cours n°2 Le signal Calcique

Les différentes familles des RCPGs en fonction de leur structure
Les RCPG ont tous une structure à 7 domaines transmembranaires (7TM) avec 3 boucles extracellulaires (ECL) et
3 boucles intracellulaires (ICL). Toutefois, on peut distinguer plusieurs familles en fonction de leur séquence en
acides aminés et leur structure 3D. Un des critères de séparation en différentes familles est le site de fixation de
l’agoniste sur le RCPG. De nombreux RCPGs ont été cristallisés et la structure 3D ainsi établie permet de
confirmer l’appartenance à une des trois familles.
Famille 1 / Classe A: la famille de récepteurs regroupant le plus grand nombre de RCPGs. La Rhodopsine est
le premier à avoir été caractérisé, puis β-adrénergique, 5HT, chimiokines, morphiniques. Ces récepteurs
présentent des ponts dissulfure entre TMIII et TMIV. On peut distinguer 3 sous-familles:
-1a le site de l’agoniste est entre les segments TM;
-1b le site de l’agoniste est entre le domaine N-terminal et les boucles ECL1 et ECL2;
-1c le site de l’agoniste est entre le domaine N-terminal et ECL1.
Famille 2 / Classe B: cette famille regroupe beaucoup de récepteurs de peptides. Ces RCPGs ont en général
un domain N-terminal plus long que ceux de la famille 1 avec des cystéines conservées dans ce domaine ce
qui facilite la liaison de certains peptides comme PTH, VIP, GnRH, sécrétine,…
Famille 3 / Classe C: les récepteurs appartenant à cette classe sont caractérisés par un très grand domaine
extracellulaire N-terminal. Les principaux membres de cette classe sont les récepteurs métabotropes du
glutamate, les récepteurs du GABA GABAB, les récepteurs du Ca2+…
Le site de liaison de l’agoniste se trouve dans le domaine extracellulaire domaine Venus Fly trap car il
ressemble à celui du piège de la dionée carnivore…
Le signal calcique
1-Voies d’entrée et de sortie de calcium dans les cellules
2-Calcium dans les cellules excitables
3-Mesure du calcium intracellulaire
4-Le signal calcique dans les cellules non-excitables: cas des cellules
immunitaires
5-Rappels d’immunologie
6-Le mécanisme d’entrée de calcium après mobilisation de calcium
intracellulaire: protéines ORAI et STIM
-Le mécanisme
-Activation de la PLCg et rappels sur la voie des ‘tyrosines kinases’
-Structure des protéines ORAI et STIM
-Mécanisme de régulation
7-La voie NFAT
8-Rôle de l’entrée de calcium par libération des stocks intracellulaires dans
l’activation des lymphocytes T (et B)
9-Pathologies associées aux mutations des protéines ORAI et STIM
10-Autres voies d’entrée de calcium dans les cellules immunitaires
11-Autres types cellulaires
Le signal calcique
•
Le calcium est de loin le messager intracellulaire le plus répandu jouant un rôle primordial dans la
signalisation intracellulaire;
•
Il est impliqué dans des effets électriques rapides de part sa nature ‘ionique’ dans les cellules
excitables: il contribue au potentiel de membrane, il est impliqué dans la génération de potentiels
d’action et de l’activité rythmique (ou pace-maker) des cellules cardiaques par exemple.
•
Mais c’est aussi le co-facteur de la plupart des enzymes de la cellule. Ainsi, il est à l’origine de la
contraction musculaire de part ses effets ‘ioniques’ et ‘biochimiques’ (voir schéma).
•
Cette implication forte dans la signalisation cellulaire exige un contrôle strict de sa concentration
intracellulaire et ce malgré un fort gradient électrochimique en faveur d’une entrée dans les cellules
dans les conditions physiologiques. En effet, le Ca2+ est très concentré dans le milieu extracellulaire
(1 à 2mM) et très peu dans le cytosol (environ 100nM). On sait depuis plusieurs décennies qu’une
élévation exagérée de Ca2+ intracellulaire est à l’origine de la mort cellulaire par nécrose et/ou
apoptose.
•
Il y a plusieurs voies permettant une augmentation de Ca2+ dans le cytosol et de le réguler (voir
schéma)
1-Voies d’entrée et de sortie de Ca2+ dans une cellule
Les acteurs de la signalisation calcique
Les voies d’augmentation de [Ca2+]i
• Canaux calciques dépendants du voltage : 4 principaux sous-types L,T,N,P essentiellement sur
les cellules excitables.
