BIO241-ET2-2012-corrigé
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BIO241 Examen terminal 2nde session (18 juin 2012) Documents et calculatrices non autorisés ATTENTION : Les parties A, B et C doivent être traitées sur des copies séparées XX pages Notation sur 80 PARTIE A Métabolisme bactérien : cours de Mr Y. Markowicz (15 pts) Un chercheur a décidé de cultiver la bactérie Escherichia coli sur milieu minimum, mais en faisant varier la source de carbone : lactose pour la culture A, glucose pour la culture B. Une fois les deux cultures lancées, il effectue un prélèvement toutes les 30 minutes, qui lui sert à suivre l’évolution de la DO600 au cours du temps. DO600 à t = Culture 0 0h30 1h 1h30 2h 2h30 3h 3h30 4h 4h30 5h A 0,008 0,007 0,012 0,027 0,058 0,123 0,241 0,492 0,976 1,453 1,635 B 0,008 0,009 0,026 0,079 0,187 0,532 1,498 2,139 2,354 2,541 2,468 1) En vous servant des données ci-dessus, tracez sur la feuille semi-log (jointe en annexe) les deux courbes de croissance, et calculez les temps de génération pour les cultures A et B. (2 points) On sait que le glucose pénètre dans la bactérie via un transport de type PTS. Le lactose, lui, entre via un symport à protons, puis est hydrolysé par la β-galactosidase pour donner du glucose et du galactose. 2) Quelles différences va-t-il y avoir quant au catabolisme des molécules de glucose et de galactose qui proviennent toutes deux de l’hydrolyse du lactose ? (2 points) 3) Quelle explication pouvez-vous donner à la différence de temps de génération observée selon la nature de la source de carbone ? (2 points) Une autre source de carbone possible pour Escherichia coli est le glycérol. Celui-ci entre dans la cellule via un mécanisme de diffusion facilitée, puis est transformé en dihydroxyacétone-phosphate via les réactions suivantes : (1) glycérol + ATP glycérol-phosphate + ADP (2) glycérol-phosphate + FAD dihydroxyacétone-phosphate + FADH2 4) Que va devenir le dihydroxyacétone-phosphate dans la cellule ? (1 point) 5) Quelles seront les principales différences au niveau métabolique entre la consommation de glucose et celle de glycérol ? (2 points) 6) D’après vous, le temps de génération de la culture effectuée avec du glycérol comme unique source de carbone sera-t-il plus long, plus court ou identique à celui de la culture effectuée avec du glucose (justifiez votre réponse) ? (1 point) Un mutant d’Escherichia coli a été isolé qui ne pousse pas en présence de glucose, de lactose ou de glycérol. Si on cultive ce même mutant dans les mêmes milieux de culture, mais cette fois en anaérobie, le mutant pousse plutôt bien. 7) D’après vous, quelle peut être l’enzyme codée par le gène muté chez cette bactérie (justifiez votre réponse) ? (2 points) La bactérie anaérobie aérotolérante Lactococcus lactis est elle aussi capable de cataboliser glucose et lactose. A l’inverse d’Escherichia coli, elle importe le glucose via un transport actif et le lactose via un système de type PTS. 8) En prenant en compte toutes les informations qui vous ont été données sur cette bactérie, pouvezvous dire (justifiez vos réponses) : a. si, quand elle a pour source de carbone unique du lactose, elle croîtra plus rapidement, plus lentement ou à la même vitesse que sur glucose ? (1 point) b. si, avec l’une ou l’autre source de carbone, elle est susceptible de croître plus rapidement sur lactose qu’Escherichia sur glucose ? (2 points) Réponses partie A Réponses : 1) Tracés (1 point) A : 30 min (0,5 point) B : 20 min (0,5 point) 2) Alors que le glucose entre directement dans la glycolyse une fois phosphorylé (consommation d’une molécule d’ATP), (0,5 point) le galactose devra d’abord être épimérisé en glucose via la voie de Leloir (phosphorylation du galactose, puis transfert de la molécule de galactose sur une molécule d’UDP, qui permet l’épimérisation du galactose en glucose, l’UDP-glucose étant alors converti en glucose-1-phosphate qui sera converti en glucose-6-phosphate). (1,5 points) 3) L’entrée du glucose se fait via un transport « gratuit », (0,5 point) celle du lactose via un transport qui coûte de l’énergie (gradient de protons) : (0,5 point) le catabolisme produira donc plus d’énergie que celui du lactose, d’où une croissance plus rapide sur glucose. (1 point) 4) Il va entrer dans la glycolyse. 