resumé

Les polynucléaires neutrophiles sont les pivots de l’immunité innée. Ils sont la première
lignée cellulaire à être recrutée rapidement sur le foyer infectieux. La fonction principale de
ces
cellules consiste à phagocyter les agents pathogènes et les détruire grâce à leur arsenal de
molécules microbicides qui sont deux types les enzymes protéolytiques et les formes
réactives
de l’oxygène (FRO) qui sont produites par la NADPH oxydase.
La NADPH oxydase est un complexe enzymatique, dont les sous unités sont recrutées
après leur phosphorylation par des protéines Kinases (PK). L’activation de l’oxydase peut se
faire in vivo par la phagocytose d’un agent pathogène ou par un facteur chimioattractant
(fMLF) et in vitro par le PMA (ester de phorbol qui active les PK). La production des FRO est
un phénomène étroitement lié la phagocytose.
Pendant la phagocytose les polynucléaires neutrophiles forment des pseudopodes
nécessaires à leur déplacement vers leurs cibles, pour enfin les englober dans un
phagosome.
Ce phénomène implique un apport de membrane, qui entraîne un remaniement des
phospholipides membranaires, qui peuvent se trouver réorientés sur le feuillet de la
membrane
plasmique. Notamment la Phosphatidylsérine (PS) qui est une composante de la membrane
plasmique, localisée exclusivement sur le feuillet interne grâce à l’action de
l’aminophospholipide translocase. Dans une situation de phagocytose, cette PS pourrait se
trouver transitoirement sur le feuillet externe qui peut être rapide, car elle sera transloquée
vers le feuillet interne.
Pour mettre en évidence la relation entre la PS et l’activation de l’oxydase, notamment dans
le recrutement des sous unités de l’oxydase. Nous avons adopté deux stratégies, que nous
avons mis en oeuvre dans des cellules myéloïdes PLB 985, la première stratégie consiste à
inhiber la PS sur le feuillet externe en utilisant de l’annexineV, qui a une affinité avec la PS ou
l’inhiber sur le feuillet interne par une approche moléculaire qui consiste à transfecter les
PLB
985 avec des constructions de plasmides exprimant des peptides fusionnés à la CFP (
variante de la EGFP), dont un domaine de l’AV qui lie la PS en présence du Ca+ et un
domaine C2 de la lactadhérine qui a une forte affinité à la PS indépendamment du Ca+. La
seconde stratégie consiste à augmenter la concentration de PS sur le feuillet interne en
traitant les cellules avec des liposomes chargés en PS.
Dans ces conditions nous avons mesuré au cytomètre en flux la phagocytose et la
production de ROS, qui reflète l’état d’activité de la NADPH oxydase. Nous avons utilisé des
levures marquées au FITC pour la phagocytose et une sonde spécifique CDCDHFDA pour la
production des ROS. L’expression des peptides fluorescents et leur recrutement au niveau
de
la membrane plasmique a été suivi par microscopie à epifluorescence.
Les mesures en cytomètrie de flux n’ont pas mis en évidence d’effet de l’addition d’AV et
d’augmentation de la concentration de PS sur la phagocytose et la production des ROS.