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Hôpital L’Archet
- Nice -
Etude fonctionnelle de la cellule par
Cytométrie en Flux
par Frédéric Larbret
Introduction à la cytométrie en flux
Origine de la cytométrie en flux :
1934: applicable aux cellules hématologiques (comptage)
1941: développement des techniques d’anticorps couplés
1960: développement des premiers cytomètres
Définition :
La cytométrie en flux permet l’étude précise de cellules isolées entraînées dans un flux
liquide. Les cellules, alignées les unes derrière les autres, sont analysées une par une
en défilant à grande vitesse (plus de 30Km/h) devant une source lumineuse (un laser).
Intérêt :
C’est une technique rapide qui permet une caractérisation :
- individuelle de chaque cellule
- quantitative (intérêt statistique)
- qualitative (morphologie de la cellule et phénotypage)
Composition d’un cytomètre
Composition d’un cytomètre
Un cytomètre est une combinaison de 3 différents systèmes :
1
1) Système fluidique :
Flux laminaire qui permet aux
cellules en suspension de
passer une à une devant le
laser
2) Système optique :
Rayon laser et différents filtres qui
permettent de sélectionner les
longueurs d’ondes appropriées
3) Système électronique :
- PMT qui capte la lumière émise,
- Digitaliseur qui la transforme en
signal électrique puis en signal
numérique,
- Ordinateur qui gère et
entrepose les données
2
3
La fluidique
Système basé sur le principe
de Focalisation hydrodynamique
L’optique
séparation des excitations
Le trajet optique
Les filtres
Système électronique
Laser
t
Voltage
2.
t
Laser
Voltage
t
3.
Laser
Pulse Height
(H)
1.
Conversion des signaux optiques en signaux électriques par des
photomulitiplicateurs (PMT)
Voltage

Pulse
area(A)
0
Pulse
Width
(W)
Time
(µs)
4
0

Analyse du pulse en Height (H), Width (W) et Area (A)

Envois des données sous forme informatique, gérées par un logiciel
d‘analyse (CellQuest ou Diva)
Les paramètres analysés
1) Mesures de phénomènes de diffusion lumineuse :
- Forward Scatter (FSC) : la lumière diffractée est
collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est
relatif à la taille de la cellule. ( = Taille de la cellule)
- Side Scatter (SSC) : la lumière est collectée à 90°
de l’axe du laser. Le signal est relatif à la granularité de la
cellule. ( = granulométrie de la cellule)
Les paramètres analysés
2) Mesures de signaux de fluorescence :
mesure d’une Intensité de fluorescence MFI Mean fluorescence intensity
(256-1024 canaux) = canal moyen de l’ensemble des canaux occupés
Dépendra du type de fluorochromes utilisés FL1, FL2, FL3…
Excitation
Emission
Analyse multiparamétrique : analyse simutanée jusqu’à 17 couleurs
Fluorochromes et compensations
 Importance dans le choix des combinaisons de fluorochromes
AVANT
APRES
FL2 - %FL1
Immunophénotypage
en routine
- La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l’hémopathie maligne la plus fréquente du sujet âgé.
- Diagnostic par hémogramme et phénotypage
- Orientation des décisions thérapeutiques en fonction des marqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie
Analyse de la mort cellulaire
Nombreuses techniques qui correspondent chacune à
différentes étapes de la mort cellulaire
Dioc6
Fas/ Fas L
Activation des récepteurs
Cytochromes C / APAF-1
Réduction du potentiel mitochondrial
Annexine V /7AAD
Activation des caspases
Exposition de la phosphatidyl-sérine
Pic Sub-G1
Changements morphologiques
Fragmentation de l’ADN
t
Cyclines
Distinction des différentes
phases du cycle
Ki-67
Pyronine y
PI
Hoechst
PI
Flux calcique
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Les protéines fluorescentes
Les protéines fluorescentes
Le tri cellulaire
 Formation de fines gouttelettes par
vibrations à une fréquence contrôlée du
liquide de gaine
 formations de gouttes (1 goutte = 1
cellule)
 Soumission à un champ électrique, les
gouttes sont déviées en fonction du
paramètre sélectionné
Applications
 Tri de cellules GFP après transfection
 Tri positif ou négatif de cellules après
immunophénotypage (jusqu’à 4
populations simultanément )
Le tri cellulaire
 Clonage cellulaire