Exercice 1

Enseignements dirigés
Biochimie
PCEM 1
Acides Aminés – Oligopeptides
Méthodes d’étude
L. Coulbault
Année 2008-2009
I – Equilibre acide-base
Exercice 1
Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions
suivantes :
A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.
B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait
intervenir une constante.
C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).
D – La constante pKa peut être déterminée par des
courbes de titrage.
E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne
peuvent pas être déterminées par titration.
EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES
HA
A- +
H+
Ka = constante de dissociation
Ka =
[H+].[A-]
________
[AH]
Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])
+A
+B
A = point d'équivalence où le pH varie beaucoup
B = Point de demi-neutralisation = pKa où le pH varie peu
Donc [A-] = [AH]
SOLUTIONS TAMPONS
* Un tampon est généralement constitué d’une solution
d’acide faible et d’un de ses sels de base forte ou
d’une solution de base faible et d’un de ses sels
d’acide fort
pH = pKa + log10 [Sel]/[AH]
* Autour de son pKa , [A-] = [AH] et le tampon maintient
le pH d'une solution
Résistant aux modifications de pH quand ajout de H+
ou OH-
Exercice 1
Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions
suivantes :
A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.
FAUX
B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait
intervenir une constante
VRAI
C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).
FAUX
Exercice 1
D – La constante pKa peut être déterminée par des
courbes de titrage
VRAI
E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne
peuvent pas être déterminées par titration
FAUX
Exercice 2
Parmi les produits suivants, quel(s) est (sont) celui (ceux) qui
peut (pourront) en théorie être utilisé(s) pour le dosage de
l’activité d’un enzyme dont le pH optimum d’activité est de
7,5 ?
A/
B/
C/
D/
E/
F/
Tris hydroxyméthyl aminométhane
pKa=8.06
Acide propionique
pKa=4.87
Pipéridine
pKa=11.2
Acide phosphorique
pKa1 = 2.15, pKa2 = 7.2, pKa3 = 12.33
Hydroxyde d’ammonium
pKa=9.25
Acide acétique
pKa=4.76
pH = 7,5
pKa de la molécule doit être proche de la valeur de
pH voulue
donc Acide phosphorique à son pKa2 = 7,2
éventuellement Tris (8,06)
Propriétés Structurales
des Acides Aminés
Définition d’un acide aminé
H
NH2/ NH3+ - C* - COO-/COOH
R
*
Chaine latérale variable
*
20 AA impliqués dans la structure des protéines
AA ALIPHATIQUES NEUTRES
Aliphatique :
R = chaîne latérale hydrocarbonée linéaire ou ramifiée
Neutre :
Ne possède pas de fonction carboxylique (COOH) ou
aminée (NH2) supplémentaire sur R
* A CHAINE HYDROCARBONEE.
Glycine ou Gly R = H seul AA sans C asymétrique
donc dépourvu de pouvoir rotatoire
Alanine ou Ala R = - CH3
CH3
Valine ou Val
R = - CH- CH3
CH3
Leucine ou Leu R = - CH2- CH - CH3
Isoleucine ou Ile
R = - CH – CH2 - CH3
CH3
* A FONCTION ALCOOL –OH.
Sérine ou Ser
R = - CH2-OH
fonction alcool primaire
Thréonine ou Thr
R = -CHOH-CH3 fonction alcool IIre
* A FONCTION SOUFREE -SH.
Cystéine ou Cys
Méthionine ou Met
R = - CH2 – SH (SH = gpt thiol)
R = - CH2- CH2- S- CH3
AA AROMATIQUES NEUTRES
(possèdent une structure cyclique de type benzénique)
Responsables de l’absorption dans l’UV des protéines
Phénylalanine ou Phé
Tyrosine ou Tyr qui possède
une fonction phénolique
Tryptophane ou Trp
Absorbe à 280 nm
AA NEUTRE HETEROCYCLIQUE
Proline ou Pro
AA ACIDES
(possédent un groupement acide carboxylique
supplémentaire sur la chaîne latérale)
NB :leurs dérivés : la glutamine (Gln) , l’asparagine (Asn)
sont considérés comme des AA neutres
AA BASIQUES
(possédant une fonction aminée supplémentaire
sur la chaîne latérale)
STEREOCHIMIE
perspective
COO-
COONH3+
C
R
série L
H
H
C
R
série D
NH3+
Notion de polarité
Ex de l’eau :
Atome O très électronégatif (attraction des électrons ++)
Formation d’un dipôle permanent + Favorise la formation des liaisons hydrogène.
