Bactériologie

Rapport de Bactériologie
Le but de ce TP est d’apprendre à mettre en évidence toute une série de bactéries grâce à leurs
caractéristiques micro-biologiques, afin de les identifier lors de leur présence dans un aliment. Nous
étudierons successivement des cocci et des bacilles Gram positif, puis des bacilles Gram négatif. Nous
finirons enfin, par l’analyse micro-biologique d’aliments.
I) Etudes de Cocci et Bacilles Gram positif :
1) Cocci Gram positif :
Les deux germes étudiés sont Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis. Ce sont deux des germes
les plus couramment retrouvés dans le milieu extérieur.
a) S. aureus :
Il est une très répandu dans la nature, il est commensal de la peau et des cavités naturelles de l’homme,
on le retrouve donc de manière assez fréquente dans produits alimentaires, cosmétiques ou
pharmaceutiques.
Après une coloration de Gram, nous observons des amas de cocci G+ plus ou moins important. La
recherche de la catalase est nettement positif (gros dégagement gazeux), l’oxydase n’a pas été faite. Pour
réaliser la recherche de la catalase, nous plaçons sur une lame de verre une goutte d’eau oxygénée, puis
nous y déposons le bout d’une pipette Pasteur avec laquelle, nous avons prélever des agents bactérien.
Dans le cadre de l’étude biochimique de S. aureus, nous avons ensemencé des milieux d’isolements dit
de Baird-Parker, Chapman et une gélose TS. Le milieu de Baird-Parker est se compose en plus
d’éléments nutritifs de lécithine, qui en présence d’une lécithinase est dégradée donnant ainsi naissance
à des zones opaques. Le milieu contient en plus un agent de sélection qui est la tellurique potassique.
Cette agent est selon le type bactérien toxique ou non, S. aureus est capable de se développer sur un tel
milieu. Sur un tel milieu S. aureus donnera des colonies avec une zone d’éclaircissement puis une zone
opaque.
La gélose de Chapman contient du mannitol et du NaCl à très forte concentration. Le NaCl est utilisé
comme agent de séléction. Si les colonies sont capables de pousser sur un tel milieu et qu’elles utilisent
le mannitol, la gélose devient jaune.
La gélose TS est utilisé car il s’agit d’un milieu beaucoup moins séléctif.
Parallelement a l’isolation du germe, nous allons ensemencé un bouillon TS de manière à avoir plus de
matériel pour travailler dans de bonne condition. Puis nous ensemençons un tube, permettant de
déterminer le type respiratoire de l’agent bactérien.
Après 24H. d’incubation à 37°C, nous lisons les premiers résultats.
La gélose TS permet d’observer de petites colonies régulière ronde, d’environ 1 mm de diamètre, et de
couleur blanchâtre. Sur Baird-Paker, on observe des colonies ponctiformes noir. Le type respiratoire
révèle que l’ensemble du tube a été colonisé, la bactérie est donc aérobie-anaérobie facultative. Le
milieu de Chapman révèle la présence de petite colonie ponctiforme, avec une décoloration nette du
milieu en jaune, notre germe est donc mannitol +. Le bouillon TS quand à lui est devenu trouble, il y a
donc bien eu multiplication bactérienne. L’état frais réaliser à partir du bouillon TS, nous révèle la
présence d’amas de cocci de différentes tailles.
Après lecture des résultats du premier jour, nous ensemençons à partir du bouillon TS une gélose à
l’ADN de manière a étudier la capacité de S. aureus à utiliser les acides nucléique du milieu, un gélose
de Mueller-Hinton (on effectue un tapissage de la gélose par du bouillon TS) utiliser pour le diagnostic
de S. aureus, sur le même milieu, nous étudierons la résistance du germe à l’O129, la bacitracine et à la
furadoïne. La gélose au sang permettra quand à elle de déterminer le pouvoir hémolythique du germe.

Puis nous ensemmencerons un bouillon qui permettra la recharge de la coagulase, une des enzymes
caractéristique de S. aureus. Touts les milieux ensemencés précédemment sont placés à l’étuve 37°C
pendant 24H, de même que le milieu de Baird-Parker du 1er jour .
