Analyse du profil d`expression de la protéine pro- apoptotique Dap

Analyse du profil d’expression de la protéine proapoptotique Dap-3 dans les vésicules extracellulaires
produites dans le contexte de l’infection au VIH-1
Mémoire
Sofiane BERRAZOUANE
Maîtrise en microbiologie-immunologie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Sofiane BERRAZOUANE, 2016
Analyse du profil d’expression de la protéine proapoptotique Dap-3 dans les vésicules extracellulaires
produites dans le contexte de l’infection au VIH-1
Mémoire
Sofiane BERRAZOUANE
Sous la direction de :
Caroline GILBERT, directrice de recherche
Résumé
L’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1 est principalement causée par la déplétion
des LT CD4 (lymphocytes T-CD4). Cette mort des LT CD4 dépend de plusieurs facteurs
comme la lyse des LT CD4 infectés et la présence de vésicules extracellulaires et
d’exosomes libérées par les cellules dendritiques et les LT CD4 infectés au VIH-1.
L’analyse protéomique des exosomes issus des cellules dendritiques mises en culture avec
le VIH-1 a révélé la présence de molécules pro-apoptotiques comme le Dap-3 (Death
Associated Protein 3). Nous avons proposé comme hypothèse que le Dap-3 puisse être
contenu dans d’autres types de vésicules extracellulaires et que le Dap-3 vésiculaire
contribue à la déplétion des LT CD4.
Après avoir optimisé l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3, nous avons déterminé la
présence de Dap-3 dans les vésicules extracellulaires issues des cellules RAJI-CD4-DCIR
infectées au VIH-1. L’utilisation de gradients de vélocité nous a permis d’observer la
présence de Dap-3 dans les fractions du gradient contenant les exosomes issus des cellules
RAJI-CD4-DCIR infectées, mais également dans d’autres fractions du gradient de vélocité
encore non caractérisées. Chez les patients, nous avons montré une hétérogénéité des
vésicules extracellulaires dans les fractions du gradient de vélocité issues des plasmas des
patients VIH-1+. Ces résultats indiquent la présence de plusieurs populations de vésicules
extracellulaires séparées par la méthode du gradient de vélocité. Enfin, la transfection des
cellules RAJI-CD4-DCIR et des cellules dendritiques a été mise au point avec les ARN
anti-sens de Dap-3 afin de produire éventuellement des vésicules Dap-3 négatives.
Ce projet de recherche aura permis de valider les outils nécessaires à la poursuite de l’étude
du rôle de Dap-3 dans la pathogenèse de l’infection au VIH-1.
iii
Table des matières
Résumé ...........................................................................................iii
Table des matières ......................................................................... iv
Liste des tableaux .......................................................................... vi
Liste des figures ...........................................................................viii
Liste des abréviations.................................................................... ix
Chapitre I : Introduction ............................................................... 1
1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). 1
1.1. Découverte ....................................................................................................... 1
1.2. Épidémiologie du VIH-1................................................................................. 1
1.3. Structure du VIH-1......................................................................................... 1
1.4. Les phases d’infection au VIH-1 ................................................................... 2
1.4.1. Phase de primo-infection ..................................................................... 3
1.4.2. Phase chronique ............................................................................... 3
1.4.3. Phase du SIDA.................................................................................. 4
2. Les cellules participant à l’immunopathogenèse de l’infection
au VIH-1 .......................................................................................... 5
2.1. Les cellules dendritiques ................................................................................ 5
2.2. Les lymphocytes T CD4.................................................................................. 7
2.3. Les lymphocytes T CD8.................................................................................. 8
2.4. Déplétion des LT CD4 .................................................................................... 8
3. Apoptose ...................................................................................... 9
3.1. Apoptose des LT CD4 ................................................................................... 10
4. Les vésicules extracellulaires .................................................. 12
4.1. Découverte des exosomes ............................................................................. 12
4.2. Types de vésicules extracellulaires .................................................. 13
4.2.1. Les microvésicules .......................................................................... 13
4.2.2. Les vésicules apoptotiques ............................................................. 14
4.2.3. Les exosomes................................................................................... 14
iv
4.3. Les rôles pléiotropiques des vésicules extracellulaires dans la réponse
immunitaire .......................................................................................................... 16
4.4. Pathogenèse de l’infection au VIH-1 ......................................................... 17
4.5. Limitation des méthodes classiques ............................................................ 18
5. Mitochondries dans les infections au VIH-1 ......................................... 19
6. La protéine pro-apoptotique Dap-3....................................................... 20
6.1. Structure de Dap-3 ............................................................................ 21
6.2. Fonctions physiologiques de Dap-3 ................................................. 21
6.3. Rôles de Dap-3 dans les pathologies ................................................ 22
Chapitre II : Problématique, hypothèse et objectifs de recherche
........................................................................................................ 24
1. Problématique.......................................................................................... 24
2. Hypothèse de recherche .......................................................................... 24
3. Objectif ..................................................................................................... 25
Chapitre III : Matériel et Méthodes ........................................... 26
1. Patients ..................................................................................................... 26
2. Réactifs et anticorps ................................................................................ 26
2.1. Réactifs ............................................................................................... 26
2.2. Anticorps ............................................................................................ 27
3. Culture cellulaire ..................................................................................... 27
3.2.Cellules dendritiques ......................................................................... 28
4. Immunobuvardage .................................................................................. 28
5. Caractérisation des vésicules extracellulaires ...................................... 29
Purification des vésicules extracellulaires avec ultracentrifugation ... 29
Purification des vésicules extracellulaires par l’ExoQuick™ .............. 29
Séparation des vésicules extracellulaires par gradient de vélocité ...... 30
6. Détection des vésicules extracellulaires ................................................. 30
6.1. Mesure de l’activité d’acétylcholine estérase ................................. 30
6.2. Rayon d’hydrolyse dynamique des vésicules extracellulaires mesuré
au Zetasizer Nano ZS (Malvern™) ........................................................ 31
7. Transfection des cellules avec des ARN anti-sens anti-DAP3............. 31
8. Production virale ..................................................................................... 32
Chapitre IV : Résultats ................................................................ 33
v
1-Optimisation de l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 .......................................... 34
2- L’infection par le VIH-1 favorise la présence de Dap-3 dans les vésicules
extracellulaires des cellules RAJI CD4 DCIR ............................................................... 38
3- Présence de Dap-3 dans les différents types de vésicules extracellulaires issues des
cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 ................................................................ 40
4-Caractérisation des vésicules extracellulaires issues des plasmas des patients infectés
au VIH-1 ........................................................................................................................... 41
4-1- Étude comparative de la présence des vésicules extracellulaires
issues des plasmas des patients infectés au VIH-1 ................................ 42
4-2- Analyse de l’abondance d’exosomes par la mesure de l’activité
d’acétylcholine estérase ........................................................................... 44
4-3-Mesure de la taille des vésicules extracellulaires avec le nanosizer46
4-4- Détection de Dap-3 dans les fractions du gradient. ....................... 51
5- Mise au point du modèle de transfection avec les ARNs anti-sens Dap-3.............. 51
Chapitre V : Discussion ............................................................... 54
1. Les rôles des vésicules extracellulaires dans la pathogenèse de l’infection au VIH-1
........................................................................................................................................... 55
2-Présence de Dap-3 sur les vésicules extracellulaires issues des cellules infectées au
VIH-1 ................................................................................................................................ 56
3-Caractérisation des vésicules extracellulaires issues des plasmas des sujets infectés
au VIH-1 ........................................................................................................................... 58
4. Rôle de Dap-3 dans les autres pathologies ................................................................ 59
Chapitre VI : Conclusions et perspectives................................. 61
Références bibliographiques ....................................................... 63
vi
Liste des tableaux
Tableau 1 : Les protéines du VIH-1 participant à la régulation de l’apoptose des LT
CD4. .................................................................................................................................. 12
Tableau 2 : Les rôles de Dap-3 ....................................................................................... 23
Tableau 3 : Quantité des protéines pour chaque dilution de cellules utilisées dans la
mise au point de l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 ............................................. 35
Tableau 4 : Caractéristiques cliniques des sujets ......................................................... 42
vii
Liste des figures
Figure1 : Séquence de la protéine Dap-3.
Figure 2 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 avec ou sans utilisation d’Enhancer
comme diluant des anticorps
Figure 3 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 et révélation avec le Luminata Forte
ou l’ECL
Figure 4 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 avec différents temps de transfert et
d’incubation avec l’anti-Dap-3
Figure 5 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 avec ou sans enhancer pour l’antiDap-3 et l’anticorps secondaire
Figure 6 : Caractérisation des vésicules extracellulaires issues des cellules RAJI CD4
DCIR infectées au VIH-1
Figure 7 : Présence de Dap-3 dans les fractions du gradient de vélocité issues des
vésicules extracellulaires des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1
Figure 8 : Détection des marqueurs d’exosomes et de membrane plasmique sur les
vésicules extracellulaires
Figure 9 : Présence d’ICAM-1 dans les fractions du gradient de vélocité
Figure 10 : Analyse de l’abondance des exosomes sur les fractions du gradient de
vélocité issues des préparations de vésicules extracellulaires des plasmas des patients
infectés au VIH-1
Figure 11 : Distribution des vésicules extracellulaires dans le gradient de vélocité
analysées au nanosizer
Figure 12 : Caractérisation de l’hétérogénéité des vésicules extracellulaires issues de
plasmas des patients infectés au VIH-1 ou non
Figure 13 : Effet des ARNs anti-sens de Dap-3 sur l’expression de Dap-3
viii
Liste des abréviations
AChE : Acétylcholinestérase
ADAM17 : metallopeptidase domain 17
Alix : ALG-2-interacting protein X
Caspases: Cysteine-dependent aspartate-cleaving proteases
CCR5: C-C chemokine receptor type 5
CCR7: C-C chemokine receptor type 7
CMH : Complexe majeur d'histocompatibilité
CNP : 2', 3’-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase
CSF: Colony-stimulating factor
CTLA-4: cytotoxic T-lymphocyte-associated protein
CytC: Cytochrome C
CXCR4: C-X-C chemokine receptor type 4
Dap-3: Death associated protein 3
DCIR: Dendritic Cell Immunoreceptor
DC SIGN: Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Nonintegrin
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
ESCRT: Endosomal sorting complexes required for transport
FADD: Fas Associating protein with Death Domain
Gp120: Glycoprotein 120
GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor
HBS: HEPES-buffered saline
ICAM-1: Intercellular Adhesion Molecule 1
IFNγ: Interferon gamma
IL: Interleukines
IgG: Immunoglobuline G
LAMP-2: Lysosomal-associated membrane protein
LFA-1: Lymphocyte function-associated antigen 1
ix
LTR: Long terminal repeat
LB: Lymphocytes B
LT CD4 : Lymphocytes T CD4
LT CD8 : Lymphocytes T CD8
MIF: Macrophage migration Inhibitory Factor
Nef: Negative Regulatory Factor
PBL: Peripheral Blood Lymphocyte
PBMCs: Peripheral Blood Mononuclear Cell
PI3 kinase: Phosphatidyl-inositol 3-kinase
PLP: major myelin proteolipid protein
PD-1: Programmed cell death
PSG: Pénicilline Streptamycine L-Glutamine
PTCP: the permeability transition pore complex
PVDF: Polyvinylidene Difluoridede
SDH: Succinate Déshydrogénase
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SIDA : Syndrome d'immunodéficience acquise
SIV : Simian Immunodeficiency Virus
SVFU : sérum du veau fœtal ultracentrigugé
TAM: Tumor Associated Macrophage
Tat: Trans-Activator of Transcription
TBS: Tris Buffer Saline
TCA: Trichloroacetic acid
TGF-β: Transforming growth factor beta
TNFα: Tumor Necrosis Factor
TRAIL: Tumor-necrosis-factor related apoptosis inducing ligand
TSG 101 : Tumor susceptibility gene 101 protein
Vpr: Viral Protein R
VPS : Vacuolar protein sorting
x
À mes chers parents et sœurs
pour leurs soutiens indéfectibles et
leurs encouragements
xi
Remerciements
Je tiens à remercier ma directrice de recherche Dre Caroline Gilbert de m’avoir accepté dans
son laboratoire et permis d’exercer ma passion pour la recherche scientifique. Également
d'avoir appris avec elle la méthodologie, l’organisation du projet de recherche et la rigueur
scientifique.
Je remercie également les membres de l’équipe : Audrey Hubert, Thy-René Nsimba
Batomene, Alma Posvandzic, Caroline Subra, Myriam Vaillancourt et Julien Vitry.
xii
Chapitre I : Introduction
1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)
1.1. Découverte
Les premiers cas du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA) ont été décrits aux
États-Unis, en 1981. En 1982, les chercheurs savaient que le taux des lymphocytes T CD4
(LT CD4) sanguin diminuait drastiquement suggérant ainsi que ces cellules pouvaient être
la cible du pathogène qui était encore inconnu à l’époque. Ce n’est que suite à l’observation
d’une activité transcriptase inverse dans le surnageant du milieu de culture des cellules
issues des biopsies des ganglions des patients présentant ce syndrome, et couplée à une
analyse en microscopie électronique que l’identification du rétrovirus a été réalisée en 1983
[1]. Cette découverte a valu le prix Nobel de physiologie ou médecine 2008 aux
Drs Luc Montagnier et Françoise Barré-Sinoussi.
1.2. Épidémiologie du VIH-1
Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), près de 78 millions de personnes dans le
monde sont infectées au VIH-1 et près de 39 millions de personnes en sont décédées depuis
le début de l’épidémie jusqu’à 2014. La prévalence de l’infection au VIH-1 était d’environ
36,9 millions de personnes en 2014 [2]. Au Canada, selon l’Agence de la santé publique, la
prévalence des infections au VIH-1 était de 75 500 personnes à la fin de 2014 [3].
1.3. Structure du VIH-1
Le VIH-1 fait partie de la famille des Retroviridae, de la sous-famille de Lentivirinae et du
genre de Lentivirus [4]. Le VIH-1 est un rétrovirus enveloppé et encapsidé mesurant entre
100 et 120 nm de diamètre. La capside virale contient un génome composé de deux copies
d’ARN monocaténaires comprenant trois gènes principaux gag, pol et env, deux gènes
essentiels tat et rev et quatre gènes accessoires nef, vpr, vif et vpu. Le gène gag (group
1
specific antigen) code pour des protéines Gag qui forment une structure de base pour la
capside [5]. Le gène pol code pour la transcriptase inverse qui rétrotranscrit l'ARN viral en
ADN viral [6]. Le gène Env code pour les glycoprotéines gp120 et gp41 de l’enveloppe
virale [7].
On retrouve également dans la capside virale des protéines comme l'intégrase p32 qui
intègre l'ADN viral dans le génome cellulaire [8] et la protéase p12 qui permet l'assemblage
et la formation des capsides du virus en clivant les précurseurs protéiques Gag [9].
L’enveloppe virale provient du bourgeonnement de la membrane plasmique de la cellule
cible lors de la multiplication virale. Cette enveloppe comprend en plus des protéines de
l’hôte [10] les glycoprotéines gp120 et gp41 qui jouent un rôle central dans l’attachement et
la pénétration du virus dans la cellule cible. La gp120 se lie avec une grande affinité au
récepteur CD4 ce qui change la conformation de la gp120 et permet la liaison aux
récepteurs de chimiokines comme le CCR5 et le CXCR4 d’avoir lieu [11, 12]. Cette liaison
expose alors la gp41 permettant la fusion entre la membrane plasmique de la cellule cible
et la capside virale permettant ainsi la pénétration de cette dernière dans la cellule [13].
Après la décapsidation, l’ARN viral sera rétro-transcrit par la transcriptase inverse formant
un ADN double brin qui se transloque vers le noyau grâce à la présence de la protéine
virale Vpr et des pores nucléaires [14, 15]. Une fois que l’ADN viral se retrouve dans le
noyau, il sera intégré dans l’ADN de l’hôte grâce à la présence d’intégrase et fera partie du
génome de la cellule, d’où la très grande difficulté d’éliminer ce virus [16].
