Télomérase et Cancer
publicité
Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase Télomères Télomérase et Cancer Quelques dates Notion d’extrémités des chromosomes protégées WATSON Mort des cellules par perte de gènes vitaux Hypothèse d’OLOVNIKOV (1971) Perte progressive d’ADN au cours des réplications Point de départ des travaux sur télomères Greider et Blackburn 1985 Depuis 1996 Protozoaire : Tetrahymenia thermophila Mise en évidence d’un complexe Ribonucléoprotéique Constitué - Reverse Transcriptase (TERT) - ARN matriciel (TR) Télomères et Télomérases sont très étudiés Protozoaire : Tetrahymenia thermophila (in vivo) Modèles Levures : • Saccharomyces cerevisiae (in vivo) • Schizosaccharomyces pombe (in vivo) Souris : TR limitant (in vivo, souris invalidées) Homme : TERT limitante (in vitro) Télomères Télomérase et Cancer Télomères Nécessité pour la cellule de différentier les extrémités de ses chromosomes des cassures dans l’ADN Système NHEJ Pour échapper aux systèmes de réparation des ADN endommagés et à la fusion inter-chromosomique Arrêt du cycle, Apoptose Télomères Télomérase et Cancer Télomères ? Séquences ADN - situées aux extrémités des chromosomes - non codantes - constituées essentiellement d’un motif répété - longueur variable selon les espèces Organismes Uni¢aires Ciliés (Euplotes…) TTTTGGGG < 100 pb Levure (S.Cerevisiae) TG < 500 pb Flagellés(Tripanosome, Leishmania) TTAGGG < 100 pb Algues TTTTAGGG < 500 pb -homme TTAGGG > 10 kpb -souris TTAGGG > 50 kpb -tous les autres TTAGGG Chlamydomonas … Organismes Multi¢aires Vertébrés Truite Plantes TTAGGG Arabidopsis thaliana… TTTAGGG > 20 kpb 3 kpb > 10 kpb Insectes (lepidoptères) TTAGG Champignons (Neurospora) TTAGGG ? Nématodes (Ascaris,Caenorhabditis Elegans) TTAGGC ? Télomères Télomérase et Cancer Régions télomériques non conventionnelles : • Drosophile : ÷ HeT-A (6kpb) et TART (10 kpb) transposons non LTR ÷ Transposés régulièrement aux extrémités des chromosomes • Anophèle et oignon : ÷ Séquences très longues répétées, ÷ homogénéité des séquences est maintenue par des Crossing over non réciproques et ou des conversions de gènes Régions sub-télomériques ÷ homogènes au sein de l’espèce mais variables entre les espèces : • Longueur variable selon l’espèce • Tandems répétés ≠ télomères + = télomères = télomères dégénérés ÷ maintien de l’homogénéité par Crossing Over non réciproques Télosome Télomérase et Cancer Télosomes : Modèles d’étude Modèles « in vivo » ==> les levures S.cerevisiae Schizosaccharomyces Pombe ≠ mais modèle « in vivo » plus proche de l’homme CONFIRMATION pour l’homme • « in vitro » ==> interaction des protéines entre elles ==> maintien en culture d’explants •Utilisation de souris invalidées pour les ≠ gènes impliqués dans le maintien des télosomes. ==> faisable car la longueur des télomères de souris permet l’obtention de 7 générations sans rallongement des télomères. ==> génération 8 apparition de souris stériles Télosome Télomérase et Cancer Télosomes Passage d’une forme à l’autre ? Structure Boucle-T Nombre de TRF1 Décrochage de TRF1 Tankyrase ADP-ribose=> TRF1 Forme réplicative ± 200 bases Ku Ku Ku TRF1 TRF2 Pot1 200bases Forme protégée et forme réplicative Brin 3’ saillant = Brin GT riche Brin 5’ = Brin CA riche Télosome Télomérase et Cancer Télosomes : Protéines constituantes • TTAGGG Repeat Factor (TRF1et TRF2) Structure Boucle-T • TRF1 - Fixés sur les télomères sous forme d’homodimères -Stabiliseraient la T-loop -Empêcherait l’accés de la télomérase aux télomères - Nombre critique (?) ==> passage à la forme réplicative • TRF2 - se lie préférentiellement à la boucle D (in vitro) AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG - lié à RAD50 et MRE11 ==> Boucle D enzymes syst. réparat. de l’ADN -GGTT AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’ TTAG- Rôle majeur suspecté dans **** ********************** **** -CCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCla protection des télomères et la stabilisation des boucles-D TRF2 - Active également la dégradation des télomères - Sa sur-expression ==> raccourcissement des télomères Télosome Télomérase et Cancer Télosomes Protéines constituantes • Pot1 : - fixée à l’extrémité 3’ du brin TG - correspond à Cdc13p de S. cerevisiae Cdc13p ==> Contrôle positif de l’élongation (in vivo) Homme ? ÷ protection de l’extrémité en fixant Ten1 & Stn1 Boucle -T et TRF2 ÷ recrutement de la TERT avant réplication Pot1 Télosome Télomérase et Cancer Télosomes Protéines associées Véronique Gire MS/2005 • Rap1 : ==> Rap1 de S. cerevisiae - fixée sur TRF2 et non sur l’ADN directement - rôle ? • Tin2 : - fixée sur TRF1 - rôle ? : Participerait au contrôle négatif de l’élongation des télomères -Tin2 Régulation du cycle ¢aire -Tin2/TRF1 : régulation du cycle et de la longueur des télomères • Ku : - hétérodimère (70 et80kDA) - Capitale dans la réparation des cassures d’ADN double brin - se fixe sur TRF1 - Rôle ? : Absence Ku (mammifères) => fusion télomères - télomères • Tankyrase : - TRF1 interacting, ankyrin-related, ADP-ribose polymerase - Activité poly ADP-ribose polymérase sur TRF1 - Conduirait au décrochage de TRF1 - Faciliterait l’accès de l’extrémité 3’ à la Télomérase - Posséderait également une fonction réparatrice de l’ADN… Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase C G C G A A U A Télomérase Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée •2 acteurs suffisants in vitro •Active en dimères 2 TR et 2 TERT Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR 12 A B’ C D E N • RT: C - Activité Reverse Transcriptase proche des RT rétrovirales - Pas de liaison avec hTR Moriarty et al, Mol. Cell Biol.2004 Télomérase Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR •2 acteurs suffisants in vitro •Active en dimères 2 TR et 2 TERT RID2 RID2 T 12 A B’ C D E N C • RID2/T: - Interaction avec le pied de boucle P6.1 de hTR Moriarty et al, Mol. Cell Biol.2004 Télomérase Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR •2 acteurs suffisants in vitro •Active en dimères 2 TR et 2 TERT RID1 RID2 RID2 T 12 A B’ C D E N • RID1: C - Liaison avec le pied de boucle P1 de hTR et C terminal de hTERT - Nécessaire à la processivité mais pas à l’activité polymérase - Apporte avec C-term la spécificité par saut de la télomérase Moriarty et al, Mol. Cell Biol.2004 Télomérase Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR •2 acteurs suffisants in vitro •Active en dimères 2 TR et 2 TERT •Processive : Type II par sauts TERT TERT Boucle-T Forme réplicative Recrutement de TERT et de TR AUCCCAAUC AUCCCAAUC TTAGGGTTAGGGTTAG GGTTAGGGTTAG Reverse transcription de la matrice TR Elongation d’un motif GGTTAG Translocation Télomérase Télomérase et Cancer Transcriptase inverse spécialisée •2 acteurs suffisants in vitro •Active en dimères 2 TR et 2 TERT •Processive : Type II par sauts Sous-unité catalytique, protéique ==> TERT Un ARN matriciel ==> TR Facteurs auxiliaires protéiques Protéine Région interagissant Fonction --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------hTERT associée TEP1 aa 1-350, 601-927 inconnue Diskérine/Hsp90 aa 1-195 Assemblage/conformation 14-3-3 aa 1004-1132 Localisation nucleaire hTR associée TEP1 nt 1-871 inconnue hGAR1 hTR H/ACA domain Stabilité, maturation, localisation Dyskerin/NAP57 hTR H/ACA domain Stabilité, maturation, localisation hNOP10 hTR H/ACA domain inconnue hNHP2 hTR H/ACA domain Stabilité, maturation, localisation C1/C2 nt 33-147 Stabilité, maturation, localisation La nt 1-205, 250-451 Accessibilité aux télomères? A1/UP1 nt 1-208 inconnue hStau nt 64-222 Accessibilité aux télomères? L22 nt 64-222 hTR processing, localisation? aa, amino acids; nt, nucléotides. Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase Régulation Télomères Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Télomérase Allongement ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) Au cours de la Réplication Erosion des télomères Par recombinaison Régulation Télomères Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Allongement et Télomérase ???? Tankyrase => décrochage de TRF1 ???? Déstabilisation de la T-loop ???? Pot1 => recrutement de la télomérase ???? Elongation des télomères ALT Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Allongement et ALT (Alternalive Lengthening of Telomeres) • Phénotype ALT + ==> identifié la première