Gram Positives

Microbiologie
L’Étude des Microorganismes
Définition d’un Microorganisme
• Dérivé du grec: Mikros, «petit» et
Organismos, «organisme»
– Organisme microscopique qui comprend soit une
seule cellule (unicellulaires) ou amas de cellules
identiques (non différentiées)
– Ils comprennent les bactéries, les champignons,
les algues, les virus, et les protozoaires
2
Microorganismes en Laboratoire
Les Milieux de Croissance
Buts
•
•
•
•
Croissance sous des conditions contrôlées
Maintien
Isolation de cultures pures
Tests métaboliques
Types
• Liquides (bouillons)
– Permets la culture en suspension
– Distribution uniforme des éléments nutritifs,
environnementaux et autres
– Permets la croissance de grands volumes
• Milieux Solides
– Mêmes que milieux liquides + agent de
solidification
• L’agar : Polysaccharide dérivé d’une algue
La Croissance en Bouillon
Non-inoculé
Limpide
Turbide + sédiment
Turbide
Limpide + sédiment
Croissance sur Gélose
• Croissance sur surface solide
• Croissance isolée
• Permets l’isolation de
colonies simples
• Permets l’isolation de cultures
pures
Colonie simple
Milieux Solides (suite)
• Pente
– Croissance en surface et en profondeur
– Différentes disponibilités d’oxygène
– Entreposage à long terme
• Tube profond
– Milieu semi-solide
– Entreposage à long terme
– Faible disponibilité d’oxygène
Compter les Microorganismes
Méthodes
•
•
•
•
Mesure de turbidité
Comptes directs
Comptes viables
Nombre le plus probable
Mesure de la Turbidité
• Mesure la quantité de lumière qui peut
traverser un échantillon
• Le moins de lumière qui traverse l’échantillon
le plus dense est la population
• Mesure la densité optique ou le pourcentage
de transmission
11
Mesure de la Turbidité
• Spectrophotomètre (A600):
– Mesure de la Densité Optique (D.O.)
Lumière
Détecteur….lecture
600nm
Lecture différente
12
Mesure de la Turbidité
D.O. 600nm
2.0
1.0
0
% Transmission
0
Relation inverse
Densité cellulaire
50
100
13
Comptes Directes
• L’échantillon à être énuméré est appliqué sur
une lame d’hémacytomètre qui retient un
volume fixe dans une chambre de comptage
• Le nombre de cellules est compté
• Le nombre de cellules dans le volume donné
est déterminé
Comptes Directes
• Avantages:
– Rapide
– Aucune croissance requise
– Aucune information a propos de l’organisme est
requise
• Désavantages:
– Ne discrimine pas entre vivant et mort
– Peux être difficile de discriminer entre les
bactéries et les détritus
15
Utilisation d’un hémacytomètre
Utilisation d’un hémacytomètre
(suite)
Hématimètre
• Cette lame possède 2 cellules de comptage
indépendante
18
Utilisation d’un hémacytomètre
(suite)
Déterminer le Compte Direct
• Compter le nombre de cellules dans trois carrés
indépendants ayant les même dimensions
– 8, 8 et 5
• Déterminer la moyenne
– (8 + 8 + 5)/3 =7
– Donc 7 cellules/carré
20
Déterminer le Compte Direct (suite)
1mm
Profondeur: 0.1mm
1mm
• Calculer le volume d’un carré:
= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml
• Diviser le nombre moyen de cellules par le volume
d’un carré
– Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml
21
Problème
• Un échantillon est appliqué à une lame
d’hémacytomètre avec les dimensions
suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des
comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans
trois carrés indépendants. Quelle était le
nombre de cellules par millilitre dans
l’échantillon original si la chambre de
comptage possède 100 carrés?