• Canaux calciques indépendants du voltage:
– Canaux type TRP (TRPC, TRPV,…)
– Canaux ouverts par les ligands (glutamate, acétylcholine, sérotonine, purines)
– Canaux ouverts par la libération de calcium des stocks intracellulaires ou ‘CRAC’
• Échangeur Na+/Ca2+ (plasmatique et mitochondrial)
• Canaux intracellulaires sensibles à l’IP3
• Canaux sensibles à la ryanodine
• Pore de transition mitochondrial
Les voies de diminution de [Ca2+]i
• Les pompes (ATPases)
– La pompe Ca2+-ATPase membranaire (PMCA)
– La pompe Ca2+-ATPase du reticulum sarcoplasmique/endoplasmique (SERCA)
– La pompe Ca2+-ATPase mitochondriale (mCA)
• Echangeur Na+/Ca2+ (plasmatique et mitochondrial)
• Uniporteur mitochondrial (mCU)
• Protéines complexant le calcium
2- Calcium et cellules excitables: rappels sur la contraction musculaire: couplage ‘excitationcontraction’
Potentiel d’action nerveux
Tubule T
Jonction neuromusculaire
Potentiel d’action musculaire
Dépolarisation
Ouverture des canaux L
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Canaux L
Ca2+
Récepteurs cholinergiques nicotiniques
Dépolarisation
Réticulum sarcoplasmique
Récepteurs ryanodine
Ca2+
Mécanisme de Ca2+-induced
Ca2+ release
Ca2+
Ca2+
actine
myosine
Sarcomère
Glissement actine-myosine et contraction musculaire
2- Calcium et cellules excitables: Rappel sur la fonction et la localisation des
canaux calciques dépendants du voltage sur un neurone
Canaux L:
Excitabilité
Libération de neurotransmetteur
Expression génique
Canaux N et P:
libération de
neurotransmetteur
Canaux T:
Excitabilité
Rythmicité
3-Mesures de Ca2+ intracellulaire: marqueurs fluorescents (RY Tsien, prix Nobel 2008)
Fura2 estérifié
Fura2 estérifié
estérases
Exc 340nm
Exc 380nm
Fura2-Ca2+
Em 510nm
Cette sonde a deux longueurs d’onde d’absorption caractéristique des deux formes:
-quand la [Ca2+]i augmente, la forme fura2-Ca2+ (lié) devient prédominante par rapport à la forme
fura2 (libre). Donc la fluorescence obtenue par excitation à 340nm augmente et celle obtenue par
excitation à 380nm diminue. C’est l’inverse qui se produit quand la [Ca2+]i diminue.
-on peut faire ensuite faire le rapport des fluorescences (fluo 340 / fluo 380) : c’est une sonde
‘ratiométrique’ (voir enregistrement suivant)
Détection dans les cellules: exemple de la stimulation P2Y dans des cellules
astrocytaires
On peut voir la variation en sens opposé des deux fluorescences caractéristiques des formes libre et liée du
fura2. Au plan technique, cet enregistrement est obtenu en excitant les cellules alternativement à 340 et
380nm
Mise en évidence de la mobilisation de Ca2+ des réserves sensibles à l’IP3
On révèle la mobilisation de calcium des réserves sensibles à l’IP3 en se plaçant dans un milieu extracellulaire dépourvu en calcium. Dans
ces conditions, si on observe une augmentation de calcium, elle provient exclusivement de l’action de l’IP3 sur le reticulum endoplasmique
et l’ouverture de récepteur-canaux IP3. On peut voir que cette variation est très rapide et transitoire (‘transients’). On observe aussi que
dans les conditions ‘normales’ en concentration de calcium extracellulaire, le signal est plus ample: ceci suggère qu’il y a une entrée de
calcium qui s’ajoute au calcium initialement libéré des réserves intracellulaires. Ce phénomènes est appelé ‘entrée capacitive de calcium’
(voir diapo suivante).
Ce type d’enregistrement permet de montrer assez rapidement qu’un RCPG est bien couplé à Gq et à la phospholipase C.
Autres sondes fluorescentes
• GCaMP protéine de fusion comprenant la GFP, la calmoduline et une
partie dérivée de la chaîne légère de myosine.