Le lendemain, nous observons l’évolution de nos milieux. Sur gélose de Mueller-Hinton, nous
retrouvons un tapis bactérien blanchâtre confluant, sauf au niveau de certain disque antibiotique. Une
lecture rapide de cet antibiogramme, nous révèle que le germe insensible à l’O129, le disque de
furadoïne est entouré dans gros halo jaune au niveau duquel on retrouve aucune colonie bactérienne, en
ce qui concerne de le disque de bacitracine, on observe un halo blanc autour de ce dernier. La lecture du
milieu de Baird-Parker révèle des colonies ronde régulière d’environ 1 mm de diamètre avec un halo
translucide autour d’un autre halo plus dense. La gélose au sang nous révèle la présence de petite colonie
blanche, régulière ronde, d’environ 1 mm de diamètre largement ß-hémolytique. La recherche de la
DNase est positive, en effet nous observons un halo d’environ une à deux fois la largeur de la strie
bactérienne. Nous rajoutons au bouillon pour coagulase le plasma de Lapin, puis nous plaçons le tout
dans un bain-marie à 37°C. Après deux heures, nous observons un prise en masse (coagulation) net du
milieu contenu dans le tube à hémolyse. Nous pouvons donc récapituler les caractéristiques de notre
souche bactérienne de S. aureus :
- Cocci en amas, Gram + (G+), immobiles
- Catalase +, coagulase +, DNAse +
- Anaérobie-aérobie facultative, mannitol +
- Résistant à l’O129, et semblant être sensible à la furadoïne, et résistant à la bacitracine
(lecture rapide sans mesure du diamètre du halo autour du disque d’antibotique)
Il est a noté que ni l’oxydase, ni le Clumping Factor n’ont été recherche. Il serait tout de même
intéressant de connaître le résultat de la recherche du Clumping Factor pour le typage du S. aureus (à
vérifier).
b) Enterococcus faecalis :
Ce germe est un pathogène que l’on retrouvera fréquemment dans le fèces, les eaux contaminées et les
plantes. Ce germe peut aussi ce retrouver dans des aliments non stérilisés, mais de sera pas forcement un
marqueur de contamination fécale.
Après une coloration de Gram, nous observons des cocci G+ légérement trapus. La recherche de la
catalase est négative. A partir de notre culture pur, nous ensemençons une gélose TS permettant d’isoler
des colonies bactériennes, un type réspiratoire, ainsi qu’un bouillon TS. Nous plaçons le tout à l’étuve
37°C sauf pour le bouillon TS qui est placer à 44°C. Après 24H. d’incubation nous lisons nos gélose. La
gélose TS révèle le présence de petites colonies ronde blanchâtre d’environ 1 mm de diamètre. Le germe
semble se développer sur l’ensemble du tube du type réspiratoire, le germe est donc aéro-anaérobie
facultatif. Le bouillon TS est quand à lui devenu trouble, avec un dépôt blanchâtre au niveau du culot.
L’état frais fait à partir du bouillon TS révèle la présence ce cooci qui semblent être arranger et chaîne,
et ils sont immobiles (à part les mouvements Browniens). Toujours à partir de ce bouillon TS, nous
ensemençons une gélose Slanetz, une gélose au tellurite de potassim, une gélose bile-esculine et un
bouillon hypersalé. La gélose de Slanetz est utilsée pour le diagnostique des entérocoques, elle possède
un agent de sélection qui est l’azide de K
+, les colonies d’E. faecalis devraient apparaître violette
fuschia. De même que le milieu bile-esculine permettra la sélection des entérocoques grâce à la bile.
Puis nous plaçons l’ensemble des milieux à 37°C pendant 24H. Le milieu de Slanetz, nous révèle de
petite colonie violette ponctiforme, caractéristiques des entérocoques. Sur le milieu au tellurite de K
+,
nous observons de petite colonie noir ponctiforme. Le tube bile-esculine est devenu entièrement noir,
sauf au niveau du culot. Nous observons d’autre part un trouble dans le bouillon hypersalé. Le recherche
de DNAse est négative.
Nous pouvons donc récapituler les caractéristiques fondamentales de notre germe :
- cocci G+ en chaîne légérement trapus
- catalase –
- type respiratoire aéro-anaérobie facultatif

2) Bacilles Gram + :
Les germes étudiés sont Bacillus céreus et Listeria monocytogene et L. innucua ,ainsi que Clostridium
sporogenes.
a) Bacillus céreus :
Ce germe est couramment responsable de problèmes de stérilisation dans l’industrie ou à l’origine
d’intoxication alimentaire. Dans le but d’étudier certaines caractéristiques de ce germes nous avons
effectué les tests suivants.