Fonction acide carboxylique/Gpt phosphate/Gpt Ammonium
+ Hydroxyles
AA avec Groupement polaire:
Polaires non ionisables :
Ser(OH),Thr (OH), Asn, Gln
Polaires ionisables en fonction du pH :
Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr
seuls les AA ionisables (Lys , Arg, His, Asp, Glu) peuvent
intervenir dans une liaison ionique à pH physiologique (car
groupements NH3+ ou COO-)
NB : Pour Tyr (O-/OH) et la Cys (S-/SH) au pH physiologique, pas
de dissociation de Tyr (OH) et Cys (SH) au regard de leur pKa
(groupement chargé seulement à pH basique)
Le caractère polaire ou apolaire d’une molécule dépendra de la
présence ou non d’une ou plusieurs fonctions chimiques supplémentaires.
M
Trp
Tyr
Phe
Leu Ile Met
Val
Cys
Ala
Gly
Thr Pro
Ser
His
Glu
Gln Asp
Asn
Arg
Lys
Polarité
Hydrosolubilité est fonction de la proportion de
groupements polaires dans la molécule.
Exercice 3
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun :
A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latérale
B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latérale
C/ Une chaîne latérale chargée
D/ Une chaîne latérale apolaire
E/ Elles n’ont aucun point commun
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun :
A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latérale
FAUX
B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latérale
VRAI
C/ Une chaîne latérale chargée
FAUX
D/ Une chaîne latérale apolaire
VRAI
E/ Elles n’ont aucun point commun
FAUX
Exercice 4
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes :
La sérine et la thréonine sont :
A/ des acides aminés avec une chaîne latérale de
nature phénolique
B/ de la série D à l’état naturel
C/ des acides aminés basiques
D/ des acides aminés alcool
E/ des acides dicarboxyliques.
Exercice 4
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes :
La sérine et la thréonine sont :
A/ des acides aminés avec une chaîne latérale de
nature phénolique
FAUX
B/ de la série D à l’état naturel
Série L (série D ex : glucose)
C/ des acides aminés basiques
FAUX
* A FONCTION ALCOOL –OH.
Sérine ou Ser
Thréonine ou Thr
R = - CH2-OH
R = -CHOH-CH3
fonction alcool primaire
D/ des acides aminés alcool
VRAI
E/ des acides dicarboxyliques.
FAUX
fonction alcool IIre
Exercice 5
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes :
Les acides aminés pouvant participer à des
interactions électrostatiques dans les protéines sont
:
A.
B.
C.
D.
E.
La phénylalanine.
L’arginine.
La glutamine.
L’acide aspartique.
La glycine.
Les acides aminés pouvant participer à des interactions
électrostatiques dans les protéines sont des
AA présentant une chaîne latérale ionisable
AA acides
AA basiques
Polaires ionisables en fonction du pH :
Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr
Exercice 5
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
Les acides aminés pouvant participer à des interactions
électrostatiques dans les protéines sont :
A.
La phénylalanine
FAUX
B.
L’arginine
VRAI
C.
La glutamine
FAUX
D.
L’acide aspartique
VRAI
E.
La glycine.
FAUX
Exercice 6
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes :
Parmi les acides aminés suivants, les acides aminés
essentiels sont :
A/ La leucine
B/ Le tryptophane
C/ La glycine
D/ L’alanine
E/ La lysine
AA essentiels : Pas de synthèse par l’organisme
Val / Leu / Ile / Lys / Phe / Trp / Met / Thr / His / Arg
Arg et His sont synthétisés par les tissus, mais en quantité
insuffisante pour le soutien de la croissance chez les enfants
Réponses A, B, E
Exercice 7
Certains neurotransmetteurs proviennent de la
transformation biochimique d’un acide aminé ;
le(s)quel(s) ?
