k -1 - Site Maintenance in progress

Cinétique enzymatique
Equation de Michaelis et Menten
Les trois phases d’une réaction
enzymatique:
• ≤ msec: « phase initiale »
(formation du complexe ES)
• quelques minutes (heures):
« état stationnaire » ( [ES]
constant, vitesse constante )
• Après quelques heures:
« approche de l’équilibre »
(disparition progressive du
substrat, vitesse diminue)
Incubation longue
(généralement quelques heures):
[ P ]
(t )
Etat
Stationnaire:

Incubation moyenne
(généralement quelques minutes):
[S]=30 mM
Produit
[S]=10 mM
[S]=3 mM
[S]=1 mM
Temps
On parle d’état
stationnaire tant
que la vitesse de
la réaction reste
constante.
A l’état stationnaire: lorsque la concentration du substrat,
[S], augmente, la vitesse initiale de la réaction, v, augmente
hyperboliquement.
vitesse
100
50
0
Interprétation???
0
50
[Substrat]
100
Observations:
• Quelque soit la concentration de S, la vitesse est
proportionnelle à [E].
• A faible concentration de S, la vitesse est proportionnelle
à [S] . La loi d’action des masses nous apprend que si
v=[E][S] c’est que la réaction passe par une étape:
E+S-- >P
• A forte concentration de S, la vitesse ne dépend plus de
[S] mais reste proportionnelle à E
Hypothèse:
• La vitesse est en fait proportionnelle à [ES] ?
[E]+[S] [ES] [E]+[P]
k +1
k cat
 ( ES ) - E + P
E + S
k -1
La loi d’action des masses prédit que:
d( P )
 k cat [ ES ]  v
d( t )
Tant que [ES] reste constant, le produit apparaît à une vitesse
constante: on parle alors “d’état stationnaire”
Méthode traditionnelle de
calcul:
• On pose: 1. état stationnaire,
d (ES )
= k1 [E ][S ] - k- 1 [ES ] - kcat [ES ] = 0
d (t )
d (P )
= kcat [ES ] = v
d (t )
•
2. Conservation des masses:
[E ] + [ES ] = [E tot ]
d (ES )
= k1 [S ][E ] - k- 1 [ES ] - kcat [ES ] = 0
d (t )
d ( ES )
 k1 [ S ]([ E tot ] - [ ES ]) - k -1 [ ES ] - k cat [ ES ]  0
d (t )
 k1 [ Etot ][ S ] - k1 [ ES ][ S ] - k -1 [ ES ] - k cat [ ES ]  0
[ ES ]( k1 [ S ] + k -1 + k cat )  k1 [ Etot ][ S ]
[ ES ] 
[ ES ] 
k1 [ E tot ][ S ]
( k1 [ S ] + k -1 + k cat )

1 k1
1 k1
[ E tot ][ S ]
[ S ] +  k -1 + k cat  k1
v  k cat [ ES ] 
k cat [ E tot ][ S ]
[ S ] +  k -1 + k cat  k1

Vmax [ S ]
[S ] + KM

Vmax [ S ] K M
[S ] KM + 1
Méthode alternative:
v = kcat [ES ]
≤1
[E tot ]= {[E ]+ [ES ]}
[ES ]
v = kcat
[E tot ]
[E tot ]
lorsque tout l'enzyme est occupé:
[ES ]
v = V max
{[E ]+ [E S ]}
V max = kcat [E tot ]
v=
V max [ES ]
[E tot ]
Quelles sont les valeurs
relatives de [E ] et [ES ]?
A l'équilibre:
E  S 

KD 
 ES 
(mais l'équilibre n'est pas atteint:
à l'état stationnaire, ES est consommé pour donner E+P!)
A l'état stationnaire,
KM
E  S 


