STRUCTURE DE LA MEMBRANE 1 II - LES PROTÉINES MEMBRANAIRES • Porteuses de la plupart des fonctions des membranes • Variable en fonction du type de cellule – myéline : protéines 25 % de la masse – membrane interne des mitochondries : protéines 75 % de la masse – en général : protéines 50 % de la masse • 50 molécules de lipide pour une molécule de protéine • Souvent glycosylées 2 A - Rapports lipides protéines 3 Modes d'insertion des protéines dans la double couche lipidique (1/2) Simple hélice Cylindre Fig 10-17 (1à4) Multiple hélice 4 Modes d'insertion des protéines dans la double couche lipidique (2/2) Phosphatidyl inositol Au départ protéine transmembranaire à un passage dans le RE Chaine d'acide gras ou groupe prényl. Au départ protéine cytosolique soluble Fig 10-17 ( 5 à 8) 5 Protéines liées aux lipides Exemple 5 • Synthèse de la protéine dans le cytosol comme une protéine soluble • Fixation d'un lipide par liaison covalente • Transport vers la membrane 6 Exemple 5 : attachement d'une protéine membranaire par une chaîne d'acide gras ou un groupement prényl Fig 10-18 7 Exemple 5 : attachement d'une protéine membranaire par une chaîne d'acide gras ou un groupement prényl • Aide à localiser une protéine soluble dans la membrane • Peut être transitoire 8 Exemple 6 : protéines liées aux lipides • Synthèse de la protéine dans le RE comme une protéine transmembranaire à un passage • Dans le RE le segment transmembranaire de la protéine est clivé • Un GlycosylPhosphatidylnositol (GPI) est ajouté • La protéine se retrouve liée à la face non cytosolique de la membrane • Facile à reconnaître grâce à une phospholipase C spécifique du phosphatidylInositol 9 Modes d'insertion des protéines dans la double couche lipidique (Rappel) Fig 10-17 ( 5 à 8) 10 Exemples 7 et 8 : protéines périphériques • Liaisons non covalentes avec d'autres protéines de la membrane • Peuvent être libérées par les procédés d'extraction doux (force ionique ou pH) 11 Protéines intégrales • = protéines intrinsèques • Nécessitent des procédés énergiques pour être libérées 12 Protéines membranaires • Transmembranaires – agissent des deux côtés de la membrane – transport de molécules – comprennent les récepteurs • reconnaissance extra cellulaire • message intra cellulaire • Non transmembranaires – associées aux lipides et/ou protéines d'une seule face de la membrane – eg : médiation chimique intra cellulaire (moitié cytosolique de la membrane) 13 Protéines transmembranaires • Toujours orientation unique dans la membrane • Dû à la synthèse dans le réticulum endoplasmique • Presque toujours en hélice • Ou cylindre 14 Hélice Fig 10-19 15 Prédiction de la localisation d'hélice d'une protéine par profil d'hydrophobicité Fig 10-20 (AB) 16 Proportion prévisible de protéines membranaires dans le génome Fig 10-20 C 17 Cylindres • Forment une structure rigide • facile à cristalliser ( hélice ) • Le nombre de plis peut varier de 8 à 22 18 • Cylindres Fig 10-21 (1de2) E. coli E. coli Récepteur à un virus bactérien Lipase 19 • Cylindres Fig 10-21(2de2) Rhodobacter capsulatus L'intérieur est comblé par un domaine globulaire de protéine qui contient un site de fixation du fer E. coli Transporteur d'ions 20 Les Cylindres • Abondants dans la membrane externe des mitochondries • Forment des pores (eg : porine) • Souvent boucles qui font saillie dans la lumière • Parfois porines spécifiques (maltoporines) • Surtout membranes externes des bactéries, mitochondries, chloroplastes • Beaucoup plus rares que hélices chez les eucaryotes • Plus rigides que l'hélice 21 • Simulations d'une hélice de protéine transmembranaire dans une bicouche lipidique. Simulations de (a) 18-mer, (b) 26-mer and (c) 34-mer modèles de l'hélice de la protéine transmembranaire M2 du virus influenza A dans une bicouche lipidique Forrest,LR2000(Fig1) Review Membrane simulations: bigger and better? 22 Simulations de canaux ioniques dans une bicouche lipidique. (a) Hélice M25 (b) Canal potassique KcsA Forrest,LR2000(Fig2) Review Membrane simulations: bigger and better? 