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes :
A/ Acétylcholine
B/ Noradrénaline
C/ Sérotonine
D/ Dopamine
E/ Acide -amino butyrique (GABA)
Ex :
Dopamine
Sérotonine
Histamine
A/ Acétylcholine
FAUX
B/ Noradrénaline
VRAI (tyrosineDOPADopamineNorAdAd)
C/ Sérotonine
VRAI (tryptophane)
D/ Dopamine
VRAI (tyrosine)
E/ Acide -amino butyrique (GABA)
VRAI (précurseur : glutamate)
Exercice 8
Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9
et pKa3 chaîne latérale = 12,5.
Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les
propositions suivantes :
A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5
B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25
C. Le pHi calculé pour X est de 10,75
D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation
E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X
n’est pas chargé
Propriétés acido-basiques
des acides aminés
EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES
HA
A- +
H+
Ka = constante de dissociation
Ka =
[H+].[A-]
________
[AH]
Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])
SIGNIFICATION DES pKA DES AA
(Valable pour tous les AA)
Gpt (COO-/COOH)
pKa1 (# 2-2,5)
pKa1 = pH pour lequel [aCOO-] = [aCOOH]
Gpt (NH2/NH3+)
pKa2 (# 9-10)
pKa2 = pH pour lequel [aNH2] = [aNH3+]
POINT ISOELECTRIQUE (pI ou pHi)
pH pour lequel le nombre de charges positives est égal au
nombre de charges négatives
O-
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTE
Cas de l’Alanine
O-
à pH << pKa1 (donc < 2) = pH acide
Les 2 Gpts sont sous forme protonée
aCOOH et aNH3+
COOH-CHR-NH3+
charge nette = +1
cation
à pH = pKa1
[aCOO-] = [aCOOH]
et forme majoritaire aNH3+ (pH < pKa2)
charge nette :
Pour 2 molécules, CN= (2 charges (+) + 1 charge (-))/2= +0,5
O-
A pH compris entre pKa1 et pKa2
forme majoritaire [aCOO-] (pH > pKa1)
forme majoritaire aNH3+ (pH < pKa2)
O-
Forme majoritaire de l’AA = zwitterion
COO- - CHR – NH3+ charge nette = 0
pI = pH pour lequel la molécule est
électriquement neutre
pI = (pKa1 + pKa2)/2
O-
à pH = pKa2
[aNH2] = [aNH3+]
et forme majoritaire aCOO- (pH >>> pKa1)
charge nette = ((1 x +1)+ (2x-1))/2 = -0,5 (en moyenne)
à pH >> pKa2 (donc > 10) donc pH basique
gpts sous forme déprotonée
COO- – CHR – NH2
charge nette = -1
anion
COO-
et NH2
O-
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTE
Cas de l’acide glutamique
Une fonction acide carboxylique supplémentaire
NH2 - CH – CH2- CH2 - COOH
COOH
Caractérisé par 3 pKa :
- pKa1 = pH pour lequel [aCOO-] = [aCOOH]
- pKa2 = pH pour lequel [aNH2] = [aNH3+]
- pKa3 = pH pour lequel [CLCOO-] = [CLCOOH]
pH << pKa1
Tous les gpts sous forme protonée :
aCOOH, CLCOOH et aNH3+
charge nette : +1
pH compris entre pKa1 et pKa3
Gpts sous forme
aCOO-, CLCOOH et aNH3+
charge nette :0 (zwitterion)
pI = (pKa1+ pKa3)/2 = 3,25
pH compris entre pKa3 et pKa2
Gpts sous forme
aCOO-, CLCOO- et aNH3+
charge nette : -1
pH >> pKa2
Gpts sous forme
aCOO-, CLCOO- et aNH2
charge nette : -2
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTE
Cas des acides aminés basiques
Ex : Lys ; une fonction amine supplémentaire
NH2 - CH – CH2- CH2 – NH2
COOH
Présence de 3 pKa
- pKa1 = pH pour lequel [aCOO-] = [aCOOH]
- pKa2 = pH pour lequel [aNH2] = [aNH3+]
-pKa3 = pH pour lequel [CLNH2] = [CLNH3+]
pI = (pKa2 + pKa3)/ 2
Exercice 8
Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9
et pKa3 chaîne latérale = 12,5.
Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les
propositions suivantes :
A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5
B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25
C. Le pHi calculé pour X est de 10,75
D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation
E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X
n’est pas chargé
Exercice 8
Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9
et pKa3 chaîne latérale = 12,5.
Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositio
suivantes :
A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5
Zwitterion majoritaire si pH proche du pHi
Valeur pKa3 élevée d’où acide aminé basique
Calcul du pHi
pHi = ( 9 + 12,5) / 2 = 10,75
7,25
B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de
Faux
C. Le pHi calculé pour X est de 10,75
Vrai
D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de
cation
Faux
pH << pHi , charge nette +
pH # pHi, charge nette nulle
pH >> pHi, charge nette E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X
n’est pas chargé
Faux
Exercice 9
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
Les techniques permettant la séparation des acides aminés
en solution sont :
A/ L’électrophorèse
B/ L’ultracentrifugation
C/ La chromatographie liquide
D/ L’électrophorèse capillaire
E/ La chromatographie d’échange d’ions
Principe
ELECTROPHORESE
Une molécule chargée se déplace dans un champ électrique vers l’électrode de signe
opposé à sa charge.
Gel d’agarose
Gel d’acétate de
cellulose
Cathode : électrode chargée négativement
Anode : électrode chargée positivement
ELECTROPHORESE CAPILLAIRE : principe identique,
Séparation d’un mélange complexe dans un capillaire soumis à une différence de
potentiel élevée ; Pouvoir de séparation très important.
Utilisé par exemple pour la détermination de séquences nucléotidiques
(=séquenceur)
La vitesse de migration d’un AA dans un champ électrique est
- fonction de la charge globale de l’AA donc
- fonction du pH de la solution d’électrophorèse
A retenir
pH << pHi , charge nette + = cation migrant vers la cathode
pH # pHi, charge nette nulle = zwitterion ne migrant pas
pH >> pHi, charge nette - = anion migrant vers l’anode
ULTRACENTRIFUGATION DE ZONE.
S=
M. (1-v.r)
____________
f
Avec M : masse moléculaire
S : coefficient de sédimentation
V : volume spécifique partiel de la particule
R : densité de la solution
F : coefficient de friction.
METHODES CHROMATOGRAPHIQUES :
Chromatographie en couche mince
METHODES CHROMATOGRAPHIQUES :
Chromatographie liquide (CLHP)
Solvants
Echantillons
Pompe
Injecteur
Colonne
Séparation
Ex :
- C18
- Echange d’ions
Détecteur
Ex :
-UV-visible
- Fluorimétrie
CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
Colonne : résine synthétique munie de groupements
chargés
résine échangeuse de cations : charges –
Ex résine de polystyrène sulfoné (ions SO3-)
carboxyméthylcellulose : C02- - CH2 – O – cellulose
résine échangeuse d’anions : charges +
DEAE-cellulose : (CH3-CH2)2NH+ - (CH2)2 - cellulose
Technique reposant sur l’interaction électrostatique entre
un AA chargé et une particule stationnaire portant une charge de
signe opposé.
L’interaction peut-être modifiée en faisant varier le pH, donc
en variant les charges des AA et donc leur vitesse de migration le
long de la colonne
Résine portant des charges - (échangeuses de cations)
À pH 2, tous les AA sous forme de cations = fixation de tous les
AA sur la colonne
Si on augmente le pH, les 1ers AA à se retrouver sous forme de
zwitterion sont les AA à pHi bas (AA acides) qui se détachent de la
colonne et sont élués les 1ers en bas de la colonne
Exercice 9
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
Les techniques permettant la séparation des acides aminés
en solution sont :
A/ L’électrophorèse
VRAI
B/ L’ultracentrifugation
FAUX
C/ La chromatographie liquide
VRAI
D/ L’électrophorèse capillaire
VRAI
E/ La chromatographie d’échange d’ions
VRAI
Exercice 10
On dispose d’un mélange de 4 acides aminés appartenant à la liste suivante :
Glu, His, Val, Arg.
