BIO241-ET2-2012-corrigé

BIO241 Examen terminal 2nde session (18 juin 2012)
Documents et calculatrices non autorisés
ATTENTION : Les parties A, B et C doivent être traitées sur des copies
séparées
XX pages
Notation sur 80
PARTIE A
Métabolisme bactérien : cours de Mr Y. Markowicz (15 pts)
Un chercheur a décidé de cultiver la bactérie Escherichia coli sur milieu minimum, mais en faisant
varier la source de carbone : lactose pour la culture A, glucose pour la culture B. Une fois les deux
cultures lancées, il effectue un prélèvement toutes les 30 minutes, qui lui sert à suivre l’évolution de la
DO600 au cours du temps.
Culture
DO600 à t =
0 0h30 1h 1h30 2h 2h30 3h 3h30 4h 4h30 5h
A 0,008 0,007 0,012 0,027 0,058 0,123 0,241 0,492 0,976 1,453 1,635
B 0,008 0,009 0,026 0,079 0,187 0,532 1,498 2,139 2,354 2,541 2,468
1) En vous servant des données ci-dessus, tracez sur la feuille semi-log (jointe en annexe) les deux
courbes de croissance, et calculez les temps de génération pour les cultures A et B. (2 points)
On sait que le glucose pénètre dans la bactérie via un transport de type PTS. Le lactose, lui, entre via
un symport à protons, puis est hydrolysé par la β-galactosidase pour donner du glucose et du
galactose.
2) Quelles différences va-t-il y avoir quant au catabolisme des molécules de glucose et de galactose
qui proviennent toutes deux de l’hydrolyse du lactose ? (2 points)
3) Quelle explication pouvez-vous donner à la différence de temps de génération observée selon la
nature de la source de carbone ? (2 points)
Une autre source de carbone possible pour Escherichia coli est le glycérol. Celui-ci entre dans la
cellule via un mécanisme de diffusion facilitée, puis est transformé en dihydroxyacétone-phosphate
via les réactions suivantes :
(1) glycérol + ATP glycérol-phosphate + ADP
(2) glycérol-phosphate + FAD dihydroxyacétone-phosphate + FADH2
4) Que va devenir le dihydroxyacétone-phosphate dans la cellule ? (1 point)

5) Quelles seront les principales différences au niveau métabolique entre la consommation de
glucose et celle de glycérol ? (2 points)
6) D’après vous, le temps de génération de la culture effectuée avec du glycérol comme unique
source de carbone sera-t-il plus long, plus court ou identique à celui de la culture effectuée avec
du glucose (justifiez votre réponse) ? (1 point)
Un mutant d’Escherichia coli a été isolé qui ne pousse pas en présence de glucose, de lactose ou de
glycérol. Si on cultive ce même mutant dans les mêmes milieux de culture, mais cette fois en
anaérobie, le mutant pousse plutôt bien.
7) D’après vous, quelle peut être l’enzyme codée par le gène muté chez cette bactérie (justifiez votre
réponse) ? (2 points)
La bactérie anaérobie aérotolérante Lactococcus lactis est elle aussi capable de cataboliser glucose
et lactose. A l’inverse d’Escherichia coli, elle importe le glucose via un transport actif et le lactose via
un système de type PTS.
8) En prenant en compte toutes les informations qui vous ont été données sur cette bactérie, pouvez-
vous dire (justifiez vos réponses) :
a. si, quand elle a pour source de carbone unique du lactose, elle croîtra plus rapidement, plus
lentement ou à la même vitesse que sur glucose ? (1 point)
b. si, avec l’une ou l’autre source de carbone, elle est susceptible de croître plus rapidement sur
lactose qu’Escherichia sur glucose ? (2 points)
Réponses partie A
Réponses :
1)
Tracés (1 point)
A : 30 min (0,5 point)
B : 20 min (0,5 point)
2)
Alors que le glucose entre directement dans la glycolyse une fois phosphorylé
(consommation d’une molécule d’ATP), (0,5 point)
le galactose devra d’abord être épimérisé en glucose via la voie de Leloir (phosphorylation
du galactose, puis transfert de la molécule de galactose sur une molécule d’UDP, qui
permet l’épimérisation du galactose en glucose, l’UDP-glucose étant alors converti en
glucose-1-phosphate qui sera converti en glucose-6-phosphate). (1,5 points)
3)
L’entrée du glucose se fait via un transport « gratuit », (0,5 point)
celle du lactose via un transport qui coûte de l’énergie (gradient de protons) : (0,5 point)
le catabolisme produira donc plus d’énergie que celui du lactose, d’où une croissance plus
rapide sur glucose. (1 point)
4)
Il va entrer dans la glycolyse. (1 point)
5)
L’utilisation du dihydroxyacétone phosphate pose deux problèmes :