1.4. Les phases d’infection au VIH-1
L’infection au VIH-1 passe par trois phases, la primo-infection, la phase chronique et la
phase SIDA. Bien que les signes cliniques de cette infection peuvent être discrets lors de la
primo-infection, dès les premières semaines, il y a une perte de la majorité des lymphocytes
T (LT) CD4 mémoires dans le tractus gastro-intestinal [17]. C’est en fait la prise de
contrôle du système immunitaire par le virus, car cette perte est irréversible. La réponse
immunitaire et les traitements antirétroviraux ne peuvent éradiquer le VIH-1, et ce, en
raison de la présence de cellules réservoirs pour le VIH-1 comme les cellules dendritiques,
les macrophages et les LT CD4 permettant ainsi la persistance de l’infection [18-20]. Par la
2
suite, lors de la phase chronique ou de latence, l’activation de la réponse immunitaire
engendre la diminution de la charge virale grâce à l’intervention des LT CD8 qui
permettent la lyse des cellules infectées. De plus, le virus peut également être contrôlé
grâce à la production d’anticorps contre les protéines virales [21]. Cependant, en absence
de traitement, l’activation accrue du système immunitaire engendre un épuisement de celuici et le patient entre dans la phase SIDA qui se caractérise par un déficit immunitaire et a
comme conséquence l’apparition d’infections opportunistes.
1.4.1. Phase de primo-infection
L’entrée du virus dans l’organisme se produit via sa capture par les cellules dendritiques
des muqueuses. Deux voies sont utilisées par le VIH-1 pour infecter les cellules
dendritiques soit : via la fusion de la gp120 du VIH-1 avec le CD4 et le CCR-5 des cellules
dendritiques [22]; ou bien via l’interaction entre les sucres de la gp120 avec les récepteurs
de lectine tels que le récepteur au mannose, le DCIR (Dendritic Cell Immunoreceptor), le
CD206, le DC SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing
Non-integrin) et la langerine [12, 23-25].
Grâce à ces nombreux récepteurs, les cellules dendritiques peuvent capturer le VIH-1 et
l’internaliser dans leurs compartiments intracellulaires. Les cellules migrent ensuite vers les
organes lymphoïdes secondaires afin de présenter les antigènes viraux aux LT CD4 et aux
LT CD8 et activer la réponse immunitaire cellulaire [26] tout en transmettant les virus au
LT CD4 [27].
1.4.2. Phase chronique
Les patients peuvent ne présenter aucun symptôme évident d’infection même si le virus
continue à se répliquer. Cependant, la progression de cette phase varie largement d’une
personne à l’autre. Cela dépend en partie du traitement. En effet, les personnes non traitées
peuvent passer de la phase asymptomatique à la phase symptomatique qui comprend une
fatigue chronique, perte de poids inexplicable, diarrhée, fièvre, sueur nocturne et problème
de peau [28]. Durant cette phase, des évènements différents peuvent se dérouler et
3
contribuent grandement à la pathogenèse de l’infection au VIH-1. Notamment la latence
virale, l’activation accrue du système immunitaire et la poursuite de la déplétion des LT
CD4.
Le virus devient latent grâce à l’intégration de son génome dans celui de l’hôte, en
particulier chez les LT CD4 mémoires [29]. En effet, ces cellules constituent un réservoir
du virus permettant ainsi l’échappement de ce dernier à la reconnaissance par le système
immunitaire et son élimination par les traitements antirétroviraux [30].
Durant cette phase, on assiste également à une activation accrue du système immunitaire.
Cela se manifeste notamment par une augmentation du taux de cytokines proinflammatoires comme le TNF-α qui peut induire l’apoptose des LT CD4 via l’activation
des récepteurs de mort cellulaire Fas et TRAIL [31, 32]. Une autre cause favorisant la
dérégulation du système immunitaire est la translocation microbienne. Ceci commence par
la perte de jonction serrée dans les muqueuses intestinales et une levée de protection de
cette dernière par les LT CD4 déplétés vis-à-vis de la flore commensale. Ce qui permet la
translocation microbienne de l’intestin vers la circulation sanguine. Ceci se manifeste par la
présence d’un fort taux de lipopolysaccharides dans les plasmas des patients infectés au
VIH-1 [33].
Depuis le début de la primo-infection et durant la phase chronique, on note une déplétion
continue des LT CD4. En effet, les LT CD4 naïfs expriment des taux élevés en récepteurs
de mort cellulaires Fas et des pores Bax proapoptotiques. Ce qui accélère
l’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1 [17, 32, 34, 35].
1.4.3. Phase du SIDA
Elle survient quand le système immunitaire est altéré. Le patient devient alors sensible à de
nombreux pathogènes y compris ceux qui causent des infections bénignes. Cette phase est
déclarée quand le compte des LT CD4 passe sous le seuil des 200 cellules/mm3 dans le
sang [36]. Ce déficit immunitaire engendre l’apparition d’infections aux pathogènes
opportunistes comme le champignon Pneumocystis responsable de la pneumocystose, les
bactéries Mycobacterium avium associées au syndrome de Lady Windermere, les
4
protozoaires Toxoplasmosis gondii qui causent la toxoplasmose et les cytomégalovirus
[37]. Certains types de cancer, tels que le lymphome, sont également plus courants chez les
personnes infectées au VIH-1 [38].
Le déficit immunitaire est le résultat de la déplétion des LT CD4 et un épuisement du
système immunitaire. Ces deux processus sont irréversibles parce que les LT CD4 perdent
leurs capacités de prolifération [39].
2. Les cellules participant à l’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1
Les cellules dendritiques représentent une porte d’entrée pour le VIH-1 puisque ces cellules
sont présentes dans la muqueuse intestinale [23]. Ces cellules migrent vers les organes
lymphoïdes secondaires et favorisent la propagation du VIH-1 vers les cellules cibles
comme les LT CD4 [40].
Les LT CD4 vont à leur tour favoriser la transmission des virus vers les LT CD4
avoisinants étant donné que ces cellules représentent un lieu de réplication et de production
du VIH-1. Quant aux LT CD8, ils permettent la lyse des LT CD4 infectés, ce qui accélère
la mort des LT CD4 mémoires en faveur du déficit immunitaire [39, 41].
2.1. Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigène qui jouent un rôle clé
dans l’élaboration de la réponse innée et acquise. Ces cellules présentent des prolongements
cytoplasmiques appelés dendrites d’où le nom de cellule dendritique. Ils existent deux types
de ces cellules dendritiques, les PDC (Plasmacytoid dendritic cells) d’origine lymphoïde
qui circulent dans le sang et les MDC (Myeloid dendritic cells) d’origine myéloïde
présentes dans les muqueuses [42, 43].
Les cellules dendritiques PDC reconnaissent les antigènes viraux et déclenchent la
sécrétion de cytokines comme l’INF γ et l’IFN β qui inhibent la réplication du virus. Ces
cellules peuvent également sécréter le TNFα qui stimule l’activité cytotoxique des LT CD8
et des cellules NK [44].
5
Les cellules dendritiques MDC jouent un rôle central dans l’activation de la réponse
immunitaire adaptative. En effet, au niveau des tissus, ces cellules en état immature ont une
grande capacité d’endocytose et de phagocytose des antigènes exogènes. Par contre elles
expriment un faible niveau de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)
les CMH-I et CMH-II responsables de la présentation antigénique [45]. À la suite de
l’internalisation des pathogènes, un processus de maturation de ces cellules et de
domiciliation vers les ganglions se met en place. Elles deviennent matures et expriment
plus de CMH-I et CMH-II. Les microvésicules libérées peuvent contenir aussi des
molécules de CMH-I et CMH-II et peuvent fusionner avec la membrane plasmique
augmentant ainsi le niveau de ces molécules [46]. De plus, ces cellules expriment des
récepteurs aux chimiokines comme le CCR7 (C-C chemokine receptor type 7) permettant
ainsi la migration des cellules dendritiques vers les organes lymphoïdes secondaires et
l’activation des LT via la présentation antigénique. En effet, les cellules dendritiques
sécrètent des cytokines comme l’IL-12 qui favorise la polarisation des LT en cellules Th1.
Ces dernières activent les LT CD8 qui lysent les cellules infectées [47].
Le virus infecte les cellules dendritiques et modifie ainsi l’évolution d’une réponse
immunitaire efficace telle que décrite ci-dessus. Le virus peut infecter la cellule dendritique
en cis c’est-à-dire suite à la fusion de la gp120 du VIH-1 avec le CD4 et le CCR-5 qui
permettent l’entrée du VIH-1 dans la cellule dendritique [22, 48]. La deuxième voie
d’infection est la trans-infection qui implique des récepteurs des cellules dendritiques
comme les récepteurs mannose, le DCIR, le CD206, DC SIGN et les langerines qui
permettent l’attachement et l’entrée du VIH-1 dans les cellules dendritiques [12, 23]. Les
récepteurs lectines de type C ne permettent pas seulement l’attachement du VIH-1, mais
aussi la formation de synapse immunologique entre les cellules dendritiques et les LT CD4
comme c’est le cas des récepteurs DC-SIGN [49]. Ce dernier est stimulé par la protéine
virale Nef pour favoriser l’interaction des cellules dendritiques avec les LT et l’infection en
trans des cellules dendritiques [12, 50]. Ce qui permet la transmission du VIH-1 des
cellules dendritiques vers les LT CD4.
Une autre voie favorise cette interaction cellulaire, c’est la protéine Nef qui déclenche la
production des chimiokines par les cellules dendritiques permettant ainsi l’attraction des LT
6
vers les cellules dendritiques infectées et favoriser la transmission du virus [51]. Les
cellules dendritiques mises en contact avec la gp120 peuvent produire des cytokines comme
l’IL-10 qui régule négativement la réponse immunitaire Th1 antivirale favorisant ainsi la
persistance de l’infection [52]; sachant que les cellules Th1 stimulent l’activité cytotoxique
des LT CD8. C’est-à-dire la production des perforines et des granzymes qui provoquent la
nécrose des cellules infectées [53-55].
2.2. Les lymphocytes T CD4
Suite à l’entrée du VIH-1 dans l’organisme via les cellules dendritiques, le virus cible
principalement les LT CD4 en raison de la présence du récepteur CD4 fortement exprimé
sur les LT CD4. En effet, l’infection de ces derniers par le VIH-1 débute par l’attachement
de la gp120 de l’enveloppe du VIH-1 au récepteur CD4. Cet attachement est également
facilité par la présence de corécepteurs de chimiokines comme le CCR5 ou le CXCR4 de la
cellule cible [56]. Ce qui permet l’entrée du virus et l’infection.
Après l’infection des LT CD4 au VIH-1, ces cellules pourront constituer un réservoir de
VIH-1 favorisant ainsi la persistance de ce virus [57]. En effet, une étude par RT PCR
réalisée sur les LT CD4 des ganglions périphériques révèle une forte expression de
protéines du VIH-1 comme Gag. De plus, le pourcentage des LT CD4 dans le ganglion est
corrélé avec le taux de virémie mesuré par le dosage de p24 [58]. Ce qui indique aussi que
les LT CD4 constituent un lieu de production du VIH-1.
L’infection ciblée des LT CD4 ne dépend pas uniquement de l’interaction de CD4 avec la
gp120, mais aussi du profil d’expression protéique des LT CD4 et de leur état de
différenciation. En effet, des études ex vivo sur les LT CD4 issus des patients VIH-1+
montraient que la population des LT CD4 enrichies en sous-populations Th1 et Th17 était
plus susceptibles aux infections au VIH-1 [59]. De plus, une analyse transcriptomique sur
les LT CD4 infectés à différents pathogènes révèle que l’expression des gènes influence la
susceptibilité des LT CD4 à être infectés par le VIH-1 [60]. Parmi ces gènes, on peut citer
les IFI (Interferon Induced protein), les cytokines pro-inflammatoires IL17-A et IL-17-F et
également les TRIM 5 et 22 (tripartite motif family) impliquées dans la reconnaissance de
l’antigène [60]. Ces facteurs sont capables d’influencer l’infectivité des LT CD4.
7
D’autres facteurs pouvant influencer l’infectivité et les fonctions des LT CD4 comme les
récepteurs CTLA-4 et le CD28. Le CTLA-4 est un récepteur qui favorise l’apoptose et le
CD28 est un récepteur qui stimule la prolifération cellulaire [61]. Les CTLA-4 sont
retrouvés surexprimés dans les LT CD4 infectés au VIH-1, en revanche, le CD28 stimulé
favorise la prolifération des LT CD4 spécifiques au VIH-1 [62].
Ces données expliquent le profil d’expression des LT CD4 détermine la susceptibilité de
ces cellules à la résistance ou à l’infection au VIH-1.
2.3. Les lymphocytes T CD8
Les LT CD8 effecteurs et mémoires sont capables de reconnaitre l’antigène viral présenté
par les CMH-I des LT CD4 infectés au VIH-1, ce qui déclenche la libération de perforine
qui perfore la membrane plasmique de la cellule infectée et la libération aussi de granzyme
qui permet la dégradation des protéines et la lyse de la cellule infectée [63]. Ce processus
est également régulé par l’interaction du récepteur de mort cellulaire Fas de LT CD8 avec
le Fas-Ligand de LT CD4.
L’une des approches dans la vaccination contre le VIH-1 est l’activation des LT CD8. En
effet, un co-traitement des macaques avec l’anti-IBB-1-4 et l’antigène Gag du virus de SIV
(Simian Immunodeficiency Virus) permet la stimulation des fonctions des LT CD8 dans la
production des granzymes, de perforine et de l’IFN-γ [64].
Les LT CD8 sont capables de libérer des cytokines comme le TNF-α (Tumor Necrosis
Factor) qui active la nécrose des LT CD4 infectés et participe à la déplétion de celles-ci
[65]. En effet, les récepteurs de TNF-α comme TRAIL, jouent un rôle prépondérant dans la
mort des LT CD4 [31].
2.4. Déplétion des LT CD4
Dès la primo-infection, il y a une déplétion massive des LT CD4 dans le tissu lymphoïde
associé au tractus intestinal [17]. On observe également une diminution du ratio des
LT CD4/LT CD8 dans le sang périphérique des patients infectés [66] car les LT CD8
8
prolifèrent et deviennent inefficaces pour éliminer les LT CD4 infectés. Le phenotype des
LT CD8 devient alors épuisé [67].
Plusieurs facteurs sont impliqués dans la déplétion des LT CD4. En effet, les protéines
virales sont évidemment incriminées dans la mort des LT CD4. En effet, la protéine Nef est
capable d’activer la déplétion des LT CD4 et d’augmenter la sensibilité des LT CD4
avoisinants à l’apoptose sur les tissus lymphoïdes cultivés ex vivo [68].
Cependant, l’infection des LT CD4 au VIH-1 n’est pas suffisante pour expliquer la
déplétion massive de ces cellules. En effet, une observation sur les sections de nodule
lymphoïde montre que la majorité des LT CD4 en apoptose ne sont pas infectés au VIH-1,
mais se trouve à proximité des LT CD4 infectés [69]. Cette mort cellulaire pourrait être
déclenchée en partie par l’interaction de glycoprotéine virale Env avec le CD4 et les
corécepteurs CCR5 et CXCR4 des LT CD4 non infectés [70].
Un autre mécanisme de déplétion des LT CD4 indépendant de la présence de l’infection au
VIH-1 est l’intervention de TGF-β1 dans l’induction de la production de collagène et son
dépôt sur le tissu lymphoïde observé chez les patients infectés au VIH-1. Cette déposition
isole les LT des facteurs de croissance comme l’IL-7, ce qui favorise l’apoptose et
contribue ainsi à leur déplétion [71].
Les récepteurs de mort cellulaire comme Fas, Fas-L et TRAIL-DR5 sont également
associés à la déplétion des LT CD4 par apoptose chez les patients infectés au VIH-1 [72].
3. Apoptose
La déplétion des LT CD4 par apoptose favorise la persistance du VIH-1 et l’apparition
d’infections opportunistes qui caractérisent la phase du SIDA [73, 74].
L’apoptose est une mort cellulaire programmée de façon intrinsèque contrairement à la
nécrose qui se produit grâce à la présence de signaux extracellulaires comme une infection.
L’apoptose se manifeste par une condensation du cytoplasme, une fragmentation de la
9
chromatine suivie de la désagrégation de la cellule en corps apoptotiques qui seront
phagocytés par les macrophages [75].
Ils existent deux voies d’apoptose, la voie extrinsèque et la voie intrinsèque. La voie
extrinsèque est régulée par les récepteurs membranaires Fas et TRAIL (tumor-necrosisfactor related apoptosis inducing ligand) qui permettent le recrutement des caspases
(cysteine-dependent aspartate-cleaving proteases) [75]. La protéine Fas comporte un
domaine de mort capable de recruter FADD (Fas Associating protein with Death Domain)
permettant ainsi l’activation des pro-caspases 8 et la fragmentation de l’ADN [76].