5) L’utilisation du dihydroxyacétone phosphate pose deux problèmes : (1 point) la nécessaire production des métabolites précurseurs à 6 carbones (glucose-6-phosphate et fructose-6-phosphate), qui implique une injection de molécules en sens contraire dans la glycolyse, (1 point) et l’injection de carbones dans la voie des pentoses phosphate (pour produire deux autres métabolites précurseurs, les pentoses-5-phosphate et l’érythrol-4-phosphate, ainsi que du NADPH + H+), ce qui se fera à partir du fructose-6-phosphate et du glycéraldéhyde-3phosphate. (1 point) 6) Plus long, car l’injection de carbones en sens contraire dans la glycolyse a un coût énergétique. (1 point) 7) La bactérie ne pousse pas en aérobie mais pousse toujours en anaérobie, elle est donc devenue sensible à l’oxygène : (1 point) l’enzyme qui n’est plus produite est donc l’une des deux enzymes qui protègent les bactéries contre les espèces radicalaires, SOD (la plus importante) ou catalase. (1 point) 8) a. Plus rapidement, puisque le lactose entre via un transport « gratuit ». (1 point) b. Lactococcus lactis est une bactérie anaérobie aérotolérante : elle ne respire pas, elle fermente. (1 point) Or, la fermentation est beaucoup moins rentable énergétiquement que la respiration : quelle que soit la source de carbone, la bactérie croître donc beaucoup plus lentement qu’Escherichia coli. (1 point) PARTIE B Bioénergétique - Enzymologie : cours de Mme F. Cornillon (40 pts) Question 1 (10 pts) a) Ecrire la demi équation redox correspondante au couple redox ci-dessous en utilisant les formules semi développées de chacun des constituants du couple : pyruvate/lactate : E'° = - 0,2 V COO----CO--CH3 + 2 H+ + 2e- COO--— CHOH--CH3 Ce couple réagit, dans les cellules, avec le couple redox NAD+/ NADH,H+ (E'° = - 0,3 V). b) Ecrire la réaction d'oxydoréduction dans le sens de l'oxydation du lactate. COO--—CHOH--CH3 + NAD+ COO----CO--CH3 + NADH + H+ c) Calculer ∆G'°. Préciser la signification de cette abréviation, ce que représente cette donnée les conditions dans lesquelles elle est mesurée et dans quel sens aura lieu la réaction d'oxydoréduction écrite ci-dessus dans les conditions précitées. ∆G'° = - n F ∆E'° = - 2x96500x(-0,3 - (-0,2)) = -193000 (-0,1) = 19300 J. mol-1 variation d'énergie libre dans les conditions standard apparentes elle représente la quantité de travail maximale qu'une réaction spontanée est susceptible de fournir au milieu extérieur. Conditions standard (P = 1bar ; T= 298°C ; [chaque réactant] = 1M) apparente (pH = 7) valeur positive donc non spontanée dans les condtions standard apparente Dans les hépatocytes (cellules du foie), la réaction a lieu dans le sens de l'oxydation du lactate. d) Comment pouvez vous l'expliquer ? Dans les cellules les conditions ne sont pas standard il faut calculer le ∆G' pour connaître le sens de la réaction : ∆G' = ∆G'° + RT ln ([produits])/([réactifs]) et selon les conditions cellulaires le ln peut être différent et faire basculer le signe du ∆G'. Donnée : F = 96 500 C. Question 2 (15 pts) La constante de Michaelis d’une enzyme est de 0,2 mM pour le substrat A et de 2 mM pour le substrat B. a- Lequel de ces deux substrats présentent l’affinité la plus grande pour l’enzyme (justifier votre réponse) La valeur de Km est un indicateur de l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Plus