la nécessaire production des métabolites précurseurs à 6 carbones (glucose-6-phosphate
et fructose-6-phosphate), qui implique une injection de molécules en sens contraire dans la
glycolyse, (1 point)
et l’injection de carbones dans la voie des pentoses phosphate (pour produire deux autres
métabolites précurseurs, les pentoses-5-phosphate et l’érythrol-4-phosphate, ainsi que du
NADPH + H+), ce qui se fera à partir du fructose-6-phosphate et du glycéraldéhyde-3-
phosphate. (1 point)
6)
Plus long, car l’injection de carbones en sens contraire dans la glycolyse a un coût
énergétique. (1 point)
7)
La bactérie ne pousse pas en aérobie mais pousse toujours en anaérobie, elle est donc
devenue sensible à l’oxygène : (1 point)
l’enzyme qui n’est plus produite est donc l’une des deux enzymes qui protègent les
bactéries contre les espèces radicalaires, SOD (la plus importante) ou catalase. (1 point)
8)
a.
Plus rapidement, puisque le lactose entre via un transport « gratuit ». (1 point)
b.
Lactococcus lactis est une bactérie anaérobie aérotolérante : elle ne respire pas, elle
fermente. (1 point)
Or, la fermentation est beaucoup moins rentable énergétiquement que la respiration :
quelle que soit la source de carbone, la bactérie croître donc beaucoup plus lentement
qu’Escherichia coli. (1 point)
PARTIE B
Bioénergétique - Enzymologie : cours de Mme F. Cornillon (40 pts)
Question 1 (10 pts)
a) Ecrire la demi équation redox correspondante au couple redox ci-dessous en utilisant
les formules semi développées de chacun des constituants du couple :
pyruvate/lactate : E'° = - 0,2 V
COO----CO--CH3 + 2 H+ + 2e- COO--— CHOH--CH3
Ce couple réagit, dans les cellules, avec le couple redox NAD+/ NADH,H+ (E'° = - 0,3 V).
b) Ecrire la réaction d'oxydoréduction dans le sens de l'oxydation du lactate.
COO--—CHOH--CH3 + NAD+ COO----CO--CH3 + NADH + H+