Au microscope, nous observons des bacilles G+ effilé, allongé, formant des chaînettes relativement
longues après coloration de Gram. La réalisation d’un état frais nous révèle que les bacilles sont
immobiles. Le test de la catalase se révèle positif. Sur gélose TS, on observe de grosses colonies beiges,
régulières. Ces colonies sont très grosses donc pour l’isolement, il est nécessaire de faire sur ¼ de la
boîte un ensemencement par une simple piqûre. Au 3
ème jour de culture, et après induction de la
sporulation ( grâce au sulfate de manganèse) de B. cereus, nous observons des spores subterminales non
déformantes. Ces spores sont caractéristique de ce germe. Le révélation des spores est réalisée à l’aide
d’une coloration au vert malachite, et une contre coloration à la saphranine. Le type respiratoire nous
révèle que le germe peut se developper sur l’ensemble du tube, il est donc aéro-anaérobie facultative. Le
milieu de Mossel contenant de la polymyxine B (inhibiteur de la croissance de certains germes
interférants), de la lécithine et du mannitol. On observe alors après incubation de 24H. à 37°C une
colonie de 9 mm de diamètre entourée d’un halo opaque d’environ 5 mm. Le germe est donc lecithinase
+ (halo opaque). Le milieu vire à une couleur fuschia dons le germe est mannitol -, et dégrade les
peptones du milieu avec production de NH3 responsable de l’alcalinisation du milieu. Le milieu
de Mueller-Hinton contenant un disque de pénicilline 100, nous montre que la culture est confluante
sauf sur un rayon de 2 mm autour du disque d’antibiotique. Le germe est donc résistant à la pénicilline,
cela peut-être corrélée à la présence d’une pénicillinase. Sur la gélose au sang, nous observons de
grosses colonies blanches de 9 mm de diamètre, et possédant une activité hémolytique.
b) Listeria monocytogenes et innocua :
Le but de ces manipulations est d’être capable de poser un diagnostic différentielle entre deux espèces
du même genre. L. monocytogenes étant pathogène alors que L. innocua est non pathogène.
La coloration Gram révèlent la présence de petits bacilles trapus G+ formant de petits amas. Ces
observations sont valables pour les deux espèces bactérienne. L’état frais est réalisé à partir de deux
bouillon qui on été incuber réspéctivement à 25°C et 37°C. A 25°C, nous n’observons rien pour L.
innocua alors que pour L. monocytogenes les bactéries sont immobiles. A 37°C, les bactéries sont
mobiles pour L. monocytogenes et légérement mobile pour L. innocua. En théorie L. innocua est
immobile à 37°C, mais il est possible que le bouillon se soit refroidit rapidement et ai donc permis à la
bactérie de produire des flagelles. Il est à noter que les bactéries sont animées par un mouvement de
bascule. Le test de recherche de la catalase est positif. Sur gélose TS L. monocytogenes et L. innocua
donnent des colonies blanches, d’environ 2 mm de diamètre, régulières et lisses. L’étude du type
respiratoire nous montre que les bactéries sont capables de se développer sur l’ensemble de la gélose par
conséquence, elles sont toutes les deux aéro-anaérobie facultative. L’isolement sur gélose d’Oxford des
deux espèces nous donne des petites colonie grisâtres, rondes, régulières avec un halo noir autour des

colonies. Ceci s’explique par le fait qu’elles sont capables de réduire l’esculine du milieu en esculetine,
qui réagira avec le Fe2+. On étudie aussi la prolifération des germes dans un bouillon TS placer à
différente température (25°C et 37°C), et les résultats sont les suivants : à 24H. L. innocua semble s’être
développée à 37°C et pas à 25°C, et de même pour L. monocytigenes. Ces résultats sont en contradiction
avec des observations qui démontrent que L. innocua se développe mieux à 25°C qu’à 37°c et
inversement pour L. monocytogenes. Nous essayons d’étudier la mobilité de nos germes, pour cela nous
ensemençons deux milieu Mannitol mobilité par germes , ces milieux seront incubés à une température
de 25°C ou de 37°C. Après 24H d’incubation, nous ne remarquons aucun développement bactérien pour
les tube de L. monocytogenes, alors que pour L. innocua les germes sont mobiles à 25°C et immobiles à
37°C.