 ES 
v
donc
 ES    E  S 
KM 
ES 

Vmax
 E  +  ES 
devient:
v  Vmax
 E  S  K 
 E  +  E  S  K 
 S  K 
1 +  S  K 
M
M
v  Vmax
M
M
Re ste à définir K M . A l'état stationnaire:
k1
2
¾
¾
® ES ¾ k¾®
E+S¬ ¾
E+P
¾
k- 1
d [ES ]
dt
= 0 = k1 [E ][S ]- k- 1 [ES ]- k2 [ES ]
k1 [E ][S ]= (k- 1 + k2 )[ES ]
[E ][S ] (k- 1 + k2 )
KM =
=
k1
[E S ]
Représentation de Michaelis-Menten
v
VmaxS 
S  + K M
Une autre façon de voir les choses:
Traditionnellement, on étudie les enzymes purs,
agissant sur des substrats purs, dans un tube à
essai.
On s’intéresse de plus en plus aux enzymes tels
qu’ils fonctionnent en cascade, « in vivo », et
non pas isolés dans un tube à essai.
On parle alors de « flux enzymatique »:
Le moindre étranglement entre deux « bassins » peut provoquer le débordement
des bassins en amont, l’interruption du flux en aval… Quelles sont les conséquences
d’une modification de KM, d’une diminution de Vmax?
Imaginons la voie métabolique comme un
Canal dont le flux est régulé par une série d’écluses:
Forme de l’ouverture de l’écluse?
Nous allons calculer la forme de l’écluse, tel que le flux
de l’eau s’écoulant du bassin précédent se comporte
comme le « flux enzymatique » à travers une réaction
Michaelienne:
La surface sous une fonction est donnée par son intégrale.
Si "fct ([S ])" représente la forme de l' "écluse" qui permet
l'écoulement:
ò fct ([S ])= v
dv
donc fct ([S ]) =
d[S ]
V max [S ]
Num
est une équat ion de la forme
K M + [S ]
Den om
æu ö u ' v - uv '
d çç ÷
÷=
èv ø
v2
æ Num ö Num ' Denom - Num Denom '
÷
d çç
=
÷
èDenom ø
Denom 2
V max [S ]
donc : si v =
K M + [S ]
V max (K M + [S ]) - V max [S ](1)
dv
=
2
d [S ]
(K M + [S ])
V max (K M ) + V max ([S ]) - V max [S ]
dv
=
2
d [S ]
K
+
S
( M [ ])
V ma x (K M )
dv
=
2
d [S ] (K M + [S ])
0
0
2
4
[Substrate] / KM
d (v) / d ([S])
in % of (Vmax / KM)
v (in % of Vmax)
100
50
6
[Substrate] / KM
Représentons chaque enzyme par une
écluse, permettant l’écoulement de l’eau:
• Surface = vitesse
La surface de l'ouverture représente la vitesse
de la réaction.
L'orifice devrait être plus large à la base puisque
– Plus large en bas
(v ↑ si [S]↑)
– Étroit en haut (vVmax)
la vitesse augmente (proportionnellement)
plus lorsque [S ] est faible.
L'orifice devrait se "resserer" vers le haut:
lorsque [S ] augmente, v ® V .
max
– Largeur maximale:
en [S]0, dv/dSVmax/KM
– Largeur minimale:
– en [S]∞, dv/dS0
d (v) / d ([S])
in % of (Vmax / KM)
Représentation de la “porte
d’écluse”
[Substrate] / KM
[Substrate ]
“Enzyme lock” gate
Représentons chaque enzyme par une
écluse, permettant l’écoulement de l’eau:
• Surface = vitesse
La surface de l'ouverture représente la vitesse
de la réaction.
L'orifice devrait être plus large à la base puisque
– Plus large en bas
(v ↑ si [S]↑)
– Étroit en haut (vVmax)
la vitesse augmente (proportionnellement)
plus lorsque [S ] est faible.
L'orifice devrait se "resserer" vers le haut:
lorsque [S ] augmente, v ® V .
max
– Largeur maximale:
en [S]0, dv/dSVmax/KM
– Largeur minimale:
– en [S]∞, dv/dS0
Représentons chaque enzyme par une
écluse, permettant l’écoulement de l’eau:
Surface sous la courbe = Flux
[S]↑
Vmax  K M 
v
si courbe :