Comptes Viables
• Cellule viable: une cellule capable de se diviser et
de générer une population (ou colonie)
1. Un compte viable est fait en diluant l’échantillon
original
2. Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu de
culture approprié
3. Incuber sous les conditions appropriées pour
permettre la croissance
•
Des colonies sont formées
4. Les colonies sont comptées et le nombre original de
cellules viables est déterminé en fonction de la
dilution
Comptes Viables
• Dilutions en séries de l’échantillon
• Étalement des dilutions sur milieu approprié
• Chaque colonie simple est originaire d’une unité
formatrice de colonie (UFC)
• Le nombre de colonies est équivalent à une
approximation du nombre de bactéries vivantes
dans l’échantillon
Dilution d’un Échantillon de Bactéries
Dilution d’un Échantillon de Bactéries
Dilution d’un Échantillon de Bactéries
Dilution d’un Échantillon de Bactéries
Dilution d’un Échantillon de Bactéries
5672
57
4
Comptes Viables
• Le nombre total de cellules viables est indiqué
en tant qu’Unité Formatrice de Colonies (UFC)
plutôt que nombre de cellule
– Chaque colonie est originaire d’une unité
formatrice de colonie (UFC)
– Une plaque avec 30-300 colonies est choisie
– Calcul:
• Nombre de colonies sur la plaque X la réciproque de la
dilution (facteur de dilution)= Nombre d’UFC/mL
– Ex. 57 UFC X 106 = 5.7 X 107 UFC/mL
30
Dilution en série
63 UFC/0.1 ml de 10-5
630 UFC/1.0 ml de 10-5
630 UFC/ml X 105 = 6.3 x 107/ml dans l’échantillon
original
S’il y avait 100 ml d’échantillon bactérien?
Comptes Viables
• Avantages:
– Dénombre les microorganismes viables
– Peu distinguer différents microorganismes
• Limites:
– Pas de milieu universel
• Ne peut pas demander combien de bactérie dans un lac
• Peut demander combien d’E. coli dans un lac
– Nécessite la croissance du microorganisme
– Seule les cellules vivantes génèrent des colonies
– Des amas ou des chaînes de cellules génèrent une seule colonie
?
?
=
=
• Ex. Un UFC de Streptococcus  un de E.coli
– UFC
une bactérie
Nombre le Plus probable: NPP
– Fondé sur les statistiques de probabilités
– Test présomptif fondé sur des caractéristiques
données
– Technique en bouillon
Nombre le Plus Probable (NPP)
• Commencer avec un bouillon qui permet de
déceler les caractéristiques désirées
• Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à
être testé dans chacun de 3 tubes
-1
Dilution
-2 -3 -4 -5 -6
3 Tubes/Dilution
1 ml de chaque dilution dans chaque tube
Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES
POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)
NPP (Suite)
• L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero
• Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les
caractéristiques désirées sont enregistré
– Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre
• Dilutions:
-1 -2 -3 -4
• Tubes positifs: 3 2 1 0
– Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau
– Multiplier le résultat par le facteur de dilution central
» 150 X 102 = 1.5 X 104/mL
» Puisque vous avez 1g dans 10mL doit multiplier encore par 10
» 1.5 X 105/g
La Microscopie
Les Colorations
Colorations Simples
• Coloration positive
– Coloration du spécimen
– Coloration indépendante de l’espèce
• Colorations négatives
– Coloration de l’environnement de fond
– Coloration indépendante de l’espèce
Méthode
• Coloration simple:
– Un seul agent de coloration
– Permet de déterminer la taille, la forme, et
l’arrangement des cellules
Les Formes Cellulaires
• Coccus:
– Sphères
– Division sur 1,2 ou 3 plans
– Nombre de plans de division donne différents
arrangements
– Arrangements typiques de différents genres
bactériens
Les Cocci (Coccus)
Plans de division
Arrangements
Diplococcus
Streptococcus
(4-20)
Tétrade
Staphylococcus
Indice: si le nom du genre de bactéria finisse par coccus,
la forme de la bactérie est cocci
Les Formes Cellulaires (suite)
• Bacilles:
– Bâtonnets
– Division sur 1 plan seulement
– Arrangements typiques de différents genres
bactériens
Les Bacilles
Plans de division
Arrangements
Diplobacille
Streptobacille
Indice: si le nom du genre de bactérie finisse par bacille,
la forme de la bactérie est bacille
Si elle ne finisse pas par cocci, c’est probablement une bacille.