la valeur de Km est faible, plus l’affinité est grande. Affinité de l’enzyme pour A > affinité pour B b- La valeur du kcat a été déterminée pour chaque substrat : elle est de 5x102 s-1 pour le substrat A et de 5x103 s-1 pour le substrat B. Calculer l’efficacité catalytique de l’enzyme pour les substrats A et B. Que pouvez vous en déduire ? On calcule la valeur de kcat/Km pour comparer l’efficacité catalytique de l’enzyme vis-àvis de ces deux substrats. Plus ce rapport est grand et plus l’enzyme est efficace. substrat A : kcat/Km = 5x102 / 0,2x10-3 = 2,5 106 M-1.s-1 substrat B : kcat/Km = 5x103 / 2x10-3 = 2,5 106 M-1.s-1 L’enzyme a la même efficacité catalytique pour les substrats A et B. La plus faible affinité pour le substrat B (10x plus faible) est compensée par une meilleure efficacité cinétique (kcat 10x meilleur). La concentration en enzyme est identique dans chacune des expériences menées. c- En utilisant la représentation de Lineweaver et Burk, dessiner l’allure des droites correspondants aux deux substrats A et B (essayez d’être le plus précis possible dans le tracé en vous aidant des indications données). 1 point pour la représentation correcte et axes nommés 2 points pour chaque courbe (trois courbes doivent figurer sur le graphe) sur 6 points Si tracé trop approximatif, noter sur 3 points seulement d- Le test cinétique est répété en présence du substrat A et d’un composé I supposé inhiber l’enzyme. Le résultat obtenu montre une diminution de la valeur de Vm et un Km inchangé. Déterminer quel est le type d’inhibition. Justifier Il s’agit d’une inhibition non compétitive car seul le Vm est affecté. Les INC sont des molécules qui se fixent sur un site de l’enzyme distinct du site de liaison du S. Ils agissent donc sur la valeur du kcat et non sur la valeur du Km. e- Sur le même graphe (question c), donner l’allure de la droite correspondant à la cinétique réalisée avec le substrat A et le composé I cf plus haut f- Quelle relation permet de déterminer la constante d’inhibition KI ? Vm app = Vm / (1 + [I]/Ki) Question 3 (15 points) Vous suivez la purification d’une enzyme à partir d’un extrait biologique (EB). Des échantillons enzymatiques sont prélevés à chaque étape pour mesurer la concentration en protéines. L’activité enzymatique est elle mesurée avec 100 µL d'échantillon enzymatique dilué au ½ dans un volume réactionnel de 3 mL. On obtient le tableau suivant : Fraction Volume Conc. de AE mesurée sur total 100 µL protéines (mL) [mg.mL-1] d’échantillon dilué au ½ (nmole.sec-1) AE totale (nkat) AS (nkat.mg-1) Rdt (%) EB 100 20 5 5x2x10x100 5x10x2/20 = 10000 =5 Etape 1 10 1 20 20x2x10x10 20x2x10/1 = 4000 = 400 Etape 2 1 0,5 100 100x2x10x1 100x2x10/0 20 =2000 ,5= 4000 a- Donner la définition de l'activité spécifique. (1pt) AS = AE(1mL)/ conc en prot b- Donner la définition de l'activité totale. (1pt) AT = AE (1mL) x vol total 40 Fp 80 800 c- Donner la définition du rendement. Que permet-il de déterminer ? (2pt) Rdt = AT extrait purifié/ AT extrait brut détermine la quantité d'enzyme conservée d- Donner la définition du facteur de purification. Que permet-il de déterminer ? (2pt) FP = AS extrait purifié/ AS extrait brut détermine la quantité de protéine contaminantes éliminées e- Calculer l’activité enzymatique totale, l’activité spécifique (AS), le Rendement (Rdt) et le facteur de purification (Fp) de chaque étape. Détailler un exemple de calcul de l'AS, l'AE totale, le rendement et le facteur de purification. Voir tableau 1 pt pour calcul de l'AE (1mL) le reste 8pts Partie C : C. Breton (25 points) Question 1- Catabolisme du pyruvate (17 pts) 1a - Décrire brièvement (éventuellement à l’aide d’un schéma) les différentes étapes mises en oeuvre pour récupérer l’énergie métabolique contenue dans la molécule de pyruvate, en