  S   K M +  S 2
Vmax
v
en [ S ]  0,

;
 S   KM 
v
 [S ]
(Vmax/KM)
dv
V max
en [S ] = K M ,
=
d [S ] 4 (K M )
Réactions en présence d’un
mélange de plusieurs substrats
possibles:
Spécificité et KS
Spécificité:
1000
800
S1 et S2 séparés:
600
Vitesse
Supposons une enzyme
capable d’agir sur deux
substrats, S1 et S2: comment
savoir quel est sur quel
substrat elle agira « de
préférence » si ils sont
présents simultanément dans
la cellule ou mélange
réactionnel étudié?
P2
400
200
P1
0
0
200
400
600
Substrat
Vmax 100, Km 10, Ks 10
Vmax 1000, Km 1000, Ks 1
800
1000
1 enzyme, 2 substrats mélangés:
S1  ES1
E+
+ P1
E
S2  ES2
+ P2
v1 = kc1at ([ES 1 ])
v2 = k
2
cat
2
([E S ])
v1
= ? ??
v2
KS:mesure de la spécificité d’une enzyme
KS=kcat/KM permet de
quantifier la vitesse
relative de la
réaction d’intérêt
lorsque l’enzyme est
en présence de
plusieurs substrats
(« spécificité):
Si
et:
1 é
1ù
1
v 1 = kcat
ES
=
k
cat
ú
ëê û
2
v 2 = kcat
[E ]éêëS 1 ùúû
éES 2 ù= k 2
êë
ú
û cat
1
kcat
K M1
[E ]éêëS 2 ùúû
K M2
= K S1 [E ]éëêS 1 ù
ú
û
= K S2 [E ]éêëS 2 ù
ú
û
E ]éêëS 1 ùúû K 1 éS 1 ù
[
K
v
S ê
ú
Alors, 2 = 2
= 2 ë 2û
éS ù
kcat
v
2ù
K
é
S
êë úû
E
S
2 [ ]ê
ú
ë
û
K
1
1
M
M
v1
[S 1 ]
est constant si 2 reste constant!
2
v
[S ]
« KS » et vitesse d’association E●S
vitesse de réaction: en [S] ® 0,
v=
V max [S ]
K M + [S ]
®
V max
kcat
v=
[S ]=
[E tot ][S ]» K S [E ][S ]
KM
KM
([E ]» [E tot ])
vitesse d'association E-S:
v = kass [E ][S ]
Donc, la constante apparente d'association, kass , est équivalente à K S
kass =
kcat
= KS
KM
Autre signification de KS:
Limite maximum de KS ?
KS =
kcat
kcat
k1kcat
=
=
KM
(k- 1 + kcat ) / k1 (k- 1 + kcat )
1
cat
enzyme "parfait" ( k -1 <<< kcat ) : E + S ¾ k¾®
ES ¾ k¾¾
®E+P
KS =
k1kcat
kk
» 1 cat = k1
(k- 1 + kcat ) (kcat )
k1 mesure le nombre de rencontres E-S :
à T° normale (20-37°C), "petits substrats": k1 £ 109 M - 1 sec - 1
"Grands substrats" (protéines) :
habituellement, k1 » 105 à 107 M - 1 sec - 1
K S £ k1 est donc toujours £ 10 9M - 1 sec - 1
Modification de l’équilibre?
Les enzymes ne modifient pas l'équilibre entre [S] libre et [P] libre.
On peut donc écrire: à l'équilibre,
r s
[P ]
= K eq et v = v
[S ]
Equilibre: relations de Briggs-Haldane
Supposons la réaction A ƒ B
l'enzyme catalyse la transformation de A ® B,
et catalyse également la réaction inverse B ® A
Il se trouve devant deux "substrats": A et B; donc
r
K SA [A ]
v
s= B
v K S [B ]
r s
A l'équilibre, v = v
[B ] K SA
= B = K eq
[A ] K S
donc:
K SA [A ]
K
B
S
[B ]
=1
L’équilibre ne peut être modifié
par les enzymes.
La catalyse est donc toujours « aussi
efficace » dans un sens que dans
l’autre?
Réactions à « sens unique »:
uuuur
suuuu
Pour que V max > > V max ,
alors que K eq
K SP
= S » 1:
KS
il suffit que K MS > > K MP
Exemple: SAM synthase
à l'équilibre: K  1
4
Vmax K MS
K

