Analyse bactériologique des eaux Equipe : Pr. Ababacar MAÏGA Dr Tidiane DIALLO Dr Sanoukhô Coulibaly Dr Abdourahamane O DIARA Présenté par :Dr Abdourahamane O DIARA OBJECTIS DU COURS 1) Connaitre les méthodes générales de dénombrement; 2) Connaitre les indicateurs de pollution d’une eau; 3) Citer quelques intérêt de la numération des colonies; 4) Connaitre les intérêts de la recherche et dénombrement d’un microorganisme pathogènes pour l’homme; 5) Citer quelques maladies dues à la pollution de l’eau et l’agent causal. PLAN I. Les méthode générales de prélèvement et analyses II. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes fécaux II.3 Streptocoques fécaux II.4 Clostridium sulfito-réducteurs III. Recherche et dénombrement des germes pathogènes IV. Principaux maladies à transmission hydrique INTRODUCTION L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eau n’est pas d’effectuer un inventaire de toutes les espèces présentes, mais de rechercher soit celle qui sont susceptibles d’etre pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de contaminations fécales. L’analyse débute par l’acte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes assurant l’absence de contamination et la survie bactérienne. Ensuite nous avons les méthodes générales d’examen bactériologique des eaux : les recherches de bactéries indicatrices de pollution et d’éfficacité de traitement et les recherches des bactéries spécifiques pathogènes. en milieu solide Méthode par incorporation Méthode par étalement Méthode par filtration En milieu liquide Méthode de détermination du nombre le plus probable (PPN) Méthodes en milieu solide Méthode par incorporation: Principe: L’échantillon d’eau à analyser est mélanger au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi une à t° proche de la t° de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées. Mode opératoire 3)faire un mouvement de rotation 2) Incorporer le milieu en . surfusion 1) volume d'eau à ensemencer ( 1 ml) Incuber Faire le dénombrement Principe: méthode par étalement L’échantillon d’eau à analyser est étaler à la Surface d’un milieu gélose sans trace d’humidité: après incubation, les colonies qui se développent à la surface sont dénombrées. Mode opératoire Etaleur stérile (râteau) Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml Incuber Dénombrer les colonies développer à la surface Méthode par filtration Principe: L’échantillon d’eau à analyser est filtré à travers une membrane qui retient les micro organisme. La membrane est ensuite placée sur un milieu gélosé. Durant l’incubation, des colonies se forment à la surface de la membrane Mode opératoire Technique de dénombrement en milieu liquide Principe générale: Les échantillons d’eau ou de ses dilution sont incorporées dans un milieu liquide conçu pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. la croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et éventuellement, une modification visible ( virage d’un indicateur de pH coloré) Méthode du nombre le plus probable Mode opératoire • On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en micro plaque). • On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-organisme. • L’absence de culture correspond à l’absence de micro-organisme. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale Notion d’indicateur La plupart des micro-organismes pathogènes véhiculés par l’eau est fécale, ainsi le principe du contrôle de la qualité de l’eau consiste à démontrer que l’eau distribuée ne contient pas de germes provenant de contamination fécale. Pour cela, on recherche des « indicateurs de contamination fécale », appelés aussi germes témoins de contamination fécale. On parle également d’indicateurs de traitement qui permettent d’évaluer l’efficacité des différents traitements de potabilisation mis en œuvre. Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature : • Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et l’apparition d’infection dans une population. • Ecologique : il doit être spécifique d’une contamination fécale c à d systématiquement rencontré lorsqu’il y a présence de fèces d’animaux à sang chaud et absent dans les milieux non pollués. • Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans l’eau. • Technique : il doit être facile et rapide à détecter et ce à moindre cout. Intérêt de la numération des colonies 1 / 2 - Elle peut servir à évaluer le contenu bactérien général de l ’eau. On n’obtient pas le nombre de micro-organismes présents, mais simplement le nombre de ceux qui sont capables de former des colonies visibles sur « le milieu nutritif » et dans des conditions données de culture. - La numération est utile pour évaluer l ’efficacité des traitements, particulièrement de la coagulation, de la filtration et de la désinfection. L’objectif étant de limiter au maximum la densité des microorganismes dans l ’eau traitée. Intérêt de la numération des colonies 2/2 - Elle peut également servir à apprécier la propreté et l ’intégrité des réseaux et à déterminer si l ’eau se prête à la consommation. - Finalement, l’intérêt principal de la numération réside dans la comparaison des résultats obtenus sur des prélèvements réguliers à partir de la même source, ce qui permet de déceler tout écart significatif par rapport à la plage normale de valeurs. A-Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux Définitions: Les coliformes totaux : bacilles Gram négatif, non sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C. Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes d’origine fécale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia. Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena. Intérêt: La recherche et le dénombrement des coliformes totaux à 37°C est intéressante pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau et pour déceler une contamination fécale sure. Les coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C, indique l’existence quasi certaine de la contamination fécale. La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli présumés, car c’est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux. B-Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux ou entérocoque Définition: bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes, formant des chainettes, non sporulées, catalase négative, possédant l’antigène D, cultivé en anaérobiose à 44°C et à pH 9.6 capables d’hydrolyser l’esculine en présence de bile. Ils se répartissent en deux genres : Streptococcus Entérocoques. Intérêt: • les entéroques sont plus résistant que les coliformes dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau. • La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes et est comparable à celle des entérovirus. • Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple le Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés. C-Recherche et dénombrement des spores des bactéries sulfitoréductrices et clostridium sulfito-réducteurs Définitions: Spores de bactéries anaérobies sulfito réductrices : formes de résistance de micro-organismes se développant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en gélose viande foie et donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium. Spores de clostridium sulfito réducteurs : même définition que la précédente pour des bacilles à Gram positif, ne possédant pas de catalase et ayant l’aspect morphologique des clostridium. Intérêt: • ils ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste. • L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporulent, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection. • Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptospridium. Méthode de recherche et Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale ANALYSE TECHNIQUE VOLUME MILIEU UTILISÉ T° Coliformes totaux filtration 100 ml Gélose lactosée 37° C Coliformes fécaux filtration 100 ml Gélose lactosée 44° C Streptocoques entérocoques filtration 100 ml Gélose Slanetz et bartley 37° C 20 ml Gélose tryptome sulfite à la Dcyclosérine 37 ° C Colistridiums Incorporation en sulfito-réducteurs milieu solide Recherche des bactéries pathogènes 1- Recherche de salmonella Définition: • Des bacille Gram négatifs • Se multiplient à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir. • Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoïdiques (Hautement pathogènes) et les non typhoïdiques. Méthode de recherche Pré-enrichissement Enrichissement primaire Enrichissement secondaire Lecture et interprétation : • Repérer les colonies caractéristiques; • Faire une identification biochimique; • Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB • ou bien s’adresser au laboratoire de référence. 2-Recherche de vibrion cholérique Définition: • Bacille Gram négatif droits ou incurvés, • Très mobiles, • Oxydase (+), • Fermentant le glucose sans production de gaz, • Hautement pathogènes. Méthode de recherche 3-Recherche de Staphylocoques à coagulase positive Définition: • Cocci à Gram (+) • Isolées ou en grappes de raisin, • Catalase (+) et coagulase (+) • Se multiple en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. • L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée. Méthode de recherche 4-Recherche de Pseudomonas aérogénosa Définition: • Un bacille Gram négatif • Oxydase (+) • Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. • Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques. Méthode de recherche Les principales maladies à transmission hydrique
