In Vitro - Plias consulting

In Vitro étude de l’action d'un extrait de polysaccharide dans des lymphocytes
humains.
Isolement et culture des cellules: les cellules mononuclées du sang périphérique
(PBMC) de donneurs sains ont été isolées en utilisant la norme Ficoll-Hypaque
centrifugation en gradient de densité et de remises en suspension dans du RPMI-1640
milieu de culture, supplémenté avec 10% du fœtus bovin sérum. Les cellules ont été
incubées pendant différentes périodes (1-4 jours) avec différentes concentrations de
l'extrait de polysaccharide (100 mg / ml - 100 mg / ml) seul, avec l'interleukine (IL) -2
(20-1000 UI / ml) seul (comme pour un contrôle positif), ou aux deux facteurs
(polysaccharide/IL-2) et ont ensuite été testées dans la prolifération des normes et des
tests de cytotoxicité.
Essai de prolifération: PBMC de 5 donneurs sains différents ont été ensemencées
dans des plaques 96 puits (2 x 105 cellules / puits) et incubées en présence du
polysaccharide, IL-2 ou polysaccharide/IL-2 pour 3 et 5 jours. Au cours des 18
dernières heures, les cultures ont été pulsées à thymidine radioactive (1 plCi / puits),
incorporée dans l'ADN des cellules en prolifération. Les cellules ont ensuite été
récoltées sur des filtres en fibre de verre, en utilisant un collectionneur de cellules et
après avoir ajoute une scintillation liquide, la radioactivité émise a été comptée dans
un compteur β –radiation.
L'extrait polysaccharidique a été testé à l'escalade des dilutions allant de 100 mg / ml
- 100 mg / ml. Les résultats montrent que en 3 jours d'incubation, la substance peut
induire des lymphocytes de façon significative (prolifération 1.3-2.8 fois plus élevée,
comparativement à la prolifération des témoins négatifs), au niveau de dose allant de
0,5 à 20 mg / ml de polysaccharide. Chez un des donateurs, l'incubation des PBMC
de 100 mg / ml de polysaccharide pendant 5 jours, s'est traduite par une augmentation
plus prononcée de la prolifération, qui était de 7,26 fois plus élevée que celle des
témoins respectifs.
Enfin, l'augmentation de prolifération des lymphocytes a été constatée lorsque le
polysaccharide a été testé en synergie avec des concentrations optimales d'IL-2 (20 UI
/ ml). L'augmentation de la prolifération, après 3 jours d'incubation avec des
concentrations optimales du polysaccharide (0,5-20 mg / ml) était de 2.5-3.9 fois plus
élevée par rapport aux témoins négatifs.
Épreuve de cytotoxicité : cellules-cibles (T) des séries cellulaires humaines
K562 (de leucémie myéloïde chronique) et Daudi (de lymphome Burkitt),
incubées avec chrome-51 pendant 90 minutes à 37o C.
Pré-incubées pendant 1-3 jours avec le polysaccharide, IL-2, ou le polysaccharide et
IL-2 cellules-exécutrices provenant de 6 donneurs de sang sains différents, ont été
réparties à des plaques de 96-puits (1-2x105 cellules/puits) et incubées pendant 18
heures avec les cellules cibles à proportion(E :T) 40:1.
En tant que témoins, des cellules-cibles ont été incubées dans une matière nutritive
nature et avec 3NHCl pour que la libération spontanée et totale de l'isotope soit
calculée. Le pourcentage de la libération spéciale de chrome-51 a été compté à son
hypertexte de culture à compteur γ-radiation et la faculté cytotoxique des cellules
tueuses a été calculé sur la base du type :
(percussions par minute (cpm) d'échantillon) - (cpm de relâchement spontané) x 100
(cpm de relâchement total) - (cpm de relâchement spontané).
Et dans cette série des expériences le polysaccharide a été testé à large
spectre de concentrations par 100 ng/ml - 100 mg/ml. La substance a augmente la

faculté cytotoxique des cellules meurtrières (NK) contre les séries cancéreuses
de K562 et Daudi (de 1,5-2,5 fois), à meilleure concentration qui oscillaient
de 1 à 10 mg/ml. Le renforcement de la cytotoxicité était beaucoup plus intense
lorsque le polysaccharide a été testé avec une dose faible de IL-2 (20 IU/ml). Dans
ce cas, un renforcement de la cytotoxicité de 2,1-4,3 fois a été constaté.
Enfin selon l'étude cinétique du renforcement de la NK de cytotoxicité il a été
constaté que l'action du polysaccharide aux lymphocytes s'exerce tôt, avec le meilleur
temps d'incubation 1-2 jours, tandis que l'incubation prolongée avec la substance ne
paraît pas renforcer davantage la faculté lytique des cellules tueuses.
Plus précisément, une concentration du polysaccharide a10 mg/ml, les taux de
cytotoxicité après incubation de lymphocytes du même donneur pour 1, 2, 3 et 4 jours
était 38,7 %, 30,5 %, 24% et 11,3 %, respectivement (taux de cytotoxicité du témoin
6,9 %).
Avec IL-2, le meilleur temps d'incubation a été déterminé à 2 jours, et les équivalents
des taux de cytotoxicité pour le 1, 2, 3 et 4 jours étaient 40,7 %, 60,2 %, 41,6 % et
30 %, respectivement (taux de cytotoxicité de témoin 13,2 %).
Les documents susmentionnés dans les résultats in vitro ne sont qu'indicatifs, réalisés
sur des échantillons de PBMC provenant d'un nombre restreint d'individus. Une série
d'expérimentations plus détaillées sont nécessaires pour enquêter sur le mode d'action
de l'extrait de polysaccharides et d'isoler et d'identifier le composé actif. En outre, afin
d'établir l'effet immunomodulateur de l'extrait de polysaccharides, la conception des
expériences in vivo dans des modèles animaux (de préférence chez la souris) seront
nécessaires.
Constantinos Vorgias et Rania Tsitsiloni de l'Université d'Athènes