condition aérobie. Ne pas détailler les réactions chimiques, mais indiquer la localisation cellulaire des réactions chimiques. Les différentes étapes ont lieu dans la mitochondrie - oxydation du pyruvate en acétyl-coA avec production 1 acétyl-CoA, 1NADH,H+, 1 CO2 - oxydation acétyl-coA (partie acétate) dans le cycle de Krebs. Avec formation de 2 CO2, 3 NADH,H+, 1 GTP (ATP), 1 FADH2 - l’énergie contenue dans les coenzymes réduits est récupérée au niveau de la chaîne respiratoire (membrane interne de la mitochondrie). Les coenzymes réduits cèdent leurs deux électrons à un système de transporteurs qui, par une cascade de réactions d'oxydo-réduction, amène ces électrons jusqu'à l'accepteur final, qui est l'oxygène moléculaire. Ce transfert d’e- est couplé à un gradient de protons à travers la membrane mitochondriale (gradient électrochimique ; force proto-motrice). L’énergie de ce gradient sera récupérée pour la synthèse d’ATP. Cette synthèse se fait au niveau d’un complexe enzymatique appelé ATP synthase. La synthèse d’ATP couplée à ce transport d’électrons est appelée Phosphorylation oxydative. 1b - Donner le bilan net en ATP de l’oxydation d’une molécule de pyruvate (utiliser les valeurs hautes de P/O) – Justifier votre réponse Production nette 15 moles ATP / mole de pyruvate (calculé à partir du bilan 1GTP, 4NADH, 1FADH2) Valeurs hautes : 1NADH,H+ = 3 ATP 1FADH2=2ATP La justification pourra être donnée éventuellement dans la question précédente 1c - Quel est le devenir du pyruvate en condition anaérobie, chez l’homme ? - Décrire précisément la ou les réactions en jeu (noms et formules semidéveloppées des réactants, nom de l’enzyme) et son intérêt pour la cellule. Pyruvate (CH3-CO-COO-) + NADH,H+ lactate (CH3-CHOH-COO-) + NAD+ Enzyme : lactate déshydrogénase (LDH) - Quel est l’intérêt principal de cette réaction Intérêt : Régénération du NAD+ - Dans quel(s) type(s) cellulaire(s) ou tissu(s) cette réaction a-t-elle lieu ? muscle squelettique (en activité) et GR - Quel est le devenir du produit de la réaction ? On peut le considérer comme un déchet de l’organisme « recyclable » (exemple, il peut être utilisé comme précurseur de la néoglucogenèse) seul exemple vu en cours Question 2 - Structure et propriétés de l’hémoglobine (8 points) 2a- décrire brièvement la structure de la protéine en précisant quel est le motif structural le plus représenté au niveau de la structure secondaire. Donner sa localisation cellulaire. Hb est une protéine globulaire. C’est un tétramère formé de 4 chaînes de globine, 2 chaînes a et 2 chaînes b. C’est une protéine tout-alpha. Localisation cytoplasme des GR 2b- Représenter à l’aide d’un graphe, l’allure de la courbe de saturation par l’O2 de l’hémoglobine. Quelle valeur est utilisée pour rendre compte de l’affinité de la molécule Hb pour l’O2. Placer cette valeur sur votre graphe. Reproduire le graphe donné en cours. Indiquer la P50 2c – Sur le même graphe, indiquer quelle serait l’allure de la courbe en présence d’un inhibiteur allostérique. Citer l’un des inhibiteurs allostériques de l’hémoglobine vu en cours. Déplacement vers la droite. Ex Inhib CO2, pH2,3-BPG 2d –La drépanocytose, ou anémie falciforme, est une maladie génétique caractérisée par la formation d’une hémoglobine anormale (hémoglobine S, Hb S) qui détruit les globules rouges. Cette destruction a pour cause la substitution, en position 6 de la chaîne , d’un résidu d’acide glutamique par un résidu valine, ce qui mène à la formation de précipités. - Donner les formules semi-développées à pH7 de ces deux acides aminés. - Comment peut-on expliquer la formation de ces précipités ? L’acide Glutamique est chargé négativement alors que la valine est neutre et hydrophobe, ce qui aura des conséquences sur le comportement de la molécule d’hémoglobine et de ses propriétés.
