+ + [E]

cinétique enzymatique
-modèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Menten
-détermination des constantes cinétiques
-Représentation hyperbolique (Michaelis-Menten )
-Représentation de Lineweaver-Burk
-Inhibitions des réactions enzymatiques
-Inhibition compétitive
-IC50 pour inhibition compétitive
-inhibition non compétitive
-IC50 pour inhibition non compétitive
-inhibition in compétitive
-IC50 pour inhibition in compétitive
- Graphiques de Dixon
1
Pr M.SLIMANI
Pr M.SLIMANI
2
Complexe enzyme-substrat
E+S
ES
E+P
à t=0, la concentration en substrat est désignée
[S]0
la concentration en enzyme est désignée [E]T et reste
constante tout au long de la mesure
à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat,
[ES], est égale à 0
à t=0, la concentration en produit est égale à 0
3
Pr M.SLIMANI
Phases de la réaction
3 états lors de la cinétique
état préstationnaire
état stationnaire
état post-stationnaire
4
Pr M.SLIMANI
Équation de Michaelis-Menten
Concentrations
état préstationnaire
E+
S
état poststationnaire
état
stationnaire
ES
E+P
[P]
[S]
[P]
[ES]
Vi
d[ES]
=0
dt
[E]libre
Temps
[S]
[E]libre
[ES]
5
Pr M.SLIMANI
6
Pr M.SLIMANI
Équation de Michaelis-Menten
E+S
k
k
1
ES
k
2
E+P
-1
La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la
réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de
la concentration en ES.
vi = k2 [ES]
La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa
vitesse de disparition.
vformation ES = k1 [E] [S]
vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]
7
Pr M.SLIMANI
ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E +
P
Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ]
Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ]
[ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"),
donc
vd = vf
(k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ]
[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM
KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten)
Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ].
[ E ] = [ E ]T - [ ES ]
où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou lié. On a donc:
Pr M.SLIMANI
8
[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM
[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM
[ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ]
[ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ])
On peut enfin introduire ce terme dans l'équation pour la vitesse initiale:
vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])
Pr M.SLIMANI
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vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])
L’équation de Michaelis-Menten
Vitesse
initiale
vi = Vmax
[S]
KM + [S]
10
Pr M.SLIMANI
Constante de Michaelis-Menten
vi = Vmax
[S]
KM + [S]
Si vi = ½ Vmax ½ Vmax = Vmax
½ (KM + [S]) = [S]
½ KM = [S] - ½ [S]
½ KM = ½ [S]
[S]
KM + [S]
KM = [S]
KM est la concentration en substrat
pour laquelle l’enzyme fonctionne
à la moitié de sa vitesse maximale
KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme. Plus
l’affinité est élevée, et moins il faudra de substrat pour que
l’enzyme fonctionne.
11
Pr M.SLIMANI
12
Pr M.SLIMANI
vi = Vmax
[S]
KM + [S]
In vivo, la [S] est rarement saturante. Le rapport [S]/KM est
compris entre 0,01 et 1 de sorte qu’au maximum la moitié des
sites actifs est occupée par le substrat.
Vmax = k2 [E]T
k2 = kcat
Prenons une condition où KM >> [S]
:
kcat
[S]
vi =
[E]T [S]
devient
vi = Vmax
KM
KM + [S]
Dans ces conditions [E]T  [E]libre
vi =
kcat
KM
kcat
KM
[E] [S]
est une constante de vitesse apparente d’ordre 2
Pr M.SLIMANI
13
Représentations linéaires
Lineweaver - Burk
Si on écrit l’équation en double inverse :
1
1
=
vi
ou
[S]
Vmax
KM +
[S]
1
vi
1
vi
=
k2 [E] = kcat [E]
T
KM
kcat [E]
x
T
1
[S]
+
1
vi
En réarrangeant on obtient :
Or Vmax =
vi = Vmax
=
[S]
KM + [S]
KM + [S]
Vmax
[S]
1
1
KM
x
=
+
Vmax
[S] Vmax
T
1
kcat [E]
ou
T
[E]T
vi
=
1
kA
x
1
[S]
+
1
kcat
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15
Pr M.SLIMANI
k
k
est appelée constante catalytique ou
Elle est
cat .
proportionnelle au nombre de réactions que peut effectuer une
molécule d’enzyme par unité de temps ( le «turn-over number»).
2
Vmax = kcat [E]T
µmole de P. mL-1.sec-1
sec-1
µmole de E . mL-1
kcat/KM est l’efficacité catalytique de l’enzyme. On l'appelle également
kA.
1/Kcat : est la durée , en s de l’acte catalytique
Kcat : donne la mesure de l’efficacité de l’acte catalytique
Lorsqu’un enzyme peut utiliser plusieurs substrats, kcat/KM permet
d’estimer quel sera le substrat le plus utilisé par la protéine.
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16
Constante catalytique
Exemple :
Dans le tube il y a une concentration saturante en substrat donc
l’enzyme fonctionne en Vmax.
On calcule la quantité de produit apparue dans le tube chaque minute :
2 mL x 30 µmoles/mL/min = 60 µmoles/min
Il y a donc 60 µmoles de produit fabriquées par min par les 10 nmoles
d’enzyme présentes dans le tube.
