JW_Saclay_juin09 (8.5 Mo)
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Les microbes anges gardiens de la biosphère Jean Weissenbach (Genoscope – Centre national de séquençage) Saclay 29 Juin 2009 Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684 Antonie van Leeuwenhoek Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684 Antonie van Leeuwenhoek 1838 Schwann (levure ferment vivant) 1857 Pasteur (fermentation lactique) 1860 Pasteur (fermentation alcoolique) 1864 Pasteur (génération spontanée) 1881 Koch (cultures pures) Postulats de Koch Par l'utilisation de cultures pures on peut montrer que des organismes distincts ont des propriétés biologiques différentes Au cours des années 70 Carl Woese procède à des comparaisons systématiques de séquences d ’ARN des ribosomes de bactéries a TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG b TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCTTGAACGAGCGCAACCCCTG c TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTG d TGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG e TGTCGTGAGATGTTGGGGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA f TGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA g TGCCGTGAGGTGTACCCTTAAGTGGGGAAACGAGCGTAACCCCTA f a c d e g b Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces sequences Analyse de d‘ARNr 16S séquences séquençage Extraction Echantillon de l'environnement ADN Clones PCR gènes d‘ARNr 16S amplifiés Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces Extraction Echantillon de l'environnement sequences Analyse de d‘ARNr 16S séquences séquençage 2% ADN Clones PCR gènes d‘ARNr 16S amplifiés 355PD (2 clones) 283PD (1) Bacteroides thetaiotaomicron 396PD (4) Bacteroides ovatus 260PD (1) Bacteroides caccae 051J7 (3) 01 25C (2) Bacteroides fragilis Bacteroides uniformis 239PD (10) 10 25C (2) Bacteroides eggerthii Bacteroides stercoris Prevotella heparinolytica 061J7 (2) 26 25C (2) 48 25C (2) 367PD 343PD (6) Bacteroides vulgatus 255PD (1) 12 25C (1) Par cette approche Norman Pace observe dans les années 90 des séquences de rDNA qui ne correspondent pas à des espèces connues cultivées. Les bactéries sont partout, nombreuses et vivent parfois dans des conditions particulièrement inhospitalières … Température pH Pyrolobus fumarii Minimum Optimum Maximum 90°C 106°C 113°C élevée thermophile basse psychrophile Polaromonas vacuolata 0°C 4°C 12°C acide acidophile Picrophilus oshimae 0,06 0,7 (60°C) 4 alcalin alcalinophile Natrialba magadii 8,5 9 12 500 atm 700 atm 4°C > 1000 atm 15 % 25 % 32 % (saturation) pression élevée barophile MT41 (Mariana Trench) 11033 mètres de profondeur salinité élevée halophile Halobacterium salinarum Avec l'augmentation de leur nombre, une compétition s'est instaurée pour les sources • énergie • matières premières (minérales ou organiques) Pour échapper à la compétition les bactéries ont recouru à l'innovation 1) en diversifiant leurs sources d'énergie et de matières premières 2) en s'adaptant à des environnements particuliers • énergie • oxydoréductions chimiques • différents oxydants, différents réducteurs • lumière • plusieurs utilisations de la lumière • avec ou sans production d'O2 • matières premières (minérales ou organiques) • C minéral (CO2 ou organique) • N atmosphérique ou sels • conditions du milieu • température • pH • ions Streptococcus pneumoniae Chondromyces Vibrio cholerae Streptococcus pyogenes Pseudomonas Salmonella Vue en m.e coloration négative vue en m. e à balayage Plus de 99% des bactéries sont encore inconnues de nos jours Habitat Nombre de bactéries % de bactéries cultivables Sol 1010 - 1013 / kg 0,01 - 0,1 Rivières, lacs 109 - 1010 / l 0,01 - 0,1 Océans (surface) 107 - 109 / l 0,001 - 0,1 Océans (profondeur) 107 - 108 / l indéterminé Océans (sédiments) 109 - 1012 / l <1% Les bactéries sont partout et nombreuses ... 107 à 1010 bactéries / g Sols Eaux Aliments Corps humain sain et propre potable en général maximum 1000 bactéries / mL bassin de natation 100 bactéries / mL mer peu polluée 10.000 bactéries / mL lait stérilisé maximum 100 bactéries / mL viande hachée 106 bactéries / g peau du dos 100 à 1000 bactéries / cm2 peau des aisselles ou du pubis 106 bactéries / cm2 fèces 50 % de la masse soit 1011 bactéries / g La flore intestinale humaine Cent mille milliards de bactéries !!! Chacun de nous héberge cent mille milliards de bactéries constituant la flore digestive. Stérile avant la naissance, notre tube digestif est rapidement colonisé par cette flore complexe et diversifiée qui se stabilise au cours des premières années de la vie. Les interactions entre l’organisme et la flore digestive participent au maintien en bonne santé, alors que nous associons souvent "bactéries" et "maladie". Les bactéries que nous hébergeons ont un rôle bénéfique en termes de nutrition et de santé. Au niveau de la planète la biomasse microbienne représente plus de la moitié de la biomasse terrestre Croûte terrestre 100 O Si 10 Ca Na Mg 1 H P 0,1 S C N 0,01 0,1 1 10 100 Biomasse Croûte terrestre 100 O Si 10 Ca Na Mg 1 H P 0,1 S C N 0,01 0,1 1 10 100 Biomasse Le rôle de l'infiniment petit dans la nature est infiniment grand Louis Pasteur A ce jour Nos