La voie intrinsèque d’apoptose peut être induite par les radicaux libres qui engendrent des
cassures d’ADN et l’activation de la protéine p53 [77], ce qui ramène au déclenchement de
la voie intrinsèque d’apoptose [78]. Les protéines mitochondriales jouent un rôle central
dans la voie intrinsèque d’apoptose. En effet, la protéine p53 active les protéines
mitochondriales Bcl-2 pro-apoptotiques et induit l’agrégation et l’activation des pores
mitochondriaux Bax. Ceci permet le relargage des protéines mitochondriales CytC
(Cytochrome C) et Smac/Diablo [79]. Ces derniers vont former avec la pro-caspase 9 et la
protéine adaptatrice Apaf-1 un complexe cytosolique appelé apoptosome.
Les deux voies mènent à l’activation de la pro-caspase 3, la fragmentation de l’ADN et la
mort de la cellule [80].
3.1. Apoptose des LT CD4
L’immunopathogenèse se développe avec une déplétion continue des LT CD4 notamment
par apoptose. Plusieurs facteurs peuvent réguler ce processus : les protéines du VIH-1 et les
LT CD8 [73, 81]. En effet, les protéines Nef et Tat du VIH-1 interagissent avec les
caspases 8 pour activer l’apoptose des LT CD4 [82]. La gp120 de l’enveloppe virale
interagit avec CXCR4 pour activer la protéine Fas et la voie extrinsèque de l’apoptose [83]
(voir tableau 1). Une autre protéine virale Vpr active le récepteur de mort cellulaire Fas-L
pour induire les caspases 8 [84].
10
Les protéines virales peuvent interagir avec les protéines mitochondriales permettant ainsi
l’induction de l’apoptose des LT CD4. En effet, les protéines Vpr et Tat peuvent inhiber les
Bcl2 anti-apoptotiques favorisant ainsi la levée de l’inhibition d’apoptose des LT CD4 [81]
(voir tableau 1). De plus, la transfection des cellules Jurkat avec les pores Bax de la
membrane mitochondriale provoque sélectivement l’apoptose des cellules Tat positives en
comparaison avec les LT CD4 Tat négatives [85].
Quant aux LT CD8, ils sont impliqués dans la mort par apoptose des LT CD4 via
l’interaction de Fas-L de LT CD8 avec le récepteur Fas de LT CD4 et aussi via le TNFα qui
active la voie extrinsèque d’apoptose des LT CD4 [73].
Par ailleurs, le récepteur de mort cellulaire TRAIL est surexprimé dans le tissu lymphoïde
humain infecté ex vivo par le VIH-1. Ce qui impliquerait ce récepteur dans l’accélération
de la déplétion des LT CD4 [86]. Les molécules TRAIL présentes sur les microvésicules
pourraient ainsi contribuer à la déplétion des LT CD4 [87].
Enfin, grâce à la présence de protéines virales comme Nef et des protéines mitochondriales
comme la death associated protein 3 (Dap-3), les exosomes peuvent favoriser la déplétion
des LT CD4 [88, 89].
Protéine du VIH-1
Protéine cible
Réponse physiologique
Caspase 8
Fragmentation de l'ADN [82]
gp120
CXCR4
Activation de la protéine Fas
[83]
Vpr
Fas-L
Activation des caspases 8
[84]
Vpr et Tat
Bcl2 anti-apoptotique
Levé d'inhibition de
l'apoptose [81]
Nef et Tat
Relargage du CytC et Apaf-1
et formation d'apoptosome
[81]
Tableau 1 : Les protéines du VIH-1 participant à la régulation de l’apoptose des LT
CD4.
Tat
Pores Bax
11
4. Les vésicules extracellulaires
4.1. Découverte des exosomes
Les exosomes furent nommés pour la première fois en 1981 pour décrire les microvésicules
issues des cellules néoplasiques contenant l’enzyme 5' nucléotidase impliquée dans la
réplication d’ADN [90]. Quelques années plus tard en 1985, les chercheurs ont observé au
microscope électronique, la fusion entre les endosomes comportant les corps
multivésiculaires avec la membrane plasmique au niveau des réticulocytes et ces vésicules
contiennent le récepteur de transferrine responsable du transfert du fe3+ [91]. Cette étude a
montré que les exosomes sont d’origines endosomales et que les endosomes ne fusionnent
pas toujours avec les lysosomes. Ces vésicules ont été obtenues par ultracentrifugation à
partir du surnageant de culture des réticulocytes.
Par la suite, les chercheurs se sont intéressés à caractériser les fonctions des vésicules
extracellulaires et ils ont montré que ces dernières étaient impliquées dans plusieurs
processus biologiques majeurs comme la présentation antigénique pour l’activation du
système immunitaire, le cancer et la pathogenèse des infections.
En 1996, une étude a mis en évidence la présence du CMH-II sur les vésicules
extracellulaires issues des LB et des cellules dendritiques [92, 93]. C’est là où les vésicules
extracellulaires ont requis toute l’attention pour les étudier dans le contexte des infections
et du cancer. Et ce, en raison de la capacité de ces vésicules extracellulaires à présenter les
antigènes exogènes et les antigènes tumoraux pour l’activation de la réponse immunitaire.
Les vésicules extracellulaires peuvent également contenir des intégrines comme LFA-1
(Lymphocyte function-associated antigen 1) et des molécules de co-stimulation comme le
CD28 régulant la survie et l’activité des cellules immunitaires [94, 95].
Par la suite, les chercheurs étudiaient la participation des vésicules extracellulaires dans le
maintien de l’environnement tumoral grâce à leurs capacités à contenir des récepteurs
régulant la prolifération cellulaire comme la présence des récepteurs EGFR (epidermal
growth factor receptor) sur les microvésicules issues des cellules tumorales [96].
Plus récemment, des études ont montré l’implication des vésicules extracellulaires dans la
pathogenèse de l’infection au VIH-1. Suite à l’observation de la présence de protéines du
12
VIH-1 comme Nef sur les vésicules extracellulaires issues des LT CD4 infectés aux
VIH-1 [88].
4.2. Types de vésicules extracellulaires
Ils existent plusieurs types de vésicules extracellulaires qui diffèrent dans la taille, l’origine
de la biogenèse et les fonctions. On peut retrouver au sein des fluides biologiques comme le
plasma la présence de plusieurs types de vésicules extracellulaires comme les exosomes, les
microvésicules et les vésicules apoptotiques [97].
4.2.1. Les microvésicules
Ce sont les plus grandes vésicules extracellulaires, leurs tailles sont comprises entre 100 et
1000 nm [98]. Les microvésicules peuvent provenir de différents types cellulaires comme
les cellules endothéliales, les plaquettes sanguines, les cellules immunitaires comme les LT
CD4 et les macrophages et les cellules tumorales [99]. Étant donné que les microvésicules
proviennent du bourgeonnement de la membrane plasmique, leur composition varie en
fonction de la composition de la membrane plasmique de la cellule productrice [100].
Les microvésicules participent dans la communication intercellulaire. En effet, les
microvésicules issues des LT CD4 peuvent contenir des TCR (T Cell Receptor) participant
ainsi à la formation de la synapse immunologique et l’interaction entre les LT CD4 et les
cellules présentatrices d’antigènes comme les LB [101]. Une autre étude a montré qu’une
co-culture des cellules cancéreuses de prostate avec les cellules de moelle osseuse rend ces
dernières capables d’exprimer des gènes actifs spécifiquement dans la prostate, et ce, grâce
à la présence des microvésicules libérées par les cellules tumorales de la prostate [102]. Les
microvésicules issues des cellules tumorales peuvent également contenir une protéine
membranaire CSE1L (chromosome segregation 1–like protein) impliquée dans le processus
métastatique par l’activation des protéines Ras [103].
Les microvésicules peuvent également réguler la survie des cellules. En effet, une étude a
rapporté que les microvésicules issues des monocytes stimulés avec l’endotoxine peuvent
activer l’apoptose des cellules VSMC (vascular smooth muscle cells) et que ces
13
microvésicules contiennent les caspases 1, ce qui suggère le possible rôle de ces
microvésicules dans l’induction de l’apoptose [104].
4.2.2. Les vésicules apoptotiques
Appelées également corps apoptotiques, leurs tailles sont comprises entre 50 et 500 nm
[105]. Elles proviennent de la fragmentation des cellules en apoptose. Ces vésicules
peuvent contenir les résidus de cellules mortes par apoptose, c’est-à-dire le cytoplasme, les
organites et de l’ADN fragmentée [106].
Des études ont montré l’influence des vésicules apoptotiques dans le processus de
migration et de différenciation cellulaire. En effet, les vésicules apoptotiques issues des
cellules endothéliales sont capables d’induire la production de MCP-1 (Monocyte
chemotactic protein 1) et l’IL8 [107]. Ce qui confère aux vésicules apoptotiques des
fonctions de régulation de la migration des cellules. De plus, ces vésicules apoptotiques
peuvent également activer la différenciation des cellules progénitrices des cellules
endothéliales [108].
4.2.3. Les exosomes
Les exosomes ont une taille comprise entre 50 nm et 100 nm [105]. Ils peuvent provenir de
différents types cellulaires comme les LB, les LT, les adipocytes, les astrocytes et les
cellules tumorales [109-111]. Les exosomes proviennent du
bourgeonnement de la
membrane endosomale vers l’intérieur de l’endosome formant des vésicules intraluminales
appelées également corps multivésiculaires [112]. L’endosome va soit fusionner avec le
lysosome formant l’endolysosome [113] ou bien fusionner avec la membrane plasmique
libérant ainsi des vésicules qu’on appelle exosomes [114].
Les complexes ESCRT-I, II et III (The endosomal sorting complexes required for transport)
permettent la biogenèse des exosomes, le recrutement et la séquestration des protéines
ubiquitinylées dans les exosomes [115]. Il est de plus en plus établi que le Tsg-101
représente un des marqueurs des exosomes qui participe au tri des protéines. Le Tsg-101 est
14
également impliqué dans le bourgeonnement du VIH-1 vers l’extérieur de la cellule
infectée [116, 117].
Les exosomes possèdent aussi comme marqueurs :
-Alix (ou ESCRT-II) impliquée dans la séquestration des protéines dans les corps
multivésiculaires [118].
-CMH-I et CMH-II responsables de la présentation antigénique retrouvés sur les exosomes
issus des LB et des cellules dendritiques [119].
-Lamp-2 (Lysosomal-associated membrane protein) impliquée dans la protection et
l’adhésion des lysosomes [120].
-ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1), une molécule de costimulation participant à
l’activation des LT [121].
-AChE-E (Acétylcholinestérase-E) possédant une ancre glycosyl phosphate inositol (GPI)
qui permet l’ancrage de cette enzyme dans la membrane des vésicules [122, 123].
Dans notre laboratoire, grâce à la méthode du gradient de vélocité, nous avons pu séparer
les exosomes AChE+ des particules du VIH-1 présent dans le culot 100 000 xg des cultures
des cellules dendritiques mises en contact avec le VIH-1 [124].
4.2.3.1. Fonctions des exosomes
La composition des exosomes varie en fonction de la cellule productrice et reflète son état
d’activation. Ce qui lui confère une large possibilité de communication intercellulaire. En
effet, les exosomes peuvent avoir des fonctions dans la réponse immunitaire et dans la
pathogenèse des infections au VIH-1.
Les exosomes sont responsables du transport et du recyclage des protéines grâce à
l’intervention de ses composantes en protéine comme Alix et VPS (Vacuolar protein
sorting) qui permettent le chargement des exosomes en protéine [125, 126].
Dans l’étude du processus de neurotransmission, les chercheurs ont observé par
microscopie à fluorescence que les exosomes issus des cellules gliales peuvent être
15
internalisés dans les neurones et protéger ces derniers du stress oxydatif [127]. De plus, ces
exosomes issus des cellules gliales peuvent contenir des protéines PLP (major myelin
proteolipid protein) et une enzyme CNP (2',3'-cyclique-nucléotide 3'-phosphodiestérase)
essentielles pour la production de myéline [128].
Des exosomes retrouvés dans la vésicule biliaire participent à la prolifération des
cholangiocytes, des cellules épithéliales des voies biliaires [129]. Les exosomes sont
également présents dans le liquide cérébro-spinal et sont associés à la séquestration des
protéines amyloïdes β. Cette fonction est protectrice contre l’accumulation des amyloïdes β
[130].
Dans le contexte de la régulation de la réponse tumorale, les exosomes issus des cellules
tumorales peuvent contenir des antigènes tumoraux qui seront reconnus par les cellules
dendritiques. Ce qui permet de déclencher une réponse immunitaire antitumorale [131]
Les exosomes peuvent également participer à la coagulation sanguine et l’angiogenèse
[132, 133]. De plus, des études ont montré que les plaquettes sanguines peuvent libérer des
vésicules extracellulaires et que le nombre de celles-ci varie en fonction de l’état
d’activation des plaquettes [134].
4.3. Les rôles pléiotropiques des vésicules extracellulaires dans la réponse immunitaire
Les exosomes participent à la régulation de la réponse immunitaire favorisant la
présentation antigénique, la sécrétion des cytokines et l’immunosuppression.
Les exosomes issus des cellules présentatrices d’antigène comme les cellules dendritiques
et les LB peuvent contenir des molécules du CMH-II lui conférant ainsi un rôle dans la
présentation antigénique [135] [136]. Ces mêmes exosomes favorisent la prolifération des
LT CD4 et l’activation des LB [135].
Une autre étude a montré que le traitement des LT CD4 avec des exosomes et de l’IL2
augmente la sécrétion de MIF (Macrophage migration Inhibitory Factor, l’IL-16 et GMCSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor) en comparaison avec les
conditions de traitement avec l’IL2 seul [137]. Ce qui montre un rôle des exosomes dans la
potentialisation de la réponse à l’IL2.
16
Les exosomes contribuent également à réguler la formation des vaisseaux sanguins
(l’angiogenèse), en effet ces vésicules modulent la sécrétion de l’IL8 et la migration des
cellules endothéliales [138]. Les exosomes issus des cellules dendritiques infectées au
Malassezia sympodialis activent la production de TNFα et l’IL4, et ce grâce à la capacité de
ces vésicules à contenir des antigènes de M. sympodialis [139].
Les chercheurs ont également mis en évidence le rôle des exosomes dans la réponse
immunitaire antivirale, en effet, ils peuvent contenir de l’UTPase du virus d’Epstein Barr
qui sera reconnu par le système immunitaire et permet la sécrétion de cytokines telle que
l’IL-10, IL-12p70, IL-1ß, IL-8 et TNF-α [140].
Enfin, les exosomes peuvent également participer à l’immunosuppression et la pathogenèse
du cancer. En effet, les exosomes issus des cellules tumorales du sein peuvent inhiber la
sécrétion de CSF-1 et de l’IL8 empêchant ainsi le recrutement et la polarisation des
macrophages en TAM (Tumor Associated Macrophage) qui régulent négativement le
système immunitaire, ce qui favorise le développement tumoral [141]. Une autre étude a
montré que les exosomes issus des cellules tumorales sont capables d’inhiber la maturation
des cellules dendritiques et activer la production de TGFβ1 dans la lymphe chez les souris
[142]. Les lymphocytes T régulateurs peuvent libérer plus d’exosomes en comparaison
avec les autres lymphocytes T observés par une analyse quantitative par ELISA de CD63,
un des marqueurs d’exosomes [143]. De plus, ces mêmes exosomes sont capables de
réguler négativement la prolifération des cellules Th1 et la sécrétion d’IFNγ [143].
4.4. Pathogenèse de l’infection au VIH-1
Les vésicules extracellulaires peuvent jouer plusieurs rôles dans l’immunopathogenèse de
l’infection au VIH-1. En effet, les exosomes issus des LT CD4 infectés au VIH-1 peuvent
contenir la protéine virale Nef et les exosomes Nef+ qui sont capables d’augmenter
l’apoptose des LT CD4 [88].
Les exosomes peuvent également favoriser la production virale. En effet, les exosomes
issus des LT CD4 infectés au VIH-1 augmentent la réplication du virus sur les LT CD4
naïfs. Une fonction associée à la présence de la protéine ADAM17 (metallopeptidase
17
domain 17) dans ces exosomes. Cette enzyme convertit le pré TNF-α en sa forme mature
[144]. Le TNF-α peut à son tour induire l’apoptose des LT CD4 via l’activation des
récepteurs de mort cellulaire Fas et TRAIL [31].