Nous étudions la capacité de nos agents à métaboliser certain sucres. Pour cela nous utilisons deux tubes
contenant du CTA auquel nous additionnons soit du Xylose soit du Rhamnose, puis nous plaçons les
tubes 24H à 37°C. Nous obtenons les résultats suivant, L. innocua : tube xylose est orange de même que
le tube du Rhamnose. Pour L. monocytogenes nous obtenons un tube xylose orange et un tube rhamose
jaune. Par conséquent L. innocua est Xylose – et Rhamnose -, alors que L. monocytogenes est Xylose –
et Rhamnose +.Les résultats pour L. innocua sont encore en contradiction avec des observations
antérieures, qui révélaient que ce germes était Xyl+ et Rha-. On peut donc penser que notre germe à
perdu la capacité d’utiliser le Xylose. Pour définitivement différencier les deux souches, nous réalisons
un CAMP test dans une gélose sang. En effet lors d’un tel test, nous déposons sur le milieu une souche
particulière de S. aureus, et nous disposons de part et d’autres nos germes. Dans un tel test le pouvoir ß-
hémolytique de S. aureus est renforcé en présence de L. monocytogenes. Les colonies de L. innocua à
proximité des colonies de S. aureus ne renforce pas son pouvoir hémolytique, alors que dans le cas de L.
monocytogenes c’est le cas. Les bactéris sont donc réspectivement CAMP- et CAMP +.
C) Clostridium sporogenes :
La coloration de Gram révèle de petits bâtonnets G+ en chaînette ou isolés. L’état réaliser à partir de la
culture pur, nous montre des mouvement orienté relativement linéaire. Le type respiratoire nous montre
que C. sporogenes se développe dans les 2/3 inférieur du tube, avec observation d’un dégagement
gazeux. Le germe est donc anaérobie stricte. Un bouillon thioglycolate et rézazurine est ensemencé et
placer 24H à 37°C. La rézazurine est un indicateur d’oxygénation, qui devient donc rose en surface et
jaune dans le reste du tube (car absence d’O2). Le milieu contient également 1% d’agarose pour
alourdier le milieu de manière à limiter les courants de convection dans l’étuve. Le germe est capable de
pousser dans le tube, mais s’arrête à 2 mm de la surface, là ou l’indicateur devient jaune. Un egélose
TSC (Triptase Sulfite Cyclosérine) est réalisé. La gélose doit être régénérée à 100°C pois refroidit à
50°C et enfin on additionne de la D-cyclosérine. Ce milieu est sélectif des Clostridium. On observe que
le germe donne une coloration noire s’arrêtant à 3 mm de la surface du tube.
3) L’inconnue X7 :
La coloration Gram révèle de petites cocci G+, ovoïde, trapus en amas, catalase -. Il doit donc
probablement s’agir de E. faecalis. Sur gélose TS incuber à 37°C pendant 24H., on obtient des petites
colonies rondes, blanchâtre, régulière d’environ 1 à 2 mm de diamètre. Sur Baird-Paker la piqûre est
noire, elle est possède donc un elécithinase.On obtient une piqûre avec un halo jaune autour, sur
Chapman, le germe est donc capable de ce développer en présence de grande quantité de sel et est
capable d’utiliser le mannitol. Son type réspiratoire est aéro-anaérobie, sur milieu de spporulation, nous
n’observons aucune colonie. Le milieu de Blantz révèle des colonies violettes ponctiformes, sur gélose
au sang, les colonies sont légèrement hémolytique, et sur Tellurite de K
+, les colonies sont noire
ponctiformes sans halo autour. Tous ces résultats tendent à confirmer que X
7 est bien des germes d’E.
faecalis.

II) Etudes de Bacilles Gram - :
1) Enterobacteriacae :
a)Salmonella enteritidis :
Salmonella est l’une des premières causes d’intoxication d’origine alimentaire en France. Il entraîne
l’apparition de syndromes intestinaux de gravités plus ou moins importants (fièvre entériques, gastro-
entérites), ainsi que des septicémies. Sa détection est donc très importante.
La coloration Gram révèle des petits bacilles trapus G- isolés ou en amas, la recherche de la catalase est
négative. On effectue aussi la recherche de l’oxydase, pour cela , on utilise un disque réactif sur lequel
on met en contact à l’aide d’une pipette Pasteur des germes, puis nous lisons le résultat au bout de 5 à
6s. de manière à éviter l ‘apparition de faux négatif. La recherche reste négative. Un état frais réaliser à
l’aide d’un bouillon TS incuber pendant 24H. à 37°C, nous révèle que les bacilles sont légèrement
mobiles.