c) Calculer ∆G'°. Préciser la signification de cette abréviation, ce que représente cette
donnée les conditions dans lesquelles elle est mesurée et dans quel sens aura lieu la
réaction d'oxydoréduction écrite ci-dessus dans les conditions précitées.
∆G'° = - n F ∆E'° = - 2x96500x(-0,3 - (-0,2)) = -193000 (-0,1) = 19300 J. mol-1
variation d'énergie libre dans les conditions standard apparentes
elle représente la quantité de travail maximale qu'une réaction spontanée est susceptible
de fournir au milieu extérieur.
Conditions standard (P = 1bar ; T= 298°C ; [chaque réactant] = 1M) apparente (pH = 7)
valeur positive donc non spontanée dans les condtions standard apparente
Dans les hépatocytes (cellules du foie), la réaction a lieu dans le sens de l'oxydation du
lactate.
d) Comment pouvez vous l'expliquer ?
Dans les cellules les conditions ne sont pas standard il faut calculer le ∆G' pour connaître
le sens de la réaction :
∆G' = ∆G'° + RT ln ([produits])/([réactifs])
et selon les conditions cellulaires le ln peut être différent et faire basculer le signe du ∆G'.
Donnée : F = 96 500 C.
Question 2 (15 pts)
La constante de Michaelis d’une enzyme est de 0,2 mM pour le substrat A et de 2 mM
pour le substrat B.
a- Lequel de ces deux substrats présentent l’affinité la plus grande pour l’enzyme
(justifier votre réponse)
La valeur de Km est un indicateur de l’affinité de l’enzyme pour son substrat.
Plus la valeur de Km est faible, plus l’affinité est grande.
Affinité de l’enzyme pour A > affinité pour B
b- La valeur du kcat a été déterminée pour chaque substrat : elle est de 5x102 s-1 pour le
substrat A et de 5x103 s-1 pour le substrat B. Calculer l’efficacité catalytique de l’enzyme
pour les substrats A et B. Que pouvez vous en déduire ?
On calcule la valeur de kcat/Km pour comparer l’efficacité catalytique de l’enzyme vis-à-
vis de ces deux substrats. Plus ce rapport est grand et plus l’enzyme est efficace.
substrat A : kcat/Km = 5x102 / 0,2x10-3 = 2,5 106 M-1.s-1
substrat B : kcat/Km = 5x103 / 2x10-3 = 2,5 106 M-1.s-1
L’enzyme a la même efficacité catalytique pour les substrats A et B. La plus faible affinité
pour le substrat B (10x plus faible) est compensée par une meilleure efficacité cinétique
(kcat 10x meilleur).
La concentration en enzyme est identique dans chacune des expériences menées.

c- En utilisant la représentation de Lineweaver et Burk, dessiner l’allure des droites
correspondants aux deux substrats A et B (essayez d’être le plus précis possible dans le
tracé en vous aidant des indications données).
1 point pour la représentation correcte et axes nommés
2 points pour chaque courbe (trois courbes doivent figurer sur le graphe) sur 6 points
Si tracé trop approximatif, noter sur 3 points seulement
d- Le test cinétique est répété en présence du substrat A et d’un composé I supposé
inhiber l’enzyme. Le résultat obtenu montre une diminution de la valeur de Vm et un Km
inchangé. Déterminer quel est le type d’inhibition. Justifier
Il s’agit d’une inhibition non compétitive car seul le Vm est affecté. Les INC sont des
molécules qui se fixent sur un site de l’enzyme distinct du site de liaison du S. Ils
agissent donc sur la valeur du kcat et non sur la valeur du Km.
e- Sur le même graphe (question c), donner l’allure de la droite correspondant à la
cinétique réalisée avec le substrat A et le composé I
cf plus haut
f- Quelle relation permet de déterminer la constante d’inhibition KI ?
Vm app = Vm / (1 + [I]/Ki)
Question 3 (15 points)
Vous suivez la purification d’une enzyme à partir d’un extrait biologique (EB). Des
échantillons enzymatiques sont prélevés à chaque étape pour mesurer la concentration
en protéines. L’activité enzymatique est elle mesurée avec 100 µL d'échantillon
enzymatique dilué au ½ dans un volume réactionnel de 3 mL. On obtient le tableau
suivant :
Fraction
Volume
total
(mL)
Conc. de
protéines
[mg.mL-1]
AE mesurée sur
100 µL
d’échantillon
dilué au ½
(nmole.sec-1)
AE totale
(nkat)
AS
(nkat.mg-1)
Rdt
(%) Fp
EB 100 20 5 5x2x10x100
= 10000
5x10x2/20
= 5
Etape 1 10 1 20 20x2x10x10
= 4000
20x2x10/1
= 400
40 80
Etape 2 1 0,5 100 100x2x10x1
=2000
100x2x10/0
,5= 4000
20 800
a- Donner la définition de l'activité spécifique. (1pt)
AS = AE(1mL)/ conc en prot
b- Donner la définition de l'activité totale. (1pt)
AT = AE (1mL) x vol total