K
Vmax K MP
vitesse
K
S
S
P
S
1 10
5000
Pour que Vmax  10  Vmax
0
Le produit est inhibiteur:
lorsque SAM  0.03mM :  voir graph
1 10
vitesse
PPi +Pi puis SAM
200
400
600
800
1000
800
1000
[ATP] (µM)
Il faut que K MMet , ATP  10  K MSAM
Met + ATP + H 2O
0
4
5000
0
0
200
400
600
[Met] (µM)
Enzyme « idéale »?
k1 grand, k-1 petit, kcat grand :
Spécificité, efficacité?
Comment varie la vitesse de la réaction
lorsque x augmente de …%?
Si [S] grand, v augmente
moins vite que [S]. Pour
exprimer cette relation:
v
écrire
Δv
[ S ]
v
v
[S ]
Δ[S]
[S]
?
dF
F = x dF = ?
dx
F dx
x
æ æ Num öö
÷
÷
ççd çç
÷
÷÷
÷
çç èDenom ø
÷
=
÷
çç
÷
dx
÷
çç
÷
÷
çè
ø
avec
F=
Num
Denom
æNum ' Denom - NumDenom 'ö
÷
çç
÷
÷
è
ø
Denom
2
ædNum
ö
dDenom ÷
Num
x dF
Denom çç
dx dx ÷
= x
÷
çç
÷
F dx
Num çè Denom
Denom
÷
ø
2
dF
dNum dx dDenom dx ö
F = xæ
÷
çç
÷
÷
dx
è Num
Denom ø
x
Si k1 augmente de …%?
v=
dv
dk1
k1kcat [S ]
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ]
d(N / D )
v =
k1
(N / D )
dk1
dv
k1
ædN / dk1 dD / dk1 ö
÷
= k1 çç
÷
çè N
D ø÷
æ k [S ]
ö
[S ]
÷
cat
ç
÷
= k1 çç
÷
çèk1kcat [S ] (k- 1 + kcat ) + k1 [S ]÷
ø
= 1-
k1 [S ]
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ]
dk1
v =
k1
(k- 1 + kcat )
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ]
Evolution de la vitesse quand k1 augmente:
v
k 1
Conclusion: la vitesse de la
réaction augmente avec k1,
d’autant plus que k1 petit.
v
1
k1
0
1
0
50
k1
100
lorsque k-1 augmente de …%?
v=
dv
dk- 1
k1kcat [S ]
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ]
d(N / D )
v
=
k- 1
(N / D )
dk- 1
dk- 1
1
v
k- 1
0
k- 1
ædN / dk- 1 dD / dk- 1 ö÷
= k- 1 çç
÷
÷
çè N
ø
D
æ
ö÷
1
ç
÷
= k- 1 çç0 ÷
çè
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ]÷
ø
=-
dv
k- 1
k- 1 + kcat + k1 [S ]
1
0
50
100
[k-1]
Conclusion: la vitesse de la
réaction diminue lorsque k-1
augmente, d’autant plus que
k-1 grand.
lorsque kcat augmente de …%?
v
v=
dv
dkcat
k1kcat [S ]
k cat
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ]
=
kcat
k cat
(N / D )
dkcat
kcat
ædN / dkcat dD / dkcat ö
÷
= kcat çç
÷
÷
çè N
ø
D
1
0
50
100
[kcat]
Conclusion: la vitesse de la
réaction augmente avec kcat,
d’autant plus que kcatest petit.
k- 1 + k1 [S ]
kcat
=
(k- 1 + kcat ) + k1 [S ] (k- 1 + kcat ) + k1 [S ]
æ k [S ]
ö
1
÷
1
ç
÷
= kcat çç
÷
çèk1kcat [S ] (k- 1 + kcat ) + k1 [S ]÷
ø
= 1-
v
0
d(N / D )
v
1
Pour résumer:
• La réaction sera d’autant plus rapide (à 1
concentration de substrat donnée) que:
– k1, (reconnaissance enzyme-substrat), est
grand;
– kcat, (transformation de ES en E+P) est grand,
– k-1, (dissociation du substrat avant
transformation), est faible.
Comment augmenter la
spécificité de l’enzyme?
1. Vaut-il mieux que le ‘bon’ substrat
ait un grand KS? Que le ‘mauvais’
substrat ait un faible KS? Ou les
deux?
2. Comment faire? (Comment varie
KS en fonction de k1, k-1 et kcat?)
Suffit-il d’augmenter KS pour le « bon »
substrat?
Une enzyme sera considérée comme
« spécifique » si elle agit sur un seul substrat,
même en présence de nombreux autres
composés très semblables.
Pour atteindre ce but, il ne suffit pas que la valeur
du KS du « bon » substrat soit élevée:
Il faut que: K S1 [S 1 ] > > K S2 [S 2 ] pour tous les substrats
alternatifs présents dans le milieu réactionnel!
Comment varie KS lorsque k1 augmente de …%?
 KS
KS 
K S
k1
KS
k1
k cat
KM