23 B - Glycosylation des protéines membranaires 24 • Protéine transmembranaire à un passage glycosylée • Glycosylation dans le RE et Golgi • La face glycosylée est la face non cytosolique • Ponts S—S sur la face non cytosolique Fig 10-22 25 C - Détergents • Petites molécules amphiphiles • Permettent de solubiliser les protéines transmembranaires – Extrémité polaire chargée (ionique) : sodium dodécyl sulfate (SDS) – Extrémité polaire non chargée (non ionique) : triton 26 • Micelle de détergent dans l'eau Fig 10-23 27 Solubilisation de protéines membranaires par un détergent léger: il y a solubilisation des protéines membranaires et des phospholipides de la membrane Fig 10-24 28 • SDS : détergent anionique • Triton X-100 : détergent ionique • Portion hydrophobe du détergent en vert • Portion hydrophile du détergent en bleu Fig 10-25 29 SDS - Page • Solubilisation des protéines par SDS : solubilisation de la protéine avec dénaturation (déroulement) • Parfois réversible • Electrophorèse en Gel de PolyAcrylamide (PAGE) • A révolutionné l'étude des protéines membranaires 30 • Utilisation de détergents légers pour solubiliser, purifier et reconstituer des systèmes de protéines fonctionnels • Très bel exemple Fig 10-26 31 D - Les globules rouges • = Hématies = érythrocytes • Facilement disponibles • Faciles à isoler • Pas de noyau, pas d'organite interne • Une seule membrane = membrane plasmique • Création de fantômes membranaires 32 Fig 10-27 Globules rouges en microscopie électronique à balayage 33 • Préparations de fantômes de globules rouges – refermés ou non – retournés ou non Fig 10-28 34 Méthodes • Marquage "vectoriel" : marqueur radioactif ou fluorescent soluble (ne se fixe que sur la face exposée) • Enzymes protéolytiques • Anticorps marqués • SDS-PAGE 35 Résultats • Certaines protéines traversent la bicouche lipidique • La composition des deux feuillets lipidiques est différente 36 • SDS-PAGE des protéines de la membrane du globule rouge humain environ 15 protéines majeures (15000 à 250000 D) • Spectrine + glycophorine + bande 3 > 60 % en masse des protéines membranaires Fig 10-29 37 a- Spectrine • Protéine du cytosquelette associée à la face cytosolique de la membrane du globule rouge • Principal constituant du cytosquelette qui donne sa forme biconcave au GR • Permet au GR de se déformer pour passer dans les petits capillaires • Mutations dans le gène de la spectrine anémie avec GR sphériques (=sphérocytose héréditaire = Minkowski-Chauffard) • 25 % en masse des protéines associées à la membrane • Longueur = 100 nm (250 000 copies / cellule) 38 • Molécules de spectrine du GR humain – Hétérodimère qui forme des tétramères – deux chaînes polypeptidiques et anti parallèles enroulées – extrémité phosphorylée pour former le tétramère Fig 10-30 A 39 • Molécules de spectrine du GR humain en microscopie électronique Fig 10-30 B 40 • Hétérodimère qui forme des tétramères (200 nm de long) • 4 ou 5 tétramères sont liés dans des complexes de jonction qui contiennent actine (13 monomères) bande 4.1, adducine et tropomyosine Fig 10-31 A 100 nm 41 Liaison de spectrine à la membrane • Ankyrine – Liaison de la spectrine à la membrane – Se lie à • spectrine • bande 3 (protéine transmembranaire) – Limite la diffusion latérale de bande 3 • Bande 4.1 – Liaison de la spectrine à la membrane – Se lie à • spectrine et ankyrine • bande 3 et glycophorine 42 • Spectrine du cytosquelette de la face cytosolique du GR humain en microscopie électronique (coloration négative) Fig 1031B 43 Autres cellules que le GR • Beaucoup plus compliqué • Cortex du cytosol riche en actine • Cf. chapitre cytosquelette 44 b - Glycophorine •Une des premières protéines membranaires à être séquencée •1 million de molécules par cellule •131 acides aminés •Fonction inconnue •N'existe que dans le GR •Type de la molécule transmembranaire à un passage Glycophorine • En général homodimère • Extrémité -N à l'extérieur • 100 résidus glucose (90 % des sucres de la membrane du GR) • Un passage : hélice hydrophobe de 23 acides aminés 46 • Transformation d'une chaîne protéique à plusieurs passages en deux chaînes protéiques à plusieurs passages Fig 10-32 A et B = même résultat A : un gène B : deux gènes 47 c - Bande 3 • Protéine transmembranaire de 930 acides aminés • 12 passages • Transport du CO2 des tissus vers les poumons • Transporteur d'anions qui permet à HCO3- de traverser la membrane • Se voit en cryofracture 48 Photo de Branton Daniel Branton (1932 - ) 49 • Congélation dans l'azote liquide • Fracture du bloc de glace avec un couteau • Le plan de fracture passe entre les deux feuillets hydrophobes de la membrane • Les plans de fracture sont ombrés au platine • Examen de la réplique au microscope électronique à transmission Fig 10-33 50 Cryofracture • Face P(rotoplasmique) face E(xterne) 51 Fig 10-34 • Globule rouge humain en cryofracture • Surtout bande 3 52 ME cryofracture 53 Devenir probable des molécules de glycophorine et bande 3 du GR humain pendant la cryofracture Fig 10-35 La protéine tend à rester avec le feuillet qui contient la plus grosse partie de la protéine 54 E - Bactériorhodopsine • Protéine de transport de la membrane plasmique dont on connaît