L’influence que peuvent avoir les vésicules extracellulaires sur l’immunopathogenèse de
l’infection au VIH-1 rend ces vésicules capables de révéler l’état d’activation des LT CD4
et sa plasticité [145].
Très récemment, notre équipe s’est intéressée à étudier les vésicules extracellulaires issues
des plasmas des patients infectés aux VIH-1 et ils ont observé que l’abondance des
exosomes et la taille des vésicules sont inversement corrélées avec le ratio de
LT CD4/LT CD8 un marqueur de l’évolution de la pathogenèse de l’infection au VIH-1
[146]. De plus, la présence de la protéine pro-apoptotiques Dap-3 a aussi été observée dans
les vésicules des plasmas des patients VIH-1+. Ce qui suggère que les exosomes et leurs
contenus pourraient être des biomarqueurs de l’immunopathogenèse de l’infection au
VIH-1 [147].
Toutefois, la distinction entre la composition des vésicules extracellulaires et celle des virus
est limitée par les méthodes de purification et les appareils de détection.
4.5. Limitation des méthodes classiques
Il était délicat, voire impossible, d’étudier les exosomes et les vésicules extracellulaires
séparément dans le contexte de l’infection au VIH-1 en raison de la taille du VIH-1 qui est
similaire à celle des exosomes. En effet, l’ultracentrifugation sur gradient de densité ne
permettait pas de séparer les exosomes du VIH-1 en raison des tailles similaires de ces deux
populations (100 nm). Dans notre laboratoire, nous avons élaboré la technique
d’ultracentrifugation sur gradient de vélocité et l’immunocapture des exosomes avec l’antiAChE-E pour séparer les exosomes du VIH-1 [124]. Ces deux méthodes nous ont permis
de montrer que les exosomes et le VIH-1 sont deux populations bien distinctes et que le
VIH-1 ne peut pas être contenu dans les exosomes. La fraction des exosomes se détectait
par la mesure de l’activité AChE qui représente un marqueur d’exosomes. Ces méthodes
nous ont permis d’observer le rôle des exosomes dans la pathogenèse de l’infection au
18
VIH-1 et détecter par protéomique la présence de molécules pro-apoptotiques comme
Dap-3 [89].
Bien que les exosomes puissent désormais être isolés et détectés par ces méthodes, les
autres types de vésicules comme les microvésicules et les vésicules apoptotiques ne sont
pas encore très bien caractérisés dans ce gradient. Et ce, en raison de l’absence de
marqueurs spécifiques de ces deux populations de vésicules. Des méthodes de séparation et
de détection des vésicules extracellulaires du plasma et des surnageants cellulaires sont en
cours de développement dans notre laboratoire afin de pouvoir caractériser la structure et la
fonction de chaque type vésiculaire et également de discriminer les vésicules
extracellulaires des protéines agrégées ou des récepteurs solubles.
Enfin, les plasmas des patients infectés au VIH-1 peuvent contenir des résidus de
mitochondries libres ou incorporés dans les microvésicules. En effet, une étude a montré
une augmentation du taux d’ADN mitochondriaux au niveau des plasmas des patients
infectés. Ce qui suggère que les mitochondries pourraient aussi représenter des
biomarqueurs potentiels des dommages causés par l’infection au VIH-1 [148].
5. Mitochondries dans les infections au VIH-1
Les mitochondries sont des organites de taille variable entre 0,5 et 1 μm de diamètre et sa
forme varie beaucoup. Elles jouent un rôle central dans le cycle respiratoire et la voie
intrinsèque de l’apoptose. En effet, les protéines impliquées dans la respiration sont en
partie traduites dans les mitochondries comme le CytB qui convertit l'énergie des molécules
organiques issues de la digestion comme le glucose en énergie utilisable par la cellule,
l'ATP [149, 150]. Également, les enzymes SDH (succinate déshydrogénase) sont
impliquées dans la phosphorylation oxydative et le cycle d’acide citrique, des processus
inclus dans la respiration [151].
Plusieurs protéines mitochondriales sont impliquées dans la voie intrinsèque de l’apoptose.
On peut citer les pores Bax et les Bcl2 qui permettent le relargage du CytC. Cette dernière
permet la formation du complexe d’apoptosome qui active les caspases et l’apoptose [152].
19
Le nombre et les fonctions des mitochondries sont affectés par la présence de l’infection au
VIH-1, ceci est notamment dû à la présence d’un fort taux de TNFα [153]. De plus, les
mitochondries sont associées à l’induction de l’apoptose dans les infections au VIH-1. En
effet, la protéine virale Vpr peut interagir avec PTCP (Permeability Transition Pore
Complex), un complexe polyprotéique de la mitochondrie. Ce qui permet une libération du
CytC et l’activation des caspases et de l’apoptose [154].
Les ARNs viraux peuvent être séquestrés au niveau des mitochondries, ce qui altère les
fonctions de ces derniers. En effet, l’augmentation du taux d’ARN viraux dans les
mitochondries fait diminuer l’activité des enzymes mitochondriales [155]. De plus, une
analyse protéomique sur les mitochondries isolées à partir des PBMCs des patients infectés
au VIH-1 révèle une altération des protéines mitochondriales [156].
Des chercheurs ont procédé au comptage des mitochondries sur les PBLs (Peripheral Blood
Lymphocytes) des patients infectés au VIH-1 traités aux antirétroviraux et ont observé que
le nombre des mitochondries a diminué significativement [157]. Cependant, ils restent des
interrogations sur l’intégrité et la localisation des mitochondries ainsi que le processus
d’autophagie des mitochondries (mitophagie) en présence de l’infection au VIH-1.
Enfin, la présence de Dap-3 dans les exosomes (AChE+) issues des cellules infectées au
VIH-1 nous laisse une question de savoir si les mitochondries altérées par l’infection
peuvent être recyclées par les endosomes et si d’autres types de vésicules peuvent contenir
le Dap-3 ?
6. La protéine pro-apoptotique Dap-3
Nous nous intéressons dans notre projet de recherche à étudier Dap-3 pour deux raisons : la
première est que les rôles physiologiques et immunopathologiques de Dap-3 ne sont pas
encore bien élucidés. La deuxième raison est qu’une analyse protéomique des exosomes
issus des cellules dendritiques mises en culture en présence de VIH-1 a révélé la présence
de Dap-3 [89] ainsi que dans les vésicules extracellulaires des plasmas des patients VIH-1+
[147].
20
6.1. Structure de Dap-3
La Dap-3 est une protéine de la sous-unité 28S du mitoribosome de 397 acides aminés (46
kDa) possédant un motif de liaison au GTP dans son extrémité N-terminale 36 [158].
Appelée également 28S ribosomal protein S29, c’est l’une des rares protéines proapoptotiques localisées dans la matrice mitochondriale [159]. Le gène codant pour Dap-3
est localisé dans le chromosome 1q21 [160]. Dap-3 possède 4 motifs de liaison au Guanine
(G1, G2, G3, G4) ainsi que cinq sites de phosphorylation représentés par un Astérix (*) sur
la figure 1 (UniProtKB, identifiant: P51398-1). La séquence indiquée en rouge est la partie
reconnue par l’anticorps anti-Dap-3 (BD®) utilisé dans notre étude.
Figure1 : Séquence de la protéine Dap-3. Le Dap-3 contient 4 motifs de liaison au
Guanine (G1, G2, G3, G4) ainsi que cinq sites de phosphorylation représentés par un
astérix (*), la séquence protéique prise à partir de UniProtKB (Identifiant : P51398-1).
6.2. Fonctions physiologiques de Dap-3
La protéine Dap-3 est impliquée dans la traduction mitochondriale en plus de posséder une
activité GTPase [161, 162].
21
Plusieurs études ont montré le rôle de Dap-3 dans l’apoptose, notamment la mise en
évidence de l’implication de Dap-3 dans la voie extrinsèque apoptotique. En effet, les
chercheurs ont observé que la déplétion de Dap-3 dans les cellules embryonnaires de souris
et les cellules mammifères augmente la sensibilité de ces cellules vis-à-vis des récepteurs
de mort cellulaire : TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) et le Fas-ligand [163,
164]. Une autre étude a mis en évidence l’interaction de Dap-3 avec le récepteur de mort
cellulaire FADD (Fas-Associated protein with Death Domain) et son rôle dans l’activation
des pro-caspases 8 [165]. Elle intervient également dans la voie de l’induction de
l’apoptose par l’IFN γ, en effet l’inactivation du gène codant pour la Dap-3 par l’ARN antisens réduit la sensibilité des cellules HeLa vis-à-vis de l’IFN γ (voir tableau 2) [166].
Enfin, une analyse de Dap-3 par RT-PCR dans les thymocytes a montré que la Dap-3 est
surexprimée dans les cellules T CD4+ CD8+. Ce qui indiquerait un possible rôle pour
Dap-3 dans la sélection négative des cellules T immatures par apoptose [167].
Rôles de Dap-3
Traduction mitochondriale [161, 162]
Augmente la sensibilité des cellules vis-à-vis de TRAIL et de Fasligand [163] [164]
Interaction avec FADD pour l’activation des pro-caspases 8 [165]
Augmente la sensibilité des cellules vis-à-vis de l’IFN γ [166]
Tableau 2 : Les rôles de Dap-3
6.3. Rôles de Dap-3 dans les pathologies
Les fonctions de Dap-3 dans les pathologies infectieuses et le cancer ne sont pas encore
bien élucidées. Néanmoins, certaines observations ont montré par RT PCR sur les tumeurs
du sein, une corrélation entre la surexpression de Dap-3 et l’évolution des stades du cancer
du sein [168].
Une autre étude a montré par RT PCR une surexpression statistiquement significative de
Dap-3 chez les cellules cancéreuses du gliome, de plus ces cellules sont résistantes au
22
camptothecin-induced apoptosis, un inducteur d’apoptose. Ce qui suggère que Dap-3
confère aux cellules cancéreuses du gliome en migration une résistance à l’apoptose [169].
Dans notre laboratoire, nous avons déterminé la présence de Dap-3 sur les vésicules
extracellulaires issues des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 [170]. De plus, une
analyse protéomique révèle la présence de Dap-3 sur les vésicules AChE+ issues des
cellules dendritiques mises en contact avec le VIH-1 [89]. Plus récemment, nous avons
observé la présence de Dap-3 sur les vésicules extracellulaires issues des plasmas des
patients infectés au VIH-1 [171].
Dans notre étude, nous nous intéressons à déterminer la présence de Dap-3 dans les
vésicules extracellulaires des cellules en contact avec le VIH-1 et celles du plasma des
patients, afin de montrer éventuellement le rôle de Dap-3 dans la pathogenèse de l’infection
au VIH-1 ou en tant que biomarqueur.
23
Chapitre II : Problématique, hypothèse et objectifs de recherche
1. Problématique
L’interaction entre les cellules dendritiques et les LT CD4+ est nécessaire pour le
déclenchement de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Cependant, plusieurs
mécanismes de dérégulation du système immunitaire sont mis en place, notamment la
déplétion massive des LT CD4+ observée dès le début de l’infection au VIH-1 [35]. Ce qui
empêche l’élaboration d’une réponse immunitaire efficace contre le virus et par conséquent
son élimination, favorisant ainsi sa propagation et l’établissement des réservoirs cellulaires
du VIH-1. Des études ont montré l’effet délétère sur la viabilité des LT CD4+ des exosomes
libérés par les cellules dendritiques ou les LT CD4+ lors de l’infection par le VIH-1 [88, 89,
147]. Cependant, les mécanismes par lesquels les exosomes ou autres types de vésicules
extracellulaires affectent la viabilité des LT CD4+ ne sont pas encore bien élucidés. Une
autre étude au laboratoire a montré la présence de molécules pro-apoptotiques comme le
Dap-3 dans les exosomes provenant des cellules dendritiques stimulées par le VIH-1 [89].
De plus, la présence de Dap-3 dans les vésicules extracellulaires issues des plasmas des
patients infectés au VIH-1 suggère un rôle pour ces vésicules dans le contexte de l’infection
au VIH-1 et peut-être dans l’évolution de la pathogenèse [147].
2. Hypothèse de recherche
L’hypothèse proposée pour ce projet de recherche est que le Dap-3 peut être contenu dans
les exosomes et autres types de vésicules extracellulaires et participe à la pathogenèse en
favorisant la déplétion des LT CD4.
24
3. Objectifs
Pour répondre à notre hypothèse, trois objectifs ont été définis :
Objectif 1 : Déterminer la présence de Dap-3 dans les différents types de vésicules
extracellulaires issues des cellules infectées au VIH-1.
Objectif 2 : Déterminer la présence de Dap-3 dans les différents types de vésicules
extracellulaires provenant des plasmas de patients infectés au VIH-1.
Objectif 3 : Déterminer le rôle de Dap-3 dans l’activation de l’apoptose des LT CD4 par
les vésicules extracellulaires.
25
Chapitre III : Matériel et Méthodes
1. Patients
Les prélèvements sanguins proviennent des patients de la clinique UHRESS (Unité
hospitalière de recherche, d’enseignement et de soins sur le SIDA) de la Dre Sylvie Trottier
au CHU de Québec. Les échantillons sanguins des patients ont été prélevés sur des tubes
contenant soit le citrate de sodium ou l’EDTA en guise d’anticoagulant. Grâce à une série
de centrifugations, les plasmas sont récupérés puis déplaquettés et conservés à -80 °C. Pour
notre analyse, nous avons utilisé les plasmas provenant de deux patients non infectés (CG
107, CG 109), deux patients porteurs du VIH-1 et sous traitement antirétroviral (CG 108,
CG 120) et deux patients porteurs du virus sans aucun traitement (CG 106, CG 111). Les
patients VIH-1+ traités ont des charges virales inférieures à 40 copies du virus/mL de
plasma. Les deux patients VIH-1+ non traités ont des charges virales de 11234 copies du
virus/mL et de 5608 copies du virus/mL (Tableau 3). Tous les participants de cette étude
ont donné un consentement libre et éclairé et cette étude a été approuvée par le comité
d’éthique du CHU de Québec.
2. Réactifs et anticorps
2.1. Réactifs
Le milieu de culture RPMI 1640 1X avec L-glutamine et sodium bicarbonate (Nºcat : 350-000CL), le PBS 1X, la Pénicilline/Streptamycine/L-Glutamine (PSG) et le bleu de trypan ont été
achetés chez Wisent™ (Montréal, Qu, Canada). Le plasmide NL4-3 a été obtenu grâce au
programme AIDS Repository Reagent Program (Germantown, MD). Le polymère ExoQuick™ a
été acheté chez System Biosciences (Mountain View, California). L’Optiprep™ ainsi que les
réactifs acétylthiocholine chloride et le 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acide) ont été acheté chez
Sigma-Aldrich™ (St Louis, Missouri). Les ARNs anti-sens de Dap-3, soit l’AS2 :
5'-TTTCAGCATCATCCTTGC-3' et l’AS3 : 5'-TATTCCTTTCAGCATCAT-3' ainsi que l’ARN
sens Dap-3 : 5'-ATGATGCTGAAAGGAATA-3' ont été achetés chez Integrated DNA
Technologies (Skokie, Illinois). L’oligofectamine et l’Optimem reduced serum medium ont été
26
acheté chez Life Technologies (Carlsbad, California). Les Signal Boost immunoreaction
Enhancers pour les anticorps primaires et secondaires ont été achetés chez EMD Millipore™
(Darmstadt, Germany). Le Luminata Forte a été acheté chez Fisher Scientific (Waltham,
Massachusetts) et l’Enhanced Chemiluminescence Substrate (ECL) a été acheté chez Perkin
Elmer (Waltham, Massachusetts). Le kit Stemsep Human CD14 Selection Kit a été acheté chez
STEMCELL Technologies (Vancouver, BC, Canada). Le sérum de veau fœtal (SVF) est acheté
chez Sigma (NºCat : F-1051, St. Louis, Missouri) puis ultracentrifugé à 100 000 xg pour avoir un
sérum dépourvu de vésicules extracellulaires (SVFU). La primocine (NºCat : ANT-PM-2) et le
plasmocine (NºCat : ANT-MPP) ont été achetés chez InvivoGen (San Diego, California).