Valeurs des différents pK
Glu
pKa1=2,2
pKa2=9,9
pKa3=4,4
Ala
pKa1=2,3
pKa2=9,7
Arg
pKa1=2,2
pKa2=9,4
pKa3=12,5
Asp
pKa1=2
pKa2=10
pKa3=3,9
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminés
B/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminés
C/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux
électrophorèses à pH=3 et pH=7.
D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du
pH imposé.
E/ Aucune réponse bonne.
Glutamate
pKa1=2,2
pKa2=9,9
Alanine
pKa1=2,3
pKa2=9,7
Arginine
pKa1=2,2
pKa2=9,4
pKa3=12,5
Aspartate
pKa1=2
pKa2=10
pKa3=3,9
1ère étape : calcul du pHi
Glutamate
pHi =3,3
Alanine
pHi = 6
Arginine
pHi = 10,95
Aspartate
pHi = 2,95
pKa3=4,4
Glutamate
pHi =3,3
Alanine
pHi = 6
Arginine
pHi = 10,95
Aspartate
pHi = 2,95
pH = 7
pH = 3
pH >>> pHi
pH >> pHi + 2
Charge nette ---
pH ~ pHi
Zwitterion +++
pH =~pHi
Charge nette -
pH <<< pHi - 2
Charge nette +++
pH<<<pHi
pH << pHi – 2
Charge nette +
pH<<<pHi
pH << pHi – 2
Charge nette +++
pH >>> pHi
pH >> pHi + 2
Charge nette ---
pH ~ pHi
Zwitterion +++
Glutamate
pHi =3,3
Alanine
pHi = 6
Arginine
pHi = 10,95
Aspartate
pHi = 2,95
pH = 7
pH = 3
pH >>> pHi
pH >> pHi + 2
Charge nette ---
pH ~ pHi
Zwitterion +++
pH =~pHi
Charge nette -
pH <<< pHi - 2
Charge nette +++
pH<<<pHi
pH << pHi – 2
Charge nette +
pH<<<pHi
pH << pHi – 2
Charge nette +++
pH >>> pHi
pH >> pHi + 2
Charge nette ---
pH ~ pHi
Zwitterion +++
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminés
Faux
B/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminés
Faux
C/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux
électrophorèses à pH=3 et pH=7.
Faux
D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et
du pH imposé.
Vrai
E/ Aucune réponse bonne.
Faux
Exercice 11
Un mélange de quatre acides aminés (Leu, His, Thr, Lys) est séparé par la
technique de Finger Print (électrophorèse sur papier à pH 6 suivie d’une
chromatographie ascendante en solvant organique). Après coloration à la
ninhydrine, on obtient la cartographie suivante :
+
Electrophorèse
-
4
2
x
Dépôt
3
1
On donne :
Leu
His
Ala
Lys
pKa1
pKa1
pKa1
pKa1
= 2,3
= 1,7
= 2,3
= 2,0
pKa2=
pKa2=
pKa2=
pKa2=
9,7
9,1
9,9
9,1
pKa3= 6,0
pKa3= 10,7
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
A/
Le spot 1 est un acide aminé aliphatique.
B/
Le spot 2 correspond à l’histidine.
C/
Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une
valeur de pHi supérieure à 6.
D/
Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une
chaîne latérale ionisée.
E/
Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à
l’alanine.
