Helicobacter pylori, inflammation chronique et cancer gastrique Hilde de Reuse ([email protected]) Unité de Pathogenèse de Helicobacter Jusqu’en 1983, on pensait que l’estomac était un organe stérile et que les ulcères de l’estomac étaient causés par le stress pH median de l’estomac = 2 Anciennes observations de bactéries dans l’estomac... 1886 : identification de bactéries spiralées dans des lavages gastriques humains par Walery Jaworski (Université de Cracovie) 1893 : description de bactéries spiralées dans l’estomac d’un chien par Giulio Bizzozero (Université de Padoue) Ces observations ne montrent pas que la bactérie cause une maladie En 1983 - le travail exemplaire de deux médecins australiens, R. Warren et B. Marshall 1) Analyse de biopsies de l’estomac de 135 patients souffrant de gastrite et de biopsies de patients sains => identification d’une bactérie spiralée uniquement chez les patients souffrant de gastrite 2) Culture de cette bactérie pure in vitro 3) Barry Marshall démontre l’un des postulats de Koch en avalant une culture de cette bactérie qu’ils appellent Helicobacter pylori 2005: R. Warren et B. Marshall Prix Nobel de Médecine pour la démonstration du rôle de la bactérie Helicobacter pylori dans le développement des maladies de l’estomac La bactérie Helicobacter pylori • Gram négatif • Classe des epsilon protéobactéries • Spiralée et fortement mobile H. pylori colonise exclusivement l’estomac des humains et des primates non-humains • Helicobacter pylori : chef de file d’un nouveau genre bactérien Helicobacter pylori chef de file d’un nouveau genre bactérien EspЏcesde Helicobacter ayant un tropisme prЋfЋrentielpour l'estomac EspЏces H™tes "Candidatus Helicobacter bovis" Bovins "Candidatus Helicobacter heilmannii" FЋlidЋssauvages, hommes "Flexispira" taxon 7 Chiens Helicobacter acinonychis GuЋpards Helicobacter baculiformis Chats Helicobacter bizzozeronii Chiens, chats, hommes Helicobacter cetorum Dauphins, bЋlugas Helicobacter cynogastricus Chiens Helicobacter felis Chats, ch iens, guЋpards, hommes Helicobacter mustelae Furets Helicobacter pylori Hommes, primates non-hominiens Helicobacter salomonis Chiens, hommes Helicobacter suis Porcs, ho mmes, primates non-hominiens "Helicobacter suncus" Musaraigne "Helicobacter winghamensis" Hommes EspЏcesde Helicobacter ayant un tropisme prЋfЋrentiel pour l'intestin et/ou le foie EspЏces H™tes "Flexispira" taxon 10 Primates non-hominiens Helicobacter aurati Hamsters Helicobacter anseris Oies Helicobacter bilis Souris, rats, hamsters, gerbilles, chiens, chats, ov ins, porcs, hommes Helicobacter brantae Oies Helicobacter canadensis Hommes, oies Helicobacter canis Chiens, chats, hommes Helicobacter cholecystus Hamsters Helicobacter cinaedi Hommes, hamsters, chiens, chats, renard s, macaque rhЋsus, rats "Helicobacter colifelis" Chats Helicobacter equorum Chevaux Helicobacter fennelliae Hommes, primates non-hominiens (?), chiens (?) Helicobacter ganmani Souris Helicobacter hepaticus Souris, hommes (?) Helicobacter marmotae Marmotte, chats Helicobacter mastomyrinus Souris, mastomys Helicobacter mesocricetorum Hamsters "Helicobacter muricola" Souris sauvages Helicobacter muridarum Rats, sour is Helicobacter pametensis Oiseaux, porcs, chats Helicobacter pullorum Volailles, hommes Helicobacter rodentium Souris Helicobacter trogontum Rats, porcs, ovins Helicobacter typhlonius Souris "Helicobacter sp. Bird-B" Oiseaux "Helicobacter sp. Bird-C" Oiseaux "Helicobacter sp. cotton-top tamarins" Cotton-top tamarins Infections par Helicobacter pylori - très forte prévalence, la moitié de la population humaine mondiale - fortes disparités géographiques (niveau socio-économique) Epidémiologie de l’infection par Helicobacter pylori Mode de transmission : - inter-humaine - acquisition par voie oro-orale - acquisition au cours de la petite enfance - transmission le plus souvent intrafamiliale - infection persiste souvent toute la vie Prévalence des infections à H. pylori Dans les pays occidentaux => l’incidence diminue - 66 % de la population de l’âge de 60 ans est infectée - 22 % de la population de l’âge de 20 ans est infectée Effet cohorte Pathologies associées à l’infection par H. pylori <1a Infection par H. pylori 20-30a Gastrite chronique (100%) Asymptomatique (80%) Gastrite atrophique Dyspepsie fonctionnelle Ulcères gastriques ou duodénaux (10%) (5-10%) 30-50a Métaplasie intestinale Lymphome du MALT (0.3%) Dysplasie Adénocarcinome (1-3%) 65-80a Facteurs de l’environnement et mode de vie de l’hôte Caractéristiques génétiques de l’hôte Polymorphismes des cytokines pro-inflammatoires -> TNF et IL1 β (puissant inhibiteur de la sécrétion acide gastrique) Risque accru d'atrophie gastrique et d'adénocarcinome Génotype de la bactérie (îlot de pathogénicité Cag, VacA-s1m1) Traitements des infections à Helicobacter pylori • Trithérapie de 7 jours : combinaison de deux antibiotiques parmi (Amoxicilline, clarithromycine, tétracycline, métronidazole) + inhibiteur de Pompe à Protons (IPP) • Nouveaux traitements (90% éradication) - séquentiel - IPP, Tetracycline, Metronidazole, Bismuth • Apparition préoccupante de souches résistantes Souches isolées de 530 biopsies (2004-2007, France) 26% clarithromycineR 61% métronidazoleR 0% amoxicillineR (Raymond et al. Helicobacter 2010) Helicobacter pylori et cancer gastrique 1994 : reconnaissance internationale de H. pylori comme oncogène de classe I par l’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC) Cancers associés aux infections Nombre total de cancers attribuables aux infections en 2002 : - 1.9 million de cas dans le monde - 18% de l’ensemble des cancers Principaux agents impliqués : Bactérie : Virus : Helicobacter pylori 5.5% Papilloma Virus humains 5.2% Virus des Hépatites B & C 4.9% Virus d’Epstein-Barr 1% VIH & HHV8 0.9% HTL Virus 0.03% Parasites du foie : 0.02% cancers gastriques (Parkin, Int J Cancer 2006) Le cancer gastrique en chiffre • 600 000 nouveaux cas/an dans le monde • 2ème cause de mortalité par cancer dans le monde (2/3 des cas dans pays en voie de développement) • 800 000 morts par an dans le monde • En France : 6 000 nouveaux cas/an • Survie à 5 ans : 10-15 % • Cancers gastriques associés à H. pylori 90 % des lymphomes gastriques de type MALT 71 % des adénocarcinomes gastrique distaux (de type intestinal ou diffus) - Suivi longitudinal sur 10 ans de 1526 patients japonais • Sur les 280 patients non-infectés par H. pylori ou infectés et traités aucun n’a développé de cancer • Sur 1246 patients infectés par H. pylori * 36 patients ont développé un cancer (2,9%) * 4,7 % Dyspeptiques 3,5 % Ulcères gastriques 2,2 % Polypes gastriques 0 % Ulcères duodénaux Uemura et al. N. Engl. J. Med. (2001) Comment l’infection par H. pylori conduit au cancer gastrique ? Processus très long (>40 ans) multifactoriel - mécanismes encore mal compris. • H. pylori provoque une réponse inflammatoire chronique au niveau des cellules épithéliales de la muqueuse gastrique => conduit à des lésions de l'ADN (espèces réactives de l'oxygène et de l'azote). • H. pylori provoque l'augmentation de l'enzyme AID, une cytidine deaminase responsable de l"editing" d'ADN => génère l'accumulation de mutations dans TP53. (Matsumoto et al. Nature Med 2007) • L'infection par H. pylori diminue l'expression de certaines enzymes de réparation de l'ADN. (Machado et al, Clin. Canc Res 2009) • H. pylori exprime des facteurs de virulence dont les activités augmentent le risque d'oncogenèse (VacA et CagA). Activités de la cytotoxine VacA Domaine autotransporteur Séquence signal s i s1 s2 i1 m i2 m1 m2 Vacuolisation Affaiblissement