique
6FKpPDG¶XQHWUDQVLWLRQDOORVWpULTXH
6FKpPDG¶XQHWUDQVLWLRQDOORVWpULTXH
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
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!"#
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^ĐŚĠŵĂĚ͛ĂůůŽƐƚĠƌŝĞ!
site ACTIF
Forme
ACTIVE
site
ALLOSTERIQUE
Substrat, S
Sous unité
REGULATRICE
Forme
INACTIVE
Produit, P
CATALYTIQUE
site
site ACTIF
ALLOSTERIQUE
Sous unité
X
Inhibiteur
ALLOSTERIQUE
$%&'(#')*#+,-./,0,1#
Cinétique
4- Cinétique
allostérique
Produit, P
!"#
allostérique
SANS EFFECTEUR
K app
K app K app
$%&'(#')"#*+,-.+/+0#
!"#
Ce sont des trétramères (enzymes), tous les sites allostériques ne sont pas occupés en
meme temps. Lʼinhibiteur va augmenter la constante donc on modifie le site actif mais Vm
et Vm/2 ne change pas. A force de mettre un activateur on va se rapprocher dʼune
cinétique michaelienne.
Modification de lʼactivité : fixation covalente
Phosphorylation est caractérisée par une kinase. Déphosphorylation est faite avec une
phosphatase.
=> transmission de lʼinflux nerveux
=> métabolisme du glycogène