Leu
pKa1 = 2,3
pKa2= 9,7
His
pKa1 = 1,7
pKa2= 9,1
Ala
pKa1 = 2,3
pKa2= 9,9
Lys
pKa1 = 2,0
pKa2= 9,1
pHi= 6
pKa3= 6,0
pHi = 7,05
pHi = 6,1
pKa3= 10,7
pHi = 9,9
Electrophorèse sur papier à pH = 6
Leu et Ala ne migrent pas
His et Lys chargés positivement avec la charge la plus
importante pour Lys (d’où migre le plus loin)
Chromatographie avec une phase organique
Les solutés migrent avec un solvant organique
Les acides aminés avec une chaîne latérale très apolaire migreront en
même temps que le front de solvant de la phase organique (donc
migrent plus loin par comparaison aux composés les plus polaires)
+
Electrophorèse
4
Leu
2
Ala
x
Dépôt
3
-
His
1
Lys
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
A/
Le spot 1 est un acide aminé aliphatique
Faux
B/
Le spot 2 correspond à l’histidine
Faux
C/
Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une
valeur de pHi supérieure à 6
Vrai
D/
Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une
chaîne latérale ionisée
Faux
E/
Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à
l’alanine.
Faux
Exercice 12
La chromatographie sur résine échangeuse de cations :
1 – indique que la colonne porte des charges négatives
2 – indique que la colonne porte des charges positives
3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au
temps
4 – permet la séparation de la valine et de la lysine
5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13
6 – ne peut échanger que des cations
1 – indique que la colonne porte des charges négatives
VRAI
2 – indique que la colonne porte des charges positives
FAUX
3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au
temps
FAUX
4 – permet la séparation de la valine et de la lysine
VRAI
5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13
FAUX
6 – ne peut échanger que des cations
VRAI
Réponse D : 1,4,6
Exercice 13
Soit un mélange de 3 oligopeptides
1/ Phe-Gly-Leu-Lys
2/ Val-Ile-Thr-Asp
3/ Ala–Gly-Trp-Ser
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié
permettra la séparation du mélange
B/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque
soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse
C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la
cathode
D/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basique
E/ La chromatographie d’exclusion est une technique
appropriée pour la séparation du mélange
Valeur du pH
1
6
13
Phe-Gly-Leu-Lys
+2
+1
-1
Val-Ile-Thr-Asp
+1
-1
-2
Ala–Gly-Trp-Ser
+1
0
-1
Exemple à pH=6 :
+H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COONH3+
CN=(2x+1) + (1x-1)=+1
Valeur du pH
1
6
13
A Phe-Gly-Leu-Lys
+2
+1
-1
B Val-Ile-Thr-Asp
+1
-1
-2
C Ala–Gly-Trp-Ser
+1
0
-1
Exemple à pH=6 :
+H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COONH3+
CN=(2x+1) + (1x-1)=+1
A
B
Cathode (-)
C
Anode (+)
dépôt
A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié
permettra la séparation du mélange
VRAI
B/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque
soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse
FAUX
C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la
cathode
FAUX
D/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basique
VRAI
E/ La chromatographie d’exclusion est une technique
appropriée pour la séparation du mélange
FAUX
Exercice 14
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions
suivantes :
Voici cinq peptides :
A/ Ala-Asp-Arg-Asp-Gly
B/ Arg-Ala-Arg-Ala-Phe
C/ Asp-Lys-Asp-Ala-Lys
D/ Glu-Lys-Trp-Lys-Val
E/ Glu-Asp-Ala-Asp-Val
et quatre critères
1)
2)
3)
4)
Hydrolyse/HCl = 3 spots
Hydrolyse trypsique = 3 spots
Electrophorèse à pH 6 = migration vers la cathode
Absorption UV à 280 nm
Lequel (ou lesquels) de ces peptides répond(ent) à tous ces
critères ?