connaissances en microbiologie ont été obtenues à partir de quelques centaines d’espèces parmi les quelques 5000 espèces répertoriées Moins de 1% des bactéries sont cultivées Le monde microbien reste encore pratiquement inexploré La plupart des contributions du monde microbien à la vie de la biosphère ne sont connues que superficiellement Objectifs des Projets Génome • Etablir un inventaire des gènes de l’espèce considérée • Identifier les autres éléments structuraux et leur fonction biologique, sur la séquence de référence • Analyser le fonctionnement du génome considéré (expression et régulation etc.) • Rechercher les mutations à l'origine de phénotypes particuliers • assise pour de nouvelles approches expérimentales • Evolution/Phylogénie • Applications médicales (diagnostic et thérapeutique) • Applications agronomiques/biotechnologiques Quels génomes séquence-t-on ? organismes modèles (génomes modèles) organismes d'intérêt médical organismes d'intérêt économique, biotechnologique organismes d'intérêt environnemental organismes occupant des positions clés dans l'arbre du vivant Le paysage des séquences de génomes en mars 2009 Le paysage des séquences de génomes en mars 2009 Projets Procaryotes Séquençage 2ème génération : équipements Illumina / Solexa Genome Analyzer Roche / 454 GS Titanium Titanium 400 b/lecture 600 Mb / run Applied Biosystems SOLiD V3 : 50 b/lecture 250 M tags / run (~10-20 Gb) GAII 50-100 b/lecture. 60 M tags ~10 Gb / run GAIIx (mi - 2009): 125-150 b/lecture (ou 250 par paires) 3ème génération vers 2011-2012 • – PacificBio SMRT – ABI Visigen – Illumina Oxford Nanopore Y a-t-il encore un besoin de séquence ? inépuisable intérêt des comparaisons (toute nouvelle comparaison apporte un nouvel éclairage) de nombreux phylums totalement inexplorés re-séquençage pas de limite scientifique au besoin, mais limites économiques De nombreuses raisons de s'intéresser aux communautés bactériennes - impact sur les équilibres biogéochimiques - quels sont les acteurs ? - nouvelles étapes des cycles biologiques des éléments - impact sur la santé (flores microbiennes humaines) - modèles d'écosystèmes (structure des communautés bactériennes) - utilisation de la biodiversité à des fins d'applications - substances thérapeutiques - substances d'intérêt industriel - enzymes utiles pour la chimie de synthèse - bioremédiation - nouveaux éclairages sur l'évolution Comment aborder la question de la composition des communautés bactériennes ? - rDNA 16S - FISH - métagénomique - techniques sur cellules isolées - culture La métagénomique Extraction Echantillon de l'environnement Clonage dans E. coli ADN Clones séquençage sequences d‘ADN Analyse de séquences Problèmes d'analyses des données d'un métagenome • Données très fragmentaires • Liens perdus avec les cellules d'origine • La grande majorité de ces cellules sont inconnues Résultats : Hybridation in situ sur les boues Floc du bassin aérobie (BA) photo CLSM (gross. 630) hybridation avec sonde : - groupe Planctomycetales Pla46F marqué au CY5 - sonde spécifique « nouveau genre » 322R marqué au CY3 - superposition Pla46F et 322R - autofluorescence 10 µm 10 µm Quelques résultats de la métagénomique - reconstitution de la séquence génomique complète de plusieurs bactéries non cultivables - présence d'un grand nombre de gènes de proteorhodopsine dans les bactéries - découverte de dizaines de milliers de gènes de fonction inconnue - association entre type de flore bactérienne intestinale et obésité La chimie de synthèse, activité industrielle mal aimée entre toutes Dans une économie qui essaie petit à petit de s'orienter vers le "durable" la chimie de synthèse souffre d'une série majeure de défauts - elle pollue considérablement procédés déchets CO2 - elle est entièrement dépendante du carbone fossile matière première source d'énergie Les lignes directrices de la Chimie Verte - concevoir des procédés ayant des rendements tendant à maximiser la quantité de matières premières retrouvées dans le produit final - utiliser des substances sans danger pour la santé et l'environnement (notamment les solvants) chaque fois que possible - concevoir des procédés avec une bonne efficacité énergétique - traiter les déchets ou mieux ne pas en produire La chimie faite par le vivant est une chimie verte par construction Les potentialités de la biotechnologie industrielle ou biotechnologie blanche ? - pas de déchets ou des déchets recyclables - utilise des substances sans danger pour la santé ou l'environnement - matières premières renouvelables (C de la biomasse) - biocatalyseurs hautement spécifiques - minimisant ou évitant la synthèse de sous-produits à éliminer - augmentant les rendements - biocatalyseurs fonctionnent en milieu aqueux dans des conditions douces de température, pression et pH limitations • Le nombre d’activités biocatalytiques connues utiles à la chimie de synthèse est une des limitations principales de la biotechnologie industrielle Le nombre d'enzymes inconnus, dans les génomes bactériens séquencés et dans les métagénomes, dépasse largement le nombre d'enzymes connus Pan-génome bactérien ensemble des gènes bactériens Pan-génome bactérien ensemble des gènes bactériens