2.2. Anticorps
Les anticorps anti-LAMP-2 (sc-18822), l’anti-Alix (sc-53538), l’anti-Hsp-70/HSC-70 (sc-24),
l’anti-ICAM-1 (sc-8439) et l’anti-actine (sc-1616) ont été achetés chez Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA). L’anticorps anti-Dap-3 (610662) a été acheté chez BD
Biosciences (Mississauga, ON, Canada). L’anti-goat IgG (Immunoglobuline G) couplé à la
peroxydase (AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey) a été acheté chez Jackson ImmunoResearch
(Baltimore Pike, PA). L’anti-p24 (hybridome 183-H12-5C) a été obtenu grâce au programme
AIDS Repository Reagent Program (Germantown, MD).
3. Culture cellulaire
3.1. Cellules RAJI CD4 DCIR
Nous avons utilisé une lignée cellulaire dérivée des lymphocytes B transfectée avec le gène
codant pour le CD4 [172, 173], pour donner des cellules RAJI CD4. Cette lignée cellulaire
permissive pour l’infection avec les virus X4 a ensuite été transfectée avec un autre vecteur
MSCV-IRES-eGFP portant l’ADNc codant pour le DCIR humain, un récepteur de lectine
de type-C présent dans les cellules dendritiques [49] rendant ainsi ce modèle cellulaire plus
proche du phénotype des cellules dendritiques humaines.
Les cellules RAJI CD4 DCIR ont été mises en culture à une concentration de 2 x 105
cellules/mL à 37°C avec 5% de CO2, dans du milieu RPMI complet comprenant 10 % de
SVFu et 1% de PSG. Deux jours après l’ensemencement des cellules, un volume du milieu
27
RPMI complet est ajouté pour une dilution de la suspension cellulaire volume/volume.
Deux jours après l’ajout du milieu, le passage suivant des cellules est réalisé. Ce dernier
consiste en la collecte de la suspension des cellules dans un tube de 15 ou 50 mL, suivie
d’une centrifugation à 300 xg pendant 5 minutes. Les cellules sont ensuite resuspendues
dans le milieu RPMI complet avec 10 % du SVFU et 1% de PSG. Les cellules vivantes
sont ensuite comptées grâce à leur capacité à exclure le colorant bleu de trypan.
3.2. Cellules dendritiques
Les cellules dendritiques proviennent de la différenciation des monocytes CD14+ purifiés à
partir des PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cell) tel que décrit [174]. Brièvement,
ces dernières sont obtenues à la suite d’une centrifugation du sang veineux à 380 xg sur un
coussin de Lymphoprep™. Les monocytes CD14+ sont séparés des PBMCs grâce au kit
Stemsep Human CD14 Selection Kit (STEMCELL Technologies) et l’appareil autoMACS®
de (Miltenyl Biotech). Les monocytes CD14+ sont mis en culture dans le milieu RPMI avec
10 % de SVFU, 1% de PSG, 0,5% de primocin et 0,1% de plasmocin. Afin de permettre la
différenciation des monocytes CD14+, le GM-CSF (1000U/mL) et l’IL-4 (250 U/mL) sont
ajoutés aux deux jours. Les cellules sont gardées en culture dans des plaques de 6 puits à
37°C et 5% CO2. Les monocytes CD14+ dérivés en cellules dendritiques immatures et
peuvent être utilisés à partir du 5e jour [175].
4. Immunobuvardage
Les échantillons cellulaires et les vésicules extracellulaires ont été mélangés à volume égal
avec le tampon d’échantillon ou le sample buffer Laemmli modifié concentré 2 X (SB 2x) à
100°C au moment de l’ajout des échantillons et incubé pendant 7 minutes tel que décrit
[176]. Les échantillons sont ensuite déposés sur un gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) de 10% de polyacrylamide. Les protéines sont
transférées à 100 V sur une membrane Immunoblot PVDF (Polyvinylidene Difluoridede)
0,22 µm pour immunotransfert. La qualité du transfert est appréciée grâce à une coloration
au rouge de Ponceau. Les sites non spécifiques de la membrane sont ensuite bloqués avec
28
une solution contenant du lait en poudre à 5% dans le tampon de TBS (Tris Buffer Saline)
0,1 % de Tween 20 (TBS/T 0,1%). Les anticorps anti-Dap-3 (BD®) (1/100), anti-Lamp-2
(1/100), anti-Alix (1/100) et anti-p24 (1/500) sont dilués dans le tampon TBS/T 0,1% et
sont incubés avec la membrane pour la nuit à 4°C. Les membranes sont lavées trois fois
pendant 5 minutes avec le tampon TBS-T 0,1%, suivi de l’incubation avec l’anticorps
secondaire, un anti-souris couplé avec la horseradish peroxydasse (HRP) dilué à 1/10 000
dans le lait 5% pendant 30 minutes. Les membranes sont lavées trois fois avec le tampon
TBS/T 0,1 % pendant 10 minutes. Les protéines ayant réagi avec les anticorps sont ensuite
révélées avec le Luminata Forte ou l’ECL incubé pendant 5 minutes.
5. Caractérisation des vésicules extracellulaires
Purification des vésicules extracellulaires avec ultracentrifugation
La suspension cellulaire est centrifugée avec une vitesse de 300 xg. Le surnageant est
récupéré puis filtré avec un filtre de 0,22 µm afin d’éliminer une grande partie des
microvésicules. Le surnageant filtré est ultracentrifugé à une vitesse de 100 000 xg pendant
45 minutes avec l’ultracentrifugeuse Sorvall WX Ultra Series centrifuge (Thermo Fisher
Scientific) et le rotor T1250 afin de concentrer les vésicules extracellulaires. Suivi d’un
lavage avec du PBS 1X stérile et une deuxième ultracentrifugation à 100 000 xg pendant 45
minutes. Le culot 100 000 xg contenant les vésicules extracellulaires est resuspendu dans le
PBS 1X stérile tel que décrit [177].
Purification des vésicules extracellulaires par l’ExoQuick™
Les prélèvements sanguins des patients VIH-1+ et VIH-1- sont centrifugés à 300 xg pendant
10 minutes afin de séparer le plasma du reste du sang. Les plasmas sont centrifugés à 3200
xg pendant 15 minutes afin d’éliminer les plaquettes. Brièvement, afin de précipiter tous les
types de vésicules extracellulaires, 250 µL de plasmas déplaquettés sont incubés avec 63
µL d’ExoQuick™ selon les recommandations du fabricant [178]. Ce mélange est incubé
pendant 30 minutes à 4°C suivis d’une centrifugation à 1500 xg pendant 30 minutes à 4º.
29
Le culot est lavé au PBS 1X stérile suivi d’une centrifugation à 1500 xg à 4°C pendant 5
minutes telles que décrit [171] et repris dans 250 µL de PBS 1X stérile [124].
Séparation des vésicules extracellulaires par gradient de vélocité
Un culot 100 000 xg de vésicules ou encore quatre préparations de vésicules de plasma sont
déposées sur un gradient composé de 11 fractions d’iodixanol ou Optiprep™ allant de 6% à
18% [171]. Les gradients et les échantillons sont ultracentrifugés à 180 000 xg pendant 50
minutes à 4°C avec l’ultracentrifugeuse Sorvall WX Ultra Series centrifuge et le rotor
65V13. Les fractions sont récupérées pour les différentes analyses : à savoir l’évaluation de
l’abondance des exosomes analysées par la mesure de l’activité acétylcholine estérase, le
rayon hydrodynamique mesuré grâce au nanosizer et les protéines par immunobuvardage.
Pour l’analyse des protéines, un volume de chaque fraction est précipité avec le TCA
(Trichloroacetic acid) et les échantillons sont entreposés à -80°C pendant une nuit. Par la
suite, ce mélange est centrifugé à 18 000 xg pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est
retiré suivi de deux lavages à l’éthanol 100% avec une centrifugation à 18 000 xg pendant
10 minutes à 4°C. Les culots sont lysés avec un tampon de lyse 1X pour perforer les
membranes des vésicules et libérer le contenu protéique de ces vésicules. Ce mélange est
incubé pendant 5 minutes sur glace. Le SB 2X est ajouté pour la dénaturation des protéines
avant leurs analyses par immunobuvardage tel que décrit [176].
6. Détection des vésicules extracellulaires
6.1. Mesure de l’activité d’acétylcholine estérase
Les exosomes se distinguent des autres types de vésicules par la présence d’une forte
activité d’acétylcholine estérase [89, 123]. La mesure de cette dernière dans les
préparations de vésicules extracellulaires nous indiquera l’abondance des exosomes purifiés
d’un surnageant de suspension cellulaire ou du plasma des patients infectés au VIH-1.
L’acétylcholine estérase hydrolyse l’acétylcholine en acétyle. L’acétyle formé réagit avec
le réactif (5,5-dithiobis (2-nitrobenzoïcacid)) pour donner le 2-nitro-5-thiobenzoate formant
30
ainsi un précipité jaune. Ce dernier sera quantifié par spectrophotométrie à 450 nm et qui
permettra d’évaluer l’activité de l’acétylcholine estérase [124].
La concentration finale du substrat l’acétylcholine est de 1,25 mM dilué dans le PBS à un
pH 8 alors que la concentration finale du réactif 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) est de
0,1 mM dilué dans le PBS à pH 7.
Une courbe standard représentant l’activité AChE en fonction de la concentration protéique
des vésicules extracellulaires bovines est réalisée afin de s’assurer d’un contrôle interne de
mesure pour chacune des expériences.
6.2. Rayon d’hydrolyse dynamique des vésicules extracellulaires mesuré au Zetasizer
Nano ZS (Malvern™)
La mesure de la taille repose sur l’analyse de la diffusion dynamique de la lumière suite à
l’émission du laser dirigé vers l’échantillon contenu dans une cuvette. La propriété des
mouvements browniens de la particule à étudier indique son rayon hydrodynamique qui
détermine la taille de la particule analysée. En effet, plus le mouvement brownien est
intense, plus la taille de la particule est petite. En d’autres termes, les grosses particules
diffusent plus lentement que les petites et ont plus de poids en intensité. Les suspensions
doivent être bien homogénéisés avec la pipette, et ce afin d’éviter la sédimentation des
particules.
7. Transfection des cellules avec des ARN anti-sens anti-DAP3
Les ARN anti-sens Dap3 sont utilisés afin de bloquer l’expression de Dap-3 au niveau posttranscriptionnel. En effet, l’ARN anti-sens utilisés est complémentaire à une partie du brin
d’ARNm
codant
pour
le
Dap-3.
Les
ARNs
anti-sens
utilisés
sont
l’AS2 :5-TTTCAGCATCATCCTTGC-3' et l’AS3 : 5'-TATTCCTTTCAGCATCAT-3'. On
utilise
comme
contrôle
positif
d’expression
de
Dap-3,
les
ARN
sens
5'-ATGATGCTGAAAGGAATA-3' décrits en [179]. 3x106 de cellules RAJI CD4 DCIR
sont ensemencées dans chaque puits d’une plaque de 6 puits à une concentration de
3,75 x 106 cellules/mL dans le milieu RPMI dépourvu de SVFU et de PSG. Concernant les
31
cellules dendritiques, 5 x 105 cellules/mL sont ensemencées dans 1 mL de milieu RPMI
seul dans chaque puits. 400 pmol d’ARN sens Dap-3 et 400 pmol d’ARN anti-sens Dap-3
sont mélangés avec l’Optimem™ et incubés pendant 10 minutes à température ambiante,
L’Optimem™ est un milieu adapté aux transfections des cellules et contient des facteurs de
croissance et des acides aminés. Par la suite, de l’oligofectamine, un agent de transfection
des cellules est ajouté au mélange d’ARN anti-sens et d’Optimem™ et incubé pendant 20
minutes à température ambiante avant de l’ajouter aux cellules RAJI CD4 DCIR ou aux
cellules dendritiques. Après 3h d’incubation à 37°C, du milieu RPMI avec 1% de PSG et
30% de SVFU est ajouté. Après 24h d’incubation à 37°C. Les cellules transfectées sont
récoltées et analysées par immunobuvardage avec les anticorps anti-Dap-3 et anti-actine.
8. Production virale
Une lignée cellulaire Human Embryonic Kidney 293 cells (HEK) est utilisée pour la
production du VIH-1 [180]. Elles sont d’abord ensemencées avec une concentration de
2,3x105 cellules/Ml dans le milieu DMEM complet (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
Après 24h de culture, les cellules sont transfectées avec un plasmide pNL4-3 (X4-tropic) tel
que décrit [181]. On utilise comme contrôle négatif d’infection, des cellules transfectées
avec un plasmide dépourvu du génome du VIH-1 (Mock). Cette transfection se réalise dans
les mêmes conditions que celles du virus VIH-1 NL4.3 (X4-tropic). L’ADN plasmidique
virale ou Mock (40 µg) est ajouté à 62,5 µL de CaCl2 2M et compléter avec 397,5 µL
d’H2O stérile. Cette solution est mélangée avec 500 µL d’HBS 2X (HEPES-buffered
saline) à pH 7 avant d’être incubée pendant 20 minutes à température ambiante. Cette
solution de transfection est ajoutée ensuite aux cellules HEK 293T et ces dernières sont
incubées à 37 °C pendant 16h à 18h maximum. Par la suite, le milieu de culture est enlevé
suivi d’un lavage avec du PBS. Ces dernières sont remises en culture dans le milieu
DMEM et incubées à 37°C pendant 24h. Le milieu de culture contenant les virus produits
est centrifugé. Le surnageant est ensuite filtré sur un filtre de 0,22 µm pour éliminer les
cellules, les débris cellulaires et les microvésicules plus larges que 220 nm. Le surnageant
filtré est ultracentrifugé à 100 000 xg pendant 45 minutes à 4°C. Le culot 100 000 xg
32
contenant le virus est resuspendu dans 400 µL de PBS stérile. Les virus sont aliquotés et
congelés à -80°C.
Infection des cellules RAJI CD4 DCIR
Les cellules RAJI CD4 DCIR sont ensemencées à une concentration de 107 cellules/mL
dans le milieu de culture RPMI complet (avec 10% de SVFU et 1% de PSG). Le virus
NL4.3 (X4-tropic) est ajouté pour une concentration finale de 2,5 ng de p24/100 000
cellules et un volume équivalent du Mock est ajouté. Les mélanges Mock ou virus sont
incubés pendant 2h à 37°C avec les cellules avant d’être centrifugés à 300 xg afin de
concentrer les cellules et d’éliminer les virus libres.
Les culots contenant les cellules sont lavés deux fois avec du PBS stérile. Les cellules
infectées sont reprises dans le milieu RPMI complet à une concentration de 2 x 105
cellules/mL. La culture des cellules infectées est incubée à 37°C pendant 2 jours. Le milieu
RPMI complet est ajouté au troisième jour et incubé pendant 2 jours supplémentaires à
37°C.
33
Chapitre IV : Résultats
1-Optimisation de l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3
La caractérisation du Dap-3 vésiculaire était peu avancée et les conditions
d’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 devaient être optimisées avant de débuter notre
étude. Nous voulions plus spécifiquement déterminer la limite de détection de cette
technique et aussi diminuer considérablement la concentration de l’anti-Dap-3 qui était
utilisé à une dilution 1/100 dans le laboratoire. De nombreux réactifs disponibles
commercialement peuvent être utilisés afin d’augmenter le signal d’immunobuvardage.
Pour notre étude, nous avons sélectionné deux d’entre eux. Un produit qui augmente la
réactivité des anticorps et un second qui est un agent de révélation plus puissant (Luminata
Forte). Les différentes conditions d’immunobuvardage ont été réalisées sur les cellules
RAJI CD4 DCIR provenant d’une infection au VIH-1. Ces cellules sont diluées à 2x107
cellules/mL dans le SB 2X tel que décrit dans la section Matériel et Méthodes. Par la suite,
elles ont été diluées dans le SB 1X. Le nombre de cellules et la quantité de protéines
correspondant à un dépôt de 10 µL de chaque dilution de cellules sont présentés dans le
tableau 3.