k1k cat
 k -1 + k cat 
 kcat
KS
kcat
 k cat

0

 k1 
k k

 1 cat  k -1 + k cat  
1
La constante de spécificité augmente proportionnellement à k1.
k1 reflète le nombre de collisions « productives » entre enzyme et substrat:
varie peu d’un composé à l’autre (sauf si ‘guidage’ par interactions ioniques)
k1
lorsque k-1 augmente de …%?
kcat
k1kcat
KS 

K M  k-1 + kcat 
 KS
 k-1
KS
k-1
 0

1
 k-1 

 k1kcat  k-1 + kcat  
-
k-1
 k-1 + kcat 
 KS
 k-1
1
KS
k-1
0
1
0
50
100
k-1 ou kcat
KS diminue lorsque k-1 augmente, d’autant plus que k-1 est
grand.
les substrats qui dissocient lentement du site actif avant transformation seront
transformés de préférence. Importance d’interactions à courte distance.
lorsque kcat augmente de …%?
KS 
 KS
 kcat
KS
kcat
kcat
k1kcat

K M  k-1 + kcat 
 KS
 kcat
 k1

1
 kcat 

 k1kcat  k-1 + kcat  
1
kcat
 1 k-1 + kcat 
0
k-1

 k-1 + kcat 
1
KS
kcat
0
KS augmente avec kcat, surtout si kcat faible
50
100
kcat
Résumé: variation de KS
• KS est toujours proportionnel à k1.
• KS diminue si k-1 augmente, surtout si k-1
grand.
• KS augmente avec kcat surtout si kcat petit
Spécificité ou efficacité? En résumé:
•Si l’enzyme peut utiliser deux (ou plusieurs) substrats: pour qu’il
soit spécifique, il faut que KS = kcat/KM diffère le plus possible
d’un substrat à l’autre.
•La vitesse de la réaction et KS augmentent lorsque k1 augmente,
lorsque kcataugmente et lorsque k-1 diminue : le guidage
électronique et la rétention du substrat dans le site actif peuvent
augmenter à la fois la vitesse de réaction et sa spécificité.
Analyse cinétique:
linéarisation
•
•
•
•
Lineweaver-Burke,
Hanes ou Woolf,
Eadie - Hofstee,
Linéaire direct
Michaelis Menten:
Avantage: statistiquement correct (y varie, x constant)
Inconvénient: non linéaire! Analyse difficile.
Double réciproque : Lineweaver-Burk (1934)
1