Après 24H d’incubation à 37°C, nous observons les premiers milieux. Sur Drigalski, nous obtenons des
colonies rondes vertes au milieu et translucide au bord, d’environ 1 à 2 mm de diamètre. Ce milieu
permet la caractérisation des micro-organismes fermentant le lactose, dans notre cas les bactéries sont
donc lactose – . La gélose TS montre la présence de petites colonies rondes, régulières, blanchâtre-jaune,
d’environ 1 à 2 mm de diamètre. Le milieu vert brillant permet un isolement sélectif de Salmonella sp.
sauf de Salmonella typhi, c’est pour cela qui est recommandé dans la recherche de notre agent bactérien.
Sur cette gélose, nous obtenons des colonie blanchâtre sur fond rose. Elles sont rondes et régulières avec
un diamètre d’environ 1 à 2 mm, il faut noter qu’il se dégage de la boîte une odeur fétide. Sur hecktoen,
nous observons des colonies rondes, noire au centre et translucide en périphérie , d’environ 1 mm de
diamètre, le fond est bleu noir. Ce milieu permet un isolement sélectif des bacilles entéropachigènes
(Salmonella et Shigella). Le type réspiratoire nous montre que le germe est capable de ce développer sur
l’ensemble du tube de gélose, par conséquent il est aéro-anaérobie facultatif. De plus, nous observons un
dégagement gazeux, et une odeur vraiment fétide (œuf pourri), notre bactérie est donc peut-être H
2S+.
Sur ligler, nous remarquons que la pente est rose, le culot noir ainsi qu’un dégagement gazeux, notre
bactérie produit donc bien de l’H2S et est lactose -. Après 24H. le bouillon de Clark et Lubs est devenu
trouble. Le milieu de Hugh-Leifson est utilisé pour la mise en évidence du type respiratoire, on ajout
préalablement quelques gouttes de Glucose. L'observation de l'acidification éventuelle sur toute la
hauteur du tube ensemencé en piqûre centrale permet de conclure. L'ensemencement de deux tubes dont
un recouvert de vaseline stérile est réalisé de manière à avoir un tube en anaérobie stricte. Les deux
tubes sont devenus jaunes, on peut donc conclure que notre germe fermente le glucose. Nous
ensemençons aussi un milieu Citrate de Simmons. Les bactéries utilisant le citrate comme seule source
de carbone bleuissent normalement le milieu (alcalinisation)les bactéries ne l'utilisant pas ne cultivent
pas.Toutefois, des bactéries peuvent utiliser le citrate comme seul source de carbone sans bleuir. Ici, la
pente bleuie, notre germe est donc citrate +. Le milieu mannitol mobilité, nous révèlent que les bactéries
sont légèrement mobile, et le milieu étant devenu jaune-orangé que le germe est mannitol+ (milieu jaune
: mannitol + ; milieu rouge : mannitol -). Après 24H. d’incubation dans le bouillon urée-indole, nous
révelons ce milieu. Si le milieu est rouge (basique) : uréase + milieu orange ou jaune : uréase - , après
addition de réactif de Kovacs il y a apparition d’: anneau rouge (indole +), anneau jaune (indole -). Ici le
milieu est orangé et ne varie pas après ajout du réactif de Kovacs, par conséquence notre bactérie est
Indole- et Uréase-. Nous réalisons la recherche de la ß-galactosidase à partir d’un milieu lactosé, sa
recherche est restée négative. A partir du bouillon nitrate, nous recherchons les nitrites. On ajoute au
bouillon les réactifs Nitrite 1 et 2. Une coloration rouge signifie la présence de nitrites. (bactérie nitrate
réductase + stade nitrites).En cas de milieu incolore, on ajoute le zinc réducteur des nitrates. Attendre
quelques minutes. Une coloration rouge montre la présence de nitrites : la bactéries est Nitrate réductase
-. Une absence de coloration montre l'absence de nitrates : la bactérie les a réduit en azote. Ici, nous
observons que notre bactérie est nitrate réductase +. Après 48H. d’incubation, nous
révélons le milieu de Clark et Lubs. Après addition d'hydroxyde