Université Mohammed Ier Faculté des Sciences Oujda Département de Biologie TD de Méthodes de séparation et d’analyse biochimique Série N° 3 Exercice 1 On a réalisé une analyse qualitative d’un médicament par chromatographie sur couche mince. Le chromatogramme obtenu est représenté ci-après. 1. Rappeler le principe de la chromatographie et décrire les opérations à réaliser pour obtenir un tel chromatogramme. 2. Que peut-on dire de la composition de ce médicament ? 3. Déterminer alors le rapport frontal des constituants mis en évidence dans ce médicament. 4. Un autre médicament contient de l’acide salicylique, du paracétamol et de la caféine. Pour un déplacement d’éluant, depuis la ligne de dépôt, égal à 5,0 cm, représenter le chromatogramme obtenu avec le même éluant et une plaque identique. Exercice 2 On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C. On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7. Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques). Exercice 3 La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls : CH2-CH3 -CH2-CH2-NH+ CH2-CH3 Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4). Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques). Exercice 4 On veut réaliser la séparation de 5 acides aminés (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5 g de résine sèche de polystyrène sulfoné que l'on dispose dans une colonne ouverte. La résine est lavée par une solution d'HCl (1 M) en excès. Après ce traitement, la résine est lavée à l'eau distillée. On fait alors passer une solution de NaCl (2 M) en excès. Le filtrat correspondant est recueilli dans sa totalité et est dosé par 11,5 ml de NaOH (1 M). 1 - Commenter les opérations effectuées (écrire sommairement les équations mises en jeu) et en déduire la capacité de rétention de la résine. 2 - Les 5 acides aminés à séparer sont solubilisés dans un tampon à pH = 3,8. A ce pH, quels sont les composés qui seront retenus sur la résine ? 3 - Après avoir chargé la colonne par les 5 acides aminés préalablement solubilisés dans le tampon à pH 3,8, l'élution est réalisée en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides aminés vont-ils être élués ? On se servira des données ci-après : Acide aminé : pK - COOH pK - NH2 pK - R Glu 2,19 9,67 4,25 Met 2,28 9,21 - Tyr 2,20 9,11 10,07 Lys 2,18 8,95 10,53 Ser 2,21 9,15 -