bien la structure 3D dans la bicouche lipidique • Pompe à protons activée par la lumière de la membrane plasmique de certains archaea • Structure semblable à de nombreuses autres protéines de membrane 55 • Halobacterium salinarum – Archeae – Vivent en eau salée et au soleil – Possèdent des "patch" dans leur membrane plasmique appelée "membrane pourpre" – Chaque patch ne contient qu'une sorte de protéine : la bactériorhodopsine Fig 10-36 56 Halobacterium Salinarum cells, as seen with a dark-field optical microscope www.ib.pi.cnr.it/groups/ halob/flabat.html 57 Halobacterium salinariumis an extreme halophile that grows at 4 to 5 M NaCl and does not grow below 3 M NaCl. This freeze etched preparation shows the surface structure of the cell membrane and reveals smooth patches of "purple membrane" (bacteriorhodopsin) embedded in the plasma membrane. • http://images.google.fr/imgres?imgurl= soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbe s/halobacterium2.gif&imgrefurl=http://s oils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes /halo.html&h=300&w=244&prev=/imag es%3Fq%3Dhalobacterium%2Bsalinaru m%26svnum%3D10%26hl%3Dfr%26lr %3D%26ie%3DUTF-8%26sa%3DN 58 Lyophilized purple membranes • Extremely halophilic microrganisms of the Archaea domain produce a purple membrane, the chromophore consisting of a retinal-protein complex called bacteriorhodopsin 59 Top view of the purple membrane patch. The hexagonal unit cell is displayed in the middle of the patch, surrounded by white line defining the unit-cell dimensions. 60 Krebs,MP20 00p15 (fig2) • (A) Vue latérale d’un monomère de bactériorhodopsine comme on le voit dans le trimère • (B) Vue cytoplasmique de la membrane pourpre 61 Bacteriorhodopsin : contient un groupe absorbant la lumière ou chromophore (le rétinal) http://www.biologia.uniba.it/fisiologia/corcelli/en/br.htm 62 Rétinal • = vitamine A dans sa forme aldéhyde • Le même chromophore que dans la rhodopsine de la rétine • Lié de façon covalente à une lysine de la protéine 63 Krebs,MP2000p15 (fig4) 64 Fontionnement de la rhodopsine • Un photon le chromophore change de forme modification de la conformation de la protéine • Transfert d'un ion H+ du cytosol vers l'extérieur de la cellule 65 • Bactériorhodopsine 7 hélices de 25 acides aminés chacune Fig 10-37 66 Fontionnement de la rhodopsine • Le transfert du proton entraîne un gradient • qui entraîne la formation d'ATP • grâce à une seconde protéine • Sorte de pile solaire 67 Bactériorhodopsine • Modèle pour beaucoup d'autres protéines à 7 passages – Bactériorhodopsine (transporteur) – Transmetteurs de signaux 68 • Autre exemple (que bactériorhodopsine) • Structure 3D du centre de photosynthèse de Rhodopseudomonas viridis – 4 sous-unité : L,M,H, cytochrome Fig 10-38 • Première protéine transmembranaire à être cristallisée et analysée 69 F - Diffusion latérale des protéines • Flip flop : non • Diffusion rotatoire : oui • Diffusion latérale : oui – Hétérocaryons – FRAP – FLIP 70 • Hétérocaryon Homme/Souris de L.D. Frye & M. Edidin (1970) Fig 10-39 71 • Fluorescence recovery After Photobleaching Fig 10-40 FRAP 72 • Fluorescence Loss In Photobleaching Fig 10-40 FLIP 73 Domaines membranaires • Membrane = mer de lipides + protéines qui flottent dedans simpliste • Confinement de protéines dans des domaines spécifiques de la cellule – Cellule épithéliale (intestin ou rein) – Distribution asymétrique des protéines – Distribution asymétrique des lipides – Pas d'échange de lipides ou protéines entre les domaines des feuillets externes • Rôle des tight junctions (jonctions étanches = jonctions serrées) 74 • Limitation de la mobilité d'une protéine membranaire dans un domaine : cellule épithéliale Fig 10-41 75 Application au spermatozoïde • Création domaines membranaires sans jonctions intercellulaires • Trois domaines distincts (au moins) – région acrosomique – région post acrosomique – queue • Barrière inconnue 76 Fig 10-42 • Spermatozoïde de cobaye • Anticorps spécifique de chaque région 77 Autres exemples • Cellule nerveuse – Axone – Dendrite • Beaucoup d'autres 78 Mécanismes d'immobilisation des protéines • Halobacterium : "membrane pourpre" : cristal qui immobilise et limite la diffusion • Assemblages macromoléculaires à l'intérieur ou à l'extérieur de la membrane – eg : GR cf. supra 79 • Quatre mécanismes de restriction de la mobilité latérale de protéines spécifiques de la membrane plasmique – (A) - auto-assemblage en gros agrégats (eg : "membrane pourpre") – (B) - assemblage à l'extérieur de la cellule – (C) - assemblage à l'intérieur de la cellule – (D) - entre deux cellules Fig 10-43 80