1
+
Km 1
v Vmax Vmax S 
Très populaire: diminue souvent l’impression de
dispersion des résultats.
Problème: erreurs amplifiées à petit substrat donc
grand 1/S (à droite du graphe).
Hanes, ou Woolf
æ1 ö
çç ÷
÷
÷[S ]=
çèv ø
æ K
ö
1 ÷
çç
M
÷[S ]
ççV [S ]+ V ÷
÷
è max
max ø
[S ] K M
v
=
V max
+
1
V max
[S ]
Avantage: les erreurs sont « normalisées » et ≈ constantes.
Inconvénient: toute erreur sur KM est reportée sur Vmax.
Eadie-Hofstee:
v
v = V max - K M
[S ]
v
Vmax
Pente: -KM
v/[S]
Vmax/KM
Rare. Les erreurs sont « obliques », et amplifiées à haut [S]!
Avantage: très sensible à toute déviation de «MichaelisMenten ».
Graphique direct linéaire
(Eisenthal et Cornish-Bowden)
Principe: Chaque paire de valeurs v et [S]
est compatible avec une infinité de valeurs
de KM et Vmax, distribués sur une droite
d’équation:
équivalente à:
V max = v +
v
KM
[S ]
y = a + bx avec y = V max , x = K M
en y = 0 x = -
a
= - [S ]
b
en x = 0; y = a = v
v
Application: tracer
chacune de ces droites:
leur intersection
correspond à la seule
valeur de KM et Vmax qui
soit compatible avec
tous les résultats.
Vmax
v1
v2
v3
S1
S2
S3
KM
[S]
v
En réalité, pas intersection
« unique » (erreurs exp.). Il
faut chercher le centre de
gravité de toutes les
intersections…
Pas pour publication, (pas
« joli »), mais pratique pour
estimer Vmax, KM sur un coin
de table de labo…
v1
v2
v3
v4
S1
S2
S3 S4
[S]
Constantes:
Définitions et dimensions
KM
"La constante K M est une mesure de l'affinité (ou plutôt de la constante
de dissociation) de l'enzyme pour son substrat." : Vrai ou faux ?
APPROXIMATION GROSSIERE: l'équilibre n'est pas atteint! L'affinité
du substrat est surévaluée:
k- 1
KD =
k1
Donc:
et
KM =
(k- 1 + k2 )
k1
KD = KM
" K M » [S ]" Vrai ou faux?
Parfois, pas toujours : inutile pour identifier le « vrai » substrat!
Dimensions:
• KM = (k-1 + kcat )/ k1 :
– k1 : M-1sec-1
– k-1 : sec-1
– kcat : sec-1
• KM : (sec-1)/(M-1sec-1) = 1/M-1 = M
KM est une concentration (M ou mol/l)
Vmax
• La vitesse maximum ou Vmax est une limite théorique,
jamais atteinte en pratique! (Il est impossible d’obtenir
une concentration infinie en substrat!)
• On peut néanmoins utiliser cette limite pour estimer le
nombre de molécules de substrat transformées par le
complexe enzyme substrat en une seconde, minute, etc.
• Ce « turnover number » (débit) donne une idée de
l’efficacité de la catalyse, surtout quand on le compare
avec la réaction non catalysée…
Quantité d’enzyme : dimensions
v et Vmax : mol/sec ou mol/min
Quantité d’enzyme: vitesse,
exprimée en « Unités » (µmol/min),
ou en « katals » (mol/sec)
Quantité d’enzyme:
Unités courantes
•
Unité (U): quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 µmole de substrat
par minute dans les conditions standard (généralement à 25°C, dans les
conditions optimales de pH, et de force ionique, en présence des cofacteurs et
coenzymes nécessaires en quantité suffisante…).
Typiquement, de l’ordre de 0.1 – 100 μg d’enzyme pur, ou de l’ordre de 0.1 - 100
mg pour les préparations industrielles d’enzyme.
Remarque: les conditions de mesure de l’activité doivent être clairement
définies par le fournisseur!
Unités « CGS » (internationales)
•
katal (kat), quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 mole de substrat
par seconde dans les conditions standard.
(1 kat = 60 000 000 U ou quelques kilos d’enzyme pur; 60 U = 1µkat).
•
(Problème: une mole = 180 g de glucose, quelques kilos de protéine…!)
KS
La constante K S est une mesure de la constante apparente de
vitesse d'association du complexe enzyme-substrat:
KS =
k1kcat
£ k1
(k- 1 + kcat )
Dimensions:
• KS = k1kcat / (k-1 + kcat ) :
– k1 : M-1sec-1
– k-1 : sec-1
– kcat : sec-1
• KS : (M-1sec-1) (sec-1) / (sec-1) = M-1 sec-1
KS a les dimensions d’une constante de
vitesse d’association
Un flux minimum peut être
indispensable pour permettre la survie:
• Plutôt que de calculer la
vitesse imposée par la [S], on
devrait calculer la [S]
nécessaire pour maintenir une
certaine vitesse.
[Substrat]
nécessaire
Survie
impossible
v
K M + [S ]
K M + [S ] 
Vmax
KM 
Vmax
[S ]
v
[S ] - [S ]
v
V