des jonctions intracellulaires Formes plus fréquemment associées avec le cancer gastrique p33 p55 Libération cytochrome C Induction de l'apoptose Activité immuno-suppressive : évasion de la réponse immunitaire adaptative (D'après Polk and Peek, Nature Reviews Cancer, 2010) Integrin ß2 Inhibition de la fusion phagosome-lysosome Macrophages Altération de la capacité à présenter les antigènes Lymphocytes B Inhibition de l'activation et de la prolifération Cellules T IL-2 L'îlot de pathogénicité Cag cagA 30 gènes - Ilot Cag : acquis par transfert horizontal de gènes, 40 kb H. pylori Membrane interne présent dans : • 50 % des souches européennes • >95% des souches asiatiques - souches Cag+ = facteur de risque pour le cancer gastrique : cancer => 95% Cag+ gastrite non-atrophique => 40 % Cag+ - Contient 22 gènes requis pour la synthèse d'un système de sécrétion de type IV (SST4) Membrane externe Cellule épithéliale CagA, une molécule pro-oncogène injectée par le SST4 Cag H. pylori récepteur intégrines 5 ß1 Cellule épithéliale CagA SRC ABL SST4 fragments de PG Viala et al. Nature Immunol. 2004 Activation de NF-kB => Stimulation de la transcription de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 P Nod1 CagA SHP2 CSK P ß-catenin - Remaniement du cytosquelette (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) - Prolifération cellulaire CagA Hyperprolifération et différentiation aberrante ZO-1 CagA JAM Perturbation - des jonctions serrées et adhérentes - de la polarité cellulaire Polk and Peek, Rôle(D'après du SST4 Cag dans la transformation des cellules épithéliales gastriques Nature Reviews Cancer, 2010) Effet de l’éradication de H. pylori sur le développement du cancer gastrique • Traitement du MALT: 80 % de régression après éradication de H. pylori • Effet bénéfique de l'éradication de H. pylori sur l'évolution des lésions pré-néoplasiques (Méta-analyse par Rokkas et al. Helicobacter 2007) Atrophie gastrique Gastrite chronique Amélioration dans l'antre et le corps Atrophie gastrique Métaplasie intestinale Aucune amélioration Point de “non-retour” ? Métaplasie intestinale Dysplasie Adénocarcinome Conclusions • Helicobacter pylori : une bactérie de découverte récente responsable de diverses pathologies de l'estomac chez l'homme. • H. pylori colonise de manière persistante la moitié de la population humaine mondiale (800 000 morts/an). • H. pylori = la seule bactérie reconnue comme oncogène de classe 1 (MALT et adénocarcinome). • Adénocarcinome apparaît après des décades d'infection par H. pylori – mutagenèse de l'ADN des cellules hôtes (inflammation, AID). – diminution de l'expression de facteurs de réparation de l'ADN. – expression de facteurs de virulence (VacA et Cag) qui augmentent le risque d'oncogenèse. • L'éradication de H. pylori fait régresser le MALT et elle est bénéfique pour l'évolution des lésions pré-oncogènes. H. pylori possède des propriétés uniques qui lui permettrent de survivre et de se multiplier à long terme dans l’estomac, un organe pourtant hostile... Barrière chimique : acidité pH médian : 2 pH 4.5-6 Barrière physique : mucus très épais pH neutre cellules épithéliales Adapté de Tortora, Funke and Case "Microbiology, an introduction" editeur Pearson Barrière biologique : réponse immunitaire Barrière immunologique Motifs Lewis : mimétisme moléculaire Immuno-suppression Barrière physique : mucus très épais Forme spiralée pour pénétrer dans le mucus Flagelles pour se déplacer dans le mucus Barrière chimique : pH très acide H+ H+ H+ H+ Uréase 2 NH3 + CO2 H+ NH2-C-NH2 + H2O = H+ O NH4+ Urease : un facteur de virulence majeur de H. pylori - Enzyme essentielle pour la résistance à l'acidité, indispensable à la colonisation de modèles animaux - Urease : 10% protéines totales de H. pylori - Uréase de H. pylori, la