• Ce marqueur peut être transféré dans les cellules par transgénèse ou
infection virale.
• Il permet de faire des mesures de [Ca2+] in vivo.
4-Le signal calcique dans les cellules non-excitables: cas des cellules
immunitaires
•
Les cellules non-excitables n’ont pas de canaux calciques dépendants du voltage.
Donc les entrées de Ca2+ dans ces cellules reposent essentiellement sur des canaux
membranaires ouverts par différents mécanismes dont la mobilisation de Ca2+ des
réserves sensibles à l’IP3;
•
En général, la quantité de Ca2+ mobilisée des réservées sensibles à l’IP3 n’est
suffisante pour déclencher une réponse cellulaire: il faut un apport du milieu
extérieur;
•
Dans plusieurs types cellulaires on a pu mettre en évidence le mécanisme dit
‘d’entrée capacitive’ de Ca2+ soit l’entrée de Ca2+ obtenue après mobilisation des
réserves intracellulaires (voir schéma suivant);
•
Ce mécanisme est particulièrement important dans les cellules immunitaires.
Mise en évidence de l’entrée de Ca2+ dans les cellules après mobilisation de Ca2+ des
réserves intracellulaires
Cette entrée de calcium consécutive à la mobilisation de calcium intracellulaire (‘store operated calcium entry’ ou SOCE), initialement
appelée ‘entrée capacitive de calcium’ est déclenchée expérimentalement en libérant le calcium des réserves intracellulaires par blocage de
la SERCA avec de la thapsigargine ou de l’acide cyclopiazonique (voir graphe), par complexant le calcium avec de l’EGTA ou par action de
l’IP3 dans un milieu dépourvu en calcium. Elle est ensuite révélée par rajout de calcium dans le milieu extracellulaire.
Ce mécanisme permet aux cellules non-excitables d’avoir du calcium en quantité suffisante pour l’activation de réponses biologiques.
Exemple de déclenchement de l’entrée capacitive de Ca2+ par application de
thapsigargine dans un milieu dépourvu en Ca2+. On obtient une forte augmentation de la
concentration intracellulaire en Ca2+ qui est inhibée par les ions La3+. Ce ions sont des
bloqueurs non sélectifs des canaux calciques.
5-Quelques rappels: immunité innée et adaptative
5-Rappels sur la réponse immunitaire: activation des lymphocytes T par les cellules
présentatrices d’antigène
5-Rappels sur la réponse immunitaire: phénotypes Th1 et Th2 des lymphocytes T
Quelques rappels: immunité adaptative humorale et cellulaire
Quelques rappels: immunité adaptative humorale et cellulaire
6-Le mécanisme d’entrée de calcium après mobilisation de
calcium intracellulaire: protéines ORAI et STIM
•
L’entrée de Ca2+ par des CRAC est requise pour l’activation, la différenciation, la multiplication et
la cytotoxicité des lymphocytes T après activation antigénique (TCR). Ce mécanisme se retrouve
aussi pour les lymphocytes B (BCR).
•
Les canaux CRAC sont codés par les protéines ORAI (3 isoformes, ORAI1 la plus répandue). Ce
sont des protéines à quatre segments transmembranaires qui forment un pore pour les ions
Ca2+ en s’organisant en tétramères.
•
Les protéines ORAI interagissent avec les protéines STIM1 ou STIM2 ceci permet un flux
calcique à travers les canaux ORAI.
•
La protéine STIM1 est intégrée à la membrane du RE. La diminution de Ca2+ du RE modifie sa
conformation et produit son oligomérisation. Le changement de conformation permet la
translocation de STIM1 et met à jour des sites d’interaction avec la protéine ORAI (domaines
‘coil-coiled’).
•
L’inactivation est produite par plusieurs mécanismes, le plus rapide étant produit par le Ca2+ luimême qui se lie sur un domaine calmoduline de STIM1. La régulation se produit par recapture
du Ca2+ dans les organites intracellulaires dont la mitochondrie.
•
L’augmentation de Ca2+ initiale est générée par l’activation du TCR par les protéines
antigéniques qui conduit à l’activation de la phopholipase Cγ.