fois dans les ¢ tumorales PML (pro myelocytic leukemia) ==> Un accroissement non limité de la taille de leurs télomères ==> Pas de télomérase réactivée ==> Inactivation des répresseurs de l’activité ALT ==> Mise en évidence de corps nucléaires spécifiques (APB-ALT associated PML Bodies) • APB composé : • ADN télomérique extrachromosomal (ECTR-Extra Chromosomal Telomeric Repeats ) ==> Circulaire et linéaire • Protéines TRF1 et TRF2 • Protéines impliquées dans la réplication et la recombinaison (RAD 50, RAD 51, RAD 52, RPA, MRE11, NBS1, BLM, et WRN. ALT Télomérase et Cancer Régulation de la taille des télomères Allongement et ALT (Alternalive Lengthening of Telomeres) Mécanismes d’échange non réciproque • validé par des télomères portant une séquence Tag • FISH => augmentation du nombre de Tag détectables => augmentation du nombre de chromosomes Tagués entre 2 chromosomes A partir de la T-Loop Par cercle roulant sur ECTR circulaire A partir d’ECTR linéaire Erosion télomères Télomérase et Cancer Mécanismes impliqués dans l’Erosion Au cours de la Réplication 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Origine Réplication 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Fragments d’Okazaki ne commencent pas exactement à l’extrémité 3’ 3’ 5’ Fin de Réplication 3’ 5’ Enlèvement des amorces ARN des extrémités Exonucléases 5’=> 3’ ? Raccourcissement des extrémités Erosion télomères Télomérase et Cancer Mécanismes impliqués dans l’Erosion Par échanges intrachromatidiens 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Erosion télomères Télomérase et Cancer Mesure de la longueur des télomères à la fin de leur vie Vitesse estimée de l’Erosion ¢ en culture 40 à 200 nucléotides/division In vivo 15 à 50 nucléotides/an Centenaires 100 ans Trisomie 21 5 à 6 kb 46 ans Progeria de Hutchinson-Gilford < 14 ans Lymphocytes en culture Arrêt des divisions Sénescence Suggère un lien potentiel entre sénescence ¢aire / vieillissement des tissus / mort des sujets ? Biopsies de derme Taux de SA-ß-Galactosidase En fonction de l’âge des sujets Erosion télomères Télomérase et Cancer Essentiellement mais pas uniquement Erosion des télomères Sénescence proliférative ? Horloge mitotique Limitation du nombre de divisions ¢aires Mémoire du nombre des réplications Mécanisme Antiprolifératif Sénescence proliférative Télomérase et Cancer Taille moyenne des télomères 10-15 kb ¢ germinales ¢ souches/basales 5-7 kb M1 = H Point de Hayflick Sénescence Proliférative ¢ somatiques Divisions Cellulaires Sénescence proliférative Télomérase et Cancer 5-7 kb Nombre limité de TRF1? Dissociation du télosome ou Changement de conformation ? Reconnu par la machinerie ¢aire comme de l’ADN endommagé (…) Induction p16INK4a ? Kinase ATM & PARP pRB-OH Active Inactivation Activation p53 Induction p21WAF1 Cyclin Dependant Kinase CDK4 et 6 X X pRB-P Inactive Association à E2F Blocage du cycle en G1/S Sénescence Immortalisation Télomérase et Cancer ¢ somatiques Immortalisées Télomérase - Taille moyenne des télomères 10-15 kb ALT + Action d’oncogènes « Inactivation » des gènes suppresseurs de tumeur 5-7 kb 2-4 kb 10-7 Sénescence Pré-immortalisation ProliférativeImmortalisation M2 Crise Divisions Cellulaires Immortalisation Pré-immortalisation Prolifération limitée (20 à 40) Dégradation des télomères Instabilité chromosomique Translocations… ¢ somatiques Immortalisées Télomérase + Mort massive des cellules Apoptose Prolifération illimitée Réactivation de télomérase ==> Stabilisation taille des télomères ou Réactivation de ALT ==> Pas de stabilisation taille des télomères Immortalisation Télomérase et Cancer Effet de hTERT ? Taille moyenne des télomères 10-15 kb Expression ectopique d’hTERT Immortalisation 5-7 kb ¢ somatiques Immortalisées Pré-immortalisation 2-4 kb Sénescence Réplicative Expression ectopique d’hTERT Crise Divisions Cellulaires Immortalisation des fibroblastes en culture Oncogènes Télomérase et Cancer Oncogène Sarc.. TERT Transformation Colonies en Agar mou Tumorigène « in vivo » Ras Immortalisation Inhibition de contact Permet la multiplication illimitée des cellules en culture Permet la pousse anarchique des cellules en culture Oncogène