60 µmoles/min / 10 nmoles d’enzyme = 6000 réactions/min
ou 100 réactions/sec
Le turn-over number est donc de 6000 réactions/min ou 100 réactions/sec.
Chaque molécule d’enzyme catalyse 100 réactions chaque seconde.
k2 ou kcat est égale à 100 sec-1.
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17
Unités de vitesse : système international
dans le système international (S.I.), l'unité officielle est le katal (kat) :
quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat
par seconde. Les biochimistes préfèrent utiliser les unités
internationales (U.I. ou U.E.)
1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 μkat = 16,6 nkat
1 U.I = 1 µmol.min-1 ( signifie à ) 16.67 nmol.s-1 =16.67 nkat
Exemple:
vi = 600 µmoles de P / L / min
vi = 10 µmoles de P / L / sec
correspond à vi = 600 U / L = 600 UIE / L
donc à
vi = 10 µkat / L
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Mode d’action des inhibiteurs
Certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en
interagissant de manière non covalente. D'autres se fixent de manière
Irréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site
catalytique. Enfin, selon le type d'inhibiteur, l'enzyme peut fixer :
-le substrat ou l'inhibiteur : c'est la fixation exclusive avec formation de
complexes binaires ES ou EI : Inhibiteurs compétitifs: fixation à la
place du substrat
-le substrat et l'inhibiteur : c'est la fixation non-exclusive avec formation de
complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins
que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif,
l'inhibition est dite totale.
Inhibiteurs non-compétitifs: fixation ailleurs qu’au site substrat
empêchant la catalyse d’avoir lieu
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Pr M.SLIMANI
Inhibiteur compétitif : (fixation exclusive)
C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat
(et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont
donc mutuellement exclusives. En effet, puisque la fixation du substrat et
celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une très forte
concentration de substrat déplace l'équilibre E + S <==> ES en faveur de
ES et donc déplace l'équilibre EI <==> E + I en faveur de E.
Un inhibiteur compétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme libre sa fixation
et celle du substrat étant exclusives l'une de l'autre.
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Pr M.SLIMANI
La vitesse d’apparition du produit s’exprime :
Vi = k2 [ ES ]
En vitesse initiale, les vitesses de formation et de disparition de ES
sont égales :
k
1
d’où
[E] [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]
k
1
[ ES ] =
[E] [S] [E] [S]
=
1/KM k-1 + k2
KM
On admet que la [ EI ] est rapidement atteinte et que [ EI ]f = [ EI ]d
k
3
[E] [I] = k-3 [ EI ]
21
Pr M.SLIMANI
On a vu que :
[ EI ] =
[E] [ I ]
Ki
[E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ]
On sait que :
On peut donc écrire :
[E] [I] [E] [S]
[E]T = [E] +
Ki
+
KM
Pr M.SLIMANI
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On définit
Ki
[ EI ] =
:comme la constante de dissociation du complexe EI :
[E] [ I ]
Ki
[E] [I] [E] [S]
[E]T = [E] +
KM
Ki
[I]
[E]T = [E] ( 1 +
Ki
[E]T = [E] (
+
KiKM
[S]
+
KM
)
+ KM [I] +Ki [S]
Ki
x
KM
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Pr M.SLIMANI
)
[E]T = [E] (
K iK M
On peut également l’écrire :
[E] =
Ki
x
+ KM [I] +Ki [S]
Ki
KM
x
)
KM
x [E]T
Ki x KM + KM[I] + Ki [S]
La vitesse de la réaction est donnée par :
Vi = k2 [ES]
Pr M.SLIMANI
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Vi = k2
[E] [S]
KM
Si on remplace [E] par sa valeur :
[E] =
Ki
KM x [E]T
Ki x KM + KM [I] + Ki [S]
On obtient donc :
vi =
x
k2
x
Ki
x
KM
x [E]T [S]
KM (Ki x KM + KM [I] + Ki [S])
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25
vi =
Comme Vmax =
k
2
k2
x
Ki
x [E]T [S]
Ki x KM + KM [I] + Ki [S]
[E]T
vi = Vmax
Sans inhibiteur :
Ki
Avec inhibiteur :
[S]
[I]
KM (1 +
Ki
vi = Vmax
) + [S]
[S]
KM + [S]
26
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Inhibition compétitive
Km' 
 [I ] 

Km.1 
 KI 
--1/Km -1/K’m
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Inhibiteur non compétitif : (fixation non exclusive)
Un inhibiteur non compétitif classique n'a aucune influence sur la fixation
du substrat (et réciproquement) : les sites de fixation du substrat et de
l'inhibiteur sont distincts.
En conséquence, l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ;
de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI. Les
inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le
substrat. Un inhibiteur non compétitif au sens large peut se fixer à la fois
sur l'enzyme libre et sur le complexe E-S, avec des constantes d'équilibre
différentes
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Pr M.SLIMANI
31
Inhibition non compétitive :
V max' 
V max
[I ]
1
KI
1/V’max
1/Vmax
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Inhibiteur incompétitif : (fixation non exclusive) du terme anglo - saxon :
"uncompetitive".
Ce type d'inhibition est aussi appelé inhibition par blocage du complexe
intermédiaire. Cette appellation décrit mieux le mécanisme : l'enzyme et le
substrat forment d'abord le complexe enzyme substrat (le complexe
intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe
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Inhibition incompétitive
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