Mécanisme de stimulation d’un flux calcique à travers ORAI après activation du TCR ou BCR
Lymphocytes T et Ca2+ intracellulaire
Activation de la PLCγ
•
Cette phospholipase C n’est pas activée par Gq mais par un récepteur à activité
tyrosine kinase (RTK);
•
Cette phopholipase C comporte dans sa structure les domaines SH2 (src homology
domain) qui permettent la reconnaissance des tyrosines phosphorylées:
•
Ainsi, l’autophosphorylation sur tyrosine d’un RTK recrute la PLCγ et l’active. Pour les
lymphocytes T c’est un peu moins direct (voir diapo suivante)
Domaines SH2
RTK
activé
Tyr-P
PLCγ
Tyr-P
IP3
PIP2
Les domaines SH2 reconnaissent les tyrosines phophorylées alors que les domaines SH3
reconnaissent les domaines riches en prolines.
Les protéines des voies activées par des RTK comportent ces domaines SH2 et SH3. Quelques
exemples :
TCR
CD3
PIP2
PLCγγ
P
P
ζζ
Lck
Elle fait intervenir plusieurs intermédiaires activés par
phosphorylation sur tyrosines: CD3 est phosphorylée par Lck.
Cette phosphorylation est reconnue par ZAP70 qui s’active et est
à son tour phosphorylée. Les phosphorylations sur ZAP70 sont
reconnues par les protéines LAT et SLP76. Enfin, la
phosphorylation sur tyrosine sur LAT est reconnue par la PLCγ
qui s’active à son tour.
P
P
SLP-76
Activation de la PLCγ dans les lymphocytes T:
P
ZAP-70
LAT
IP3 et DAG
Structure des protéines ORAI et STIM
Monomère ORAI1
Domaine de liaison au Ca2+
Tétramère ORAI1
Domaine de liaison à ORAI
(ou CAD CRAC ’Activating Domain’)
Interaction entre ORAI et STIM
Les étoiles rouges marquent les mutations
rencontrées dans des pathologies humaines
(voir plus loin).
Après activation du système, il y a une régulation produite par le Ca2+ lui-même qui diminue
l’interaction entre ORAI1 et STIM1. De plus la recapture de Ca2+ dans le RE par la SERCA conduit à
la ‘dé-oligomérisation’ de STIM1. Enfin le Ca2+ est régulé notamment par capture dans la
mitochondrie par le mCU.
7-La voie NFAT
L’augmentation de calcium produite par l’activation du TCR entraîne l’activation de la voie
intracellulaire NFAT ou ‘Nuclear Factor of Activated T-cells’. Ce facteur transloque dans le noyau suite
à sa déphosphorylation par une phosphatase, la calcineurine, elle-même activée par la calmoduline
liée au Ca2+.
L’activation de NFAT est cruciale pour la différentiation et la synthèse d’interleukines. Elle se rencontre
dans d’autres types de cellules immunitaires (voir plus loin).
Autre facteurs NF-kB, MEF
Model for Ca2+-dependent T cell activation.
Ariel Quintana et al. PNAS 2007;104:14418-14423
©2007 by National Academy of Sciences
7-La voie NFAT
La voie NFAT est présente dans la plupart des cellules. Elle est impliquée notamment
dans la morphogénèse au cours du développement.
8-Rôle de l’entrée de calcium par libération des stocks
intracellulaires dans l’activation des lymphocytes T (et B)
Les mutations qui conduisent à une perte d’activité des CRAC sur les cellules immunitaires
ont permis de mettre en évidence l’importance de ce mécanisme dans la réponse
immunitaire:
-L’activation des CRAC est essentielle pour la réponse immunitaire produite par les cellules
T, B, NK. Elle requise pour la réponse face à une infection. Elle est nécessaire à la
différenciation et prolifération des cellules T CD4+ et à leur production de cytokines (ILx).
-Elle est nécessaire à la libération de perforine et granzyme des cellules T CD8+ à la
synapse immunitaire.
- Elle est nécessaire à la libération de cytokines et toxines par les cellules NK.
-Elle est importante pour l’activité des lymphocytes T régulateurs (tolérance immunitaire)
Mutants de ORAI1 et STIM1/2 : impact sur l’entrée capacitive et la production d’interleukines
Mutant ORAI1
Mutant STIM1/2
Mutant STIM1 Mutant STIM1/2
Mutant ORAI1
Mutant STIM1
A partir de cellules T de souris mutantes, on mesure l’effet des mutations sur l’entrée de calcium et sur la
production d’interleukines (IL-2 et IFNγ). On constate que les mutations affectent fortement ces deux
paramètres.