plus active de toutes les uréases décrites (Km=0,2-0,5 mM) - Au niveau des cellules épithéliales gastriques de l'hôte - l'ammoniac produit par H. pylori est cytotoxique - la présence d'ammoniac accélère l'induction de l'apoptose induite par la cytokine TNF Urease : une métalloenzyme à nickel Ni2+ 24 nickel ions par complexe actif d'uréase [(UreA-UreB)3]4 Uréase : une arme à double tranchant - à pH acide : activité indispensable à la survie de H. pylori - à pH neutre : production d'ammoniac délétère car conduit à un pH alcalin toxique pour H. pylori Ni2+ Tests de la réponse de H. pylori à l'acidité in vitro 2x108 bact./ml PBS pH 7.0 H. pylori PBS pH 2 + 10mM urée PBS pH 7.0 + 10mM urée 37°C - 1 H pH Compte-viable des bactéries Incubation sans urée pH initial 9 8 pH = 77 6 5 4 3 pH = 22 1 0 Incubation avec urée pH initial pH final pH = 7 108 CFU/ml pH = 2 0 1 H1 9 8 pH = 7 6 5 4 3 pH = 22 1 0 pH final Toxique pH = 9 pH = 6.5 108 CFU/ml 0 1 H1 Nécessité pour la bactérie de contrôler son activité uréase Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux - Accessibilité de son substrat, l'urée - Transport de son co-facteur, le nickel - Incorporation du nickel dans son site actif - Stockage du nickel Urée H+ UreI Canal à urée Urée P ureA ureB ureI ureE ureF ureG ureH Sous-unités catalytiques Protéines accessoires Ni2+ UreHEFG (UreA-UreB)6 Construction d'un mutant de H. pylori DureI -> activité uréase identique à celle de la souche sauvage (sur des lysats) Skouloubris et al. Infect & Immun 1998 Bury-Moné et al. Mol Microbiol 2001 et 2004 Incubation avec urée pH initial 9 8 pH = 77 6 5 4 3 pH = 22 1 0 pH final pH initial pH = 9 pH = 6.5 108 CFU/ml 0 1 H1 Souche de H. pylori sauvage 9 8 pH = 77 6 5 4 3 pH = 2 1 0 pH final pH = 9 pH = 2.5 105 CFU/ml 0 1 H1 Mutant de H. pylori DureI UreI est nécessaire pour la survie de H. pylori à pH acide en présence d'urée Démonstration du transport de l'urée à pH acide par UreI dans un système hétérologue (oocytes de Xénopes) Weeks et al. 2001 Inoculation par voie orogastrique de 109 bactéries (souche SS1) 0 1 2 3 4 semaines 108 107 (CFU/g estomac) Charge bactérienne Sacrifice 109 106 105 104 103 H. pylori sauvage 102 H. pylori DureI Contrôle négatif 101 0 0 2 7 10 14 20 28 jours Compte-viable (Skouloubris et al. I&I 1998) La protéine UreI est essentielle pour la colonisation d'un modèle animal par H. pylori H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ UreI Urée H+ NH4+ NH3 + CO2 Uréase Urée H+ UreI = canal à urée dans la membrane interne de la bactérie ouvert uniquement à pH acide (cible thérapeutique - brevet) Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux - Accessibilité de son substrat, l'urée - Transport de son co-facteur, le nickel - Incorporation du nickel dans son site actif L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte est un élément de virulence Nickel Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se procurer du nickel dans l’estomac de son hôte Acquisition du nickel par H. pylori Environnement gastrique : - complexe et varié - biodisponibilité des ions métalliques ? Concentration du nickel dans le corps humain est très faible : 2-11 nM MI ME ? Ni2+ NixA Comment le nickel est-il transporté à travers la membrane externe (ME) ? Aucune source d'énergie disponible au niveau de la ME Le complexe TonB/ExbB/ExbD fournit de l'énergie pour le transport à travers la membrane externe (ME) en utilisant la force proto-motrice de la membrane interne (MI) Transporteur Substrate-binding site dépendant de TonB = TBDT ME Substrats du système TonB : • Fer chélaté (sidérophores) • Cobalamin, vitamine B12 (cofacteur cobalt) MI Modified from Braun & Braun La machinerie ExbB/ExbD/TonB est impliquée dans le transport du fer chez H. pylori Question: est-ce que TonB est requis pour le transport