Dilution des cellules
1/10
1/20
1/50
1/100
Nombre de cellules*106 /mL
2
1
0.4
0.2
Concentration des protéines
(µg/mL)
4825
2425
985
505
Nombre de cellules dans 10 µL
20 000
10 000
4000
2000
Concentrationdes protéines
(µg/mL) dans 10µL
73
49
35
30
Tableau 3 : Quantité de protéines pour chaque dilution de cellules utilisées dans la
mise au point de l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3
Nous avons en premier lieu testé comme diluant des anti-Dap-3 et des anticorps
secondaires le Signal Boost Immunoreaction Enhancers qui améliore la réaction entre
l’antigène et son anticorps. En effet, l’Enhancer permet de résoudre les problèmes liés à la
faible sensibilité et la présence de bruit de fond souvent rencontré lors de
34
l’immunobuvardage de protéines très peu présentes et conçues aussi pour les anticorps
ayant une faible affinité. Différentes combinaisons avec les Enhancers et les anticorps
primaires et secondaires sont réalisées. Les résultats présentés à la figure 2 montrent que
l’immunobuvardage réalisé lorsque l’anti-Dap-3 est dilué dans le Enhancer ou seulement le
second anticorps dilué dans le Enhancer permet de détecter faiblement le Dap-3 dans 4000
cellules (panneaux centraux versus le premier). De plus, la dilution de l’anti-Dap-3 ainsi
que l’anticorps secondaire dans le Enhancer donne un fort signal dans 4000 cellules (Figure
2, dernier panneau).
Figure 2 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 avec ou sans utilisation d’Enhancer
comme diluant des anticorps. Les cellules RAJI CD4 DCIR (2 x107 cellules/mL) sont
diluées à 1/10, 1/20 et 1/50 dans le SB 1x. 10 µL de chaque dilution de cellules sont
déposés sur le gel SDS-PAGE 10%. L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 dilué à 1/1000
dans le tampon TBS/T (0,1 %) ou dans l’Enhancer pour anticorps primaires. L’anticorps
secondaire de souris, couplé à la peroxydase, est dilué à 1/10000 dans l’Enhancer pour
anticorps secondaires ou dans le tampon TBS/T 0,1% suivi de la révélation enzymatique
avec le Luminata Forte.
En résumé, l’utilisation de l’Enhancer permet d’augmenter sensiblement le signal du
marquage de Dap-3 sans augmenter le bruit de fond. La dilution de l’anti-Dap-3 ainsi que
des anticorps secondaires dans le Enhancer donne un marquage optimal de Dap-3 (Figure
2, dernier panneau).
Par la suite, nous avons comparé les agents de révélation de la réaction enzymatique de
l’oxydation du luminol, un produit qui émet une lumière lorsqu’il est oxydé par la
peroxydase couplée au second anticorps. Les deux produits testés sont l’ECL (Enhanced
Chemiluminescence substrate) et le Luminata Forte.
35
Figure 3 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 et révélation avec le Luminata Forte
ou l’ECL. Les cellules RAJI CD4 DCIR (2 x107 cellules/mL) sont diluées à 1/10, 1/20 et
1/50 dans le SB 1x. 10 µL de chaque dilution de cellules sont déposés sur le gel SDSPAGE 10%. L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 a été réalisé avec l’anti-Dap-3 dilué à
1/1000 dans l’Enhancer pour anticorps primaires. L’anticorps secondaire couplé à la
peroxydase est dilué à 1/10 000 dans l’Enhancer pour anticorps secondaires suivi de la
révélation enzymatique avec le Luminata Forte ou le ECL.
L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 présenté à la figure 3 confirme la supériorité du
Luminata Forte vis-à-vis de l’ECL.
Parfois, l’augmentation du temps de transfert peut augmenter la quantité de matériel sur la
membrane PVDF. Tandis que l’augmentation du temps d’incubation avec le premier
anticorps peut augmenter les chances d’interaction entre l’anticorps primaire et sa protéine.
Figure 4 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 avec différents temps de transfert et
d’incubation avec l’anti-Dap-3. Les cellules RAJI CD4 DCIR (2 x107 cellules/mL) sont
diluées à 1/10, 1/20 et 1/50 dans le SB 1x. 10 µL de chaque dilution de cellules sont
déposés sur le gel d’acrylamide. Les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF
pendant 1,5 h ou 20 h. L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 est réalisé avec l’anti-Dap-3
dilué à 1/1000 dans l’Enhancer pour anticorps primaires et incubés pendant 1h ou 20h.
L’anticorps secondaire couplé à la peroxydase est dilué à 1/10 000 dans l’Enhancer pour
anticorps secondaires suivis de la révélation avec le Luminata Forte.
36
La condition d’immunobuvardage comprenant 20 h de transfert et 1h d’incubation avec
l’anti-Dap-3 donne le meilleur marquage de Dap-3.
Enfin, nous avons testé la nouvelle condition d’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 dilué à
1/1000 dans l’Enhancer et l’anticorps secondaire dilué à 1/10 000 dans l’Enhancer suivi
d’une révélation avec le Luminata Forte. Cette condition a été comparée avec
l’immunobuvardage utilisant une concentration 10 fois plus importante d’anti Dap-3 soit
une dilution de 1/100. Nous avons utilisé comme échantillon une dilution 1/100 des cellules
RAJI CD4 DCIR correspondant à 2000 cellules par puit.
Figure 5 : Immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 avec ou sans enhancer pour l’antiDap-3 et l’anticorps secondaire. Les cellules RAJI CD4 DCIR (2 x107 cellules/mL) sont
diluées à 1/100 dans le SB1x. 10 µL de chaque dilution de cellules sont déposés sur le gel
d’acrylamide. Les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF pendant 1,5 h.
L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 dilué à 1/1000 dans l’Enhancer ou 1/100 dans le
tampon TBS/T 0,1 % et incubé pendant 1h. L’anticorps secondaire couplé à la peroxydase
est dilué à 1/10 000 dans l’Enhancer ou 1/10 000 dans le tampon TBS/T 0,1 % suivi de la
révélation avec le Luminata Forte.
L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 dilué à 1/1000 dans l’enhancer et l’anticorps
secondaire couplé à la peroxydase diluée à 1/10 000 dans l’enhancer nous a permis
d’obtenir un signal similaire à celui de la condition de blot utilisant l’anti-Dap-3 dilué à
1/100 (Figure 2). Cette condition d’immunobuvardage nous permettra d’analyser des
échantillons peu concentrés sans devoir utiliser des concentrations trop grandes d’anticorps
primaires. L’optimisation de cet immunobuvardage nous permettra d’analyser la présence
de Dap-3 sur des échantillons peu concentrés comme les vésicules extracellulaires issues
des cellules infectées tout en réalisant une économie de 58 $ par immunobuvardage.
37
2- L’infection par le VIH-1 favorise la présence de Dap-3 dans les
vésicules extracellulaires des cellules RAJI CD4 DCIR
Précédemment dans notre laboratoire, nous avons observé que les vésicules AChE+ issues
des cellules dendritiques stimulées par le virus contenaient la protéine pro-apoptotique
Dap-3 [89]. Bien que Dap-3 soit présent dans les vésicules AChE+, cela ne signifie pas
qu’elle n’est pas aussi présente dans d’autres types de vésicules. Dans cette partie du projet,
nous nous sommes intéressés à évaluer la présence de Dap-3 sur l’ensemble des vésicules
extracellulaires issues des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1. Pour cela, nous
avons mis en culture les cellules RAJI CD4 DCIR en présence du virus NL4.3 ou du Mock
pendant 4 jours. Les vésicules extracellulaires incluant les virus et les exosomes ont été
récupérés par ultracentrifugation à 100 000 xg. Ces culots de virus et de vésicules
extracellulaires ont été caractérisés par immunobuvardage ainsi que les cellules les ayant
produits. Les résultats sont présentés à la figure 6.
38
Figure 6 : Caractérisation des vésicules extracellulaires issues des cellules RAJI CD4
DCIR infectées au VIH-1. Les cellules RAJI CD4 DCIR ont été cultivées en présence du
virus NL4.3 ou d’un mock pendant 4 jours. Les cellules ont été resuspendues à 2 x 107
cellules/mL dans le SB 2X. Les vésicules extracellulaires incluant les virus ont été purifiés
par ultracentrifugation et resuspendues dans le SB2X. Les immunobuvardages avec les
anticorps dirigés contre des marqueurs de vésicules extracellulaires tels qu’Alix, Lamp-2,
Hsp-70 ainsi que des anticorps anti-Dap-3 et des anticorps dirigés contre la protéine virale
p24 ont été réalisés sur les cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 ou non ainsi que
sur les culots de vésicules. Les résultats sont représentatifs d’au moins trois expériences
indépendantes.
39
Les résultats présentés à la figure 6 indiquent une présence similaire de Dap-3, Lamp-2,
Alix et Hsp-70 sur les cellules RAJI CD4 DCIR incubées avec le virus ou non tandis que la
protéine de la capside virale, la p24 n’est présente que sur les échantillons provenant des
cellules infectées. L’immunobuvardage des vésicules extracellulaires révèle une
augmentation de Lamp-2, d’Alix et de Hsp-70 dans les vésicules provenant des cellules
ayant été incubées avec le virus. Ceci est en accord avec plusieurs observations antérieures
montrant une accumulation des vésicules extracellulaires lors de l’infection. De plus, dans
ce modèle d’infection de lignée cellulaire, on observe aussi la présence de la protéine proapoptotique Dap-3 enrichie dans les vésicules extracellulaires des cellules ayant été en
contact avec le virus. Ces résultats permettent de valider que l’infection au VIH-1 des
cellules RAJI CD4 DCIR augmente l’accumulation des vésicules extracellulaires et que ces
dernières peuvent contenir une protéine pro-apoptotique Dap-3 confirmant ainsi que ce
modèle de lignée cellulaire peut être utilisé pour étudier et caractériser le Dap-3 dans les
vésicules extracellulaires.
3- Présence de Dap-3 dans les différents types de vésicules extracellulaires
issues des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1
Les préparations de vésicules extracellulaires réalisées précédemment (figure 6) ne
permettent pas de savoir si Dap-3 peut être présent dans d’autres types de vésicules que les
exosomes. Une expérience a été réalisée dans le laboratoire par Claude Mfuni et Myriam
Vailancourt. Ils ont cultivé les cellules RAJI CD4 DCIR en présence ou non du virus
pendant 10 jours, avant de purifier l’ensemble des vésicules extracellulaires par
ultracentrifugation suivi d’une séparation avec le gradient de vélocité.
Figure 7 : Présence de Dap-3 dans les fractions du gradient de vélocité issues des
vésicules extracellulaires des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1. Les cellules
RAJI CD4 DCIR ont été cultivées en présence du virus NL4.3 ou d’un mock pendant 10
40
jours. Les surnageant de culture cellulaire ont été récupérés et ultracentrifugés à 100 000 xg
suivi d’une séparation des vésicules extracellulaires avec le gradient de vélocité. Un
immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 a été réalisé sur les fractions du gradient (cette
expérience a été réalisée par Claude Mfuni et Myriam Vaillancourt).
Cette expérience préliminaire révèle une plus grande quantité de Dap-3 dans les fractions
du gradient issues des cellules cultivées en présence du virus (Figure 7). En plus d’être
présent dans les fractions correspondant aux exosomes, le Dap-3 est enrichi dans la fraction
15,6 % des vésicules provenant de la culture en absence du virus ainsi que les dernières
fractions 14,4 %, 15,6%, 16,8% et 18% du gradient issues des cellules en culture avec le
virus. Ceci nous suggère la présence de Dap-3 dans des vésicules qui pourraient être des
vésicules apoptotiques (Figure 7).
4-Caractérisation des vésicules extracellulaires issues des plasmas des
patients infectés au VIH-1
La détection de la présence de Dap-3 dans les vésicules extracellulaires provenant des
plasmas des patients infectés au VIH-1 [147] soulève la question suivante : est-ce que le
Dap-3 est présent dans uniquement chez les exosomes et/ou aussi chez d’autres types de
vésicules dans les plasmas des patients VIH-1. Dans un premier temps, nous avons
caractérisé les vésicules extracellulaires issues des plasmas des patients infectés au VIH-1,
en déterminant la présence et l’abondance des vésicules extracellulaires dans les plasmas
des patients infectés au VIH-1 par immunobuvardage avec des anticorps dirigés contre les
marqueurs de vésicules (figures 8-9). Ensuite, grâce au gradient de vélocité nous avons
évalué l’abondance des exosomes par la mesure de l’activité de l’acétylcholine estérase
(figure 10). Enfin l’hétérogénéité des vésicules extracellulaires a été estimée par la mesure
du rayon hydrodynamique des différents types de vésicules extracellulaires (figures 11-12).
Malheureusement, les immunobuvardages avec l’anti-Dap-3 n’ont pas donné de résultats
satisfaisants pour le moment.
Des plasmas de sujets non infectés et de sujets infectés au VIH-1 sous traitement
antirétroviral ou non ont été utilisés pour cette partie de l’étude afin de répondre au second
objectif. Les différents paramètres cliniques des patients sont présentés dans le tableau 4.
41
Les vésicules ont été purifiées en utilisant le produit ExoQuick™ tel que décrit dans le
chapitre Matériel et Méthodes.
Sujets
Numéro du sujet
Charge virale (nombre de copies/mL)
Nombre d'années d'infection
CD4 (cellule/µL)
CD8 (cellule/µL)
Ratio CD4/CD8
VIH-1
Neutrophiles (109 /L)
-
+
107
-
109
-
ND
ND
ND
ND
ND
ND
VIH-1 non traités
106
111
11 234
5608
10
12
395
470
597
1070
0,66
0,44
4000
2600
+
VIH-1 traités
108
120
<40
<40
13
15
594
650
685
480
0,87
1,37
2400
270
ND
ND
9
ND
ND
600
312
500
40
9
ND
ND
35
homme
34
femme
144
31
homme
265
50
femme
143
31
homme
148
42
homme
Monocytes (10 /L)
Plaquettes (10 /L)
Age (ans)
Genre
Tableau 4 : Caractéristiques cliniques des sujets
4-1- Étude comparative de la présence des vésicules extracellulaires issues des plasmas
des patients infectés au VIH-1
Afin d’évaluer la présence des vésicules extracellulaires dans les plasmas des patients
infectés au VIH-1 ou non, nous avons réalisé un immunobuvardage avec des anticorps
contre les marqueurs des vésicules extracellulaires tels que Alix et ICAM-1.
Figure 8 : Détection des marqueurs d’exosomes et de membrane plasmique sur les
vésicules extracellulaires. Les plasmas déplaquettés de 2 sujets VIH-1- , 2 sujets VIH-1+
non traités et 2 sujets VIH-1+ traités sont incubés avec l’agent précipitant l’ExoQuick tels
que décrits dans les matériels et méthode. Un immunobuvardage avec l’anti-Alix et l’anti42
ICAM-I a été réalisé sur les préparations de vésicules extracellulaires purifiées à partir des
plasmas de chaque participant.
L’immunobuvardage avec les anticorps dirigés contre la protéine Alix (un marqueur
d’exosome) révèle la présence d’exosomes dans tous les échantillons de vésicules des
plasmas des sujets VIH-1- et VIH-1+. Par contre, l’immunobuvardage avec un anti-ICAM-1
révèle une présence plus importante d’ICAM-1 dans les vésicules des patients VIH-1+
traités ou non en comparaison avec les vésicules des sujets VIH-1- (Figure 8). Ce qui
suggère une présence plus grande des vésicules extracellulaires issues des plasmas des
sujets VIH-1+ qui ne sont pas nécessairement des exosomes. Ceci conforte le premier
résultat du projet montrant l’augmentation de l’accumulation des vésicules extracellulaires
libérées par les cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 en comparaison avec les
cellules non infectées. L’augmentation de l’abondance des vésicules extracellulaires des
plasmas des patients infectés au VIH-1 a également été observée via la mesure de l’activité
d’acétylcholine estérase et de l’immunobuvardage avec l’anti-TSG101 [171].
Ces résultats illustrent la variabilité entre les sujets et soulèvent le point de l’hétérogénéité
au niveau de la présence d’ICAM-1 dans les vésicules extracellulaires. Ceci s’explique par
le fait que la protéine ICAM-1 peut se retrouver dans un état soluble. Par contre, la
présence du marqueur d’exosome Alix sur les vésicules extracellulaires des plasmas est
assez similaire entre les donneurs de chaque catégorie de patients. L’utilisation du gradient
de vélocité pour séparer les différents types de vésicules et le nanosizer pour mesurer la
taille pourrait être informatif sur l’hétérogénéité des vésicules plasmatiques tel que décrit
[171].
Nous avons analysé la présence de vésicules extracellulaires en marquant par
immunobuvardage la protéine ICAM-I un des marqueurs de ces vésicules sur les fractions
du gradient de vélocité issues de plasma du 1er sujet VIH-1+ non traité Nº106 (voir tableau
4). C’est une analyse complémentaire avec le nanosizer afin de confirmer la présence des
vésicules sur les fractions du gradient de vélocité issues des plasmas des patients. Les
résultats représentatifs de l’immunobuvardage d’ICAM-I sur les fractions du gradient sont
représentés dans la figure 9.
