Bactériologie des eaux
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I. Les méthode générales de prélèvement et analyses II. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes fécaux II.3 Streptocoques fécaux II.4 Clostridium sulfito-réducteurs II.5 Bactériophage III. Recherche et dénobrement des germes pathogènes IV. Principaux maladies à transmission hydrique L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eaux n’est pas d’effectuer un inventaire de toutes les espèces présentes, mais de rechercher soit celle qui sont susceptibles d’etre pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fécales. L’analyse débute par l’acte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes assurant l’absence de contamination et la survie bactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodes générales d’examen bactériologique des eaux suivies des recherches de bactéries indicatrices de pollution et d’éfficacitée de traitement puis des bactéries spécifiques pathogènes Matériel de prélèvement : flacon en verre (borosilicaté de préférence) de 250 à 1000 ml. flacon en plastique à usage unique stérilisés par le fabriquant. Appareils de prélèvement : Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en cas de prélèvement d‘eau un puits, au centre d’un cours d’eau, en profondeur dans un lac, on doit utiliser des appareils tel que le plongeur et la canne à prélèvement. plongeur Canne à prélèvement Mode de prélèvement En fonction de la nature des eaux analysées et celle des micro-organismes recherchés, les normes fixent des conditions à respecter (volume de l’échantillon, agent neutralisant, qualité du matériel d’échantillonnage…..) L’objectif est d’obtenir un échantillon aussi représentatif que possible de l’eau à examiner, sans contaminer ni modifié l’échantillon. Des précautions doivent être prises à trois niveau: Le matériel de prélèvement Le mode de prélèvement Le transport la conservation des échantillon en milieu solide Méthode par incorporation Méthode par étalement Méthode par filtration En milieu liquide Méthode de détermination du nombre le plus probable (PPN) Méthode par incorporation: Principe: L’échantillon d’eau à analyser est mélanger au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi une à T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées. Mode opératoire 3)faire un mouvement de rotation 2) Incorporer le milieu en . surfusion 1) volume d'eau à ensemencer ( 1 ml) Incuber Faire le dénombrement Principe: L’échantillon d’eau à analyser est étaler à la Surface d’un milieu gélose sans trace d’humidité: après incubation, les colonies qui se développent à la surface sont dénombrées. Etaleur stérile (râteau) Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml Incuber Dénombrer les colonies développer à la surface Principe: L’échantillon d’eau à analyser est filtré à Travers une membrane qui retient les micro organisme. La membrane est ensuite placée sur un milieu gélosé. Durant l’incubation, des colonies se forment à la surface de la membrane Mode opératoire Principe générale: Les prise d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses Dilution sont incorporées dans un milieu liquide conçu Pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. la croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible ( virage d’un indicateur de pH coloré) Principe: Cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organisme supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire. L’estimation de la densité bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilution successives de la suspension bactérienne originelle. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif. On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en micro plaque). On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-organisme. Il doit être tenu compte que si l’absence de culture correspond à l’absence de microorganisme, plus d’un micro-organisme peut être responsable d’une culture positive. Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance). Notion d’indicateur comme l’origine de la plupart des micro-organismes pathogènes véhiculés par l’eau est fécale, le principe du contrôle de la qualité de l’eau repose sur la démonstration que l’eau distribuée ne contient pas de germes provenant de contamination fécale. Pour cela, on recherche des indicateurs de contamination fécale, appelés aussi germes témoins de contamination fécale. On parle également d’indicateurs de traitement qui permettent d’évaluer l’efficacité des différents traitements De potabilisation mis en œuvre vis-à-vis de différents germes. Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature : Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et l’apparition d’infection dans une population. Ecologique : il doit être spécifique d’une contamination fécale : systématiquement rencontré lorsqu’il y a présence de féces d’animaux à sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollués. Il doit être sensible : il doit être mis en évidence dans l’eau lorsque des pathogènes sont présents, et ce en grand nombre. Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans l’eau. Technique : il doit être facile et rapide à détecter, et ce, à moindre cout. Définition: On entend par microorganismes : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai est effectué selon la méthode spécifiée. Le principe consiste à mettre en évidence les bactéries Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les germes spécifiques de l’eau. Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes issus de l’homme et des animaux à sang chaud. dans les milieux de très bonne qualité microbiologique pour contrôler une possible contamination bactérienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrôlées. Dans l’usine de potabilisation, il permet de contrôler l’efficacité des différentes étapes du traitement. dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne après la station de traitement peut être le signe d’une multiplication bactérienne dans le réseau ou d’une intrusion de bactéries à l’intérieur de celui-ci. Dans les réservoirs et châteaux d’eau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualité de l’eau et sur la reviviscence des germes Définitions: Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C. Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes d’origine fécale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia. Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena. Intérêt: la recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C :intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une contamination fécale sure coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence signe l’existence quasi certaine de la contamination fécale. La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux. Définition : bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes, formant des chainettes, non sporulées, catalase négative, possédant l’antigène D, cultivant en anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables d’hydrolyser l’esculine en présence de bile. Ils se répartissent en deux genres : streptococcus et enterococcus. Intérêt: les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau plus ancienne. La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale d’une eau. Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés. Définitions: Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices : formes de résistance de micro-organismes se développant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en gélose viande foie et donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium. Spores de clostridium sulfitoréducteurs : même définition que la précédente pour des bacilles à Gram positif, ne possédant pas de catalase et ayant l’aspect morphologique des clostridium. Intérêt: ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste. L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection. Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-àvis des parasites et en particulier de Cryptosporidium. analyse technique Volume de PE Milieu utilisé T d’incubation µ-organisme revivifiables Incorporatio n en milieu liquide 1 ml Gélose à l’extrait de levure 37° OU 20° C Coliformes totaux filtration 100 ml Gélose lactosée au TTC 37° C Colonies typique OX- Coliformes fécaux filtration 100 ml Gélose lactosée au TTC 44° C Colonies typique Streptocoque Du Gr D filtration 100 ml Gélose Slanetz et bartley 37° C Colonies typiques +Litsky Colistridiums sulfitoréducteurs Incorporatio n en milieu solide 20 ml Gélose tryptome sulfite à la Dcyclosérine 37 ° C Colomies typique confirmation - IV.1 Recherche de salmonella Définition: Des bacille Gram négatifs (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir. Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques. Pré-enrichissement Enrichissement primaire Enrichissement secondaire Lecture et interprétation : Repérer les colonies caractéristiques. Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée Indole, LDC… Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de référence. Définition: Bacille Gram négatif droits ou incurvés, Très mobiles, Oxydase (+), AAF, Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S, Hautement pathogènes. Définition: Cocci à Gram (+) Isolées ou en grappes de raisin, Catalase (+) et coagulase (+) (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée. Définition: Un bacille Gram négatif Oxydase (+) Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques.