K M   max - 1 [ S ]
 v

donc :
[S ] 
Vitesse de
production
Vmax [ S ]
KM
 Vmax

- 1

 v

Nécessité d’autres modèles:
• Enzymes allostériques:
– Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au
substrat, ni au produit de la réaction
Exemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, …
• Enzymes coopératives:
– Courbe cinétique de forme « sigmoïde » (vitesse de réaction
proportionnelle à [S]n lorsque [S] est faible)
Remarque: la majorité des enzymes coopératives sont
également régulées allostériquement, et beaucoup
d’enzymes allostériques sont également coopératives
vis-à-vis d’au moins un substrat!
Exemple d’enzyme coopérative : Aspartate
transcarbamoylase bactérienne
ZOOM:
1
1
Controle
VITESSE
VITESSE
+ATP
0.5
+CTP
+ATP
0.5
Controle
+CTP
0
0
20
[SUBST RAT ] (mM)
40
0
0
5
[SUBST RAT ] (mM)
Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP;
Inhibé lorsque les purines sont disponibles;
activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles
10
Aspartate Transcarbamoylase
bactérienne
R
R
C
C
Vue du haut:
C
R
Vue de profil:
C
C
R
R
C
C
INACTIVE (T)
ACTIVE (R)
Forme de la courbe: justification?
1
v
i
t
e
s
s
e
1
v
i
t
e
s
s
e
R
R
0.5
T
0.5
0
T
0
0
2
4
6
Conformation R
Conformation T
Enzyme allostérique (2sites)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
[S]
8
10
[S]
L’enzyme coopérative existe en 2
conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine;
les courbes v et T sont confondues à très petit [S].
Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la
vitesse se rapproche de la courbe R
Enzyme allostérique de type « V »:
la glycogène phosphorylase
Ser-PO4
AMP
Sites actifs
Sucres (glycogène)
Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparement
pas grande différence au niveau des vitesses?
1
0.5
0
0
2
4
6
Enzyme "Michaelienne"
Enzyme allos térique (2 s ites )
8
10
Mais…pas du tout le même effet sur le
« Flux » à travers la voie métabolique:
{orifice étroit à la base, s’élargit (la
vitesse augmente plus que [S] lorsque [S]
est très faible), puis redevient très étroit
(la vitesse augmente moins que [S]
lorsque [S] est grand)}
{orifice large à la base, de plus en plus
étroit car la vitesse augmente moins que
[S] à toutes [S]}
Pourquoi? Zoom sur les petites
concentrations de Substrat:
0.3
Enzyme Michaelienne:
v varie moins que S,
pente max en [S]0
vitesse
0.2
Enzyme coopérative:
v varie plus que S
0.1
pente ≈ 0 en [S]0
0
0
0.1
0.2
[Substrat]
Enzyme "Michaelienne"
Enzyme allostérique (2 sites )
0.3
Enzymes coopératives:
Modèle de Monod, Jacob et Changeux
Modèle de Koshland, Nemethy et Filmer
Monod, Jacob et Changeux:
R
T
Si  
S
KR
S
c 
S
S
Tn 
 Rn 
S
Y 
S
S 
KT
L
S
S 
S
(1 +  ) n -1 + L (1 + c ) n -1
(1 +  ) n + L (1 + c ) n
Koshland, Nemethy et Filmer:
S
S
S
Equation encore plus complexe
(2 complexes ES2 différents)
S
S
S
La réalité: un mélange de ces deux modèles?
R
T
T
T
T
T
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Régulation d’une enzyme coopérative
par des régulateurs allostériques:
1
Activateur,
stabilisant R
0.5
Inhibiteur stabilisant T
0
0
2
4
6
Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100)
Enzyme allostérique activé (T/R = 10)
Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)
8
10
Régulation d’une enzyme
coopérative et allostérique:
Inhibiteur stabilisant la conformation « T »