énergisé du nickel ? Kristine SCHAUER Mesures du contenu intracellulaire en nickel par la technique de "Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry" (ICP-MS) µmol Ni2+ /g prot pH 7 pH 5 Ni2+ mutant ∆exbB-exbD-tonB + mutant complémenté • A pH 7, peu de nickel accumulé indépendamment de TonB • A pH 5, augmentation de l'accumulation du nickel, dépend de TonB Identification du transporteur TonB-dépendant FrpB4 présente les caractéristiques d'un TBDT localisée dans la membrane externe (Ernst et al. 2006 J. Bact) régulée par NikR en réponse au nickel (Muller et al. 2011 NAR) Mutant ∆frpB4, même phénotype que le mutant ∆exbB-D-tonB Modified from Braun & Braun Conséquences du transport du nickel TonB-dépendant sur l'activité uréase pH 7 A pH 7, accumulation du nickel TonB-indépendante => activation de l'uréase pH 5 A pH 5, à des faibles doses de nickel => Machinerie ExbB/ExbD/TonB + FrpB4 nécessaires à l'activité uréase Première démonstration d'un transport du nickel à travers la ME par un mécanisme dépendant de la machinerie TonB Nickel H+ ME • FrpB4 = Transporteur de nickel dépendant de TonB FrpB4 • Transport de nickel est activé à pH acide TonB H+ ExbB MI ExbD NixA • Activation de l'uréase à pH acide par l'apport de nickel PMF Schauer et al. Molec Microbiol (2007) Uréase Schauer, Rodionov et al. TIBS (2008) Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori Identification de mécanismes originaux - Accessibilité de son substrat, l'urée - Transport de son co-facteur, le nickel - Incorporation du nickel dans son site actif Incorporation du nickel dans l'uréase par des complexes protéiques • Carte génomique d'interaction protéiques par paires (Y2H) Nature (2001), Mol Microbiol (2001), NAR (2003) • Purification de complexes protéiques par la technique TAP, Tandem Affinity Purification (Kerstin STINGL) • Purification de complexes multiprotéiques à partir de l'organisme d'origine => Meilleure spécificité des complexes (moins de faux positifs) Recherche de complexes protéiques associés à l'uréase chez H. pylori par TAP Identification de deux populations de complexes - un complexe enzymatique actif associé à des enzymes du métabolisme de NH3 - un complexe d'incorporation du nickel partagé avec celui de l'hydrogénase (distribution du nickel) Urease Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel Hydrogenase Ni2+ FrpB4 TonB-ExBD Nouveaux mécanismes pour l'acquisition du nickel, activés à bas pH NixA Ni2+ Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel Urée H+ Urée UreI Urease H+ Canal à urée activé à pH acide Hydrogenase Helicobacter pylori est une bactérie fascinante ! - il reste beaucoup d’aspects de sa virulence à comprendre - elle constitue un bon système d’étude * pour comprendre les processus qui conduisent au cancer * pour identifier de nouveaux mécanismes ou de nouvelles fonctions dont certains peuvent être communs à d’autres bactéries pathogènes Pour en savoir plus sur H. pylori http://www.helicobacter.fr./ Sylvie AUBERT ERL3526 Julien GALLAUD Daniel VINELLA Yulia REDKO Karine ANGER Valérie MICHEL Eliette TOUATI Julien FERNANDES Hilde DE REUSE Unité Pathogenèse de Helicobacter Mireille FERRAND Mécénat Janssen ODYSSEY-Re Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (CEA/CNRS Grenoble) Christelle BALHAWANE Isabelle MICHAUD-SORET Groupe de Cristallographie Macromoléculaire (ESRF Grenoble), now at IBCP Lyon Cyril DIAN Laurent TERRADOT Burnham Institute, La Jolla USA Dmitry RODIONOV Laboratoire de Cristallographie et Cristallogenèse des Protéines (CEA/CNRS Grenoble) Christine CAVAZZA Laboratoire CEA de Cadarache DSV/IBEB/SBVME/LB3M Pierre RICHAUD Génopole IP (Proteopole) Pascal LENORMAND Jean-Claude ROUSSELLE Abdelkader NAMANE MERCI POUR VOTRE ATTENTION ! 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