Microscopie
Colorations Différentielles
Coloration de Gram
(coloration différentielle)
• Divise les bactéries en deux groupes
• Gram Négatives &
Gram Positives
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• Colorées Mauves
– Bacille
• Genres: Bacillus et Clostridium
– Coccus
• Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus
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• Colorées Rouges
– Bacille:
• Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc.
– Coccus:
• Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter
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Règles
• Si le nom est bacillus et/ou clostridium
= Gram (+), bacille
• Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre
que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-))
= forme de coccus et Gram (+)
• Si ça fait pas partie des règles ci-dessus,
= Gram (-) bacilles
Paroi Cellulaire
Gram +
Vs
Gram -
Paroi
Peptidoglycane
Membrane
Plasmique
Absente
Couche de
Lipopolysaccharide
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Méthode - Coloration Primaire
1. Coloration avec le cristal violet +
2. Ajout d’iode de Gram (Mordant)
+ + +
Paroi :peptidoglycane
Membrane plasmique
+
+ + +
+ + +
+
+ + +
LPS
--------------Gram positif
--------------Gram Négatif
Méthode - Étape Différentielle
3. Lavage à alcool
Paroi est déshydratée
– Complex colorant + iode est piégé
Paroi :peptidoglycane
Membrane plasmique
Paroi n’est pas déshydratée
– Complex n’est pas piégé
LPS
- -+ - -+ - +- - +- - +- - +- -+- Gram positif
- -+ - -+ - +- - +- - +- - +- - +- Gram Négatif
Méthode - Contre Coloration
4. Coloration avec la Safranine +
+ + + + + + +
Paroi :peptidoglycane
Membrane plasmique
+ + + + + + +
LPS
- -+ - -+ - +- - +- - +- - +- -+- Gram positif
--------------Gram Négatif
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Sommaire
Gram Négatif
Gram Positif
Fixation
Coloration primaire
Violet de cristal
Lavage
Décoloration
Contre coloration
Safranine
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Coloration Acido-Alcoolo-Résistante
• Coloration diagnostique de Mycobactérium
– Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre
– Paroi cellulaire avec acide mycoïque
– Cireuse, très imperméable
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Méthode
• Principe:
– Contenu élevé de composés similaires aux cires
dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces
bactéries très résistantes aux colorants
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Méthode (Suite)
• La paroi est rendue perméable par la chaleur
• Coloration avec de la fuchsine basique
– À base de phénol, soluble dans la couche
mycoique
– Refroidissement retourne la paroi à son état
imperméable
• Colorant est piégé
• Lavage avec de l’alcool acide
– Étape différentielle
• Mycobactéries retiennent le colorant
• Autres bactéries perdent le colorant
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Coloration de Spores
• Spores:
– Cellule bactérienne différentiée
– Résistante à la chaleur, la déshydratation, les
ultraviolets, et différents traitements chimiques
– Alors, très résistante aux colorant aussi!
– Typique des bacilles Gram positifs
• Genres Bacillus et Clostridium
– Conditions défavorables induisent la sporogénèse
• Différenciation de cellule végétative à l’endospore
– E.g. Anthrax
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Coloration au Vert de Malachite
Sporangium
(strucutre dans laquelle les
spores se forment)
Spores
(structures résistantes utilisées pour la
survie dans des conditions
défavorables)
Cellules végétatives
(en croissance active)
•
•
•
•
Endospore
(dormant, non reproductrices)
Perméabilisation des spores par la chaleur
Coloration primaire au vert de malachite
Lavage
Contre coloration à la safranine
57