43
Iodixanol
[%]
6
7,2
8,4
9,6
10,8
12
13,2
14,4
15,6
16,8
18
ICAM-I
Figure 9 : Présence d’ICAM-1 dans les fractions du gradient de vélocité. Un
immunobuvardage d’ICAM-I a été réalisé sur les fractions du gradient de vélocité issues
des préparations de vésicules extracellulaires des plasmas du 1er sujet VIH-1+ non traité
Nº106 (voir tableau 4).
L’immunobuvardage avec l’anti-ICAM-I révèle la présence d’ICAM-I dans les fractions
6%, à 10,8% avec une plus grande quantité dans les fractions 7,2 et 8,4 (Figure 9). Les
fractions enrichies en ICAM-I ne correspondent pas aux fractions les plus positives pour
l’AChE comme les fractions 9,6%, 10,8% et 12%. Puisque l’ICAM-1 peut aussi être sous
une forme soluble, il est possible que ces premières fractions correspondent aux récepteurs
solubles et/ou aux agrégats de protéines.
4-2- Analyse de l’abondance d’exosomes par la mesure de l’activité d’acétylcholine
estérase
Afin d’évaluer l’abondance des exosomes, les vésicules AChE+ dans les plasmas des
patients infectés ou non, nous avons mesuré l’activité de l’acétylcholine estérase sur les
fractions du gradient de vélocité issues des préparations de vésicules extracellulaires des
différents plasmas.
44
50
Sujet VIH-1 Sujet VIH-1 + non traités
Sujet VIH-1 + traités
Vmax AChE
DO=450nm
40
30
20
10
18
16.8
15.6
14.4
13.2
12
10.8
9.6
8.4
7.2
6
0
Iodixanol [%]
Figure 10 : Analyse de l’abondance des exosomes sur les fractions du gradient de
vélocité issues des préparations de vésicules extracellulaires des plasmas des patients
infectés au VIH-1. Les plasmas déplaquettés de 2 sujets VIH-1- , 2 sujets VIH-1+ non
traités et 2 sujets VIH-1+ traités sont mélangés avec l’ExoQuick™ et centrifugé à 1500 xg,
les culots de vésicules sont déposés sur les gradients de vélocité. Ces derniers sont
ultracentrifugés à 180 000 xg. L’abondance des exosomes dans les fractions du gradient de
vélocité est analysée par la mesure de l’activité d’acétylcholine estérase.
La mesure de l’activité d’acétylcholine estérase a été réalisée sur chacune des fractions du
gradient. Les résultats présentés à la figure 10 confirment que le gradient de vélocité a bien
séparé les exosomes AChE+. De plus, on note aussi une quantité plus grande d’exosomes
sur les fractions provenant des plasmas des patients infectés au VIH-1 non traités aux
antirétroviraux en comparaison avec celles des patients non infectés (Figure 10). La
présence de plus de vésicules AChE+ dans les plasmas de patients infectés par le VIH-1
mais non-traités est en accord avec nos précédentes observations montrant une
accumulation des exosomes libérés par les cellules infectées au VIH-1 [170] ainsi que le
résultat montrant l’augmentation de l’abondance des vésicules extracellulaires sur les
préparations de vésicules extracellulaires issues des plasmas des patients infectés au VIH-1
[171].
45
Bien que la mesure de l’activité d’acétylcholine estérase permet de quantifier les exosomes
dans les différentes fractions du gradient, cela ne signifie pas qu’elles sont les seuls types
de vésicules extracellulaires dans le plasma.
4-3-Mesure de la taille des vésicules extracellulaires avec le nanosizer
Afin de déterminer la présence d’autres types de vésicules extracellulaires, une analyse
avec le nanosizer a permis de déterminer la taille et l’hétérogénéité des vésicules de chaque
fraction du gradient. Les résultats de la mesure du rayon hydrodynamique sont présentés
dans les figures 11 et 12.
Nous avons comparé l’effet de deux anticoagulants le citrate de sodium et l’EDTA utilisés
sur les prélèvements sanguins et les tailles des vésicules extracellulaires purifiées des
plasmas d’un patient VIH-1+.
46
A
Citrate
B
EDTA
Figure 11 : Distribution des vésicules extracellulaires dans le gradient de vélocité
analysées au nanosizer. Les vésicules extracellulaires des plasmas déplaquettés du 1er
sujet VIH-1+ prélevés suite aux traitements des prélèvements sanguins avec le citrate de
sodium (A) ou l’EDTA (B) sont purifiées avec l’ExoQuick™ et séparées avec le gradient
de vélocité. Les tailles des vésicules extracellulaires de chaque fraction du gradient ont été
analysées avec le nanosizer.
L’analyse des tailles des vésicules extracellulaires séparées par le gradient de vélocité
issues du 1er sujet VIH-1+ non traité révèle la présence de particules dans la fraction 16,8 et
18 % qui ont une taille moyenne autour de 100 nm (Figure 11). On observe également la
47
présence des vésicules ou des résidus de vésicules qui ont une taille de 48 nm de moyenne.
Les particules ayant une taille inférieure à 10nm représentent l’iodixanol utilisé dans le
gradient de vélocité. Curieusement, les fractions 10,8%, 12% et 13,2% du gradient issues
des prélèvements sanguins préalablement traités avec l’anticoagulant citrate révèle un
pourcentage plus grand en vésicules ayant une taille comprise entre 259 nm et 325 nm en
comparaison avec les fractions 10,8%, 12% et 13,2% du gradient issues des prélèvements
sanguins préalablement traités avec l’anticoagulant EDTA (Figure11, A et B).
Le nanosizer permet une analyse qualitative en mesurant les tailles des vésicules présentes.
Afin d’identifier la présence de chaque type de vésicules extracellulaire dans chaque
fraction
du
gradient,
des
analyses
supplémentaires
sont
requises
comme
l’immunobuvardage avec des marqueurs d’exosomes comme Alix, TSG-101 ou de
vésicules extracellulaires comme ICAM-I. L’observation des vésicules au microscope
électronique permet de confirmer leurs présences.
Par la suite, les mesures de la taille des vésicules présentes dans les fractions du gradient de
chaque patient ont été réalisées deux fois et la moyenne de la taille des pics majeurs pour
chaque fraction du gradient est présentée dans la figure 12.
48
Sujets VIH-1-
Sujet 107
1000
Diamètre (nm)
Diamètre (nm)
1000
100
100
10
6
7,
2
8,
4
9,
6
10
,8
12
13
,2
14
,4
15
,6
16
,8
18
6
7,
2
8,
4
9,
6
10
,8
12
13
,2
14
,4
15
,6
16
,8
18
10
Iodixanol [%]
Iodixanol [%]
Sujet 106
Sujets VIH-1+ non traités
Diamètre (nm)
100
10
100
6
7,
2
8,
4
9,
6
10
,8
12
13
,2
14
,4
15
,6
16
,8
18
7,
2
8,
4
9,
6
10
,8
12
13
,2
14
,4
15
,6
16
,8
18
6
10
Iodixanol [%]
Iodixanol [%]
Sujets VIH-1+ traités
Sujet 108
Sujet 120
1000
Diamètre (nm)
1000
Diamètre (nm)
Sujet 111
1000
1000
Diamètre (nm)
Sujet 109
100
100
10
6
7,
2
8,
4
9,
6
10
,8
12
13
,2
14
,4
15
,6
16
,8
18
6
7,
2
8,
4
9,
6
10
,8
12
13
,2
14
,4
15
,6
16
,8
18
10
Iodixanol [%]
Iodixanol [%]
Figure 12 : Caractérisation de l’hétérogénéité des vésicules extracellulaires issues de
plasmas des patients infectés au VIH-1 ou non. Les vésicules des plasmas déplaquettés
de 2 sujets VIH-1- (A et B), 2 sujets VIH-1+ non traités (C et D) et 2 sujets VIH-1+ traités
(E et F) ont été purifiées avec l’ExoQuick™ et séparées avec le gradient de vélocité. Les
tailles des vésicules extracellulaires de chaque fraction du gradient ont été analysées avec le
49
nanosizer. Chaque mesure a été réalisée deux fois et la moyenne de la taille des pics
majeurs est présentée dans ces graphiques.
L’analyse avec le nanosizer des fractions du gradient des différentes catégories de patients
a permis de détecter la présence de différentes populations de vésicules réparties dans
toutes les fractions du gradient confirmant une hétérogénéité des vésicules extracellulaires
présentes dans les plasmas. Une certaine hétérogénéité est aussi observée entre les
différentes catégories de patient. Par contre, les vésicules retrouvées dans les dernières
fractions du gradient sont généralement plus grandes que celles présentes dans les
premières fractions.
En comparant les dernières fractions 15,6%, 16,8% et 18% du gradient de vélocité entre les
groupes de donneurs, on note la présence des particules de 100 nm correspondant
possiblement aux particules virales. Cependant, les particules de 100 nm de taille sont
présentes également dans les dernières fractions du gradient des sujets VIH-1-. Ce qui
indique que les particules de taille de 100 nm n’incluent pas seulement les particules
virales, mais aussi d’autres types de vésicules extracellulaires. Quant aux autres fractions
du gradient, il est difficile de tirer des conclusions en raison de la variabilité présente au
sein du même groupe de donneurs.
La présence de différentes populations de vésicules réparties dans les fractions du gradient
indique que le gradient de vélocité sépare différents types de vésicules extracellulaires.
Ceci est conforté par le fait qu’on observe souvent la présence de grandes vésicules de taille
supérieure à 200 nm dans les dernières fractions du gradient généralement de la fraction
14,4 à la fraction 18%. Alors que dans les premières fractions 6 et 7,2%, on observe plus
souvent la présence de particules de tailles inférieure à 40 nm correspondants peut être aux
complexes protéines.
Ceci est conforté par la présence d’ICAM-I dans les premières fractions du gradient
déterminées par immunobuvardage (Figure 9). L’ICAM-I peut être sous la forme dite
soluble dans le plasma et peut ainsi se retrouver dans les fractions du gradient. Dans les
fractions 8,4%, 9,6%, 10,8% et 12%, on note plus souvent la présence de vésicules ayant
une taille variable entre 50 et 150 nm de diamètre (Figure 12).
50
4-4- Détection de Dap-3 dans les fractions du gradient.
L’objectif final de cette analyse était de réaliser un immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 sur
les différentes fractions du gradient. Bien que nous ayons optimisé l’immunobuvardage
avec l’anti-Dap-3 sur les échantillons de cellules, la détection de Dap-3 dans les différentes
fractions du gradient demandera encore quelques mises au point. En effet,
l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 sur les différentes fractions du gradient montrait des
bandes non spécifiques correspondant peut être à la présence des anticorps secondaires antisouris couplés à la peroxydase qui se fixeraient sur les immunoglobulines humaines issues
des plasmas. Pour éviter ce marquage non spécifique de Dap-3, il est suggéré de saturer
d’abord les sites non spécifiques des immunoglobulines avec des anticorps anti-IgG non
couplés à la peroxydase avant de procéder au marquage de Dap-3. Ou encore, utiliser les
anticorps (TrueBlot®) qui reconnaissent les immunoglobulines natives pour bloquer les
sites non spécifiques de ces derniers.
5- Mise au point du modèle de transfection avec les ARNs anti-sens Dap-3
Afin de confirmer le rôle du Dap-3 vésiculaire dans l’infection au VIH-1 et de répondre à
notre troisième objectif, nous avons transfecté des cellules RAJI CD4 DCIR et des cellules
dendritiques avec les ARNs anti-sens Dap-3 [179]. Les cellules sont incubées en présence
des ARNs anti-sens Dap-3 AS2, AS3 et d’ARN sens contrôle ou d’H2O pendant 24h. On
utilise comme contrôle négatif de transfections des cellules, l’oligofectamine, un agent de
transfection utilisé dans nos expériences. Après 24h d’incubation, les cellules sont
récupérées et analysées par immunobuvardage avec un anticorps anti-Dap-3 et les quantités
déposées sont normalisées grâce à un second immunobuvardage avec un anticorps antiactine. Les analyses semi-quantitatives des autoradiogrammes ont été réalisées avec le
logiciel Image Lab.
La compilation des analyses est présentée à la figure 13 et une illustration représentative
des autoradiogrammes est aussi présentée.
51
Figure 13 : Effet des ARNs anti-sens de Dap-3 sur l’expression de Dap-3. Pour chaque
condition de transfection, 3x106 de cellules RAJI CD4 DCIR et 0,5x106 de cellules
dendritiques ont été incubées pendant 24h avec 400 pmol d’ARN anti-sens Dap-3 AS2,
AS3 ou l’ARN sens Dap-3. Ces conditions de transfection ont été réalisées trois fois avec
les cellules RAJI CD4 DCIR et une fois avec les cellules dendritiques.
L’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 a été réalisé une fois sur les cellules RAJI CD4
DCIR transfectées pour chacune des expériences et deux fois sur l’expérimentation réalisée
avec les cellules dendritiques. Une lecture de la mesure de l’intensité des bandes des
autoradiogrammes de chaque condition de transfection a été réalisée avec Image Lab. Le
calcul des ratios des intensités de signal de marquage de Dap-3 sur celui de l’actine nous
permet de comparer les différentes conditions de transfections.
Les résultats obtenus suite à la transfection des cellules RAJI CD4 DCIR (panneau de
gauche) avec les deux ARNs anti-sens Dap-3 montrent une diminution du ratio de Dap3/actine sur les cellules transfectées en comparaison avec les cellules non transfectées
(H2O). Cependant, l’ARN sens Dap-3 affecte aussi l’expression de Dap-3 (Figure 13). Des
tests supplémentaires sur un autre lot d’ARN sens de Dap-3 seront nécessaires afin de
valider le contrôle négatif de transfection.
Dans les cellules dendritiques transfectées avec l’ARN anti-sens de Dap-3 (panneau de
droite), on observe une diminution du ratio de Dap-3/actine en comparaison avec les
52
cellules dendritiques transfectées avec l’ARN sens Dap-3 (Figure 13). Cependant, la
concentration d’ARN permettant un blocage d’expression de Dap-3 pendant plus de 24h
reste à déterminer afin d’appliquer ce modèle de transfection dans d’autres expériences
comme dans l’étude des vésicules extracellulaires Dap-3+ qui sont libérées généralement
par les cellules dendritiques dès le 2e jour d’infection.
53
Chapitre V : Discussion
L’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1 est principalement causée par la déplétion
des LT CD4 [182, 183]. Plusieurs facteurs sont associés à cette mort cellulaire comme la
lyse des LT CD4 infectés ou l’activation de l’apoptose par les vésicules extracellulaires
libérées par les cellules dendritiques et les LT CD4 [88, 89].
Les exosomes issus des cellules dendritiques cultivées en présence du VIH-1 affectent aussi
la survie des LT CD4 [89]. De plus, l’analyse protéomique de ces exosomes issus des
cellules infectées a révélé la présence de molécules pro-apoptotiques comme Apaf-1 et
Dap-3 [89]. Cependant, les exosomes ne sont pas les seuls types de vésicules
extracellulaires. De plus, la présence des molécules pro-apoptotiques dans les autres types
de vésicules n’est pas encore déterminée. Ce qui nous a amené à émettre l’hypothèse que
des molécules pro-apoptotiques comme Dap-3 empaquetée dans les exosomes ou autres
types de vésicules pouvait contribuer à la déplétion des LT CD4 avoisinants.
Nous avons déterminé la présence de Dap-3 sur les vésicules extracellulaires issues des
cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 grâce à l’immunobuvardage optimisé avec
l’anti-Dap-3. La séparation des vésicules extracellulaires par le gradient de vélocité a
permis de montrer la présence de Dap-3 dans les fractions du gradient contenant les
exosomes issus des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 et également dans des
fractions du gradient de vélocité qui correspondent aux fractions positives pour le virus. La
mise au point de la transfection des cellules RAJI CD4 DCIR et des cellules dendritiques
avec les ARN anti-sens Dap-3 a permis de visualiser par immunobuvardage une diminution
de l’expression des Dap-3 sur les cellules RAJI CD4 DCIR et les cellules dendritiques. Les
modèles cellulaires, les anticorps et les anti-sens sont validés pour poursuivre cette
recherche sur le rôle de Dap-3 dans la pathogenèse.
