Utilisation de la spectrométrie de masse pour diverses études

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Utilisation de la spectrométrie de masse pour
diverses études protéomiques
en 2007-2008
Anaïs AULAS, Alessandro BALLESTER, Joseph BAREILLE,
Hannah BENISTY, Naciba DAHMANI, Emilie DELVERDIER,
Yoana DIMITROVA, Kevin DROMER, Karine JACQUET,
Mathias MANGION, Paola MUNOZ, Thomas PRUDHOMME,
Sandrine RAZAFIMAHATRATRA, Karine ROTTIER, Farah ZMIRI,
Professeur référant : François COUDERC
Promotion EGPR 9

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TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION 4
ETUDES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES 5
La glycosylation 5
• Généralités
• Caractérisation des sites de glycosylation
• Diagnostic par quantification de la glycosylation
• Diagnostic par étude de la glycosylation
• Études du profil de glycosylation
La phosphorylation 10
• Généralités
• Techniques d’analyse de peptides phosphorylés
• Indentification des sites de phosphorylation
• La quantification
• Présomption de sulfatation artefactuelle
Autres modifications 15
• Généralités
• Sulfatation de la tyrosine
• Acétylation de la lysine
• Formation de déhydroalanine
QUANTIFICATION EN SPECTROMETRIE DE MASSE DES PROTEINES 20
Techniques de quantification protéique en MS 20
• Quantification absolue : AQUA
• Marquage isotopique in vivo pour quantification relative: ISIS (Isobaric SILAC
with Immonium Ion Splitting)
• Amélioration de la technique iTRAQ par fractionnement OFFGEL
Applications à l’environnement médical. 25
• Généralités
• Détection et quantification du facteur létal de l’anthrax dans le sérum par
spectrométrie de masse
• Mise au point d’un test de dépistage de la maladie de Wilson par LC-MS/MS.

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APPLICATIONS 30
Applications médicales 30
• Modifications post-traductionnelles.
• Recherche de biomarqueurs
Applications en protéomique végétale 34
• Généralités
• Identification des changements du protéome dans des feuilles de blé, en réponse à
un stress salin par établissement de cartes peptidiques massiques
• Identification des protéines des feuilles de riz dont l’expression est induite en
réponse au froid par séquençage peptidique par spectrométrie de masse en mode
tandem.
• Etudes des modifications post-traductionnelles des histones par méthode
classique.
• Identifications des protéines chloroplastiques et de leurs modifications.
CONCLUSION 37
REFERENCES 38

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INTRODUCTION
L’analyse du protéome représente un enjeu majeur qui permet d’accéder à des
données fondamentales. Les études en protéomique sont en effet en grand essor depuis le
début des années 2000 et la spectrométrie de masse apporte un grand soutien dans la
compréhension des mécanismes de régulation des protéines ainsi que dans les voies où elles
sont impliquées. Elle est un outil indispensable dans cette approche d’étude et de
caractérisation des protéines. En constante évolution, elle est souvent couplée à d’autres
techniques d’analyse permettant d’augmenter la sensibilité de détection et donc d’analyse.
A travers cette revue nous avons essayé de donner un aperçu des capacités de la
spectrométrie de masse dans des études touchant des domaines divers et variés. En effet, cette
technique permet d’étudier les nombreuses modifications post-traductionnelles telles que la
phosphorylation, la glycosylation…
De part ces analyses en spectrométrie de masse, un aspect quantitatif des protéines et
de leurs modifications peut être abordés.
Différentes applications dans le domaine médical ou végétal utilisables en routine ou
non, sont également traitées dans cette étude.

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ETUDES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES
De façon générale, les modifications post-traductionnelles sont identifiées par
MALDI-TOF MS/MS ou par ESI-TOF MS/MS. L’analyse des ions issus de la fragmentation
met en évidence les modifications post-traductionnel006Ces caractérisées par un incrément
de masse correspondant à l’ajout de groupement chimique.
La glycosylation
Généralités
Les protéines glycosylées sont généralement destinées à être sécrétées ou à être
intégrées à la membrane plasmique. Les chaînes de polysaccharides sont souvent ramifiées et
font varier de 1 à 50% la masse de la protéine. Déterminer la structure des glycoprotéines est
actuellement l'un des travaux les plus difficiles puisque chaque ose possède plusieurs
hydroxyles libres pouvant interagir avec un autre ose ou un autre composé. Ainsi, la
possibilité de former des différents de polysaccharides est immense. Par ailleurs, on distingue
la N-glycosylation (sucre lié à l’Asn) et la O-glycosylation (Ser & Thr).
Ici nous étudierons la détermination les sites de glycosylation ainsi que des séquences
consensus de ces sites. Egalement dans une autre optique nous étudierons la compréhension
des mécanismes de certaines maladies et leur diagnostic ainsi que le dépistage de maladies
(les troubles congénitaux) et la glycosylation d’anticorps thérapeutique recombinant.
Caractérisation des sites de glycosylation
Les expériences de la publication de Gross et al. visent l’étude de la glycosylation de
la protéine HMW1. L’Haemophilus influenzae HMW1 est une adhésine bactérienne
possédant un ou plusieurs sucres N-liés par une glycosyltransférase. Cette adhésine est
responsable du « Human Respiratory Tract Disease ».
Des études préliminaires de digestion à la PNGase F, clivant les N-glycosylations, ne
modifient pas la taille de la protéine suggérant une O-glycosylation ou une N-glycosylation
non reconnue par l’enzyme. Des expériences de spéctrométrie de masse vont permettre
I
IN NI IT TK K
y4 :
ΣR + 162 +19
Peptide non modifié
Peptide modifié [M-162 + H]+
m/z= ΣR + 18 + 2
[M-162 + 2H]++
y4 -162
b2-162
Figure 1 : Exemple d’un
spectre MS/MS du peptide.
INITK m/z= 750.3 permettant
l’identification du résidu
portant la modification de
162Da portée par le y4 vert.