Hydrolyse par HCl = séparation des AA avec destruction du
Trp
Ala-Asp-Arg-Asp-Gly
4 spots = Ala, Asp, Arg et Gly
Arg-Ala-Arg-Ala-Phe
3 spots : Arg, Ala et Phe
Asp-Lys-Asp-Ala-Lys
3 spots : Asp, Lys, Ala
Glu-Lys-Trp-Lys-Val
3 spots : Glu, Lys et Val
Glu-Asp-Ala-Asp-Val
4 spots : Glu, Asp, Ala et Val
Hydrolyse trypsique = 3 spots
Trypsine = coupe la liaison peptidique du coté carboxylique
des AA basiques Lys et Arg
Arg
Ala-Arg et Ala-Phe
3 spots
Asp-Lys
et Asp-Ala-Lys 2 spots
Glu-Lys
Trp-Lys et Val
3 spots
Électrophorèse à pH 6 ; migration vers la cathode
donc sous forme de cation chargé positivement
Arg-Ala-Arg-Ala-Phe
2 AA basiques et 3 AA neutres
3 NH3+ et 1 COO- charge nette = +2
vrai
Glu-Lys-Trp-Lys-Val
1 AA acide, 2 AA basiques et 2 AA neutres
3 NH3+ et 2 COO- charge nette = +1
vrai
Absorption dans l’UV à 280nm : oligopeptide d)
Hydrolyse acide (Hcl) Séparation des AA avec destruction du Trp
Trypsine :
Endopeptidase coupant l’AA basique Lys ou Arg
à son extrémité carboxylique
Chymotrypsine :
Endopeptidase coupant essentiellement les
AA aromatiques du côté carboxylique
Carboxypeptidase B : Exopeptidase permettant de séparer
l’AA du côté carboxylique
Bromure de cyanogène : Coupe du côté carboxylique de la Met.
= Coupure des liaisons peptidiques
b-mercaptoéthanol : rupture des ponts disulfures établis entre 2 Cys
Urée 8M / Dodécylsulfate de sodium : rupture des liaisons hydrogène,
ioniques
Exercice 15
Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais
l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides
aminés différents.
L’action du b-mercaptoéthanol sur le composé A libère un
hexapeptide B et un dipeptide C.
L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur
le peptide C et Ile sur le peptide B.
L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH-Asp.
L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide
dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide. Le
dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir
rotatoire.
L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet
l’obtention de deux tripeptides.
Indiquer la séquence des peptides A, B et C.
Le composé peptidique A comporte huit acides aminés
mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six
acides aminés différents.
Attention à la terminologie : A possède huit AA et il n’est
pas spécifié qu’il s’agit d’un octapeptide c-à-d enchainement
de 8 AA
Hydrolyse : 6 AA
Possibilité de Trp (1 ou 2) détruit lors de l’hydrolyse acide
ou de la présence d’un ou deux AA identiques
L’action du b-mercaptoéthanol sur le composé A libère un
hexapeptide B et un dipeptide C.
Mercaptoéthanol : rupture d’un pont disulfure entre 2 Cys
Donc 2 Cys l’un sur l’hexapeptide B (a-b-c-d-e-f)
l’autre sur le dipeptide C (g-h)
B et C étants reliés par un pont disulfure pour former A
L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg
sur le peptide C et Ile sur le peptide B.
Carboxypeptidase B : exopeptidase permettant de séparer
l’AA du côté carboxylique
Donc f = Ile
h = Arg et g = Cys
Donc B = a-b-c-d-e-Ile (dont 1 cys) et C = Cys-Arg
L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTHAsp
Réactif d’Edman : Réaction qui permet de séquencer
l’oligopeptide à partir de son extrémité aminée
Donc a = Asp
L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide
dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide.
Deux info :
Tétrapeptide contient 1 Trp détruit par l’hydrolyse acide
Donc 8 AA : Cys (2), Trp, Asp, Ile, Arg, Lys, X
Par hydrolyse acide, 6 spots correspondant à 6 AA différents
Cys, Asp, Ile, Arg, Lys et X
B = tétrapetide-dipeptide ou dipeptide-tétrapeptide
Or le tétrapeptide contient Asp = a-b-c-d =
Tétrapeptide = Asp – (Trp,X)- Lys
Donc B = Asp – (Trp, Gly) – Lys – Cys – Ile
Car le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu
de pouvoir rotatoire. Il s’agit de Gly.
L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obten
tion de deux tripeptides.
Donc c = Trp et b = Gly pour obtenir deux tripeptides
Asp-Gly-Trp et Lys-Cys-Ile
C = Cys-Arg
B = Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile
A
Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile
S
S
Cys -Arg