Chez les patients, nous avons observé une hétérogénéité des vésicules extracellulaires dans
les fractions du gradient de vélocité issues des plasmas des patients infectés au VIH-1.
Cependant, la détection de Dap-3 dans ces différentes fractions du gradient nécessite encore
quelques mises au point.
54
1. Les rôles des vésicules extracellulaires dans la pathogenèse de
l’infection au VIH-1
Dans notre laboratoire, nous avons observé une accumulation d’exosomes dans le
surnageant de culture des cellules dendritiques mises en contact avec le VIH-1. De plus, la
culture des LT CD4 en présence des exosomes issus des cellules dendritiques infectées
augmente l’apoptose des LT CD4 [89]. Ce qui nous a amenés à étudier l’abondance des
vésicules extracellulaires issues des cellules infectées et la présence de Dap-3 dans ces
vésicules. Un modèle des cellules RAJI CD4 DCIR a été utilisé dans nos expériences. Ces
cellules sont des lymphocytes B modifiés pour exprimer le CD4, un récepteur permettant
l’attachement du VIH-1 et l’infection. Nous avons choisi les cellules RAJI CD4 DCIR
parce que ce sont des cellules présentatrices d’antigène et aussi en raison de leurs
manipulations faciles et reproductibles. Nous avons observé une augmentation de l’activité
d’acétylcholine estérase dans les vésicules extracellulaires issues des cellules RAJI CD4
DCIR infectées au VIH-1. Ce qui témoigne de l’augmentation de l’abondance des
exosomes libérés par les cellules RAJI CD4 DCIR infectées en comparaison avec les
cellules non infectées. Ceci est confirmé par immunobuvardage des marqueurs d’exosomes
qui montre une présence de Lamp-2 et d’Alix sur les culots des vésicules issus des cellules
RAJI CD4 DCIR infectées en comparaison avec les cellules non infectées (Figure 6). Ceci
montre que l’infection au VIH-1 augmente la libération des vésicules extracellulaires par
les cellules infectées.
D’autres observations ont également montré l’association des vésicules extracellulaires à la
pathogenèse des infections au VIH-1. En effet, les vésicules extracellulaires issues des LT
CD4 infectés au VIH-1 augmentent la réplication du virus sur les LT CD4 quiescents [144].
De plus, les exosomes issues des LT CD4 infectés peuvent contenir Nef [88], une protéine
virale connue pour son rôle dans l’apoptose des LT CD4 [184]. En effet, une culture des LT
CD4 en présence des exosomes Nef+ engendre une augmentation de la mort de ces LT CD4
par apoptose [88]. Par ailleurs, une inhibition de la libération des exosomes par les LT CD4
grâce au traitement avec le GW4869 ou le spiroepoxide qui inhibent la sphingomyelinase
neutre, engendre une diminution de la sensibilité de ces cellules vis-à-vis de l’infection au
55
VIH-1 contrairement aux cellules non traitées avec ces inhibiteurs suggérant ainsi
l’implication des exosomes dans l’apoptose des LT CD4 [144].
2-Présence de Dap-3 sur les vésicules extracellulaires issues des cellules
infectées au VIH-1
Nous avons procédé à l’optimisation de l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 dans le but
de connaitre la limite de détection de cette technique, de diminuer de façon considérable la
concentration de l’anti-Dap-3 et donc diminuer le coût de l’immunobuvardage. Ceci nous a
permis d’augmenter la dilution d’anticorps primaires de 1/100 jusqu’à 1/1000 et ainsi
réduire le coût de l’immunobuvardage de 58 $. Nous avons également testé comme
révélateur le Luminata Forte qui nous a permis d’avoir un signal bien plus intense du
marquage de Dap-3 en comparaison avec l’ECL (Figure 2). La nouvelle condition
d’immunobuvardage est mise au point avec l’anti-Dap-3 dilué à 1/1000 dans l’Enhancer et
l’anticorps secondaire dilué dans l’Enhancer et révélé avec le Luminata Forte nous a
permis d’obtenir un signal similaire à celui du marquage de Dap-3 avec une concentration
10 fois plus grande d’anti Dap-3 dilué dans le tampon TBS Tween 20 (Figure 5).
Nous avons observé la présence de Dap-3 dans les vésicules extracellulaires issues des
cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1. Ceci pourrait expliquer l’origine des
vésicules extracellulaires Dap-3+ présentes dans les plasmas des patients infectés au VIH-1
[145]. Ces vésicules pourraient donc provenir des cellules infectées au VIH-1. Néanmoins,
la présence de Dap-3 dans les différents types de vésicules extracellulaires reste à
déterminer. Pour cela, des analyses de la présence de Dap-3 sur les exosomes et les autres
types de vésicules extracellulaires séparées par la méthode du gradient de vélocité et issues
des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 ont été réalisées. L’immunobuvardage
avec l’anti-Dap-3 sur les fractions du gradient de vélocité issues des cultures des cellules
RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 révèle un signal de marquage de Dap-3 plus intense
chez les exosomes situés dans les fractions 9,6 % et 10,8 % du gradient issues des cellules
RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 en comparaison avec les exosomes issus des cellules
non infectées (Figure 7) (Claude Mfunyi). De plus, le Dap-3 est plus présent dans les autres
types de vésicules extracellulaires situées dans les dernières fractions 14,4 %, 15,6%,
56
16,8% et 18% du gradient issues des cellules infectées en comparaison avec celles des
cellules non infectées (Figure 7). Ceci suggère la présence des vésicules apoptotiques dans
ces dernières fractions du gradient de vélocité. Ceci est conforté par l’observation de
vésicules extracellulaires dans les dernières fractions du gradient de taille comprises entre
200 nm et 500 nm correspondant peut-être aux vésicules apoptotiques (Figure 12). Puisque
Dap-3 est une protéine de la matrice mitochondriale et qu’elle se retrouve dans les dernières
fractions du gradient issues des cellules infectées en comparaison avec celles des cellules
non infectées, ceci pourrait suggérer la présence des mitochondries dans ces fractions 14,4
%, 15,6%, 16,8% et 18%. Cependant, pour en faire la démonstration, il faudrait déterminer
la présence des mitochondries sur les dernières fractions du gradient de vélocité issues des
cellules infectées en réalisant un immunobuvardage avec des marqueurs spécifiques des
mitochondries comme le cytochrome C et la protéine Tom 20. Ou encore en utilisant des
marqueurs fluorescents spécifiques de la mitochondrie, couplés avec une analyse en
cytoflurométrie.
Dans le but de confirmer le rôle de Dap-3 dans l’activation de l’apoptose des LT CD4.
Nous avons d’abord mis au point un modèle de transfection des cellules RAJI CD4 DCIR
et des cellules dendritiques avec les ARNs anti-sens Dap-3 afin d'inhiber l’expression de
Dap-3. Ce modèle nous permettra par la suite d’isoler les vésicules extracellulaires Dap-3- à
partir des cellules transfectées avec les ARNs anti-sens Dap-3 et infectées au VIH-1. Et ce,
dans le but d’étudier le rôle de ces vésicules Dap-3- dans l’apoptose des LT CD4 en
comparaison avec les vésicules Dap-3+ et de savoir si Dap-3 représente un mécanisme par
lequel les vésicules pourraient activer l’apoptose des LT CD4. La transfection des cellules
RAJI CD4 DCIR et des cellules dendritiques avec les ARNs anti-sens Dap-3 a permis de
diminuer le ratio Dap-3/actine sur les cellules RAJI CD4 DCIR transfectées avec les deux
ARNs anti-sens Dap-3 AS2 et AS3 en comparaison avec les cellules RAJI CD4 DCIR non
transfectées (Figure 13). Dans les cellules dendritiques transfectées avec l’ARN anti-sens
Dap-3 AS2, on observe également une diminution du ratio de Dap-3/actine en comparaison
avec les cellules dendritiques transfectées avec l’ARN sens Dap-3 (Figure 13).
Le modèle de transfection avec les ARNs anti-sens Dap-3 est sujet à des améliorations. En
effet, il reste à déterminer la concentration d’ARN anti-sens Dap-3 permettant un blocage
57
d’expression de Dap-3 pendant 48h afin d’appliquer ce modèle dans d’autres expériences
comme dans l’étude des vésicules extracellulaires Dap-3+ qui sont libérées généralement
par les cellules dendritiques 48h après l’infection.
Le modèle de transfection aux ARNs anti-sens est peut-être plus physiologique dans des
cellules primaires susceptibles d’être activées par le virus comme les cellules dendritiques.
Ce modèle présente d’autres avantages, le premièr est que la mise en culture de ces cellules
en présence de VIH-1 active la libération des exosomes à partir de 24h d’incubation et que
l’analyse protéomique a révélé la présence de Dap-3 sur les exosomes libérés après 48h de
culture des cellules dendritiques en présence du VIH-1, plus rapide que les cellules RAJI
CD4 DCIR infectées qui libèrent les vésicules Dap-3+ après 5 jours de culture. Un autre
avantageest que la mise en culture des cellules dendritiques en présence du VIH-1 engendre
peu de production virale contrairement aux cellules RAJI CD4 DCIR. Enfin, les cellules
dendritiques ne prolifèrent pas et produisent plus d’exosomes en comparaison avec les
cellules RAJI CD4 DCIR par million de cellules. Ceci suggère que le modèle de
transfection aux ARN anti-sens peut être transféré aux cellules dendritiques qui sont un
modèle plus pertinent pour notre étude.
3-Caractérisation des vésicules extracellulaires issues des plasmas des
sujets infectés au VIH-1
Après avoir observé une accumulation des vésicules extracellulaires issues des cellules
RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 et déterminer la présence de Dap-3 sur ces vésicules.
Nous nous sommes intéressés à étudier et caractériser les vésicules extracellulaires issues
des plasmas des patients infectés au VIH-1. À partir des plasmas déplaquettés de 2 sujets
VIH-1-, 4 sujets VIH+ dont 2 patients traités aux antirétroviraux et deux autres non traités.
Nous avons isolé puis séparé les vésicules extracellulaires par la méthode du gradient de
vélocité. On a observé une augmentation de l’abondance des exosomes dans les fractions
9,6 %, 10,8 % et 12% du gradient de vélocité issues des plasmas des patients infectés au
VIH-1 non traités et traités aux antirétroviraux en comparaison avec celles des sujets non
infectés (Figure 10). Ceci est conforté par l’observation d’une augmentation de l’abondance
58
des exosomes dans les préparations de vésicules extracellulaires issus des plasmas des
patients infectés au VIH-1 [145].
L’analyse des tailles des vésicules des différentes fractions du gradient de vélocité issus des
plasmas des patients infectés au VIH-1 montre la présence de différentes populations de
vésicules dans les fractions du gradient de vélocité. Ce dernier sépare donc des vésicules
extracellulaires de tailles différentes. De plus, le gradient de vélocité a permis la séparation
des exosomes et des particules du VIH-1 [124]. En effet, l’analyse des tailles des vésicules
extracellulaires avec le nanosizer révèle la présence de particules dans la fraction 16,8 et 18
% qui ont une taille moyenne autour de 100 nm (Figure 12). On a observé la présence de
grandes vésicules de taille supérieure à 200 nm dans les dernières fractions 14,4 %, 15,6%,
16,8% et 18 % du gradient. Quant aux premières fractions 6 et 7,2%, celles-ci contenaient
plus souvent des particules de tailles inférieures à 40 nm correspondant peut-être aux
complexes protéiques. Dans les fractions 8,4%, 9,6%, 10,8% et 12%, on notait la présence
de vésicules ayant une taille variable entre 50 et 150 nm de diamètre (Figure 12).
Après avoir observé la présence de Dap-3 sur les fractions du gradient de vélocité issues
des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1, nous avons voulu déterminer la présence
de Dap-3 sur les fractions du gradient issues des plasmas des patients infectés par
immunobuvardage avec l’anti-Dap-3. Suite au marquage de Dap-3, on a observé des bandes
non spécifiques correspondant peut être à la présence des anticorps secondaires anti-souris
couplé à la peroxydase qui se fixeraient de façon non spécifique sur les immunoglobulines
issues des plasmas. Cette problématique est confirmée après avoir incubé directement les
protéines des fractions avec les anticorps secondaires. Ces bandes non spécifiques étaient
effectivement observées. Pour pallier à cette problématique, il faudrait utiliser différentes
stratégies de blocage comme l’utilisation des anticorps secondaires ne reconnaissant que les
IgG natives ou encore éliminer les IgG humains du plasma.
4. Rôle de Dap-3 dans les autres pathologies
Des raisons supplémentaires s’ajoutent pour approfondir notre étude sur le rôle de Dap-3
dans la déplétion des LT CD4 et l’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1. En effet,
une étude a montré une corrélation inverse entre le niveau d’ARNm de Dap-3 quantifié par
59
qPCR et le stade de développement du cancer du sein [168]. Ce qui indique un mécanisme
pro-apoptotique régulé négativement dans les cellules tumorales favorisant ainsi la
tumurogenèse. De plus, récemment, une autre étude a montré que les cellules tumorales
gastriques qui ont un knock-down pour Dap-3 ont une plus grande capacité à migrer pour
former des métastases et sont plus résistantes aux agents chimiothérapeutiques [185]. Ce
qui suggère que le Dap-3 pourrait être un facteur de bon pronostique de la réponse à la
chimiothérapie, ou de résistance à l’apoptose.
60
Chapitre VI : Conclusions et perspectives
L’infection au VIH-1 augmente l’accumulation des vésicules extracellulaires libérées par
les cellules RAJI CD4 DCIR mises en contact avec le VIH-1. Ceci est conforté avec
l’observation chez les patients infectés au VIH-1 montrant une abondance des exosomes
issus des plasmas des patients infectés en comparaison avec les sujets non infectés.
Nous avons mis au point l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3 qui permet d’augmenter le
signal de marquage tout en réduisant le cout de la technique. De plus, nous avons montré
que la protéine pro-apoptotique Dap-3 est présente dans les vésicules extracellulaires issues
des cellules RAJI CD4 DCIR infectées au VIH-1 en comparaison avec les cellules non
infectées. Également, Dap-3 est plus présent dans les exosomes issus des cellules RAJI
CD4 DCIR infectées au VIH-1 en comparaison avec celles des cellules non infectées.
Cependant, la protéine Dap-3 est plus présente dans les dernières fractions du gradient de
vélocité issues des cellules infectées au VIH-1 et que ces fractions contiennent peut-être des
vésicules apoptotiques. Une caractérisation de ces fractions du gradient est requise afin de
déterminer la présence de vésicules apoptotiques ou d’autres types de vésicules pas encore
identifiées.
L’ultracentrifugation des vésicules extracellulaires sur les gradients de vélocité permet la
séparation de plusieurs populations de vésicules avec des tailles différentes analysées avec
le nanosizer. Les fractions du gradient de vélocité sont à caractériser par microscopie
électronique et immunobuvardage des marqueurs d’exosomes afin de visualiser les
différents types de vésicules.
Afin de montrer le rôle de Dap-3 dans l’apoptose des LT CD4 par les exosomes, il serait
pertinent de récupérer les vésicules extracellulaires Dap-3- à partir des cellules dendritiques
transfectées avec l’ARN anti-sens Dap-3 et infectées au VIH-1. Et ce, dans le but
d’analyser le rôle de ces vésicules Dap-3- dans l’apoptose des LT CD4 en comparaison
avec les vésicules Dap-3+. Ceci nous permettra de savoir si la protéine Dap-3 représente un
mécanisme par lequel les exosomes issus des cellules infectées activent l’apoptose des LT
CD4.
61
À plus long terme, une analyse quantitative de Dap-3 par ELISA sur les LT CD4 issus des
PBMCs des patients VIH-1+ ainsi que sur les vésicules extracellulaires issues des plasmas
des patients VIH-1+ pourrait peut-être servir au pronostique de mortalité des LT CD4. En
effet, l’étude de la corrélation entre la quantité de Dap-3 et l’apoptose des LT CD4
permettra de montrer le rôle de Dap-3 dans la pathogenèse de l’infection au VIH-1 ou
comme outil de pronostique. Enfin, il est possible que les vésicules extracellulaires issues
des cellules infectées au VIH-1 contiennent d’autres molécules pro-apoptotiques comme les
récepteurs de mort cellulaire PD-L1, Fas-L et Fas dont il serait pertinent de valider la
présence dans les vésicules extracellulaires.
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