immortalisant Oncogène transformant Télomérase et Cancer Télomères Télomérase Régulation Télomères Régulation Télomérase Télomérase et Cellules Télomérase et Cancer •Activité télomérase ¢ germinales > ¢ basales > ¢ somatiques •Classiquement dans ¢ somatique pas d’activité. Activité élevée = Tumeur • Activité décrite dans les lymphocytes • Régulation de l’activité télomérase => 3 niveaux => transcriptionnelle (TR et TERT) => post-transcriptionnelle (TERT) => post-traductionnelle (TERT) Régulation Transcription Télomérase et Cancer hTR hTERT Constitutif mTERT Régulé mTR Régulation Transcription Télomérase et Cancer Transactivateurs & Répresseurs Pas de CAAT box ni de TATA box Région GC riche îlot CpG autour de l’ATG ==> régulation par méthylation suspectée? Identification de nombreux sites de fixation de facteurs de transcription Confirmation en ¢ : Promoteur + luciférase Surexpression Facteur de Transcription siRNA ATG Exon1 -1000 -800 -600 -400 -200 1 200 Exon2 400 600 pb Régulation Transcription Télomérase et Cancer Boîtes E E box 2 1 ATG Exon1 -1000 -800 -600 BRCA1 Complexe cMyc c-Myc-Max oncogène activant: prolifération, croissance et apoptose TGF-ß/Smad3 -400 -200 1 200 Exon2 400 600 pb USF 1 et USF2 => répresseur sur E box Mad-Max Boîte E Compétition Antagonisme crucial pour activité Télomérase => répresseur sur E box Régulation Transcription Télomérase et Cancer Boîtes GC En synergie avec Boîtes E E box 2 1 ATG GC box 5 4 3 21 Exon1 -1000 -800 -600 -400 -200 1 Exon2 200 400 600 pb P53 Complexe SP1 SP1 Boîte GC SP1 et SP3 Certaines conditions recrutement Histones déacéthylases Régulation Transcription Télomérase et Cancer Autres Eléments de Réponse E box 2 1 ATG GC box 5 4 3 21 Exon1 -1000 -800 -600 -400 -200 1 200 Exon2 400 600 pb HER2/Neu Ras EGF Raf ER81 Métalothioléine Œstrogène E2F1 : => direct (transcription) ETS boîte MT boîte ERE E2F MZF-2 Wilm’s tumor 1 tumor supressor Tissu spécifique (rein, gonades et rate) VDR VDR : Vit D Recepteur WT-1 Myeloid cell-specific Zn finger protein2 Progestérone : antagoniste Œstrogènes Régulation Transcription Télomérase et Cancer Action des protéines virales sur la transcription E6 HPV Tax HTLV1 Lympho T NFkB E6 /E6AP HBX HBV p53 cMyc Sp1 E Boxes GC Boxes USF1 et 2 Ubiquitination LANA HHV8 Kaposi Régul Post-Transcription Télomérase et Cancer ATG Télomère hTERT +> 16 exons Centromère 5p15 -2Mb -41kb mRNA hTERT 1132 aa N-teminal T-spécifique RT C-teminal Epissage différentiel Transcrit épissé alpha 36 bases 5’ Exon 6 Transcrit épissé béta Perte Exons 7 & 8 3 Transcrits avec insertion Dans divers Exons 4, 14, ou 15-16 Régul Post-Transcription Télomérase et Cancer Fonction inconnue de ces Transcrits alternatifs chez l’homme Profils de transcrits toujours identique : Pas alléatoire Maintien du rapport transcrit codant / transcrits alternatifs Transcrit Alpha Seul en phase Régulation par compétition Effet négatif des transcrits alternatifs exogènes surexprimés EPISSAGE ALTERNATIF MECANISME ADDITIONNEL DE REGULATION DE L’ACTIVITE TELOMERASE Régulation Post-Traduction Télomérase et Cancer Régulation post-traductionnelle de la télomérase Lymphocytes Amygdales Lymphocytes B et T circulants ARNm Télomérase taux identique Activité Télomérase différente ARNm TERT et RT détectables Modulation de l’activité télomérase par modifications post-traductionnelles de hTERT Tissus ovariens normaux Pas d’activité Télomérase Action de ≠ inhibiteurs de kinase =>Sur cellules explantées de tumeurs =>Sur cordons ombilicaux maintenus en culture =>Sur cellules en cultures Au moins 3 kinases identifiées modifiant activité télomérase Régulation Post-Traduction Télomérase et Cancer Kinase Site de phosphorylation Sur hTERT Action Sur hTERT Protein Kinase C ? Active Akt ProteineKinase 220-GARRRGGSAS-229 817-AVRIRGKSYV-826 Active Tyrosine Kinase c-Abl 308-PSTSRPPRP-316 Inactive Cas des lymphocytes CD4+ hTERT produite dans le cytoplasme Translocation hTERT-P dans le noyau INACTIVE phosphorylation dépendante ACTIVE Régulation Télomérase et Cancer Activité Télomérase Régulée Via hTERT Tumorigenèse Transcription Epissage Différentiel ??? Post-traductionnel TERT autre fonction dans la cellule suspectée