L’entrée de calcium par les CRAC est requise pour la différenciation des lymphocytes T.
L’entrée de calcium par les CRAC est commune à la plupart des cellules immunitaires
9-Pathologies associées aux mutations des protéines ORAI et STIM
Immunodéficience associée à des mutations inactivant l’entrée de calcium par les CRAC
Des mutations de ORAI1 et STIM1 qui abolissent
l’activation des CRAC dans les cellules T, B, NK et
neutrophiles, sont associées à des formes
d’immunodéficience d’origine génétique. Ce sont des
‘canalopathies’
Ainsi des mutations autosomiques récessives de ORAI1 et
STIM1 sont associées avec des signes cliniques
particuliers à savoir, d’abord, une forte immunodéficience,
même si le nombre des lymphocytes est inaltéré voire
augmenté, mais aussi l’autoimmunité .D’autres signes non
reliés au système immunitaire sont observés:
l’hépatosplénomégalie, l’amélogénèse imparfaite, la
dystrophie musculaire.
Ainsi, au niveau musculaire, on observe que l’activité des
CRAC est importante pour l’activité (voir plus loin).
Mutations recensés dans l’immunodéficience sévère.
En jaune les mutations qui affectent essentiellement la fonction des lymphocytes mais
pas leur nombre.
En rouge les mutations qui affectent le nombre et la fonction des lymphocytes
Diminution de l’expression de l’ARNm et de la protéine
Diminution de l’expression de la protéine
Perte de fonction de la protéine
Mutations de ORAI1 et STIM1 rencontrées chez l’humain
Détection de déficits de l’entrée de calcium CRAC chez individus immunodéficients hétérozygotes pour
des mutations de ORAI1 ou STIM1. Globalement, ces mutations affectent fortement l’entrée de calcium
dans les lymphocytes de ces patients.
Familles portant les mutations d’ORAI1 ou STIM1
Les carrés et ronds noirs marquent les individus homozygotes et le trait les individus
décédés. Les ronds et carrés marqués d’un point noir marquent les individus
hétérozygotes (lorsqu’ils ont été génotypés).
Tableau clinique des individus homozygotes portant les mutations d’ORAI1 ou
STIM1 et présentés dans la figure précédente.
10-Autres voies d’entrée de calcium dans les lymphocytes:
Même si l’entrée de calcium par les CRAC semble prépondérante sur les
lymphocytes, d’autres voies d’entrée sont possibles:
-les récepteurs P2X (sensibles aux purines , notamment l’ATP)
-les canaux voltage dépendant de type L
-Les canaux de type TRP (TRPC et TRPM)
Le rôle exact de ces entrées de calcium dans l’activation des lymphocytes reste à
démontrer. Toutefois, ces entrées de calcium semblent amplifier les entrées par les
CRAC.
D’autres canaux comme des canaux potassiques ouverts par l’augmentation de
calcium intracellulaire régulent l’activité des lymphocytes par hyperpolarisation du
potentiel de membrane.
Autres voies d’entrée de calcium dans les lymphocytes
Cas des P2X
11-Les CRAC dans d’autres types cellulaires:
1-les cellules musculaires
Tubule T
CRAC
STIM1
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Réticulum sarcoplasmique
Récepteurs ryanodine
Canaux L
Ca2+
Ca2+
Même si la contraction musculaire repose en grande partie sur le phénomène de calcium induced calcium
release entre les canaux L et les récepteurs ryanodine, il apparaît que l’ouverture de CRAC est aussi
nécessaire à la contraction musculaire.
Par ailleurs, la présence des protéines ORAI1 et STIM1 est absolument requise pour le développement
normal des myotubes [d’où les problèmes de myopathie chez les patients portant des mutations de ces
protéines].
2-les plaquettes
L’activation des CRAC représente l’entrée principale de
calcium dans les plaquettes en particulier après
activation de RCPGs couplés à Gq comme les P2Y ou
ceux de la thrombine (Protease Activated Receptors).
L’activation des CRAC conduit à la thrombose et
l’hémostase.
Dans ce cas des bloqueur s de l’entrée de calcium par
les CRAC pourraient avoir un effet anti-thrombique.
3-les cellules cancéreuses
De manière globale, l’entrée de calcium par les CRAC a plutôt un effet positif sur la cancérisation,
même si dans certains cas le calcium exerce un effet pro-apoptotique sur les cellules cancéreuses.