Thèse de doctorat
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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU --------------École Doctorale Sciences et Technologies --------------Laboratoire de Biologie et de génétique moléculaires (Labiogene) No d’ordre ……… Thèse Présentée Par Cyrille BISSEYE Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Ouagadougou Option Sciences Biologiques Appliquées Réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre les antigènes de Plasmodium falciparum candidats vaccins dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière (Gambie) Soutenue le 14 Décembre 2011 devant le jury composé de : Président : David MODIANO, Professeur Titulaire, Université de Rome La Sapienza (Italie) Membres : Yves TRAORE, Maître de Conférences, Université de Ouagadougou (Rapporteur) Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thèse) Virginio Pietra, Chargé de Recherches, Université de Brescia (Italie) DEDICACES Je dédie cette thèse de Doctorat : A Feu Mon Père ANGOGHE NDONG ROBERT GUY pour l’amour, la patience et l’amitié. A ma grand-mère AGNEGHE MARIE pour avoir fait de moi un homme. A ma mère NZE ANTOINETTE (La rose), pour l’amour, la lumière et les prières. A CYRIANE QUESSIA MARY pour être la raison de croire même quand les nuages s’amoncèlent. A DZIMEZE MBA JEAN, EMANE, BISSOUE Bi Ekoh ALBERT, ESSINGONE ANGOGHE THIERRY pour l’aide précieuse et les encouragements dans les moments de doute. A mes Frères, Sœurs, Parents et Amis, pour votre soutien moral, pour être ma famille et pour tous vos encouragements tout au long de ces années. A Yâ Nse et A Yâ Katoue A BETTY, VIVIE et LUCILE. A mes Oncles OYE MENGOME, NKOUBA, NTSAME, WAGHA, ANGWE, NTOUTOUME, EKOMI, NDONG, BITEGHE OBAME pour l’aide et le soutien pendant mes études. A mon frère et ami BATOUME CELESTIN pour l’amitié et le soutien dans nos différentes aventures. A tous mes amis et collegues de FANGUINOVENY, MELEN et de l’EDR (Franceville). Je n’oublie pas tous les frères et les sœurs d’ADOUMA (Lambaréné), mes compagnons de toujours. 2 REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé en partie au Laboratoire dirigé par le Docteur Jamila Ismaili au Medical Research Council (MRC) en Gambie, mais aussi au Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de l’UFRSVT, Université de Ouagadougou), du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) dirigé par le Professeur Jacques SIMPORE. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Professeur Jacques SIMPORE, Directeur de cette thèse, membre du jury et Directeur de plusieurs institutions : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de l’UFR/SVT, Université de Ouagadougou) ; Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) ; Laboratoire du Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou et Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin (USTA). Le Professeur SIMPORE est le principal promoteur de la présente thèse, merci pour votre soutien moral et financier, pour la qualité de l’encadrement scientifique, pour vos précieux conseils et votre disponibilité en dépit de vos multiples fonctions. Je remercie également le Docteur Jamila Ismaili pour la fructueuse collaboration au MRC en Gambie sans laquelle cette thèse n’aurait peut-être pas aboutie. Je remercie également le Professeur David Modiano (Université de Rome La Sapienza) qui a bien voulu accepter d’évaluer et de présider le jury de cette thèse. Je remercie Le Professeur Elie Mavoungou, Directeur de Recherches qui a bien voulu lire et juger la présente thèse. Mes remerciements vont aussi au Professeur Yves Traoré (Université de Ouagadougou) qui a accepté de juger la présente thèse. Je remercie Le Docteur Virginio Pietra, Médecin épidémiologiste, chargé de recherches (Université de Brescia, Italie), qui a bien voulu participer au jury de la présente thèse. 3 Je remercie aussi les Professeurs Bernard Vray et Sylvain Meuris de l’Université Libre de Bruxelles. Je remercie le Professeur Bernard Vray pour m’avoir accueilli et initié à l’immunologie dans son laboratoire à l’université Libre de Bruxelles. Le Professeur Vray me fait aussi la grande amitié de relire cette thèse et donc d’en améliorer la qualité, Professeur je vous en remercie infiniment. Je remercie également le Professeur Anthony Holder (National Institute of Medical Research, MRC, UK) pour la précieuse collaboration dans la préparation de mes publications. Je remercie également le Docteur Giorgio Sirugo (Université de Rome) pour notre collaboration en Gambie et pour son aide précieuse. Je voudrais aussi adresser mes remerciements au Docteur Mahamoudou Sanou Directeur du Centre National de Transfusion sanguine pour notre fructueuse collaboration. Je remercie Mr Bolni Marius Nagalo pour la sympathie, la franche collaboration mais aussi pour les bons repas chez Tantine. J’adresse mes remerciements à Dénis, Lucien, Robert, Georges et Patrice du Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou pour leur sympathie pendant toutes ces années. Mes remerciements s’adressent aussi à l’ensemble de l’équipe du CERBA/LABIOGENE, Djeneba, Florencia, Tani, Zoenabo, Zeba, Rémy, Bazié, Désiré, Stella Laure pour les moments d’échanges et de partage au laboratoire. Je remercie aussi mes amis de toujours, Guy Pierre Biteghe, Endama Mbang Anicet (Ziggy), Ango Billie Alix qui malgré les années et la distance ont su garder le contact. Je remercie enfin mon frère Engone Moure Engone Wilfried pour avoir été souvent le lien avec la famille. 4 TABLE DES MATIERES DEDICACES ........................................................................................................................................................... 2 REMERCIEMENTS................................................................................................................................................. 3 TABLE DES MATIERES .......................................................................................................................................... 5 LISTE DES FIGURES .............................................................................................................................................10 LISTE DES TABLEAUX .........................................................................................................................................11 SIGLES ET ABREVIATIONS ..................................................................................................................................12 RESUME ..............................................................................................................................................................15 INTRODUCTION .................................................................................................................................................18 Objectifs de la thèse ..........................................................................................................................................19 I. GENERALITES .............................................................................................................................................21 I.1. Situation globale et historique ...............................................................................................................21 I.1.1. Situation globale du paludisme ......................................................................................................21 I.1.2 Historique et pathologie ..................................................................................................................21 I.2. Le parasite ...............................................................................................................................................23 I.2.1. Cycle de vie de Plasmodium............................................................................................................23 I.2.2. Pathogenèse du paludisme .............................................................................................................25 I.2.2.1. La Séquestration .......................................................................................................................25 I.2.2.2.Les Rosettes ...............................................................................................................................26 I.2.2.3. La Variation antigénique..........................................................................................................26 I.2.3. Antigènes de surface de P. falciparum...........................................................................................27 I.2.3.1. Antigène de surface du mérozoïte 1 (MSP1)..........................................................................27 I.2.3.2. Apical membrane Antigen-1 (AMA1) ......................................................................................31 I.2.3.3. Protéine Circumsporozoite (CSP) .............................................................................................32 I.3. La maladie ................................................................................................................................................33 I.3.1. Caractéristiques cliniques ...............................................................................................................33 I.3.1.1. Le paludisme simple .................................................................................................................34 5 I.3.1.2. Paludisme grave .......................................................................................................................34 I.3.2. Paludisme et grossesse ...................................................................................................................35 I.3.3. Epidémiologie du paludisme ...........................................................................................................37 I.3.4. Résistance des parasites aux médicaments antipaludiques.........................................................40 I.3.4.1. Résistance à la chloroquine .....................................................................................................40 I.3.4.2. Résistance à la pyrimethamine-sulfadoxine ...........................................................................41 I.3.4.3. Résistance à la quinine.............................................................................................................42 I.3.4.4. La résistance à la méfloquine ..................................................................................................42 I.4. Paludisme à P. falciparum et vaccination..............................................................................................43 I.4.1. Vaccins pré-érythrocytaires ............................................................................................................44 I.4.2. Vaccins érythrocytaires ...................................................................................................................45 I.5. Immunité antipalustre ............................................................................................................................46 I.5.1. Mécanismes effecteurs de protection contre le paludisme .........................................................46 I.5.1.1 Immunité au stade pré-érythrocytaire .....................................................................................46 I.5.1.2. Immunité au stade érythrocytaire...........................................................................................48 I.5.1.3. Immunité dirigée contre les antigènes variables de surface .................................................50 I.5.1.4. Mémoire immunologique ........................................................................................................51 I.5.2. Rôle des cytokines dans l’infection palustre..................................................................................52 I.5.2.1 Cytokines pro-inflammatoires et paludisme ............................................................................52 I.5.2.1.1. TNF- .................................................................................................................................52 I.5.2.1.2. Interféron-gamma (IFN-).................................................................................................53 I.5.2.1.3. L’interleukine-12 (IL-12) ...................................................................................................54 I.5.2.2. Cytokines anti-inflammatoires ................................................................................................55 I.5.2.2.1. Interleukine-4 ....................................................................................................................56 I.5.2.2.2. Facteur de croissance transformant-beta (TGF-β)..........................................................56 I.5.2.2.3. L’interleukine-10 (IL-10) ...................................................................................................57 I.5.3. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ...............................................................................58 6 I.5.3.1 Les cellules dendritiques (DC) ...................................................................................................59 I.5.3.2. Les lymphocytes B.....................................................................................................................59 I.5.3.3. Les macrophages/monocytes ..................................................................................................60 I.5.4. Stratégies d’évasion immunitaire ...................................................................................................60 I.5.4.1. Altération des ligands peptidiques ..........................................................................................60 I.5.4.2. Altération des cellules présentatrices d’antigènes.................................................................61 I.5.5. Rôle des cellules T régulatrices naturelles dans l’infection palustre ...........................................61 I.5.5.1. Rôle des Tregs naturelles dans le contrôle de l’infection palustre chez les rongeurs ..........63 I.5.5.2. Rôle des cellules Tregs naturelles dans le contrôle du paludisme cérébral expérimental...64 I.5.5.3. Rôle des cellules T régulatrices dans le contrôle du paludisme chez l’homme.....................65 II. Matériels et méthodes..................................................................................................................................68 II.1. Populations d’étude ...............................................................................................................................68 II.2. Mesure des anticorps dirigés contre P. falciparum par Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................................................................................................................................................70 II.2.1. ELISA MSP119 et AMA1 ...................................................................................................................70 II.2.2. ELISA pour mesurer les anticorps anti-R32LR (CSP) .....................................................................71 II.3. Culture in vitro de P. falciparum et préparation d’extraits de schizontes .........................................72 II.4. Séparation et analyse des cellules T CD4+CD25+..................................................................................73 II.5. Culture des cellules mononuclées du sang de cordon ........................................................................73 II.6. Détection des cellules T CD4+ productrices d’IFN-γ par culture ELISPOT (Enzyme Linked Immunoassay Spot) .......................................................................................................................................74 II.7. Extraction de l'ARN et transcription inverse de Foxp3........................................................................75 II.8. Génotypage de la G6PD et de l’hémoglobine S par PCR en temps réel...........................................75 III. Résultats........................................................................................................................................................78 III.1. Article I. L’infection placentaire par Plasmodium falciparum interfère sur l’équilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales à travers les cellules T régulatrices CD4+CD25+FoxP3+ et la production d’IL-10 ...78 III.1.1. But de l’étude.................................................................................................................................78 III.1.2. Population ......................................................................................................................................78 III.1.3. Résultats .......................................................................................................................................79 IV.1.3.1 Fréquence des cellules T CD4+CD25+ FoxP3+ parmi les CMSCs .............................................79 7 III.1.3.2. Effet des cellules T régulatrices sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponse à la stimulation par la PHA ....................................................................................................80 III.1.3.3. Effets des Tregs sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponses aux globules rouges intacts parasités et aux antigènes de P. falciparum ...............................................82 III.1.3.5. Effet de l'IL-10 sur la production des cytokines Th1/Th2 par les CMSCs ............................84 III.1.4. Conclusion ......................................................................................................................................85 III.2. Article II. Un variant de la protéine de 19 kilodaltons de l’extrémité C-terminal du Merozoite Surface Protein 1 de Plasmodium falciparum candidat vaccin induit des taux élevés d’IFN-gamma associés à des réponses immunitaires cellulaires à des séquences peptidiques spécifiques chez les adultes gambiens naturellement exposés au paludisme ...........................................................................86 Clinical and Experimental Immunology (2011), 166 (3):366-73 ............................................................86 III.2.1. But de l’étude.................................................................................................................................86 III.2.2. Population ......................................................................................................................................87 III.2.3. Résultats .........................................................................................................................................87 III.2.3.1. Réponses des adultes gambiens aux protéines MSP119 par ELISPOT en culture................87 III.2.3.2. Production des cytokines en réponses aux protéines MSP119 .............................................87 III.2.3.3. Réponses des adultes gambiens aux peptides MSP119 par ELISPOT en culture .................87 III.2.3.4. Production de cytokines en réponse aux peptides mutants et sauvages de MSP119 .........91 III.2.3.5.Typage HLA-DR et présentation des peptides MSP119 aux cellules T CD4+ .........................91 III.2.4. Conclusion ......................................................................................................................................94 III.3. Article III. Comparaison des réponses humorales dirigées contre CSP, AMA1 et MSP119 et la susceptibilité au paludisme chez les Peuls, Wolofs et Mandingues de Gambie...........................................95 Article soumis pour publication ...................................................................................................................95 III.3.1. But de l’étude.....................................................................................................................................95 III.3.2. Population ..........................................................................................................................................96 III.3.3. Résultats .............................................................................................................................................96 III.3.3.1. Caractéristiques des participants de l’étude ..........................................................................96 III.3.3.2. Comparaisons interethniques de l'incidence du paludisme ....................................................96 III.3.3.3. Comparaisons interethniques dans la réponse humorale à CSP, AMA1 et MSP119 ...............98 III.3.3.4. Association anticorps et incidence du paludisme et de la parasitémie ................................101 III.3.4. Conclusion ........................................................................................................................................105 8 IV. Discussion générale ...................................................................................................................................106 V. Conclusion générale ....................................................................................................................................118 VI. Perspectives................................................................................................................................................120 Bibliographie ....................................................................................................................................................122 Annexes ............................................................................................................................................................163 9 LISTE DES FIGURES FIGURE 1. DISTRIBUTION DU PALUDISME À P. FALCIPARUM EN FONCTION DE L'ENDÉMICITÉ EN 2007. ...........22 FIGURE 2. CYCLE DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET MÉCANISMES IMMUNITAIRES DE L’HÔTE À CHAQUE PHASE DU CYCLE DU PARASITE. ............................................................................................................24 FIGURE 3. RÉCEPTEURS DE L’HÔTE IMPLIQUÉS DANS LA SÉQUESTRATION DU GLOBULE ROUGE INFECTÉ PAR P. FALCIPARUM. ....................................................................................................................26 FIGURE 4. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DE MSP1 DE P. FALCIPARUM...............................................28 FIGURE 5. ASSEMBLAGE ET PROCESSING DU COMPLEXE MSP1. ............................................................28 FIGURE 6. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE D’AMA1. .......................................................................31 FIGURE 7. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DE CSP ET DU VACCIN RTS, S..............................................33 FIGURE 8. EFFET DU PALUDISME PENDANT LA GROSSESSE SUR LA SANTÉ MATERNELLE, NÉONATALE ET INFANTILE. ......................................................................................................................................36 FIGURE 9. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DU POSSIBLE MÉCANISME D’ACTION DE L’IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE DIRIGÉE CONTRE LE STADE SANGUIN DE PLASMODIUM ..................................................49 FIGURE 10. MÉCANISMES DE BASE UTILISÉS PAR LES TREGS .................................................................62 FIGURE 11. (A) CONTRÔLE DE QUALITÉ DE LA DÉPLÉTION DES CELLULES T CD4+CD25+ (B) EXPRESSION DE L’ARNM FORKHEAD BOX P3 (FOXP3) ET (C) PRODUCTION DE L’IL-10 APRÈS STIMULATION PAR LA PHA PENDANT 18 H...................................................................................................................79 FIGURE 12. POURCENTAGE DES CELLULES TREGS CHEZ LES CMCS PARASITÉS OU NON PARASITÉS. .................80 FIGURE 13. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES CMSCS EN RÉPONSE À LA PHYTOHÉMAGGLUTININE (PHA)...81 FIGURE 14. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES CMSCS EN RÉPONSE AUX GLOBULES PARASITÉS ET AUX ANTIGÈNES DE P. FALCIPARUM. ..............................................................................................83 FIGURE 15. LE TRAITEMENT DES CULTURES CELLULAIRES AVEC DES ANTICORPS ANTI-IL-10 RESTAURE LA PRODUCTION D’IFN- DANS LE GROUPE DE PLACENTAS PARASITÉS. .................................................84 FIGURE 16. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES PBMC EN RÉPONSE AUX PROTÉINES MSP119. ..................89 FIGURE 17. (A) FRÉQUENCE DES DONNEURS ET DES CELLULES SÉCRÉTRICES D’IFN- EN RÉPONSE AUX PEPTIDES DE MSP-119 CHEZ 43 ADULTES GAMBIENS EXPOSÉS AU PLASMODIUM. ...............................................90 FIGURE 18. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES PBMCS EN RÉPONSE AUX PEPTIDES MSP-119. ..................92 FIGURE 19. CONCENTRATION EN IGG, IGG1 ET IGG3 ANTI-CSP, ANTI-AMA1 ET ANTI-MSP119 CHEZ LES PEULS, WOLOFS ET MANDINGUES. .......................................................................................102 FIGURE 20. COURBE DE SURVIE DE KAPLAN-MEIER REPRÉSENTANT LES RÉPONSES HUMORALES ET L’INCIDENCE DU PALUDISME DANS LES 3 GROUPES ETHNIQUES PEUL , MANDINGUE ET WOLOF . ........................... 104 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 10 LISTE DES TABLEAUX TABLEAU I : DONNÉES ÉPIDÉMIOLOGIQUES DES FEMMES GAMBIENNES DE SUKUTA....................................78 TABLEAU II. SÉQUENCE DES PEPTIDES MUTANTS ET SAUVAGES DE MSP119 .............................................88 TABLEAU III. ALLÈLES HLA-DR CLASS II DÉTECTÉS DANS LA POPULATION D’ÉTUDE. ...................................93 TABLEAU IV. CARACTÉRISTIQUES DES PARTICIPANTS DE L’ÉTUDE ET DE LA RÉPONSE HUMORALE AUX ANTIGÈNES DE P. FALCIPARUM CSP, AMA1 ET MSP119 À L’INCLUSION .........................................................97 TABLEAU V. CARACTÉRISTIQUES DES PARTICIPANTS DU GROUPE À L’ENRÔLEMENT ET INCIDENCE DU PALUDISME EN ASSOCIATION AVEC LES TAUX D’IGG ANTI-AMA1, ANTI-MSP119 ET ANTI-CSP AJUSTÉS POUR LES FACTEURS CONFONDANTS. ....................................................................................................99 TABLEAU VI. RÉPONSES IMMUNITAIRES HUMORALES À P. FALCIPARUM À L'ENRÔLEMENT DANS LES 3 GROUPES ETHNIQUES ..................................................................................................................... 101 TABLEAU VII. INCIDENCE DU PALUDISME EN ASSOCIATION AVEC LES TAUX DES SOUS-CLASSES D’IGG ANTI- AMA1, CSP ET MSP119 AJUSTÉS POUR TOUS LES FACTEURS CONFONDANTS..................................103 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 11 SIGLES ET ABREVIATIONS Ac Anticorps ADCI Immunité cellulaire dépendante d’anticorps ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire ARN Acide Ribonucléique AMA1 Antigène apical de la membrane du mérozoite AMPc Adénosine monophosphate cyclique BCR Récepteur du lymphocyte B CD Groupe de différenciation CERBA Centre de recherche Biomoléculaire Pietro CIDR Région inter-domaine riche en cystéine CMH Complexe majeur d’histocompatibilité CMSC Cellules mononuclées du sang de cordon CPA Cellule présentatrice d’antigène CSP Protéine circumsporozoite CSA Sulfate de Chondroïtine A CR1 Récepteur du complément 1 CTLA-4 Antigène du lymphocyte T Cytotoxique DI Domaine I DII Domaine II DIII Domaine III DBL Duffy Binding-Like DC Cellule dendritique DO Densité optique DHFR Dihydrofolate réductase DHPS Dihydropteroate synthétase EBA Erythrocyte Binding Antigen Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 12 EDTA acide éthylène diamine tétracétique EGF Eperdimal growth factor ELISA Enzyme-Linked immunosorbent assay ELISPOT Enzyme-Linked immunospot EIR Taux d'inoculation entomologique FITC Fluorescéine isothiocyanate FOXP3 Forkhead box protein 3 GADPH Glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase GM-CSF Facteur de croissance de colonies de granulocytes et de macrophages GLURP Protéine riche en Glutamine GPI Glycosylphosphatidylinositol G6PD Glucose 6 phosphate déshydrogénase GYP Glycophorine Hb Hémoglobine HLA antigènes des leucocytes humains ICAM1 molécule d’adhésion intercellulaire IDO Indolamine 2,3 dioxygénase IFN Interféron Ig immunoglobuline IL Interleukine kDa Kilo dalton LAG-3 Gène d’activation du Lymphocyte MSP1 Antigène de Surface du Merozoïte 1 MSP2 Antigène de Surface du Merozoïte 2 MSP3 Antigène de Surface du Merozoïte 3 MSP119 Fragment de 19 kilo daltons de MSP1 NK Cellule tueuse naturelle NO Monoxyde d’azote NOS Oxyde nitrique synthétase iNOS Oxyde nitrique synthétase inductible Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 13 PBMC cellules mononuclées du sang circulant PCR Réaction en Chaîne par Polymérase PE Phycoérythrine PHA Phytohémagglutinine Pf Plasmodium falciparum PfAMA1 AMA1 de Plasmodium falciparum PfCRT Plasmodium falciparum Chloroquine resistance transporter PfEMP1 Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 Pfmdr1 Plasmodium falciparum multidrug resistance 1 RT-PCR PCR en temps réel SERA5 Serine repeat Antigen 5 STAT4 Facteur de transcription 4 T CD4+ Lymphocytes T CD4+ T CD8+ Lymphocytes T CD8+ TCR Récepteur du lymphocyte T TGF Facteur de croissance transformant Th Lymphocyte T auxiliaire TNF facteur de nécrose tumorale Tregs Cellules T régulatrices VSA Antigène variable de surface Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 14 RESUME Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique en Afrique subsaharienne. Du fait de la résistance du parasite aux antimalariques, et du vecteur aux insecticides, le contrôle voire même l’éradication de la maladie passe par la mise au point d’un vaccin efficace. À ce stade de la recherche aucun vaccin efficace n’a été mis sur le marché. La mise au point d’un vaccin se heurte à la complexité du parasite. Différents antigènes du parasite sont des candidats vaccins en phase d’essai clinique. La présente thèse est une contribution à l’étude de l’immunité humorale et cellulaire contre les antigènes candidats vaccins AMA1, CSP et MSP119 dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière. Nous avons étudié le rôle des cellules T régulatrices dans la réponse Th1/Th2 des cellules T néonatales. Nous avons montré que l’infection placentaire influence la différentiation Th1 des cellules T néonatales en impliquant les cellules T régulatrices à travers la production d’IL10. La réponse immunitaire cellulaire a été aussi évaluée en étudiant l’antigénicité d’une protéine triple mutant de MSP119 chez des Gambiens adultes naturellement exposés au paludisme. Cette protéine MSP119 triple mutant est responsable d’une production plus élevée d’IFN-γ que la protéine native par les PBMCs de Gambiens adultes. La réponse humorale dirigée contre les antigènes de P. falciparum a été évaluée en étudiant les différences interethniques des réponses humorales dirigées contres ces derniers chez des Peuls de Gambie et des groupes ethniques sympatriques Wolofs et Mandingues. Nous avons montré, contrairement aux études précédentes, que l’incidence du paludisme, la prévalence parasitaire et les réponses humorales dirigées contre les antigènes de P. falciparum étaient les mêmes chez les Peuls de Gambie comparativement aux groupes ethniques Wolofs et Mandingues. Mots-clés : Immunité, Lymphocyte T, anticorps, groupe ethnique, Tregs. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 15 ABSTRACT Malaria remains a major public health problem in sub-Saharan Africa. Because of parasite resistance to antimalarial drugs and vectors to insecticides; control even eradication of the disease necessites the development of an effective vaccine. At this stage of researches, no effective vaccine is available on the market. The development of a vaccine is hampered by the complexity of the parasite. Different parasite antigens which are vaccine candidates are actually tested clinically. The present thesis is a contribution to the humoral and cellular immunity against antigens vaccine candidates AMA1, MSP119 and CSP in an area of malaria seasonal transmission. We studied the role of regulatory T cells in the neonatal T cells Th1/Th2 bias and found that Plasmodium placental infection influence the Th1 differentiation of neonatal T cells through regulatory T cells and IL-10. The cellular immune response was also assessed by studying the antigenicity of a triple mutant MSP119 protein among Gambian adults naturally exposed to malaria. The triple mutant MSP119 protein showed a higher production of IFN-γ than the native protein by PBMCs of adult Gambians. The antibody responses directed against P. falciparum antigens were assessed by studying the inter-ethnic humoral differences in the Gambian Fulani and the sympatric ethnic groups Wolof and Mandinka. In contrast to previous reports, we found that the prevalence and the incidence of malaria parasite as well as humoral responses directed against P. falciparum antigens were the same in the Gambian Fulani compared to Wolof and Mandinka. Keywords: immunity, T cells, antibodies, ethnic group, Tregs. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 16 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 17 INTRODUCTION Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique en Afrique subsaharienne. En effet, le paludisme continue d’y tuer les enfants, essentiellement ceux de moins de cinq ans. Les femmes enceintes payent aussi un lourd tribut dans la morbidité palustre. Du fait de la complexité du parasite à travers son cycle de vie, de sa résistance aux antipaludiques, des échecs observés dans la lutte anti vectorielle et d’une compréhension incomplète des mécanismes immunitaires assurant la protection de l’hôte contre la maladie; le développement d’un vaccin anti palustre est l’outil qui permettrait le contrôle de l’infection voire même son éradication. Le développement d’un vaccin anti palustre se heurte non seulement à la complexité du parasite à travers, son polymorphisme et sa variation antigénique, mais aussi à la complexité des interactions entre le parasite et le système immunitaire de l’hôte. Dans les régions hyper endémiques pour le paludisme, les adultes sont mieux protégés que les enfants contre les formes sévères de la maladie. Cela, met en évidence un mécanisme de protection des adultes, protection acquise au cours de longues années d’exposition au parasite. Les mécanismes immunitaires responsables de cette protection ne sont pas bien connus. Il a été montré que le parasite induit chez l’hôte de fortes réponses immunitaires humorales et cellulaires. Ces réponses sont dirigées contre les antigènes du parasite dont certains sont considérés comme de potentiels candidats vaccins. La présente thèse est une contribution à une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires humoraux et cellulaires dirigés contre les antigènes de Plasmodium falciparum candidats vaccins. Les différentes études qui font l’objet de cette thèse ont été menées en Gambie, dans une région où la transmission du paludisme est saisonnière. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 18 Objectifs de la thèse Objectif principal Le principal objectif de ce travail est l’étude des réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre quelques antigènes de P. falciparum candidats vaccins dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière. Objectifs spécifiques Ce travail se décompose en trois principaux objectifs spécifiques qui sont : L’étude du rôle des cellules T régulatrices dans le biais Th1/Th2 des cellules T néonatales L’évaluation de l’antigénicité des peptides et des protéines du candidat vaccin MSP119. L’évaluation des réponses humorales dirigées contre les antigènes candidats vaccins MSP119, AMA1 et CSP chez des sujets appartenant aux principaux groupes ethniques de Gambie : Peul, Wolof et Mandinka. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 19 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 20 I. GENERALITES I.1. Situation globale et historique I.1.1. Situation globale du paludisme Selon les estimations mondiales en 2009, 225 millions de personnes étaient malades de paludisme et parmi elles, 781.000 personnes ont décédé de la maladie (OMS, 2010). Le nombre de personnes malades dans les zones endémiques d’Afrique subsaharienne et d’Asie du Sud-Est était respectivement de 176 et 49 milliions. L’Afrique subsaharienne avec 709.000 décès représentait 90% de la mortalité due au paludisme (OMS, 2010). La majorité d’épisodes cliniques à Plasmodium falciparum (P. falciparum), se produit en Afrique tropicale et en Asie du Sud-est avec respectivement 70% et 25% d’épisodes cliniques (Snow et al, 2005) (figure 1). Le paludisme est responsable en Afrique de 3000 décès par jour, la plupart des décès concernent les enfants de moins de cinq ans. La distribution du paludisme dans les régions endémiques du monde est définie en fonction du degré d'endémicité. Le paludisme est considéré comme endémique dans les zones où il y a une transmission constante au cours d’années successives. Le paludisme est dit hypo endémique dans les zones où la prévalence de l'infection est inférieure à 10%, et méso endémique dans les zones où la prévalence de l'infection se situe entre 11% et 50%. Dans les régions où la prévalence de l'infection est supérieure à 50%, les zones sont définies comme holo endémiques et hyper endémiques. I.1.2 Historique et pathologie Le parasite du paludisme, P. falciparum, a d'abord été décrit par Laveran en 1880 dans le sang d'un patient présentant des fièvres intermittentes. Les parasites du paludisme de l'homme appartiennent au genre Plasmodium, à la famille des Plasmodiidae, au sous-ordre des Haemospondiidae et à l’ordre des coccidies. Les parasites de l'homme appartiennent à deux sous-genres : Laverania et Plasmodium. Quatre espèces distinctes de Plasmodium sont traditionnellement reconnues comme étant des parasites de l’homme, il s’agit de: Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale et Plasmodium vivax. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 21 Figure 1. Distribution du paludisme à P. falciparum en fonction de l'endémicité en 2007. La couleur rouge claire indique les zones hypo endémiques, le brun rougeâtre les zones méso endémiques et le rouge foncé les zones holo et hyper endémiques (Hay et al, 2009) Trois parasites du paludisme sont exclusivement trouvés chez l’Homme, ce sont P. falciparum (Welch, 1897); P. vivax (Grassi, 1890); et P.ovale (Stephens, 1922). Le paludisme à P. malariae a été décrit aussi bien chez l’homme que chez les singes africains (Grassi, 1890). Toutefois, il est à noter que les infections par P. knowlesi (parasite simien) ont été rapportées chez l’homme à Bornéo (Singh et al, 2004). Les quatre espèces responsables du paludisme chez l'homme se retrouvent dans les régions tropicales et subtropicales du monde, mais leur répartition est variable: P. falciparum est le parasite répandu en Afrique subsaharienne; P. vivax est plutôt le parasite le plus fréquemment trouvé en Asie, en Amérique du Sud et Central alors qu'il est absent de l'Afrique de l'Ouest, la majorité de la population ne portant pas le facteur Duffy qu’ utilise le parasite pour entrer dans les globules rouges de l’hôte. P. malariae et P. ovale sont des parasites beaucoup moins fréquents dans la plupart des régions d'Afrique. La grande majorité des cas cliniques de la maladie et notamment la quasitotalité des décès liés au paludisme sont dues à P. falciparum. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 22 I.2. Le parasite I.2.1. Cycle de vie de Plasmodium Tous les parasites du paludisme ont besoin de deux hôtes dans leur cycle de vie: l'hôte définitif où a lieu le développement sexuel (anophèle femelle) et l'hôte intermédiaire (l'homme par exemple) où se produit le développement sexuel (Figure 2). Le plasmodium, parasite haploïde adopte trois stratégies au cours de son cycle de vie pour proliférer. La première stratégie est sa capacité de croissance et de réplication intensive, réalisée grâce à trois stades différents. Le premier stade est l'oocyste qui se produit chez le moustique dans un processus appelé sporogonie. Le deuxième stade est la schizogonie préérythrocytaire (ou exo-érythrocytaire ou héatique) et le troisième stade est la schizogonie érythrocytaire qui se produisent tous les deux chez l’hôte intermédiaire. La deuxième stratégie adoptée par le parasite est la dispersion et l'invasion des cellules hôtes. Cette stratégie inclut : les stades mérozoïte, sporozoïte et ookinète du parasite. La troisième stratégie est la reproduction sexuée impliquant la formation des gamétocytes chez l'hôte vertébré, elle est complétée lors de la formation de l'ookinète chez l’anophèle femelle après un repas sanguin. Les trois stratégies du parasite sont indiquées dans le cycle de vie ci-dessous chez le moustique et chez l’hôte humain (Figure 2). Les sporozoïtes sont injectés dans la circulation sanguine avec la salive du moustique, et circulent pendant une courte période (2-30 min) avant d'entrer dans les hépatocytes. Dans les hépatocytes, les sporozoïtes se transforment en schizontes pré-érythrocytaires qui engendrent des mérozoïtes (stade hépatique de 5-15 jours). Un sporozoïte unique qui se divise peut donner naissance à un schizonte multinuclé de 30.000 mérozoïtes filles. Les mérozoïtes issus des schizontes hépatiques sont libérés dans la circulation et la phase érythrocytaire du cycle peut commencer. Chez P. falciparum, le cycle érythrocytaire dure 48 heures en fonction de la souche du parasite. Les mérozoïtes envahissent les globules rouges et se développent jusqu’au stade « ring » (anneaux) (0-24h), puis au stade trophozoïte (24-35h) et enfin au stade schizonte (35-48h) où les mérozoïtes sont produits. Les mérozoïtes sont libérés dans la circulation sanguine après la rupture des schizontes pour commencer un nouveau cycle érythrocytaire. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 23 Figure 2. Cycle de Plasmodium falciparum et mécanismes immunitaires de l’hôte à chaque phase du cycle du parasite. Adapté de Crompton et al, 2010. Certains parasites se différencient en gamétocytes, formes sexuées, qui sont repris par le moustique lors d'un repas sanguin. Les microgamétocytes (mâles) suibssent le phénomène d’exflagellation et fécondent les macrogamétocytes (femelles). Les gamétocytes sont fécondés et produisent les ookinètes dans l’estomac du moustique. L’ookinète mûrit, ensuite donne naissance à un oocyste qui traverse l'épithélium intestinal et migre vers les glandes salivaires où il mâture et donne naissance aux sporozoïtes. Les sporozoïtes sont ensuite inoculés à un hôte humain lors d'un repas sanguin et le cycle pré-érythrocytaire puis érythrocytaire recommence. Les stimuli déclenchant la gamétocytogénèse ne sont pas Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 24 encore entièrement compris, mais résulteraient très probablement de diverses formes de stress, y compris la pression exercée par le système immunitaire de l'hôte. I.2.2. Pathogenèse du paludisme Comme le montre son cycle de vie, P. falciparum survit chez le moustique où sa reproduction sexuée s’effectue, et le moustique vecteur transmet le parasite à l'hôte humain. Chez l’homme le parasite a besoin de proliférer et de survivre sans être détruit par la réponse immunitaire de l'hôte. Pour ce faire, P. falciparum utilise différentes techniques afin de contourner le système immunitaire de l'hôte et cela aboutit au développement d’une maladie qui peut devenir grave. Les techniques les mieux connues incluent notamment la cyto-adhérence et la séquestration, la formation de rosettes et la variation antigénique. I.2.2.1. La Séquestration La séquestration est définie comme l’élimination des globules rouges infectés de la circulation périphérique grâce à leur liaison à l'endothélium vasculaire des veinules postcapillaires des tissus profonds. La surface du globule rouge infecté est recouverte d'excroissances appelées Knobs qui sont le point de contact avec les cellules hôtes. Une protéine unique du parasite, P. falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1 (PfEMP1), assure sa liaison avec divers récepteurs (Baruch et al, 1995). PfEMP1 est codée par la grande famille des gènes variables var, comprenant environ 60 loci polymorphes dans le génome de P. falciparum (Su et al, 1995, Gardner et al, 2002). La séquestration du globule rouge infecté dans la micro vascularisation des organes vitaux est un trait marquant du paludisme à P. falciparum. La séquestration massive des globules rouges parasités dans le cerveau est considérée comme la principale cause du coma dans le paludisme cérébral souvent rapidement mortel (Turner et al, 1994). La séquestration des parasites dans le cerveau impliquerait des récepteurs de l’hôte tels que : le CD36 et l’ICAM1 (Intercellular Adhesion molecule 1) (Figure 3). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 25 Figure 3. Récepteurs de l’hôte impliqués dans la séquestration du globule rouge infecté par P. falciparum. CIDR (cysteine-rich inter-domain regions); DBL (Duffy-binding-like); PfEMP-1; RBC (red blood cell); TM (transmembrane region). Adapté de Mackintosh et al, 2004 En outre, la séquestration des parasites dans le placenta est assurée par l'adhésion au sulfate de chondroïtine A (CSA). I.2.2.2.Les Rosettes Les globules rouges infectés peuvent se lier aux globules non infectés pour former des rosettes. Si la liaison se fait entre globules rouges infectés, on parle d’agglutination. Agglutination et rosettes sont associées au paludisme sévère et à l'anémie (Carlson et al, 1990; Newbold et al, 1995; Rowe et al, 1995). Le récepteur du complément (CR1) a été identifié comme un important récepteur de PfEMP1 dans la formation des rosettes (Rowe et al, 1997). I.2.2.3. La Variation antigénique La variation antigénique a été découverte chez P. knowlesi (Craig et al, 2001). PfEMP1 est impliquée dans la variation antigénique du paludisme à P. falciparum. Avec environ 60 gènes var codant pour PfEMP1 et un seul gène var dominant exprimé au stade adulte du Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 26 parasite, PfEMP1 a atteint une forme de variabilité qui permet au parasite de contourner le système immunitaire de l'hôte. De plus, les fréquentes recombinaisons et remaniements génétiques au cours des processus de fusion et de division dans le moustique et les érythrocytes humains peuvent entraîner une grande diversité génétique et antigénique du parasite (Flick et al, 2004). L'affinité d'un PfEMP1 à certains récepteurs de l'hôte pourrait déterminer la virulence du parasite (Roberts et al, 1992). Cette hypothèse est appuyée dans le cas du paludisme placentaire par le biais de DBL et β (Duffy Binding-Like) qui assurent l’adhésion du parasite au tissu placentaire à travers le CSA ou les immunoglobulines non-immunes. Un autre exemple appuyant la même hypothèse est l’existence chez le parasite 3D7 des domaines CIDRα (Cysteine-rich Inter-domain regions) qui ont une affinité pour les récepteurs CD36 (Flick et al, 2001; Scherf et al, 2001). Ce qui revient à dire que certains parasites peuvent être plus virulents que d'autres et des souches de parasites tels que 3D7 qui ont plus de gènes var conservés dans leur centromère pourraient être plus virulents (Flick et al, 2004). I.2.3. Antigènes de surface de P. falciparum I.2.3.1. Antigène de surface du mérozoïte 1 (MSP1) Structure et processing de MSP-1 MSP-1 est une grosse protéine qui varie en taille et en séquence d'acides aminés dans différentes lignées parasitaires. La protéine est synthétisée au cours de la schizogonie comme un polypeptide précurseur unique d’environ 200 kDa et exprimé à la surface du parasite intracellulaire. La structure primaire de la protéine a été déduite de l'analyse des séquences des gènes de plusieurs clones de P. falciparum (Tanabe et al, 1987; Miller et al, 1993). La séquence de la protéine est divisée en blocs numérotés de 1 à 17 (figure 4). Il existe trois types de blocs : conservés, semi-conservés et variables. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 27 Figure 4. Représentation schématique de MSP1 de P. falciparum Les blocs 1, 3, 5, 12 et 17 sont très conservés, les blocs 4, 6, 8, 10, 14 et 16 sont variables et les blocs 7, 9, 11, 13 et 15 sont semi-conservés. Le bloc 4 est l’un des plus variables. Après sa synthèse, MSP1 est associée à d'autres protéines, en particulier MSP6 et MSP7 à la surface du schizonte et ancrée à la membrane plasmique par le glycosylphosphatidylinositol (GPI). La protéine subit un premier <processing> juste avant la rupture des schizontes; le précurseur polypeptidique de MSP1 est clivé par la protéase subtilisine SUB1 (Koussis et al, 2009) en quatre fragments, 83 (MSP183), 30 (MSP130), 38 (MSP138) et 42 (MSP142) qui restent assemblés en un complexe à la surface du mérozoïte (Figure 5). Figure 5. Assemblage et processing du complexe MSP1. D’après Holder, 2009 Lorsque le mérozoïte envahit un globule rouge, un second processing, initié par la subtilisine SUB2 clive le fragment 42 kDa de MSP-1 en deux fragments de 33 et 19 kDa (Harris et al, 2005). En conséquence, le fragment Thèse de Doctorat Unique 2011 MSP-133 est libéré à la surface avec le reste du Cyrille BISSEYE Page 28 complexe MSP-1 et MSP119 est retenu par son ancre GPI à la surface du parasite (Blackman et al, 1990) (Figure 5). Réponse immunitaire protectrice dirigée contre l’extrémité C-terminal de MSP1 De nombreuses études ont montré que la région C-terminale de MSP1 est la cible des réponses immunes protectrices. Ces réponses sont médiées par des anticorps. En effet, les expériences d’immunisation dans le modèle d’infection de P. yoelii montrent le rôle de certains anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre l’extrémité C-terminal de MSP1 dans la protection d’un challenge par les parasites du stade sanguin (Ling et al, 1997; Spencer-Valero et al, 1998). Les études in vitro confirment que les anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de l’extrémité C-terminal de P. falciparum peuvent inhiber l’invasion des érythrocytes (Blackman et al, 1990; Chang et al, 1992). De plus, la vaccination avec les protéines recombinantes de cette région de MSP1, induit une réponse immunitaire protectrice, dans différents modèles tels que, P. yoelii (Ling et al, 1994); P. cynomolgi (Perera et al, 1998) et P. falciparum (Chang et al, 1996). La réponse dirigée contre MSP119 induit trois classes différentes d’anticorps monoclonaux et polyclonaux (Blackman et al, 1994; Guevara Patino et al, 1997) : anticorps inhibiteurs, anticorps bloquants et anticorps neutres. Les anticorps inhibiteurs sont des anticorps qui inhibent le processing secondaire de MSP1 et inhibent ainsi l'invasion des érythrocytes. Les anticorps neutres n’inhibent ni le processing ni l’invasion. Enfin, les anticorps bloquants n’inhibent pas le processing ou l’invasion mais facilitent l’invasion des érythrocytes en rentrant en compétition avec les anticorps inhibiteurs dans la liaison à l’antigène. Alors que tous les anticorps inhibiteurs se fixent à MSP119, certains anticorps bloquants sont spécifiques d'épitopes formés à partir d'acides aminés qui sont éloignés dans la séquence primaire de la protéine (Guevara Patino et al, 1997). La présence de ces différentes classes d'anticorps dans les sérums d’enfants développant une immunité anti palustre en zone endémique met en exergue l'importance de la compréhension de la fine spécificité de la liaison de ces anticorps (Nwuba et al, 2002; Corran et al, 2004; Okech et al, 2004; Omosun et al, 2008). Il a été postulé que l'induction Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 29 d'anticorps bloquants par P. falciparum représenterait un mécanisme d'évasion du système immunitaire de l’hôte (Holder et al, 1999). Modifications de MSP119 visant à améliorer l’antigène Malgré le fait que la région C-terminale de MSP1 soit la cible d'une réponse immunitaire protectrice, les résultats d’un essai vaccinal en phase 2b utilisant cet antigène, ont été très décevants ; les sujets vaccinés ayant produit des anticorps sans effet sur la sensibilité à la maladie (Ogutu et al, 2009). Il est possible que les anticorps produits chez les sujets vaccinés fussent des anticorps neutres ou bloquants. Il existe différentes approches pour améliorer l’immunogénicité de MSP119. Une de ces approches pour améliorer l’antigène serait d’enlever de la protéine les épitopes d’anticorps bloquants sans affecter les épitopes des anticorps inhibiteurs; en limitant la taille de la protéine ou par mutagenèse dirigée. Les substitutions d’acides aminés affectant l’apprêtement et la présentation de l’antigène sont importantes. Dans un modèle rongeur, il a été montré que la protéine sauvage MSP119 est un mauvais substrat pour les protéases dans l’apprêtement de l’antigène dans les lysosomes des cellules dendritiques. En effet, les protéines réduites ou alkylées (ayant perdues leurs ponts disulfures) induisent une réponse immunitaire plus rapide mais non protectrice, en l’absence d’anticorps dirigés contre les épitopes conformationnels de la protéine (Hensmann et al, 2004). Une étude similaire menée chez P. falciparum a permis de mettre en évidence l’importance des ponts disulfures dans l’existence d’épitopes des cellules T et B de la protéine (Egan et al, 1997). Une étude plus récente confirme la très grande résistance de MSP119 aux protéases, la protéine est à la fois présente et intacte dans la vacuole alimentaire (lysosomale) tout au long du développement intracellulaire (Dluzewski et al. 2008). Une autre approche possible pour améliorer l’antigénicité de MSP119 serait l'introduction d’acides aminés qui favorisent le processing sans avoir un effet considérable sur la structure de la protéine ou sur la présence d'épitopes des cellules B et T. En effet, l'insertion d’asparagines supplémentaires reconnues par l'asparagine endoprotéinase des lysosomes des cellules dendritiques (Hensmann et al, 2004) pourrait accélérer le processing de MSP119. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 30 Un certain nombre de variants MSP119 qui sont sans effets sur les anticorps inhibiteurs mais affectent plutôt les anticorps bloquants ont été décrits (Uthaipibul et al, 2001). Plusieurs de ces variants MSP119 construits ne se lient plus aux anticorps bloquants, tout en continuant à se fixer aux anticorps inhibiteurs (Annexe Table 1) et il serait intéressant de voir quel est le résultat d'une immunisation par ces protéines. I.2.3.2. Apical membrane Antigen-1 (AMA1) Structure et fonction d’AMA1 AMA1 de P. falciparum (PfAMA1) est localisé dans les micronèmes du mérozoïte, organite contenant des récepteurs de l’invasion, ce qui suggère qu’AMA1 pourrait jouer un rôle dans ce processus. La protéine est exprimée en fin de schizogonie au cours du développement érythrocytaire asexué. PfAMA1 est synthétisée sous forme d’un précurseur de 83 kDa (PfAMA183) qui est converti en PfAMA166 (Narum et Thomas, 1994). La protéine se subdivise en trois domaines (DI, DII et DIII) sur la base des ponts disulfures (Hodder et al, 1996) et de sa structure cristalline (Pizarro et al, 2005) (Figure 6). La protéine est apprêtée au stade tardif du mérozoïte ou au cours de l'invasion érythrocytaire (Howell et al, 2001). Elle jouerait un rôle lors de la réorientation du mérozoïte au cours de laquelle, les organites apicaux sont alignés sur la membrane des érythrocytes (Mitchell et al, 2004). PfAMA1 pourrait également être impliqué dans l'invasion des hépatocytes (Sylvie et al, 2004). PfAMA1 jouerait un rôle dans l’invasion érythrocytaire par l’intermédiaire de son domaine DIII (Kato et al, 2005). PfAMA1 présente de nombreux polymorphismes dans ses trois domaines DI, DII et DIII. Figure 6. Représentation schématique d’AMA1. Adapté de Kato et al. (2005) TM : domaine transmembranaire; Cyt : domaine cytoplasmique Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 31 Réponses immunes naturelles dirigées contre AMA1 La plupart des personnes exposées au Plasmodium produisent des anticorps antiAMA1, leur prévalence augmentant avec l’âge (Polley et al, 2004; Cortes et al, 2005; Chelimo et al, 2005; Johnson et al, 2004). Chez les individus naturellement infectés par P. falciparum la réponse immunitaire humorale est caractérisée par la production d’IgG1 et une faible réponse IgG3. La production d’IgG2 et IgG4 est rarement observée. Les anticorps anti-AMA1 sont essentiellement dirigés contre les domaines DI et DII de la protéine (Polley et al, 2004; Cortes et al, 2005) et ces anticorps réagissent avec plusieurs variants alléliques (Polley et al, 2004; Cortes et al, 2005). La réponse anticorpale dirigée contre le domaine DIII de la protéine est généralement faible mais augmente chez les adultes. Il a été montré que les IgG dirigées contre une construction d’AMA1 contenant au moins les domaines DI et DII sont associées à un risque réduit de paludisme clinique chez les sujets présentant une parasitémie avant la saison de transmission (Polley et al, 2004). Les anticorps anti-AMA1 purifiés de sujets immuns inhibent aussi la croissance des parasites in vitro (Hodder et al, 2001). Dans les populations vivant en zone d’endémie palustre les réponses immunes antiAMA1 sont souvent beaucoup plus élevées que celles d’autres antigènes de P. falciparum tels que MSP119, GLURP, MSP3 (Chelimo et al, 2005). La réponse immune cellulaire dirigée contre AMA1 fait l’objet de peu d’études. Une étude suggère que la réponse cellulaire T antiAMA1 est de courte durée et qu’elle est associée à la protection contre l’infection (Udhayakumar et al, 2001). I.2.3.3. Protéine Circumsporozoite (CSP) La protéine circumsporozoite est l'antigène qui prédomine à la surface des sporozoïtes. La protéine est composée d'une région N-terminal qui se lie aux protéoglycanes de sulfate d'héparine (RI), une région centrale contenant une répétition de quatre acides aminés (Asn-Ala-Asn-Pro), et une région C-terminal contenant un domaine thrombospondine (RII) ancrée à une GPI (Figure 7). La région centrale répétée contient l’épitope immunodominant des cellules B. Cette région centrale induit la production d’anticorps qui inhibent l’invasion des hépatocytes par les sporozoïtes in vitro (Gysin et al, 1984 ; Plassmeyer et al, 2009). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 32 Les anticorps dirigés contre la région centrale répétée sont associés à la protection contre l’infection par P. falciparum (Guinovart et al, 2009 ; Aponte et al, 2007) mais ne protègent pas contre la maladie (Alonso et al, 2004 ; Bejon et al, 2008). Les anticorps monoclonaux dirigés contre la thrombospondine bloquent également l'invasion des hépatocytes par les sporozoïtes, mais à un degré moindre que les anticorps de la région centrale répétée (Plassmeyer et al, 2009). La CSP induit aussi une réponse immune cellulaire T. En effet, elle comporte trois épitopes de lymphocytes T connus: un épitope des cellules T CD4+ très variable en amont du domaine de la thrombospondine (Guttinger et al, 1988), un épitope de cellules T CD8+ très variable à l’intérieur du domaine de la thrombospondine (Kumar et al, 1988), et un épitope"universel" conservé des cellules T CD4+ à l'extrémité C-terminal de la protéine (Sinigaglia et al, 1988). Figure 7. Représentation schématique de CSP et du vaccin RTS, S. Adapté de Crompton et al, 2010 I.3. La maladie I.3.1. Caractéristiques cliniques Les premiers symptômes du paludisme lors d’une primo-infection peuvent être observés 8 à 10 jours après que le parasite ait été introduit dans l'hôte humain par la piqure du moustique femelle. La maladie se manifeste essentiellement par des fièvres qui deviennent peu à peu récurrentes. Elles sont dues à la libération de toxines du parasite lors de la rupture des érythrocytes infectés. Différentes types de fièvres ont été décrites en fonction de l’espèce plasmodiale responsable de l’infection. Certaines formes de paludisme présentent des fièvres quotidiennes (fièvre semi-tierce) tandis que d'autres sont responsables des fièvres tous les deux jours (fièvre tierce) et il y a encore d'autres formes qui Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 33 présentent des fièvres tous les trois jours (fièvre quarte). Le paludisme à P. falciparum présente deux formes de fièvre, tierce et semi-tierce, tandis que P. vivax et P. ovale présentent une forme de paludisme à fièvre tierce. Le paludisme à P. malariae est responsable d’une forme de paludisme à fièvre quarte. P. falciparum est responsable de deux formes de paludisme : le paludisme simple et le paludisme grave (Berendt et al, 1992). Dans les zones endémiques, le paludisme simple se produit chez les personnes semi-immunes alors que le paludisme grave et celui associé à la grossesse affectent les personnes non-immunes et notamment les enfants de moins de cinq ans et les femmes enceintes (les primipares principalement). I.3.1.1. Le paludisme simple Les principaux symptômes cliniques de l’accès palustre simple sont : la fièvre, les frissons et sueurs, céphalées, vomissements, diarrhée, l'anémie, la jaunisse et souvent la splénomégalie. Parfois les enfants peuvent présenter des expériences de convulsions. I.3.1.2. Paludisme grave La définition du paludisme grave est difficile, il résulte probablement d'une combinaison de facteurs spécifiques du parasite : adhérence, séquestration dans le système vasculaire et libération de molécules bioactives ; mais aussi de la réponse inflammatoire de l'hôte avec notamment la production de cytokines, chémokines et d’infiltrats cellulaires (Mackintosh et al, 2004). Deux syndromes majeurs caractérisent le paludisme sévère: l’anémie sévère et le paludisme cérébral. La pathogénie du paludisme cérébral est attribuée à la cytoadhérence des érythrocytes infectés aux cellules endothéliales dans les micros vaisseaux du cerveau entrainant l’obstruction puis la rupture des vaisseaux sanguins. Un des mécanismes de la pathogenèse du paludisme grave est l'acidose métabolique qui entraîne la détresse respiratoire. Différentes études ont montré que l’acidose métabolique est un bon prédicteur de la mortalité due au paludisme sévère (Taylor et al, 1993; Marsh et al, 1995; English et al, 1996). La pathogénie de l'acidose métabolique est mal connue. Les cytokines pro-inflammatoires jouent un rôle central dans les manifestations cliniques du paludisme cérébral. L’interleukine 10 (IL-10) aurait un rôle protecteur dans le paludisme Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 34 cérébral (Clark et Cowden, 2003). Par contre, une cytokine comme le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-) est plutôt associée à la sensibilité au paludisme cérébral (Grau et al, 1989; Kwiatkowski et al, 1990; Brown et al, 1999). Le rôle de l’interféron gamma (IFN-) est ambigu, elle est associée à la fois à la pathogenèse et à la protection contre le paludisme chez l'homme (Day et al, 1999; Luty et al, 1999). Un autre mécanisme impliqué dans la pathogenèse du paludisme cérébral est l’induction du monoxyde d’azote (NO), il serait responsable non seulement d’une hypotension intracrânienne due à la dilatation excessive des vaisseaux sanguins (vasodilatation) mais aussi à une neurotransmission aberrante (Clark et al, 1994). I.3.2. Paludisme et grossesse Plus de 50 millions de femmes sont exposées au risque de paludisme pendant la grossesse chaque année. Le paludisme est responsable d’une morbidité maternelle et infantile substantielle, causant de 75.000 à 200.000 décès de nourrissons chaque année (Steketee et al, 2001; Desai et al, 2007). Les effets du paludisme pendant la grossesse sur la santé maternelle, néonatale et infantile sont présentés dans la figure 8. Les infections par P. falciparum et P. vivax pendant la grossesse entraînent l'anémie maternelle et un faible poids des nouveau-nés en relation avec les accouchements prématurés et un retard de croissance fœtale (Nosten et al, 1999). Les femmes enceintes sont plus sensibles que les femmes non enceintes au paludisme, et cette sensibilité est plus grande chez les primipares comparativement aux multipares. Le paludisme pendant la grossesse se manifeste par une parasitémie plus élevée dans l’espace intervilleux du placenta que dans la circulation périphérique (Rogerson et al, 2007); une absence de trophozoïtes et de schizontes matures dans le sang périphérique, car séquestrés dans le placenta (Beeson et al, 2002). Ainsi, la relation entre parasitémie placentaire élevée et accouchement prématuré a été établie (Menendez et al, 2000). L’infection placentaire est souvent accompagnée d’une infiltration intervilleuse de monocytes et de macrophages, certains contenant l’hémozoïne (pigment malarique ou hémoglobine oxydée). Une densité élevée de monocytes dans l’espace intervilleux du placenta est associée au faible de poids chez le nouveau-né et à l’anémie (Ordi et al, 1998; Rogerson et al, 2003). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 35 La séquestration des érythrocytes infectés par P. falciparum dans le placenta diffère de celle observée dans d’autres organes tels que le cerveau. Elle est assurée via deux récepteurs : CSA et acide hyaluronique (Fried et Duffy, 1996; Beeson et al, 2000). Ces récepteurs sont exprimés par les syncytiotrophoblastes qui tapissent les espaces intervilleux du placenta (Salem et al, 1984; Matejevic et al, 2001). La séquestration des érythrocytes parasités dans le placenta pourrait être aussi favorisée par les immunoglobulines M se fixant au CSA (Creasey et al, 2003). Figure 8. Effet du paludisme pendant la grossesse sur la santé maternelle, néonatale et infantile. Adapté de Desai et al, 2007. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 36 La formation des rosettes qui est importante dans la pathogénèse du paludisme cérébral, joue un rôle mineur dans l’infection du placenta (Maubert et al, 1998; Rogerson et al, 2000). Le ligand de P. falciparum au CSA est la PfEMP1 une protéine codée par la famille des gènes multiples var. Un gène var particulier appelé var2csa est exprimé dans la plupart des isolats se liant au placenta (Salanti et al, 2003; Duffy et al, 2005). I.3.3. Epidémiologie du paludisme Les facteurs environnementaux, l’intensité de la transmission, la virulence du parasite et les différents traits génétiques de l’hôte confèrent une complexité au paludisme (Mackinnon et al, 2005). Les études épidémiologiques montrent que, la sensibilité au paludisme est très variable entre les individus d’une population. Ainsi, charge parasitaire, incidence et gravité de la maladie (Greenwood et al, 1991); ampleur et type de réponses immunitaires dirigées contre les antigènes du parasite diffèrent selon les individus (Good et al, 1988; Troye-Blomberg et al, 1989; Riley et al, 1990; Modiano et al, 1996). Les manifestations cliniques du paludisme sont liées à l’âge des individus en zone endémique (Marsh, 1992 ; Brewster et al, 1990). Les enfants de moins de cinq ans souffrent du paludisme cérébral alors que les adultes souffrent du paludisme simple. Le risque de décès est aussi plus élevé chez les enfants que chez les adultes vivant en zone endémique. Les facteurs génétiques de l’hôte affectent aussi l’évolution de la maladie. Parmi ces facteurs génétiques, les polymorphismes de l’hémoglobine jouent un rôle essentiel. Hémoglobines S et C (HbS et HbC) Les polymorphismes génétiques de HbS et HbC assurent la protection contre les formes simples et sévères du paludisme. En effet, les individus hétérozygotes HbAS présentent de faibles parasitémies (Allison, 1954). Plus de 70% de porteurs HbAS sont protégés contre le paludisme sévère alors que 60% sont protégés contre le paludisme simple (Allison, 1954; Flint et al, 1986). HbC est aussi associée à la protection contre le paludisme en Afrique de l’ouest (Agarwal et al, 2000; Modiano et al, 2001). La protection est d'environ 90% chez les homozygotes HbCC et de 30% chez les hétérozygotes HbAC (Modiano et al, 2001). Des résultats contrastés sur la Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 37 protection contre le paludisme conférée par HbC ont été signalés au Mali (Guinet et al, 1997). D’autres études menées au Ghana (Mockenhaupt et al, 2004) et au Burkina Faso (Rihet et al, 2004) ont confirmé la protection contre le paludisme conférée par HbC. HbAS joue un rôle dans la mise en place d’une immunité acquise. Une étude réalisée au Kenya a montré l’acquisition accélérée de l'immunité contre le paludisme simple chez les enfants âgés de moins de 10 ans porteurs de HbAS (Williams et al, 2005). Alpha et Béta-Thalassémies Deux autres polymorphismes de l’hémoglobine qui affectent la susceptibilité au paludisme sont les α et β-Thalassémies. et β-thalassémies sont associées à la protection contre le paludisme (Allen et al, 1997; Udomsangpetch et al, 1993). L’-thalassémie protégerait contre le paludisme en limitant les manifestations cliniques de la maladie plutôt que la multiplication du parasite. Par contre, la β-thalassémie protégerait contre le paludisme sévère en altérant la cytoadhérence et la formation de rosettes par les érythrocytes β-Thalassémiques infectés (Udomsangpetch et al, 1993). Déficience en Glucose 6 phosphate déshydrogénase (G6PD) Un autre type de polymorphismes génétiques de l’hôte influençant la sensibilité au paludisme est la déficience en G6PD. Le variant G6PD A- (A376G et G202A) est le plus fréquent en Afrique sub-saharienne. La déficience en G6PD a été associée à la protection contre le paludisme grave chez les enfants africains (Allison and Clyde, 1961). Cette protection concerne les femmes hétérozygotes (Bienzle et al, 1972). Cependant, une autre étude a montré que la déficience en G6PD protégeait aussi bien les hommes hémizygotes que les femmes homozygotes et hétérozygotes (Ruwende et al, 1995). Une étude plus récente menée au Mali confirme, que la protection conférée contre le paludisme par la G6PD ne concerne que les hommes hémizygotes et les femmes homozygotes (Guindo et al, 2007). Antigène Duffy Le polymorphisme de la membrane des érythrocytes de l’hôte joue un rôle dans la susceptibilité ou la protection contre le paludisme. La fréquence élevée du polymorphisme Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 38 de l’antigène Duffy prévenant l’invasion des globules rouges par P. vivax dans la population ouest africaine explique l’absence de P. vivax dans cette région (Miller et al, 1976). Glycophorines A et B Chez l’homme, les globules rouges déficients en Glycophorines A et B (GYPA et GYPB) sont résistants à l'invasion par P. falciparum (Bejon et al, 2007). EBA175, protéine du micronème présente sur le mérozoïte a des domaines Duffy Binding-Like (DBL) spécifiques qui reconnaissent les résidus d'acide sialique sur la molécule de GYPA, ainsi l'absence de GYPA et GYPB affecterait la reconnaissance de la protéine par le globule rouge. L’absence de l'exon 3 au niveau de la GYPC est responsable du groupe sanguin Gerbich que l’on trouve chez 50% d’hommes vivant sur les côtes de Papouasie-Nouvelle Guinée. Chez les individus Gerbich négatifs, la protéine EBA140 ne se fixe pas aux globules rouges et l'invasion de P. falciparum est bloquée (Maier et al, 2003). Groupes sanguins ABO Le polymorphisme du complexe des groupes sanguins ABO joue un rôle dans l’évolution du paludisme. Il a été montré que les individus du groupe sanguin O étaient plus protégés contre le paludisme grave comparativement aux individus des autres groupes sanguins. Une faible séquestration et un taux réduit de rosettes par les érythrocytes du groupe sanguin O infectés par P. falciparum assureraient cette protection (Rowe et al, 2007). Le groupe sanguin A, a quant à lui été associé au paludisme grave (Rowe et al, 2007; Fischer and Boone, 1998). Récepteur du Complément (CR1) Le CR1 est une protéine immunorégulatrice présente à la surface des érythrocytes. Certaines populations présentent une déficience en CR1. C’est le cas des populations mélanésiennes. La déficience en CR1 induit une réduction de la formation des rosettes par les érythrocytes infectés par P. falciparum (Rowe et al, 1997). Elle a été associée à la protection contre le paludisme grave dans les zones endémiques de Papouasie-Nouvelle Guinée (Cockburn et al, 2004). Une étude réalisée au Kenya associe la déficience en CR1 à la protection contre l’anémie sévère (Waitumbi et al, 2000). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 39 Un autre facteur qui complique le pronostic du paludisme est le développement de la résistance des parasites aux antimalariques. Cette résistance est responsable de l’échec thérapeutique des médicaments de première intention dans le traitement du paludisme simple dans différentes régions du monde. I.3.4. Résistance des parasites aux médicaments antipaludiques La résistance à un médicament antipaludique est la capacité du parasite à survivre et à se multiplier dans l’organisme de l’hôte en présence de la dose thérapeutique de ce médicament. La résistance aux antipaludiques concerne essentiellement P. falciparum et P. vivax. Elle n’a pas été décrite avec P. ovale et P. malariae. La résistance de P. falciparum aux antipaludiques est celle qui est la plus étudiée en Afrique sub-saharienne. La résistance aux antipaludiques se produirait dans les zones de faible ou de haute transmission de paludisme (Hastings et D’Alessandro, 2000; Molyneux et al, 1999). En effet, la résistance s’est développée en premier dans les zones de faible transmission (Thaïlande et Brésil) et elle demeure plus fréquente dans ces zones que dans celles de transmission plus élevée, appuyant l'hypothèse de la faible transmission. La résistance concerne à des degrés variables la plupart des antipaludiques actuels sur le marché compliquant l’efficacité du traitement contre le paludisme. I.3.4.1. Résistance à la chloroquine La résistance à la chloroquine est apparue à la fin des années 50 à la frontière entre la Thaïlande et le Cambodge et en Colombie (Wernsdorfer, 1994). En Afrique, la résistance à la chloroquine s’est propagée d’Est en Ouest. Les polymorphismes de deux gènes de P. falciparum sont responsables de cette résistance: Pfcrt (P. falciparum chloroquine resistance transporter) (Wellems et al, 1991) et Pfmdr1 (P. falciparum multidrug resistance 1). Le gène Pfcrt est situé sur le chromosome 7, et code pour pfCRT, une protéine membranaire de transport vacuolaire. De nombreux polymorphismes de Pfcrt associés à la résistance à la chloroquine ont été identifiés. La mutation sur le codon 76 (Thr→Lys) de Pfcrt est essentielle dans la résistance à Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 40 la chloroquine. La mutation Thr76Lys est associée à une résistance absolue à la chloroquine in vitro (Djimdé et al, 2001; Fidock et al, 2000). De nombreuses études cliniques réalisées dans diverses zones géographiques ont confirmé l'association entre la mutation Thr76Lys et la résistance à la chloroquine notamment en Afrique , au Mali (Djimdé et al, 2001), au Cameroun (Basco et Ringwald, 2001), au Soudan (Babiker et al, 2001), et au Mozambique (Mayor et al, 2001) ; en Asie, au Laos (Pillai et al, 2001) et en Thaïlande (Cheng et al, 2001); ainsi qu’en Amérique du Sud, au Brésil (Vieira et al, 2001). Pfmdr1 est situé sur le chromosome 5 et code pour une glycoprotéine. Le polymorphisme de Pfmdr1 est aussi associé à la résistance à la chloroquine. Le changement d’acide aminé sur le codon 86 (Asp86Tyr) de Pfmdr1 a été associé à la résistance à la chloroquine dans certaines études in vitro ou cliniques : en Gambie (Von Seidlein et al, 1997), en Ouganda (Flueck et al, 2000), en Thaïlande (Price et al, 1999) et au Brésil (Zalis et al, 1998). En revanche, ce polymorphisme Asp86Tyr n’était pas associé à la résistance à la chloroquine dans d’autres études : en Ouganda (Dorsey et al, 2001), au Laos (Pillai et al, 2001), en Thaïlande (Chaiyaroj et al, 1999) et au Brésil (Povoa et al, 1998). Plusieurs autres polymorphismes de pfmdr1 notamment, Phe184, Cys1034, Asp1042 et Tyr1246, sont impliqués à des degrés divers dans la résistance à la chloroquine. I.3.4.2. Résistance à la pyrimethamine-sulfadoxine La résistance à la pyrimethamine-sulfadoxine est apparue à la frontière entre la Thaïlande et le Cambodge dans le milieu des années 60. En Afrique, la sensibilité de la pyrimethamine- sulfadoxine a commencé à baisser dans les années 1980. Cette résistance s’est répandue plus rapidement à l’Est qu’à l’Ouest du continent. La résistance in vitro à la pyrimethamine-sulfadoxine a été reportée dans plusieurs pays d’Afrique subsaharienne, variant de 13 à 30 % (Alin, 1997; Benito et al, 1995; Philipps et al, 1998; Landgraf et al, 1994). De toutes les résistances aux antipaludiques, la base moléculaire de la résistance à la pyrimethamine-sulfadoxine est la mieux caractérisée. Les mutations spécifiques de P. falciparum qui conduisent à la résistance à la pyrimethamine et à la sulfadoxine ont été identifiées. Sulfadoxine et pyrimethamine agissent en synergie. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 41 La sulfadoxine inhibe la dihydropteroate synthétase (dhps) et la pyrimethamine, la dihydrofolate réductase (dhfr) du parasite. Ces deux enzymes sont impliquées dans la synthèse des folates. Les mutations sur cinq codons du gène dhps sont associées à la résistance à la sulfadoxine en diminuant l'affinité de liaison de l'enzyme au médicament: ce sont les codons 436 (Ser→ Ala ou Phe), 437 (Ala→Gly), 540 (Lys→Glu), 581 (Ala→Gly) et 613 (Ala→Ser ou Thr). La résistance à la pyrimethamine est due à des mutations ponctuelles spécifiques dans le gène dhfr. Il en résulte une réduction de l’affinité de liaison entre dhfr et la pyrimethamine. Ces mutations ont lieu sur les codons : 16 (Ala→Val), 51 (Asn→Ile), 59 (Cys→Arg), 108 (Ser→Asn ou Thr) et 164 (Ile→Leu). La mutation sur le codon 108 (Ser→Asn) est connue pour être la mutation clé de la résistance à la pyrimethamine. Les mutations ponctuelles supplémentaires dans trois autres codons, Ile51, Arg59, et Leu164, sont connues pour augmenter progressivement le degré de la résistance. I.3.4.3. Résistance à la quinine La résistance à la quinine a été documentée au milieu des années 60 à la frontière de La Thaïlande et du Cambodge. Les données des tests in vitro, ont montré que cette résistance est moins fréquente en Amérique du sud (Zalis et al, 1998) et en Afrique (Jelinek et al, 2001). La quinine est réservée comme traitement de deuxième ou troisième ligne et est utilisée dans les cas de paludisme grave. Dans une étude menée au Brésil les mutations de Pfmdr1 (Asn86, Phe184, Cys1034, Asp1042 et Tyr1246) ont été associées à la réduction de la sensibilité à la quinine (Zalis et al, 1998). En Gambie une faible association entre la mutation Tyr86 de Pfmdr1 et la réduction de la sensibilité à la quinine a été observée (Duraisingh et al, 2000). I.3.4.4. La résistance à la méfloquine La résistance à la méfloquine a été observée près de la frontière de la Thaïlande et du Cambodge à la fin des années 80 (Wongsrichanalai et al, 2001). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 42 Des études in vitro ont suggéré la présence de souches de P. falciparum ayant une faible sensibilité à la méfloquine en Afrique (Jelinek et al, 2001; Brasseur et al, 1992). Bien que rares, quelques résistances cliniques à la méfloquine ont été décrites en Afrique (Witkowski et al, 2010; Brasseur et al, 1990; Gay et al, 1990). Les résultats contrastés ont été obtenus sur le rôle du polymorphisme de Pfmdr1 dans la résistance à la méfloquine. Des études réalisées en Thaïlande (Price et al, 1999; Wilson et al, 1993) et récemment en Afrique de l’Ouest (Witkowski et al, 2010) ont suggéré l’association entre le nombre élevé de copies de Pfmdr1 et la résistance à la méfloquine. Une autre forme de résistance de P. falciparum est la multi résistance aux antipaludiques. La multi résistance a été définie comme étant une résistance à plus de deux composés antipaludiques opérationnels appartenant à des classes chimiques différentes (Wernsdorfer, 1994). Du fait de cette multi résistance, et de la résistance à la plupart des médicaments de première ligne tels que la chloroquine, la pyrimethamine-sulfadoxine et dans une moindre mesure la méfloquine; de nouveaux schémas thérapeutiques ont été mis en place : ce sont des associations médicamenteuses impliquant souvent l’arthémisinine. Aucune résistance à l’arthémisinine n’a encore été formellement documentée en Afrique subsaharienne. I.4. Paludisme à P. falciparum et vaccination L’outil clé pour le contrôle, l'élimination, voire même l'éradication du paludisme, en plus des médicaments antipaludiques et de la lutte anti vectorielle, est un vaccin efficace. À ce jour, aucun vaccin efficace contre le paludisme n’est disponible. Le développement d'un vaccin contre le paludisme est entravé par la complexité du parasite et de son cycle de vie (Gardner et al, 2002; Florens et al, 2002), une très grande variation antigénique (Scherf et al, 2008), et une compréhension limitée des interactions entre P. falciparum et le système immunitaire de l’hôte humain (Langhorne et al, 2008). Dans l’infection par P. falciparum, Le développement d'un vaccin est possible parce que l'infection induit une immunité clinique. Dans les zones hyper endémiques à P. falciparum, l'immunité contre le paludisme sévère est acquise dès la petite enfance, alors que l'immunité contre une maladie bénigne n'est pas acquise avant la fin de l'adolescence (Marsh et al, 2006, Gupta et al, 1999). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 43 L’immunité est acquise plus rapidement par les adultes que par les enfants (Baird et al, 1991; Baird et al, 1993), cette immunité est rarement complète et des épisodes occasionnels de paludisme peuvent se produire (Marsh et al, 2006). Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires qui assurent la protection chez l’adulte et l’identification de leurs cibles sur P. falciparum, pourraient servir au développement d’un vaccin qui induirait chez l’enfant une immunité mimant celle de l’adulte. Différents vaccins contre le paludisme sont testés chez l’homme. Nous nous limiterons à la présentation des vaccins des stades pré-érythrocytaire et érythrocytaire. I.4.1. Vaccins pré-érythrocytaires L’immunité du stade pré-érythrocytaire ne semble pas acquise naturellement dans les zones endémiques où les adultes sont souvent infectés par les stades asexués du parasite. L'idée d'un vaccin pré-érythrocytaire a pris forme avec l'observation historique faite par Ruth Nussenzweig que la vaccination de souris avec des sporozoïtes irradiés les protégeait contre le paludisme (Nussenzweig et al, 1967). En outre, cette protection pouvait être obtenue par l’immunisation avec la CSP (Circumsporozoite protein) seule (Nussenzweig et Nussenzweig, 1986). Le clonage de la CSP de P. falciparum (Dame et al, 1984) a accéléré la mise au point du vaccin RTS, S. Le RTS, S se compose de particules de l'antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) fusionnés au segment CSP dans l’adjuvant AS01 (Casares et al, 2010, Gordon et al, 1995). Le vaccin RTS,S/AS02A est composé de deux polypeptides (RTS and S) provenant de la circumsporozoite protein (CSP) de P. falciparum, exprimés dans des cellules de la levure Saccharomyces cerevisiae (la levure de boulanger) et fusionné à l’HBsAg, (le vaccin contre l’hépatite B); • Il est présenté sous une forme particulaire associée à un adjuvant, AS02A, une émulsion d’huile dans de l’eau avec deux immunostimulants : le monophosphoryl lipid A et le QS21dérivé de la saponine; • Il induit une forte réponse anticorps et il stimule l’immunité cellulaire de type 1. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 44 RTS, S est le vaccin du stade pré-érythrocytaire le plus avancé en ce qui concerne les essais cliniques. Les essais cliniques en phase II ont montré que 30 à 50% d’adultes naïfs vaccinés avec RTS, S étaient protégés contre un challenge par des moustiques infestés par un clone homologue de P. falciparum (Gordon et al, 1995; Stoute et al, 1997; Kester et al, 2001; Kester et al, 2008, Kester et al, 2009). Les essais cliniques en phase II menés en zones endémiques ont montré qu’environ 30 à 50% d’enfants et nourrissons vaccinés avec RTS, S étaient protégés contre le paludisme clinique (Alonso et al, 2004 ; Sacarlal et al, 2009 ; Abdulla et al, 2008 ; Bejon et al, 2008), mais que la protection induite par la vaccination était de courte durée. Aussi, ce vaccin, induit des anticorps qui sont corrélés à la protection contre l'infection par P. falciparum (Guinovart et al, 2009 ; Aponte et al, 2007) mais qui n’assurent pas la protection contre la maladie clinique (Alonso et al, 2004 ; Bejon et al, 2008 ; Guinovart et al, 2009). Le mécanisme par lequel un vaccin qui cible le sporozoïte et le stade hépatique du parasite, protège contre le stade sanguin de la maladie reste inconnu. Il est probable que le vaccin RTS, S induise une protection contre le paludisme clinique en réduisant temporairement le nombre de mérozoïtes qui sortent du foie; ce qui conduirait l’hôte à une exposition prolongée aux parasites du stade sanguin à des niveaux sub-cliniques qui, stimulerait à son tour l'immunité acquise (Guinovart et al, 2009). I.4.2. Vaccins érythrocytaires Les candidats vaccins du stade érythrocytaire comprennent essentiellement les antigènes exprimés à la surface du mérozoïte. À l’heure actuelle, quelques antigènes du stade sanguin du parasite sont à l’étape clinique de développement vaccinal. Il s'agit notamment d’AMA1 (Sagara et al, 2009), de EBA175 (El Sahly et al, 2010), de GLURP (Glutamate rich protein) (Esen et al, 2009; Hermsen et al, 2007), de MSP1 (Ogutu et al, 2009 ), de MSP2 (Genton et al, 2002), de MSP3 (Esen et al, 2009; Audran et al, 2005; Sirima et al, 2009; Druilhe et al, 2005), et de SERA5 (serine repeat antigen 5) (Horii et al, 2010), qui sont tous fortement exprimés à la surface du mérozoïte. Contrairement au stade pré-érythrocytaire avec le vaccin RTS, S actuellement testé en phase Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 45 III, aucun vaccin du stade érythrocytaire n’a atteint à l’heure actuelle la phase III de développement. Les récents essais en phase II des candidats vaccins du stade érythrocytaire les plus avancés, AMA1 et MSP1, n'ont pas démontré d’efficacité chez les enfants en Afrique (Sagara et al, 2009; Ogutu et al, 2009). Cependant, sont en cours, les efforts visant à l’amélioration des vaccins AMA1 et MSP1, soit par l’adjonction de nouveaux adjuvants (Ellis et al, 2010; Sagara et al, 2009), soit par le boosting dans des vecteurs viraux (Hill et al, 2010), ou par leur combinaison (Malkin et al, 2008). L’obstacle majeur pour la réalisation d’un vaccin du stade sanguin du parasite demeure, sa grande diversité génétique découlant de la pression sélective exercée par la réponse immunitaire de l'hôte (Weedall et al, 2010; Takala et al, 2009). I.5. Immunité antipalustre I.5.1. Mécanismes effecteurs de protection contre le paludisme Les êtres humains vivant dans les zones endémiques développent une immunité contre le paludisme. En effet, les enfants âgés de plus de cinq ans et les adultes sont résistants au paludisme grave et à la mortalité, tout en demeurant sensibles à l'infection (Marsh, 1992). L’immunité anti palustre se développe dans tous les stades du cycle parasitaire et notamment aux stades pré-érythrocytaire et érythrocytaire. I.5.1.1 Immunité au stade pré-érythrocytaire L’immunité au stade pré-érythrocytaire du parasite pourrait être dirigée contre le sporozoïte libre, du site de son injection dans la peau à son entrée dans l'hépatocyte, ou sous sa forme de schizonte intra-hépatique. Bien que les humains vivant dans les zones endémiques soient exposés aux sporozoïtes à intervalles réguliers, il est peu probable que l’immunité pré-érythrocytaire y soit acquise naturellement. Chez l’homme et dans les modèles expérimentaux d’infection, Il a été montré que l’injection de sporozoïtes atténués par irradiation entraîne une résistance complète contre l’infection pendant une durée variable (Nardin et al, 1999). Il n’est pas encore compris pourquoi la vaccination avec les sporozoïtes atténués provoque une plus forte réponse immune que celle induite par l’infection naturelle. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 46 La différence pourrait cependant s’expliquer d’une part par le grand nombre de sporozoïtes utilisés (des centaines ou des milliers par la vaccination par rapport à 1 à 100 sporozoïtes par piqûre dans les infections naturelles) (Beier et al, 1991; Hoffman et al, 2002) et d’autre part, par la persistance de sporozoïtes atténués dans le foie (Scheller et al, 1995) et enfin, par l'induction de l’apoptose d’hépatocytes observée en présence de sporozoïtes atténués, mais absente en présence de sporozoïtes normaux, permettant l'exposition d’antigènes au système immunitaire (Leiriao et al, 2005; James, 2005). La protection contre le stade pré-érythrocytaire du parasite est assurée par les anticorps. En effet, les anticorps dirigés contre le sporozoïte permettraient de protéger, soit par opsonisation en entraînant l’élimination du parasite avant d'atteindre l'hépatocyte, ou bien en interférant avec l'invasion des hépatocytes. La réponse humorale anti-CSP est dirigée contre une région immunodominante composée d'une séquence répétée d’acides aminés (Asn-Ala-Asn-Pro) (Esposito et al, 1988). Les anticorps anti-CSP inhibent aussi l’invasion des hépatocytes par les sporozoïtes in vitro (Pasquetto et al, 1997; Silvie et al, 2004). L'immunité au stade pré-érythrocytaire est assurée aussi par une réponse immunitaire à médiation cellulaire (Tsuji et al, 2003). Les modèles murins ont permis une meilleure compréhension des mécanismes effecteurs mis en jeu, en révélant leur complexité. Doolan et Hoffman ont montré au moins cinq mécanismes de protection distincts avec les lignées de souris consanguines d’origines génétiques diverses (Doolan et Hoffman, 2000). Chez certaines souris (C57BL/6) la protection contre la maladie était associée aux cellules T CD4+ et NK. Dans la plupart des cas, la protection dépendait des cellules T CD8+. La protection assurée par les cellules T CD8+ ne dépendait pas de la voie cytotoxique classique comprenant, la synthèse de perforine et de granzyme, mais plutôt par l'induction de cascades cellulaires et cytokiniques incluant : les cellules T CD4+ ou NK et les cytokines IL-12 et IFN-; déclenchant la production d'effecteurs finaux tels que le NO. La complexité de la réponse cellulaire décrite chez les souris existe aussi chez l’homme, avec un mécanisme de protection différent. Dans une étude faite en Gambie, Reece et al. (2004), ont montré que la sécrétion de l’IFN- par les cellules T CD4+ en réponse à une séquence Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 47 conservée de CSP, était associée à la fois à la protection contre l’infection et contre la maladie. I.5.1.2. Immunité au stade érythrocytaire Le stade érythrocytaire du parasite est marqué par l’invasion des globules rouges. C’est une étape clé dans l’établissement de l’infection palustre. Elle est susceptible d’être aussi une importante cible pour les réponses immunes protectrices. La preuve la plus directe que les anticorps sont des médiateurs importants de l'immunité palustre provient d'études de transfert passif d'anticorps dans lesquelles les sérums d’adultes immuns ont été utilisés avec succès pour traiter les patients atteints de paludisme grave (Cohen et al, 1961; Sabchareon et al, 1991). Les anticorps pourraient empêcher l'invasion des érythrocytes par les mérozoïtes par différents mécanismes : opsonisation favorisant leur phagocytose par les macrophages, destruction par le complément, inhibition du processing des protéines d'invasion ou blocage de leurs sites de liaison sur les érythrocytes. En outre, les anticorps cytophiliques (IgG1 et IgG3 chez l'homme) peuvent en collaboration avec les monocytes détruire les globules rouges infectés par le mécanisme d’immunité cellulaire dépendante d’anticorps (ADCI). Osier et al, (2008) ont montré qu’une forte réponse humorale était associée à la protection contre le paludisme et que les associations les plus fortes étaient obtenues en combinant les réponses dirigées contre MSP2 et MSP3. Le rôle des anticorps dirigés contre les antigènes du mérozoïte dans la protection contre le paludisme demeure controversé. En effet, certaines études suggèrent que les anticorps dirigés contre des épitopes des protéines telles que MSP1, MSP2 et AMA1 (Polley et al, 2004; Egan et al, 1996; Conway et al, 2000; Metzger et al, 2003) mesurée par ELISA peuvent être des marqueurs de la protection contre le paludisme clinique, d'autres études ne corroborent pas ces résultats (Dodoo et al, 1999; Okech et al, 2004 ; Corran et al, 2004). Les mérozoïtes libres et les hématies infectées, n’exprimant pas à leurs surfaces de molécules HLA, sont souvent négligés comme cibles pour des réponses immunes protectrices à médiation cellulaire. Cependant l’un des résultats les plus étonnants sur le rôle de l’immunité à médiation cellulaire dans la protection contre le paludisme a été la Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 48 démonstration faite par Pombo et al, (2002) que les personnes non immunes infectées à maintes reprises par des doses ultra faibles de parasites du stade sanguin et soignés, développent une immunité subséquente en l'absence de réponse anticorpale détectable. Dans cette étude, les personnes protégées présentaient de fortes proliférations cellulaires T CD4+ et T CD8+, une réponse cytokinique composée d’IFN-, mais une absence d’interleukine 4 ou d’interleukine 10 et la production de fortes concentrations de NO dans les cellules mononuclées du sang des sujets (Pombo et al, 2002). Figure 9. Représentation schématique du possible mécanisme d’action de l’immunité à médiation cellulaire dirigée contre le stade sanguin de Plasmodium. Good, 2001. Le rôle des cellules T spécifiques de Plasmodium a été mis en évidence grâce au transfert adoptif de la protection en absence de réponse humorale détectable (van der Heyde et al, 1994, von der Weid et al, 1996). Les cellules T ont la capacité d'inhiber la croissance du parasite in vitro (Taylor-Robinson et al, 1993; Fell et al, 1994; Amante et al, 1997). Le modèle de l'immunité cellulaire ne dépendant pas d’anticorps au stade sanguin du parasite est résumé sur la figure 9 ci-dessus. Dans ce modèle, la réponse immune cellulaire débute par l'activation des cellules T CD4+ dans la rate, après la présentation antigénique par les Cellules dendritiques (DC). L’immunité Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 49 cellulaire T est régulée par l'IL-12 et fait intervenir IFN- et TNF- qui, induisent la phagocytose des globules rouges infectés ainsi que la mort des parasites intracellulaires via la synthèse de NO et des radicaux oxygénés (Ferrante et al, 1990, Stevenson et al, 1995) par les neutrophiles et les macrophages (Ockenhouse et al, 1984, Stevenson et al, 1989). La destruction des parasites a lieu essentiellement dans la rate (Favila-Castillo et al, 1996). L’IFN- produite par les cellules T peut également contribuer à produire des anticorps cytophiliques qui interviennent dans l’immunité cellulaire dépendante d’anticorps (ADCI) (Bouharoun-Tayoun et al, 1995). La contribution relative de l'immunité humorale et cellulaire dépend à la fois parasite et de l’hôte, et de la complexité de la relation hôteparasite. Chez les souris, l'immunité chez Plasmodium yoelii est principalement assurée par les anticorps alors que chez P. chabaudi, elle est essentiellement à médiation cellulaire. Il est probable que les humains diffèrent entre eux par le type de mécanisme effecteur mis en jeu dans la réponse immune protectrice contre le parasite. Il est possible que différents mécanismes effecteurs opèrent pour différentes souches de parasites. I.5.1.3. Immunité dirigée contre les antigènes variables de surface Les antigènes variables de surface (VSA) exprimés à la surface des globules rouges parasités par P. falciparum sont des cibles importantes de l'immunité protectrice acquise qui se développe après une exposition au parasite (Bull et al, 1999; Fried et al, 1998; Marsh et al, 1989; Nielsen et al, 2004). Il a été montré que chez les femmes ayant souffert de paludisme placentaire, la présence d’anticorps antiadhésifs spécifiques de VSA est associée à la protection contre le paludisme lors de grossesses ultérieures (Staalsoe et al, 2004; Duffy et Fried, 2003). Ces anticorps différencient les femmes primipares et multipares dans leur sensibilité au paludisme. Les anticorps protecteurs sont dirigés contre des antigènes conservés du parasite. En effet, des réactions croisées entre sérums et parasites provenant de régions endémiques différentes ont été montrées (Fried et Duffy, 1998). La protection contre le paludisme pendant la grossesse est associée au var2csa. L’acquisition d’anticorps dirigés contre ce VSA est faite pendant la grossesse en réponse au parasite (Tuike Ndam et al, 2006). Les taux plasmatiques élevés d'anticorps anti-VAR2CSA en début Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 50 de grossesse sont associés à un risque réduit de faible poids à la naissance (Salanti et al, 2004) et d’infections placentaires de longue durée (Tuike Ndam et al, 2006). Le mécanisme humoral de protection contre le paludisme placentaire implique à la fois, les anticorps bloquant l'adhérence, tout comme des processus cytophiliques tels que la phagocytose et l’activation du complément. En effet, il a été montré que les IgG secrétées pendant la grossesse chez les femmes camerounaises impaludées sont essentiellement composés de sous-classes IgG1 et IgG3 (Megnekou et al, 2005). L’immunité à médiation cellulaire joue aussi un rôle dans le paludisme placentaire, mais sa contribution dans la protection demeure ambigüe. Au début de la grossesse il y a un biais dans la polarisation Th1/Th2 pour faciliter le développement de l'allogreffe fœtale, en favorisant une diminution des cytokines de type Th1 (TFN- et IFN-) (Krishnan et al, 1996) et une augmentation des cytokines de type Th2 (IL-4, IL-10, TGF-β) (Wegmann et al, 1993; Chaouat et al, 1999). Les cytokines placentaires modulent la fonction des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) en inhibant ou en stimulant l’expression de molécules à la surface des monocytes, des cellules dendritiques (DC) et des macrophages. La sécrétion d’IFN- par les cellules mononuclées du sang intervilleux est associée à la protection contre le paludisme placentaire (Moore et al, 1999), montrant le rôle de l’implication de la réponse cellulaire. I.5.1.4. Mémoire immunologique L’immunité anti palustre se développe lentement, et n’est jamais totale, elle est perdue chez les adultes qui quittent une zone d’endémie palustre, suggérant que l’exposition constante aux antigènes du parasite est nécessaire pour la mise en place de la mémoire immunologique mais aussi de son entretien. Il est généralement admis que les réponses immunes anti palustres et notamment les réponses humorales sont de très courte durée (Achtman et al, 2005). Cependant, la notion de mémoire immunologique dans le paludisme reste controversée. Chez les adultes, on a mis en évidence, la présence de cellules B mémoires spécifiques de P. falciparum pendant une période supérieure à 8 années en absence évidente d’exposition au paludisme (Deloron et Chougnet, 1992). Une étude plus récente confirme la persistance des cellules B mémoires Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 51 spécifiques de P. vivax et P. falciparum pendant une période de 6 ans en absence de toute transmission dans une zone endémique à faible transmission (Wipasa et al, 2010). De même, une autre étude récente a montré que le compartiment des cellules B mémoires spécifiques de P. falciparum augmente avec l’exposition au paludisme (Weiss et al, 2010). En revanche, une étude précédente avait rapporté de très faibles fréquences de cellules B mémoires spécifiques du parasite chez les enfants exposés au paludisme (Dorfman et al, 2005). I.5.2. Rôle des cytokines dans l’infection palustre Dans l’infection par Plasmodium la réponse inflammatoire est nécessaire pour éliminer le parasite. Cependant, elle peut conduire à des lésions tissulaires considérables. L’activation des phagocytes pour l’élimination des parasites intracellulaires ou extracellulaires, nécessite la production des cytokines inflammatoires, ce qui peut provoquer des effets systémiques tels que l’anémie sévère ou le paludisme cérébral (McGuire et al, 1994; Luty et al, 2000). Le pronostic d’une infection palustre dépend d’un délicat équilibre entre une induction appropriée ou inappropriée de ces médiateurs. I.5.2.1 Cytokines pro-inflammatoires et paludisme I.5.2.1.1. TNF- TNF- est la première cytokine caractérisée, induite par le parasite. La production de TNF- est induite chez les macrophages par les érythrocytes infectés par Plasmodium, l’hémozoïne (Pichyangkul et al, 1994) et certains glycolipides comme le GPI (Scholfield et al, 1993). Le GPI stimule aussi la synthèse d’oxyde nitrique synthétase (NOS) par les macrophages (Tachado et al, 1996) et active les cellules endothéliales par la transduction d’un signal médiée par la tyrosine-kinase (Schofield et al, 1996). Les anticorps dirigés contre le GPI bloquent la production de TNF- par les cellules mononuclées en réponse à l’activation de lysats de globules rouges infectés par différents clones de parasites (Bate et al, 1994). TNF- joue un rôle important dans la phagocytose des érythrocytes infectés en augmentant l’expression des récepteurs Fc sur les monocytes. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 52 TNF- agit également sur les lymphocytes et monocytes en augmentant l’inhibition de P. falciparum par un mécanisme indépendant de la phagocytose. TNF- joue aussi un rôle dans la régulation de la production d’autres cytokines. En effet, TNF- régule la production de l’interleukine-12 (IL-12) par les macrophages. C’est aussi un important cofacteur de l’IL-12 dans la production d’IFN- par les cellules NK (Tripp et al, 1993). Les concentrations plasmatiques de TNF- et NO sont associées à la résolution rapide de la fièvre et à l’élimination des parasites. Toutefois, il convient de noter que TNF- semble également avoir, chez environ 1% des individus atteints de paludisme, des propriétés néfastes telles que la fièvre, les courbatures et douleurs en relation avec la phase aiguë de la maladie, une hypoglycémie, des hémorragies et un coma réversible (Beutler et al, 1993). En outre, une étude a montré une étroite association entre l’anémie sévère, des concentrations élevées de TNF- et un grand nombre de monocytes circulants contenant l’hémozoïne. Ceci suggère que la production de TNF- induite par l’hémozoïne joue un rôle dans l’initiation ou l’exacerbation de l’anémie comme pronostic clinique d’une parasitémie chronique incontrôlée (Luty et al, 2000). I.5.2.1.2. Interféron-gamma (IFN-) L'interféron est un facteur d'activation des macrophages impliqué dans la réponse immunitaire innée au paludisme. Il est produit principalement dans une réponse immunitaire spécifique par les lymphocytes T CD4+ et T CD8+et par les cellules NK dans une réponse immunitaire non spécifique (Weiss et al, 1993). Les études faites dans les modèles murins expérimentaux ainsi que chez l'homme suggèrent un rôle important de l’IFN- dans les réponses immunitaires protectrices contre le paludisme au stade sanguin. La production d’IFN- par les cellules T CD4+ spécifiques d’antigènes du stade sanguin est associée à une protection contre la réinfection (Luty et al, 1999). La sécrétion cellulaire de l’IFN- pourrait également contribuer à stimuler la synthèse des immunoglobulines cytophiliques spécifiques du stade sanguin et jouer un rôle dans les mécanismes cellulaires inhibiteurs dépendant d’anticorps (Bouharoun-tayoun et al, 1995). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 53 Les cellules cibles de l’IFN- lors d'une infection à P. falciparum sont des monocytes/ macrophages (Bate et al, 1988), les neutrophiles (Kumaratilake et al, 1991), les cellules Th2 (Taverne et al, 1993) et les hépatocytes infectés par le parasite (Klotz et al, 1995). Les Macrophages activés par l’IFN- libèrent le TNF-, le facteur de croissance transformantbeta (TGF-β), l'interleukine 1 (IL-1), l’interleukine 6 (IL-6), les radicaux libres oxygéné et le NO (Clark et al, 1997). L’IFN- par l’intermédiaire de signaux de transducteurs associés à la transcription, active l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) et induit la L-arginine par la voie dépendante du NO, entrainant l'élimination d’hépatocytes ou de schizontes hépatiques infectés (Snounou et al, 2000). Le NO jouerait donc un rôle important dans la destruction des parasites intra hépatiques en réponse à l’IFN- et à d'autres cytokines libérées par les cellules T et les cellules NK. Le traitement d’hépatocytes infectés par Plasmodium in vitro avec de l’IFN- entraîne l’élimination de P. falciparum de la culture. Chez l’homme, il a été montré que les enfants ayant une hyper parasitémie à P. falciparum avaient des concentrations plus faibles en cellules T CD4+ sécrétrices d’IFN- comparativement à ceux ayant un paludisme simple (Winkler et al, 1999). Il semblerait que l’IFN- soit essentiel dans la résolution de l'infection primaire en limitant la phase initiale de la réplication du parasite, mais contribuerait également aux symptômes de la phase aigue du paludisme, comme la fièvre, les nausées, des maux de tête à travers l’induction de TNF- et l’IL-1(Riley et al, 1999) I.5.2.1.3. L’interleukine-12 (IL-12) L’IL-12 est une cytokine immunomodulatrice impliquée dans la protection contre les infections virales, bactériennes et parasitaires. Cette cytokine stimule non seulement une réponse immunitaire à médiation cellulaire, mais elle affecte également l’immunité humorale en induisant la commutation isotypique des immunoglobulines par des mécanismes qui sont à la fois dépendants ou indépendants de l’IFN- (Trinchieri, 1995). L’IL12 stimulerait aussi la production d’anticorps par les lymphocytes B. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 54 Dans un modèle murin, Il a été montré que l'IL-12 induisait une immunité protectrice contre le stade sanguin de l'infection plasmodiale (Crutcher et al, 1995). Il est probable que la production d’IL-12 soit stimulée par la phagocytose du parasite. L’IL-12 agit sur les cellules T CD4+ activées par l'antigène, en stimulant les signaux transducteurs, en activant le facteur de transcription 4 (STAT4) et en induisant la différenciation des cellules T en sous-type Th1 (O’Garra et al, 2000). Les cellules effectrices Th1 produisent l’IFN- qui agit sur les macrophages en stimulant leur fonction microbicide et en augmentant leur production d'IL-12. Les concentrations élevées d'IL- 12 modulent l'activité des macrophages, qui est associée à une forte destruction des érythrocytes (Luty et al, 2000, Crutcher et al, 1995). Il semblerait que les événements précoces de la réponse immunitaire à médiation cellulaire nécessaires dans la défense contre le paludisme, sont initiés par la libération de l'IL- 12 par les monocytes/macrophages, les cellules B, et d'autres types cellulaires (Luty et al, 2000, Crutcher et al, 1995) et par conséquent la concentration d'IL-12, révèle une signification pronostique dans l’infection palustre. L'induction de l’IFN- est une conséquence directe de l’activation des cellules T CD4+ et T CD8+: la production d’IFN- précède et initie celle de l’IL-12, qui à son tour induit la production de l’IFN- par les cellules NK dans une boucle rétroactive positive qui représente un important mécanisme d'amplification (O’Garra et al, 2000). Les concentrations réduites d’IL-12 chez les patients atteints d’hyper parasitémie et de paludisme sévère pourraient être liées à l’activité réduite de l’interféron médiée par les cellules T. Au cours du paludisme aigu la production constitutive de l'IL-12 par les monocytes est inhibée après la phagocytose de l’hémozoïne ou après production d'IL-10 qui antagonise l'activité de l'IL- 12 (O’Garra et al, 2000). I.5.2.2. Cytokines anti-inflammatoires Les réponses précoces des cytokines pro-inflammatoires semblent assurer une immunité protectrice, tandis que les réponses tardives contribuent à la pathologie. Ceci suggère qu’un équilibre crucial devrait exister au cours de la réponse inflammatoire dans l’infection palustre ; une réponse asymétrique conduisant à une maladie grave. Dans le Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 55 paludisme simple, la réponse inflammatoire devrait être régulée par les cytokines antiinflammatoires telles que l’IL-4, l’IL-10 et TGF-β. I.5.2.2.1. Interleukine-4 L’IL-4 est produite par les lymphocytes de type Th2 et les basophiles/mastocytes activés. Elle est impliquée dans l’activation des lymphocytes T cytotoxiques (LTC), les cellules NK et les macrophages. L’IL-4 est une composante importante de la réponse immunitaire. Elle stimule la croissance des lymphocytes Th2 et inhibe la réponse Th1 par la réduction de la production d'IFN- (Luty et al, 2000). L’IL-4 et les lymphocytes Th2 sont importants dans la réponse immunitaire humorale contre Plasmodium. Les cellules T CD4+ sont cruciales pour le développement de réponses T CD8+ dirigées contre les hépatocytes infectés (Carvalho et al, 2002). Il a été montré que la production d’IL-4 stimulée chez les cellules T par les antigènes du parasite in vitro était associée à l’augmentation d’anticorps sériques en réponse aux mêmes antigènes plasmodiaux in vivo. Cependant, une autre étude a montré que l’IL-4 inhibait la capacité des macrophages de donneurs naïfs à éliminer P. falciparum (Kumaratilake et al, 1992). Cette étude est en contradiction avec celle montrant que l’IL-4 contribue à la réponse humorale dirigée contre les parasites (Troye-Blomberg et al, 1990). I.5.2.2.2. Facteur de croissance transformant-beta (TGF-β) TGF-β produit par un large éventail de cellules comme les macrophages, les cellules NK et les cellules T et B, a un rôle central dans le contrôle de la transition entre la réponse pro-inflammatoire (Th1) et la réponse anti-inflammatoire (Th2) pendant les phases aigue et de résolution de l’infection palustre (Tsunawaki et al, 1988). Le rôle de TGF-β a été mis en évidence dans un modèle expérimental d’infection où, sa concentration est cruciale pour l’activation des macrophages (Tsunawaki et al, 1988). Effet, les monocytes / macrophages immatures ont de fortes concentrations de récepteurs TGF-β et sont sensibles à de faibles concentrations de TGF-β, qui favorisent la maturation des macrophages et les rendent plus sensibles à l'activation par ce dernier. De plus, le TGF-β inhibe la production d'IFN- et de TNF-, augmente celle de l 'IL-10 (Maeda et Shiraishi, 1996) et diminue l’expression des molécules d'adhésion (Nakabayashi et Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 56 al, 1997). Une production précoce de TGF-β dans l'infection, active les monocytes/macrophages provoquant la phagocytose des globules rouges parasités et la mort des parasites ingérés (Ferrante et al, 1990). La cinétique de TGF-β semble être cruciale pour un contrôle efficace de la densité parasitaire dans l’infection plasmodiale. En effet, trop de TGF-β trop tôt va empêcher la mise en place de l’immunité cellulaire de type Th1 par l’inhibition de l’IFN- et de TNF-. Trop peu de TGF-β trop tard conduit à une hyper parasitémie et à la mort liée à une surproduction des cytokines de type Th1 (Omer et al, 2000). TGF-β jouerait deux rôles importants dans le paludisme qui varient selon le moment de l'infection. Au début de l'infection, le TGF-β pourrait induire les réponses de type Th1 qui contrôlent la croissance du parasite. Plus tard dans l'infection TGF-β pourrait réguler négativement les réponses Th1 pour limiter la pathologie associée à l’inflammation. TGF-β joue aussi un rôle dans le pronostic de l’infection plasmodiale à travers ses effets sur les lymphocytes B. En effet, de faibles concentrations de TGF-β stimulent la sécrétion de sousclasses d'immunoglobulines par les cellules B (Snapper et al, 1993), mais à des concentrations plus élevées la production d'anticorps est inhibée (Stavnezer et al, 1995). Le rôle de TGF-β a été aussi étudié dans les infections palustres chez l’homme. Deux études de l'infection naturelle chez les patients au Gabon (Perkins et al, 2000) et en Thaïlande (Wenisch et al, 1995) et une étude expérimentale de l'infection humaine (Walther et al, 2005 et Walther et al, 2006) corroborent les résultats obtenus dans les modèles animaux. Une étude longitudinale d’une infection induite par les sporozoïtes de P. falciparum chez l’homme a montré qu’une régulation positive précoce du taux de TGF-β1 et des taux élevés de TGF-β1 bioactifs au moment de l'émergence du parasite du foie étaient associés à une croissance plus rapide du parasite (Walther et al, 2005 et Walther et al, 2006). I.5.2.2.3. L’interleukine-10 (IL-10) L’Interleukine-10 a été trouvé dans le plasma des patients atteints de paludisme aigu (Wenisch et al, 1995). L’IL-10 est produite par les monocytes, les lymphocytes Th2 et les cellules B. Cette cytokine inhibe la production des cytokines des lymphocytes Th1 et des cellules T CD8+, mais pas celle des lymphocytes Th2. Néanmoins, l'IL-10 n'affecte pas la Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 57 prolifération des lymphocytes Th1 et T CD8 +, mais induit la prolifération des cellules B et la production d'immunoglobulines, qui est essentiel pour le développement et la maturation des anticorps antipaludéens. L’IL-10 semble avoir un rôle important dans la définition de la réponse des cellules T auxiliaires du paludisme. En outre, l'IL-10 réduit l’expression du CMH II sur les macrophages, conduisant à la réduction de la présentation d’antigènes (Akdis et al, 1999), inhibe la production des radicaux libres oxygénés et le monoxyde d’azote (NO), empêche le priming et la prolifération des cellules T', et supprime la production par les cellules T d'IFN-, d’IL-6, TNF- et de GM-CSF (Akdis et al, 1999). L'inhibition de la sécrétion de l’IFN- et de TNF- par l'IL-10 a été reportée comme un mécanisme pour contrecarrer le rôle pathologique des macrophages dans le paludisme cérébral (Kossodo et al, 1997). Une étude réalisée au Gabon chez des enfants et des adultes infectés par P. falciparum, a montré de nombreuses cellules T CD4+ et T CD8+ productrices d’IL-10 co-exprimant l’IFN- (Winkler et al, 1999). Enfin, l'augmentation de l'IL-10 est plus prononcée et plus spécifique que l'IL-6 et l'IL-8 chez les patients ayant une infection palustre par rapport à d'autres infections (Jason et al, 2001). Toutefois, il n'est pas encore clair si l'augmentation de la concentration d’IL-10 a un rôle bénéfique en réduisant la réponse inflammatoire induite par le parasite, ou est préjudiciable en diminuant les réponses immunitaires cellulaires. I.5.3. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) La présentation d’antigènes d’un agent pathogène peut être faite aux lymphocytes B mais également aux lymphocytes T. La présentation de l’antigène aux lymphocytes B se fait via l’interaction entre leur récepteur d’antigène (BCR) et des épitotes d’antigènes solubles, particulaires ou situés sur des membranes cellulaires. Les CPA des lymphocytes B sont essentiellement les cellules dendritiques folliculaires (CDF) des ganglions et de la rate. Les antigènes sont aussi présentés aux lymphocytes T. Cette présentation est faite au TCRβ sous forme de peptides par les molécules de classe I ou de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). La présentation par les CMH I aux lymphocytes T CD8+ est assurée par presque toutes les cellules de l’organisme. Elle intervient dans la lyse des Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 58 parasites intracellulaires. Les CPA comprennent les cellules dendritiques, les lymphocytes B, les macrophages/monocytes, les cellules endothéliales et les cellules épithéliales. I.5.3.1 Les cellules dendritiques (DC) Les cellules dendritiques sont les principales CPA dans la majorité des organes. Ce sont des cellules qui ont la particularité unique d’activer les cellules T naïves. Elles expriment à leur surface des molécules de CMH II et présentent les antigènes aux cellules T CD4+. Elles interagissent avec les cellules T et cette interaction se fait via la relation entre leurs molécules co-stimulatrices B7 (CD80 et CD86) et le CD28 des cellules T. Les cellules dendritiques captent les antigènes, assurent leur apprêtement, et leur présentation sous formes de peptides associés aux CMH II, puis leur transport vers les zones T des ganglions lymphoides. Elles ont la particularité d’orienter la réponse immunitaire vers une réponse de type Th1 par la production d’IL-12. Elles perdent leur capacité de phagocytose par la migration et la maturation (augmentation à leur surface de molecules CMH II, CD80 et CD86, CD40). Leur maturation est stimulée par divers parasites et agents pathogènes et par certains composés bactériens tels que les lipopolysaccharides (LPS) ; mais elle est inhibée en présence d’IL-10. Le rôle des cellules dendritiques a été décrit dans divers modèles d’infections plasmodiales. Certaines études ont montré que leur maturation est inhibée en présence d’érythrocytes inféctés par P. falciparum, alors que d’autres études au contraire, montrent qu’elles demeurent fonctionnelles. I.5.3.2. Les lymphocytes B Les lymphocytes B reconnaissent l’antigène par leurs immunoglobulines membranaires, internalisent le complexe BCR-Antigène et le dégrade en peptides dans la voie des endosomes ; ces peptides sont associés aux CMH II et exprimés sur la membrane cellulaire. Cela permet l’activation des cellules T qui, à leur tour par contact membranaire et synthèse de cytokines contrôlent l’activation des cellules B. Ce mode de présentation de l’antigène intervient surtout lors de la réponse anticorps à une injection de rappel d’un antigène T-dépendant. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 59 I.5.3.3. Les macrophages/monocytes Les macrophages et monocytes, qui expriment les molecules de classe II du CMH, présentent des peptides d’antigènes aux lymphocytes T CD4+. Du fait de leur localisation anatomique hors des zones T des organes lymphoïdes périphériques, ces cellules n’interviennent pas dans l’induction d’une réponse immunitaire. Elles interagissent par contre avec des lymphocytes T CD4+ différenciés au stade effecteur des réponses T dépendantes. La présentation de l’antigène aux lymphocytes T CD4+ peut aussi être assurée par les cellules endothéliales ou des cellules épithéliales exprimant des molécules de classe II du CMH après stimulation par l’IFN-. I.5.4. Stratégies d’évasion immunitaire Les relations entre l’hôte et son parasite sont complexes. Pour survivre P. falciparum a développé plusieurs stratégies d’évasion du système immunitaire de son hôte. Ces stratégies vont du parasitisme intracellulaire, simple mécanisme d’échappement à la reconnaissance antigénique, à la diversité ou la variation antigénique. Le génome de P. falciparum compte plus de 5300 protéines, et nombreuses d’entre elles sont polymorphes (Gardner et al, 2002). La plupart des réponses induites par les antigènes polymorphiques du parasite pourraient ne pas être protectrices mais servir de leurre au système immunitaire de l’hôte. La variation antigénique apparaît alors comme un mécanisme efficace pour échapper à l’immunité humorale. Les stratégies d’évasion immunitaire de P. falciparum sont nombreuses. Nous présentons deux de ces mécanismes dans la section ci-dessous. I.5.4.1. Altération des ligands peptidiques Les épitopes variants de CSP provoquent un antagonisme induit par l’altération des ligands peptidiques qui inhibe le priming des cellules T par les cellules présentatrices d’antigènes de class I (Gilbert et al, 1998; Young et al, 2005). Ainsi, les cellules T sont capables de proliférer en réponse à l’antigène, mais sont incapables d’éliminer le parasite ou de produire des cytokines protectrices telles que l’IFN-. Il a été montré aussi que les mêmes épitopes variants de CSP sont capables d’interagir avec les cellules T cytotoxiques mémoires Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 60 de sujets exposés au paludisme, abolissant ainsi leur activité lytique (Plebanski et al, 1999). L’altération des ligands peptidiques interfère avec les réponses T protectrices. Cet antagonisme pourrait être une stratégie pour maintenir une population de cellules T de l’hôte exposée au paludisme tout en demeurant fonctionnellement naïve. L’infection par P. falciparum induit l’anergie et la suppression des cellules T spécifiques du parasite et non celle des cellules T de spécificité différente, c’est une autre stratégie développée par le parasite pour échapper à son hôte et de retarder le développement de l’immunité dirigée contre lui (Hirunpetcharat et Good, 1998). I.5.4.2. Altération des cellules présentatrices d’antigènes L’infection des globules rouges par P. falciparum altère la maturation des cellules dendritiques aussi bien chez l’homme (Urban et al, 1999) que chez les souris (Ocana‐Morgner et al, 2003). Chez l’homme, l’inhibition des cellules dendritiques est probablement médiée par l’interaction entre PfEMP-1 exprimé à la surface des globules rouges parasités et le récepteur CD36 exprimé à la surface des cellules dendritiques (Urban et al, 2001). Le parasite peut aussi échapper au système immunitaire de l’hôte en inhibant la fonction des monocytes/macrophages par les globules rouges infectés (Leitner et Krzych, 1997) et/ ou par l’hémozoïne (Skorokhod et al, 2004). L’inhibition de la maturation des cellules dendritiques par les globules rouges parasités demeure une controverse. En effet, différentes études ont montré des cellules dendritiques entièrement fonctionnelles en réponse à l’infection plasmodiale (Seixas et al, 2001; Coban et al, 2002; Perry et al, 2004). PfEMP-1 peut aussi atténuer la réponse immune de l’hôte en supprimant la production d’IFN- par les PBMCs par un mécanisme indépendant du CD36 (D’Ombrain et al, 2007). I.5.5. Rôle des cellules T régulatrices naturelles dans l’infection palustre Les lymphocytes T régulatrices (Tregs) appartiennent à une population de cellules lymphoïdes exerçant une activité immunosuppressive. Elles jouent un rôle critique dans l’équilibre entre les réponses immunes protectrices et les pathologies auto-immunes (Kullberg et al, 2002; Maloy et al, 2003; Hori et al, 2002; Montagnoli et al, 2002). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 61 Figure 10. Mécanismes de base utilisés par les Tregs, d’après Vignali et al, 2008. Les mécanismes sont regroupés en quatre modes d’action : + + 1. Cytokines inhibitrices comprennent IL-10, IL-35 et TGF-β qui inhibent les cellules T effectrices T CD4 et T CD8 . 2. Cytolyse des cellules effectrices par un mécanisme granzyme A et granzyme B dépendant ou perforine dépendante. 3. Perturbation du métabolisme comprenant une apoptose médiée par la privation d’IL-2 aux cellules effectrices par la haute affinité des Tregs au récepteur IL-2 α (CD25), inhibition des cellules effectrices médiée par l’AMPc, immunosuppression induite par CD39 et/ou CD73 ou par le récepteur de l’adénosine de type A2A. 4. Ciblage des cellules dendritiques (DC) par les mécanismes qui modulent la maturation et / ou la fonction des cellules dendritiques tels que l’inhibition de la maturation médiée par l’interaction CMH II-LAG-3 (Lymphocyte activation gene-3 ou CD223) et induction de l’indolamine-2,3dioxygenase (IDO) qui est une molécule immunosuppressive via l’interaction CTLA-4 / (CD80/CD86). Cette lignée de cellules T suppresseurs est caractérisée par une expression élevée de CD4 et CD25 (Sakaguli et al, 1995) et une faible expression de CD127 (Liu et al, 2006). Les Tregs expriment constitutivement des taux élevés du récepteur de l’inhibiteur des cellules T CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte Antigen 4 ou CD152) (Salomon et al, 2000) et le récepteur de TNF- inductible par les glucocorticoïdes (GITR) (McHugh et al, 2002). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 62 Forkhead box P3 (Foxp3) est le seul facteur de transcription requis pour la génération des Tregs (Hori et al, 2003) et c’est le marqueur le plus spécifique de cette population de cellules. Le rôle des Tregs est bien établi dans l’inhibition de l’immunité anti-tumorale (Shimizu et al, 1999) mais aussi dans la prévention des maladies auto-immunes comme le diabète (Salomon et al, 2000). Les mécanismes de base utilisés par les cellules Tregs sont résumés dans la figure 10. Les cellules T regs naturelles sont capables d'inhiber à la fois la production d'IL-2 et la prolifération cellulaire des lymphocytes TCD4+ classiques (Thornton et al, 1998) par des mécanismes contact-dépendants et/ou par la production de cytokines anti-inflammatoires comme le TGF-β (Nakamura et al, 2001) et l'IL-10 (Asseman et al, 1999). Les T regs naturelles ont une capacité de prolifération limitée et sont incapables de sécréter l’IL-2, elles exercent leur fonction suppressive à travers un récepteur des cellules T (CTLA-4), un processus qui semble nécessiter la présence de cellules présentatrices d’antigène comme les cellules dendritiques (Thornton et al, 1998). Après activation, les Tregs naturelles ne nécessitent aucune stimulation supplémentaire et sont capables de supprimer les réponses des lymphocytes T de manière non spécifique. En plus des Tregs naturelles, les Tregs inductibles constituent un autre sous-type de lymphocytes T suppresseurs (Bluestone et al, 2003). Contrairement aux Tregs naturelles qui se développent dans le thymus, les Tregs inductibles proviennent des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ classiques qui acquièrent leur activité suppressive par l’activation par les cytokines immunosuppressives ou les cellules dendritiques immatures. La raison pour laquelle les parasites du paludisme persistent dans l'état de prémunition est inconnue. Il est probable que des mécanismes immunosuppresseurs modulant l’immunité protectrice conduisent à la persistance des parasites. Par leur action immunosuppressive, les Tregs naturelles pourraient entraver l’induction de l’immunité anti plasmodiale. I.5.5.1. Rôle des Tregs naturelles dans le contrôle de l’infection palustre chez les rongeurs Chez les rongeurs, de nombreuses études ont investigué le rôle des Tregs naturelles dans la modulation de l’induction des mécanismes immunitaires responsables du contrôle de la charge parasitaire. En effet, Il existe deux sous-lignées de P.yoelii 17X. L'une d’entre Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 63 elle est très virulente (PyL) et provoque des infections létales, tandis que l’autre (PyNL) se traduit par une auto-résolution d’infections non létales. Chez les souris BALB/c infectées par les parasites virulents PyL, la déplétion des cellules Tregs naturelles provoque une hyper parasitémie suivie de la mort, faisant ainsi apparaître le rôle des cellules Tregs dans un mécanisme d’échappement essentiel utilisé par les parasites pour se soustraire à l'immunité de l'hôte (Hisaeda et al, 2004). Dans une autre étude utilisant les parasites virulents et non virulents de P. yoelii, les expériences de déplétion in vivo n’ont pas confirmé le rôle des cellules Tregs naturelles dans le contrôle de la parasitémie chez les souris (Couper et al, 2008). L'impact de la déplétion des cellules Tregs naturelles a été aussi évalué dans les modèles murins d’infection par les lignées létales (DS) et non létales (DK) de P. chabaudi adami. Dans ces modèles, La déplétion des cellules Tregs entraîne une production accrue d'IFN- et de TNF- au cours d’infections létale et non létale par P. chabaudi adami. La déplétion des cellules Tregs entraîne des réponses pro-inflammatoires accrues chez les souris infectées par la lignée non létale; cependant, elle ne modifie pas le cours de leur infection (Cambos et al, 2008). Dans la même étude, il a été montré que La déplétion des Tregs naturelles aggravait la charge parasitaire et accélérait la mort des souris infectées par la lignée létale DS. L'anémie hémolytique qui résulte d’une hyper parasitémie a également été renforcée chez les souris en l'absence de cellules Tregs naturelles (Cambos et al, 2008). I.5.5.2. Rôle des cellules Tregs naturelles dans le contrôle du paludisme cérébral expérimental Plasmodium berghei-ANKA induit chez les lignées de souris sensibles le paludisme cérébral. Cette infection murine a de nombreuses caractéristiques communes avec l’infection humaine et est donc acceptée comme un modèle pour certains aspects importants du paludisme cérébral (Brain de Souza, 2002; Miller et al, 2002; Schofield et Grau, 2005; Clark et Schofield, 2000). Les cytokines anti-inflammatoires comme le TGF-β et l'IL-10 régulant d’une part les réponses immunitaires de type Th1 au cours de l’infection palustre (Omer et al, 1998), et d’autre part, jouant un rôle protecteur contre le paludisme cérébral à P. berghei (Kossodo et Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 64 al, 1997), il a été postulé que la résistance à la maladie pourrait être associée à l'élaboration de mécanismes de défense visant à inhiber directement les réponses inflammatoires pathogènes. Chez les souris BALB/c résistantes au paludisme cérébral, les cellules T CD4+ présentent une sécrétion d’IL-2 réduite et une prolifération cellulaire fortement inhibée en réponse aux stimuli polyclonaux et spécifiques du parasite. Les cellules Tregs joueraient un rôle dans l’inhibition de la prolifération des cellules T se produisant au cours de l’infection (Nie et al, 2007). Dans cette même étude, la déplétion des cellules Tregs a montré qu’ils empêchaient la mise en place de cellules mémoires de type Th1 spécifiques du parasite, démontrant le rôle des Tregs dans le contrôle des réponses pathogéniques aboutissant à une maladie fatale (Nie et al, 2007). I.5.5.3. Rôle des cellules T régulatrices dans le contrôle du paludisme chez l’homme Quelques études se sont intéressées au rôle des cellules Tregs dans l’infection palustre chez l’homme. Ces études sont complexes du fait de la variété de facteurs à prendre en compte: design de l’étude, taille de l’échantillon, utilisation d’échantillons frais ou cryopréservés qui pourraient avoir un impact sur les résultats. Walther et al, (2005) ont montré chez des volontaires infectés expérimentalement par les piqûres de moustique, une augmentation du nombre de cellules Tregs dans leur sang périphérique. Ils ont observé chez les personnes ayant un nombre élevé de cellules Tregs, de plus fortes densités parasitaires que chez celles ayant de faibles fréquences de cellules Tregs; suggérant que la présence de cellules Tregs dans le sang périphérique de personnes infectées pourrait faciliter la réplication du parasite. Dans cette même étude, ces auteurs ont montré qu’une réduction des cytokines pro-inflammatoires telles qu’IFN-, IL-6 et IL-12 ainsi qu’une production significative de TGF-β étaient associées à une parasitémie élevée (Walther et al, 2005). En outre, les monocytes et non les cellules Tregs étaient la source cellulaire de TGF-β produit en réponse à l'infection (Walther et al, 2005). Ces auteurs ont de ce fait postulé que le TGF-β produit par les monocytes pouvait favoriser la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs périphériques en cellules Tregs en induisant leur expression de Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 65 Foxp3. Cette augmentation du nombre de cellules Tregs entraîne une croissance accrue du parasite. Dans une étude réalisée au Kenya, l’augmentation du nombre de cellules Tregs CD4+ CD25high dans le sang périphérique des sujets a été associée à un risque accru de paludisme clinique (Todryk et al, 2008), suggérant que les lymphocytes Tregs naturelles peuvent affecter négativement l'immunité naturelle acquise contre le paludisme. Il a été montré que, malgré le niveau similaire d’exposition au paludisme, les Peuls du Burkina Faso semblent être plus résistants à la maladie que les autres groupes ethniques (Modiano et al, 1996). Au Burkina Faso, le rôle des cellules T régulatrices a été étudié dans une approche comparative interethnique intégrant la susceptibilité au paludisme (Torcia et al, 2008). Dans cette étude, le pourcentage de cellules Tregs était supérieur chez les Mossis que chez les Peuls. Une forte résistance au paludisme chez les personnes d’origine Peule était associée non seulement à un déficit fonctionnel des cellules Tregs mais aussi à une réduction de l’activité immunosuppressive par rapport aux Mossis (Torcia et al, 2008). Le rôle des cellules Tregs a été aussi exploré chez les enfants gambiens atteints de paludisme simple ou sévère (Walther et al, 2009). Walther et al, ont montré que la réponse immunitaire de type Th1 était plus élevée chez les enfants présentant un paludisme grave. Cependant, le nombre et la fréquence des cellules Tregs étaient identiques dans les deux groupes cliniques (Walther et al, 2009). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 66 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 67 II. Matériels et méthodes II.1. Populations d’étude Groupe de Sukuta Le groupe d’étude de Sukuta a été recruté en collaboration avec le ministère gambien de la santé de septembre 2001 à janvier 2002. La ville de Sukuta (banlieue de Banjul) est située à 11 km du Medical Research Council (MRC). La ville de Sukuta compte environ 20.000 habitants, le nombre d’accouchements annuels est d’environ 800. Soixante quinze (75) femmes ayant consenti librement à participer à l’étude ont été recrutées. Le sang du cordon (jusqu'à 50 ml) a été prélevé à l’accouchement dans les tubes héparines. Les gouttes épaisses ont été préparées, colorées au Giemsa pour la recherche de l’infection active par P. falciparum dans le sang périphérique des mères, le sang du cordon prélevé dans les tubes EDTA, et les empreintes de placentas. Toutes les lames ont été lues à deux reprises par deux microscopistes expérimentés et les différences de lecture ont été résolues par un troisième lecteur. Une lame n’était déclarée négative qu’après lecture de 100 champs au grossissement x1000 (limite de détection, 2 parasites/µL) (Greenwood et al, 1991) Groupe de Brefet Quarante-trois (43) donneurs adultes asymptomatiques pour le paludisme ont été recrutés à Brefet (village situé à 85 km de Banjul) en Gambie. Des échantillons de sang (50 ml) ont été collectés dans des tubes héparine après consentement éclairé de tous les donneurs. Les gouttes épaisses ont été préparées pour déterminer la parasitémie des donneurs. Le taux d’hémoglobine des donneurs a été aussi mesuré. Des échantillons de sang ont ensuite été traités pour séparer les plasmas des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC). Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique mixte gouvernement de Gambie/ MRC. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 68 Groupe de Farafenni Pour étudier la réponse immunitaire dirigée contre les antigènes MSP119, AMA1 et CSP de P. falciparum, un groupe de 658 adultes et enfants (303 enfants et 234 adultes) a été recruté à Farafenni, située sur la rive nord du fleuve Gambie à près de 300 kms de Banjul. La transmission du paludisme y est saisonnière, elle correspond à la saison pluvieuse comprise entre août et décembre. La transmission connaît un pic entre octobre et novembre. Les sujets ont été recrutés dans 8 villages environnant Farafenni. Le système démographique d’enregistrement des ménages du MRC a été utilisé pour recruter un échantillon d’enfants et d’adultes âgés de 6 mois à 45 ans. Les enfants et les adultes ont été recrutés parmi les trois principales ethnies de la région, Wolof, Mandinka et Peul. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants adultes et des parents ou tuteurs des enfants. Les individus ont été inclus dans l’étude du 14 au 28 juillet 2003. Un prélèvement de sang veineux a été effectué dans des tubes EDTA et héparine. Culots sanguins et plasmas ont été séparés. Les plasmas ont été congelés et conservés à -20°C pour l’analyse des réponses immunitaires humorales. Les culots sanguins ont servis pour l’extraction d’ADN génomique humain. Les gouttes épaisses ont été préparées et colorées au Giemsa pour la détection des parasites à l’inclusion. Après l’échantillonnage initial en juillet 2003, une détection active des cas de paludisme était faite par un suivi clinique hebdomadaire de chaque participant pendant près de 23 semaines (jusqu’à janvier 2004). À chaque visite, la température axillaire du patient était prise avec un thermomètre digital. En cas de fièvre (température > 37,5 ° C), un test rapide de paludisme (ICT Malaria Pf/PvTM: HRP, AMRAD, Australia) était effectué. Si le test était positif, une goutte épaisse était aussi faite pour déterminer la densité parasitaire par microscopie. Toutes les personnes malades ont été traitées conformément aux directives nationales en vigueur (Pyrimethamine-sulfadoxine ou Amodiaquine). Tous les participants ayant eu des épisodes de fièvre en dehors du suivi actif étaient référés à l’hôpital provincial de Farafenni et pris en charge par un médecin. Deux enquêtes transversales impliquant l’ensemble des participants ont été réalisées, pour estimer le taux d’infection des sujets pendant les périodes de haute transmission (fin Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 69 octobre début novembre 2003) et de faible transmission (mi-décembre 2003) du paludisme. Les informations concernant l’utilisation ou non des moustiquaires imprégnées et l’état de l’habitat ont été aussi recueillies à l’inclusion. Une enquête entomologique a été réalisée dans les villages pour estimer le taux d'inoculation entomologique (EIR). Un questionnaire a été rempli pour recueillir les informations sur l’origine ethnique de chaque participant (groupe ethnique des parents, et des grands parents paternels et maternels). Le paludisme a été défini comme une fièvre (température axillaire > 37,5 ° C) avec densité parasitaire > 5000/µl (Migot-Nabias et al, 2000). L'étude a été approuvée par le comité d’éthique mixte gouvernement de Gambie / MRC. II.2. Mesure des anticorps dirigés contre P. falciparum par Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) II.2.1. ELISA MSP119 et AMA1 Les réponses immunitaires humorales dirigées contre MSP119 et AMA1 ont été mesurées dans les plasmas par (ELISA). Brièvement, les plaques ELISA (Immunlon4, Dynatech) sont recouvertes avec 1µg/ml d’antigène (MSP119 ou AMA1) dans du tampon carbonate et incubées pendant 16 heures à 4 ˚ C. Les plaques sont lavées trois fois avec une solution de PBS-Tween (0,05%), puis on y ajoute 150 µL d’une solution de blocage de PBSBSA à 1%. Les plaques sont incubées pendant 3 heures à température ambiante. La solution de blocage est retirée des plaques. Une dilution sériée des plasmas est ajoutée dans les plaques (1/1000; 1/2000; 1/4000; 1/8000 pour MSP119 et 1/1000 et 1/2000 pour AMA1). Une dilution sériée d’IgG humain purifiée et d’anti-IgG-POD (Dako A/S, Danemark) ont été utilisés pour servir de standard dans chaque plaque pour déterminer les concentrations relatives d’anticorps anti-MSP119 et AMA1. Les plaques sont incubées pendant 16 heures à 4°C, ensuite elles sont lavées 6 fois avec la solution de lavage de PBS-Tween (0,05%). Les anticorps anti-IgG-HRP, anti-IgG1-HRP et antiIgG3-HRP (The Binding Site, UK) sont ajoutés dans les plaques à la dilution de 1/5000 dans une solution de PBS-BSA à 1%. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant 3 heures, puis lavées 6 fois. La réaction est développée avec 100 µL d’une solution de Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 70 tetramethyl-benzidine (TMB) (Sigma, UK). Les réactions sont stoppées avec 100 µL de solution d’acide sulfurique 2M et elles sont lues le plus tôt possible à 450 nm. Les plasmas d’adultes vivants en zone d’endémie (Brefet) ont servi de contrôles positifs. Un pool de plasmas d’adultes européens n’ayant jamais eu de contact avec le paludisme a servi de contrôle négatif. Le seuil de détection a été défini comme étant la moyenne ± 3 déviations standard de la concentration du contrôle négatif. II.2.2. ELISA pour mesurer les anticorps anti-R32LR (CSP) Pour mesurer la réponse immunitaire humorale dirigée contre la séquence répétitive de CSP de P. falciparum, les plaques ELISA (Immunlon 4, Dynatech) sont enduites avec 0,1 µg d’antigène R32LR dans 50 µL de PBS et caséine [4 µL de caséine bouillie (0,5% de caséine, rouge de phénol, Thimérosal, PBS, 5N NaOH)] pour 5 mL d’antigène dilué. Cinquante (50) microlitres de l’antigène dilué sont mis dans les plaques ELISA en triplicata. Les plaques sont incubées pendant 16 heures à température ambiante. Elles sont ensuite bloquées par 250 µL d’une solution de blocage de caséine bouillie-Tween20 à 0,5% pendant une heure à température ambiante. Le contenu de la plaque est vidé, et on y ajoute 50 µL des plasmas dilués à la concentration appropriée. Chaque plaque comprend un contrôle négatif, un contrôle positif (DGP) et un blanc. Les échantillons sont mis dans les puits en triplicata à la dilution 1/50, suivi de dilutions sériées de 1/2. Les plaques sont incubées pendant 2 heures à température ambiante puis lavées avec du PBS-Tween20 à 0,5%. Dans chaque puits un volume de 50 µL d’anticorps anti-IgG humain couplé à la peroxydase est ajouté. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant 1 heure. Les plaques sont ensuite lavées 4 fois avec du PBS-Tween20 à 0,5%. Les IgG de chèvres anti-humaines couplées au HRP (Kirkegaard et Perry Laboratories) sont utilisées à une dilution de 1/1000. La révélation de la réaction est faite en utilisant 100 µL d’une solution de substrat ABTS HRP (Kirkegaard et Perry Laboratories) après une incubation pendant 1h à température ambiante. La réaction est arrêtée avec 10 µL de SDS à 10% (Sigma, Allemagne). La lecture des plaques est faite à 414 nm. La moyenne de la densité optique (DO) du sérum testé en triplicata est calculée, cette moyenne est multipliée par le facteur de dilution pour obtenir la moyenne pondérée (MP). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 71 La moyenne pondérée de chaque plaque est calculée de la façon suivante : MPcorrigée = moyenne MPDGP x MPéchantillon / MPDGP Les concentrations en µg/ml pour chaque plaque sont calculées selon la formule ci dessous: Concentration échantillon (µg/ml)= concentration DGP (9,8) x MPcorrigée échantillon/MPcorrigée DGP II.3. Culture in vitro de P. falciparum et préparation d’extraits de schizontes La souche Pf164 de P. falciparum a été maintenue en culture par la technique classique de Trager et Jensen (1976). Les globules rouges non parasités de donneurs de sang de groupe sanguin O ont été collectés dans les tubes citrate (ACD) [0,6% citrate d'hydrogène disodique, 0,4% de dextrose (D-glucose), Sigma, St Louis, MO, USA]. Les cultures des parasites sont repiquées par l’ajout de globules rouges frais chaque semaine. Le mélange des globules rouges parasités avec ceux non parasités a permis d’obtenir les parasitémies désirées. Les flacons sont mis en culture sous jarre à 37°C. Le milieu de culture est changé tous les jours et une goutte épaisse est faite pour déterminer la parasitémie et le stade parasitaire de la culture. Quand dans la culture la parasitémie est suffisamment élevée, elle est lavée et les schizontes sont concentrés dans une solution de Percoll à 72% (Sigma) et resuspendus à un taux d’hématocrite de 20%. Les schizontes subissent 4 fois un cycle de congélation et décongélation et la concentration protéique est évaluée par la lecture de la densité optique à 280 nm. Les extraits sont titrés avec des PBMCs d’adultes semi immuns. L’activation maximale induite par l’extrait de schizonte à travers la production d’IFN- par les PBMCs a été obtenue à une concentration de 10 µg/ml. L’extrait de globules rouges non parasités de concentration identique a servi de contrôle négatif. Les cultures de P. falciparum ont été testées à intervalles réguliers et déclarées exemptes de contamination par des mycoplasmes en utilisant un kit à base d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) (American Type Culture Collection; ATCC, Manassas, USA). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 72 II.4. Séparation et analyse des cellules T CD4+CD25+ Les cellules mononuclées du sang de cordon (CMSC) sont délestées en cellules T CD4+ CD25+ en utilisant des billes Miltenyi (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne), en suivant les instructions du fabricant. Brièvement, la déplétion des cellules T CD4+CD25+ est réalisée en deux étapes. Dans la première étape , les cellules non TCD4+ sont marquées avec un cocktail d’anticorps biotinylés anti- CD16, CD14, CD8, CD19, CD56 et TCRγδ et des microbilles anti-biotine pour séparer cellules T CD4+ des non T CD4+. Les cellules marquées sont déplétées sur les colonnes MACS®. Dans la seconde étape, la fraction pré-enrichie en T CD4+ est marquée avec un anticorps anti-CD25+ biotinylé et des billes anti-biotine pour séparer les cellules T CD4+CD25+ des T CD4+ CD25-. La fraction des cellules T CD4+CD25résultant de la séparation des cellules T CD4+CD25+ est ensuite ajoutée aux cellules non CD4+ pour reconstituer cette population lors d’expériences de stimulation in vitro. Les cellules T CD4+CD25+ obtenues par sélection positive sont éluées des colonnes et mises en culture (106/ml) pendant 24h en présence de phytohémagglutinine (PHA) pour évaluer leur production d’IL-10 comparativement aux cellules T CD4+CD25-. Les anticorps anti-CD25 et anti-CD4 couplés respectivement à la phycoérythrine (anti-CD25PE) et à la fluorescéine isothiocyanate (anti-CD4-FITC) (Becton-Dickinson, UK) ont été utilisés pour contrôler la qualité des séparations mais aussi pour comparer la fréquence des cellules T CD4+CD25+ dans les groupes de placentas parasités ou non parasités. Pour les analyses de contrôle de qualité, les cellules mononuclées du sang de cordon ont été décongelées et colorées pendant 20 mn à 4°C. Elles sont ensuite lavées avec un tampon de PBS-BSA à 2% et analysées par un cytomètre de flux (FACS Calibur, Becton-Dickinson, UK). II.5. Culture des cellules mononuclées du sang de cordon Une sélection de CMSCs congelées du groupe de participants de Sukuta, a été décongelée et lavée avec du RPMI-1640 (Sigma, St Louis, MO, USA). Les cellules ont été remises en suspension dans du RPMI-1640 supplémenté avec 20 µg/ml de gentamycine (Sigma), 2 mM de L-glutamine (Sigma) et 10% de sérum d’anticorps humains (Sigma). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 73 La viabilité des CMSCs était de 85%. Les CMSCs ont été cultivées (2 x 105 cellules dans 200 µl de milieu complet) pendant 3 jours en présence de PHA (PHA-L 2,5µg/ml; Sigma) ou pendant 6 jours en présence d'érythrocytes infectés par P. falciparum (Pf164) ayant une parasitémie de 10% ou en présence de d’extrait de schizontes de 10 µg/ml. Les érythrocytes non infectés ou les extraits provenant de ces derniers ont été utilisées comme témoins négatifs. L’antigène MSP119 (Morgan et al, 1999) a été utilisé à une concentration de 5 µg/ml pour étudier la réponse des lymphocytes T. Tous les essais ont été effectués en triplicata. Les cytokines (IFN-, IL-10 et sCD30 solubles) ont été mesurées dans les surnageants de culture en utilisant la technique ELISA. II.6. Détection des cellules T CD4+ productrices d’IFN-γ par culture ELISPOT (Enzyme Linked Immunoassay Spot) Les PBMCs ont été séparés du sang veineux par centrifugation dans un gradient de densité sur Ficoll (Pharmacia, Oslo, Norvège) à 2200 tr/min pendant 20 min dans une centrifugeuse de paillasse. Les cellules ont été lavées dans du milieu RPMI 1640 (Sigma, Saint Louis, USA), puis remises en suspension dans le même milieu supplémenté avec 2 mM LGlutamine (Life Technologies), 100 UI/ml de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine (Life Technologies) et 10% de sérum humain du groupe sanguin AB+ (Sigma, Saint Louis, USA) inactivé par la chaleur (30 min à 56°C). 2 x 105 PBMCs par puits ont été cultivés à 37 ° C dans un incubateur à CO2 en présence de formes sauvages ou modifiées des peptides MSP119 (25 µg/ml) ou de protéines (10 µg/ml). La PHA à 2,5 µg/ml et 10 µg/ml d’un dérivé protéique purifié de Mycobacterium tuberculosis (PPD RT49, States Serum Institute, Denmark), ont été utilisés comme contrôles positifs. Les surnageants sont collectés 72 heures après le début de la culture et congelés à -20°C pour le dosage des cytokines. Aux jours 3 et 7 sont ajoutés aux cultures 20U/ml d’IL-2 (Proleukine). Au jour 10 de la culture, les cellules sont lavées et transférées dans les plaques ELISPOT (Millipore MAIPS45 PVDF-backed plates). L'activation des PBMCs a été réalisée pendant 24 heures en présence de peptides ou protéines de MSP119; le test ELISPOT a été réalisé en utilisant le kit ELISPOT IFN- (MABTECH, Stockholm, Suède) en suivant les recommandations du fabricant. Brièvement, 4 x 105 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 74 PBMCs/puits sont mis en culture dans les plaques ELISPOT (MAIP 45S; Millipore, Molsheim, France) contenant des anti-IFN- (Mabtech, Nadra, Sweden). Les plaques sont lavées 6 fois avec du PBS-Tween 20 (Sigma, Irvine, CA, USA) à 0,05%. On ajoute dans les plaques le second anticorps biotinylé puis elles sont incubées à température ambiante pendant 2 heures. Les plaques sont lavées 6 fois avec la même solution de lavage puis sont incubées en présence de streptavidine couplée à la phosphatase alcaline. Après un lavage, le substrat de la phosphatase alcaline est ajouté. On incube 5 à 10 min jusqu'à l’apparition des spots. La réaction est arrêtée par lavage à l’eau. Les cellules productrices d’IFN- sont dénombrées par un système informatisé et exprimées en spot-forming units (SFU) par million de PBMC. II.7. Extraction de l'ARN et transcription inverse de Foxp3 L’ARN total a été extrait des fractions des T CD4+CD25+ et T CD4+CD25- en utilisant un kit d’extraction de l’ARN total (Promega Corporation, Madison, WI, USA) en suivant les instructions du fabricant. La synthèse de L’ADN complémentaire est faite par transcription inverse à 37°C pendant 1h30mn, suivie d’incubation à 95°C pendant 5 min pour désactiver la transcriptase inverse. Foxp3 et Glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase (GAPDH) (Contrôle positif) ont été amplifiés par PCR dans un volume réactionnel de 25 µl contenant 1 µl d’ADNc, 0,2 µmol de chaque amorce, 0,5unité de Taq Polymérase (Boehringer, Mannheim, Germany), 0,1 µmol de chaque dNTP et 1X de Tampon Polymérase. Les séquences des amorces pour Foxp3 et GADPH sont les suivantes : GADPH (sens) 5’GCAAATTC CATGGCACCGT-3’ ; GADPH (anti-sens) 5’-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3’ ; Foxp3 (sens) 5’- AGCTGGAGTTCCGCAAGAAAC-3’ et Foxp3 (anti-sens) 5’- TGTTCGTCCATCCTCCTTTCC-3’. II.8. Génotypage de la G6PD et de l’hémoglobine S par PCR en temps réel L'ADN a été extrait à partir de PBMCs en utilisant le kit d'extraction d'ADN Puregene (Flowgen, Ashby de la Zouch, Royaume-Uni) ou la méthode standard salting-out. Le déficit en G6PD et l’'hémoglobine S ont été génotypés en utilisant les sondes Taqman (ABI, Applera Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 75 International Inc, Foster City, CA, USA) suivantes, rs1050828 (G6PD 202G/A), rs1050829 (G6PD 376A/G) et rs334 (HbS), dans un volume réactionnel de 10 µl, en utilisant soit le Rotor-Gene 3000 (Corbett Robotics Pty Ltd, Brisbane, Queensland, Australie ) ou le système PCR en Temps réel 7500 ABI. Les courbes de fluorescence ont été analysés avec la version 6 du logiciel Rotor-Gene et le système de détection de séquence 7500 ABI version 1.1. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 76 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 77 III. Résultats III.1. Article I. L’infection placentaire par Plasmodium falciparum interfère sur l’équilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales à travers les cellules T régulatrices CD4+CD25+FoxP3+ et la production d’IL-10 C. Bisseye*, M. van der Sande*, W. D. Morgan†, A. A. Holder†, M. Pinder* and J. Ismaili* *Medical Research Council Laboratories, Banjul, The Gambia, and †Division of Parasitology, National Institute for Medical Research, Mill Hill, London, U Clinical and Experimental Immunology (2009), 158: 287–293 III.1.1. But de l’étude Des études antérieures ont montré que Plasmodium falciparum induit un biais Th2 dans l’infection palustre au cours de la grossesse. L’infection placentaire affecte aussi l’équilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales. Nous avons étudié le rôle potentiel des cellules T régulatrices dans cet équilibre en comparant les réponses des lymphocytes T des cellules mononuclées du sang de cordon (CMSCs) provenant de placentas de femmes gambiennes parasitées et non parasitées par Plasmodium falciparum. III.1.2. Population La description du groupe de femmes gambiennes utilisées dans la présente étude a déjà été faite par Ismaili et al, (2003). Le tableau I résume les données épidémiologiques de ce groupe de femmes de l’étude. Tableau I : Données épidémiologiques des femmes gambiennes de Sukuta. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 78 III.1.3. Résultats IV.1.3.1 Fréquence des cellules T CD4+CD25+ FoxP3+ parmi les CMSCs Nous avons d'abord comparé les fréquences des T CD4+CD25+FoxP3+ dans les deux groupes de CMSCs provenant de femmes parasitées et non parasitées. Les CMSCs ont été délestées de leurs cellules T CD4+CD25+FoxP3+, puis mises en culture en présence de mitogène, de parasites vivants ou d’antigène de P. falciparum. La fraction des cellules T CD4+CD25+FoxP3+ a été aussi mise en culture en présence de PHA pendant 18 heures. La production élevée d’IL-10 par les T CD4+CD25+ comparativement aux cellules T CD4+CD25suggère fortement que la quasi-totalité des cellules T CD4+CD25+FoxP3+ sont des cellules T régulatrices et non des cellules effectrices (Figure 11). + + Figure 11. (a) Contrôle de qualité de la déplétion des cellules T CD4 CD25 (b) Expression de l’ARNm forkhead box P3 (FoxP3) et (c) Production de l’IL-10 après stimulation par la PHA pendant 18 h. L’expression de l’ARNm FoxP3 et la production d’IL-10 sont significativement plus élevées chez les cellules T CD4+CD25+ (n = 5) comparativement aux cellules T CD4+CD25- (n = 6) (P* = 0,0427). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 79 La fréquence des cellules T CD4+CD25+Foxp3+ était faible et similaire dans les CMSCs des deux groupes (1,2% ± 0,2 comparativement à 1,4% ± 0,3 ; P = 0,11) (Figure 12). Figure 12. Pourcentage des cellules Tregs dans les CMSCs parasités ou non parasités. Une sélection d’échantillons des cellules mononuclées du sang de cordon (CMSC) provenant des groupes parasités (n = 8) et non parasités (n = 8) a été colorée avec des anticorps anti-CD25-PE et anti-CD4-FITC et analysée au cytomètre de flux. Le résultat d’un échantillon sur 8 est montré. III.1.3.2. Effet des cellules T régulatrices sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponse à la stimulation par la PHA Comme dans l’étude de Ismaili et al, (2003), nous montrons que l’infection placentaire par P. falciparum entraîne une diminution significative de la production d’IFN- (p2 = 0,03) par les CMSCs en réponse à la stimulation in vitro par la PHA, alors que la production de sCD30 n’est pas affectée (Figure 13). La production de l’IL-10 par les cultures de CMSC de placentas parasités est plus élevée (p5 = 0,025) que celle de placentas non parasités. Nous montrons de façon très intéressante, que la production d’IL-10 est significativement réduite par la déplétion des Tregs dans les deux groupes (p3 = 0,028; p4 = 0,035). La déplétion des Tregs restaure la production d’IFN- (p1 = 0,02) par les CMSCs du groupe parasité et elle entraîne aussi une légère augmentation de la production de sCD30 par les CMSCs dans les deux groupes (Figure 13). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 80 Figure 13. Production de cytokines par les CMSCs en réponse à la phytohémagglutinine (PHA). Les CMSCs des nouveau-nés dont les placentas des mères étaient parasités à l’accouchement (barres noires, n = 21) ou non parasités (barres grises, n = 34) ont été cultivées pendant 3 jours en présence de PHA et évaluées pour leur capacité à produire les cytokines et le CD30 soluble (sCD30). La production d’IFN- (Th1), d’IL-10 et de + + sCD30 (Th2) est mesurée par ELISA en présence (+) ou en absence (-) de déplétion des cellules T CD4 CD25 . La production d’IFN- par les CMSCs du groupe parasité (P2 = 0,003) est significativement plus faible par rapport au groupe non parasité, tandis que la production de sCD30 est similaire dans les deux groupes. La production d'IL-10 est plus élevée dans le groupe placenta parasité (P5 = 0,025). La déplétion des cellules T régulatrices diminue la production d’IL-10 par les CMSCs des deux groupes (p3 = 0,028; p4 = 0,035) et restaure celle de l’IFN- (p1 = 0,02). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± déviation standard. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 81 III.1.3.3. Effets des Tregs sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponses aux globules rouges intacts parasités et aux antigènes de P. falciparum Les CMSCs ont également été testés pour leur capacité à produire in vitro les cytokines en réponse à leur stimulation par les globules rouges infectés par P. falciparum, les extraits de schizontes Pf164 et la protéine purifiée MSP119 après 6 jours en culture (Figure 14). Nous montrons une baisse de la production d'IFN- (schizontes Pf164 p1 = 0,0485; MSP119 p2 = 0,00497) et une augmentation de celle de l'IL-10 (schizontes Pf164 p12 = 0,048; MSP119 p13 = 0,0478) par les CMSCs en réponse à la stimulation par les extraits de schizontes Pf164, les globules rouges infectés (Live Pf) et l’antigène MSP119 dans le groupe parasité par rapport au groupe non parasité. En outre, la production de sCD30 observée en réponse à la stimulation par les antigènes de P. falciparum (schizontes Pf164 p7 = 0,0245; MSP119 p8 = 0,021) est plus élevée dans le groupe parasité. La déplétion des Tregs affecte la production des cytokines par les CMSCs. Elle restaure la production de l’IFN-, réduit celle de l’IL-10 et augmente la production du sCD30 dans les deux groupes (Figure 14). Dans le cas du sCD30, l’augmentation reste significative en réponse aux antigènes de P. falciparum (schizontes Pf164 p10 = 0,032; MSP119 p11 = 0,041). Les globules rouges infectés par P. falciparum (Live Pf) induisent des concentrations les plus élevées de toutes les cytokines testées par rapport aux antigènes (schizontes Pf164 et MSP119). Une plus faible concentration d’IFN- (p6 = 0,015) et de plus fortes productions d’IL-10 (p15 = 0,038) et de sCD30 (p9 = 0,028) sont observées dans le groupe parasité. En outre, la déplétion des cellules T CD4+CD25+ réduit la production d’IL-10 (p14 = 0,049), elle restaure celle de l'IFN-(p3 = 0,0209) et augmente la production de sCD30 dans les deux groupes conduisant à une production similaire dans ces deux derniers. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 82 Figure 14. Production de cytokines par les CMSCs en réponse aux globules parasités et aux antigènes de P. falciparum. Les CMSCs provenant des groupes de placentas non parasités (-) (n = 21) et parasités (+) (n = 25) ont été évaluées pour la production de cytokines et de sCD30 en réponse à la stimulation par MSP-119, un extrait de schizontes Pf164 et les globules rouges intacts parasités (live Pf). Les CMSCs non stimulées, ou stimulées soit en présence de d’extraits de globules rouges non parasités ou de globules rouges intacts non parasités, ont été utilisées comme contrôles négatifs. Les cytokines ont été mesurées en présence (barres grises) ou en absence + + (barres noires) de cellules T CD4 CD25 . Une faible production d'IFN- (schizontes Pf164 p1 = 0,0485; MSP-119 p2 = 0,0497, Live Pf p6 = 0,015), tout comme une production élevée de sCD30 (Pf164 schizontes p7 = 0,0245; MSP-119 p8 = 0,021 ; live pf p9 = 0,028) et d’IL-10 (Pf164 schizontes p12 = 0,048; MSP-119 p13 = 0,0478; Live Pf p15 = 0,038) ont été obtenues en réponse à l’extrait de schizontes Pf164, à l’antigène MSP-119 et aux parasites vivants. La déplétion des cellules T CD4+CD25+ a réduit la production de l’IL-10 dans les deux groupes et elle est significative en réponse au Live Pf (p14 = 0,0315). La déplétion des T CD4+CD25+ a maintenu une production élevée de sCD30 en réponse aux protéines de P. falciparum dans le groupe parasité (Pf164 schizontes p10 = 0,032; MSP119 p11 = 0,041) et elle a restauré la production d’IFN- en réponse aux parasites vivants (p3 = 0,0209). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± déviation standard. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 83 III.1.3.5. Effet de l'IL-10 sur la production des cytokines Th1/Th2 par les CMSCs Comme le montrent les figures 13 et 14, les CMSCs provenant de placentas parasités produisent des taux plus élevés d'IL-10. La déplétion des CMSCs en cellules T CD4+CD25+ entraîne une baisse de la production de l'IL-10 et la restauration de l'expression de l'IFN-. Afin d'examiner le rôle direct de l'IL-10, nous avons comparé les cultures de CMSCs des deux groupes en présence de globules rouges parasités (Live Pf), soit après déplétion des Tregs ou en présence d’anticorps neutralisants anti-IL-10. Comme le présente la Figure 15, la déplétion des Tregs et le traitement des cultures par les anti-IL-10 restaurent la production d’IFN- par les CMSCs du groupe parasité. En revanche, le traitement des anti-IL-10 n’a aucun impact significatif sur la sécrétion de sCD30 (données non présentées). Figure 15. Le Traitement des cultures cellulaires avec des anticorps anti-IL-10 restaure la production d’IFN- dans le groupe de placentas parasités. Les CMSCs du groupe parasité (figure de haut, barres noires; n = 10) et du groupe non parasité (Figure de bas, barres grises; n = 12) étaient soient délestées en cellules T régulatrices (Tregs-) ou non traitées et mises en culture en présence d'anti-IL-10 ou d’un anticorps isotype de contrôle. La production d’IFN- a été mesurée après stimulation par les globules rouges infectés par Pf164. Une production significative d’IFN- a été observée après la déplétion des Tregs (P1 = 0,014) et le traitement par les anticorps bloquant anti-IL-10 (P2 = 0,021). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± déviation standard. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 84 III.1.4. Conclusion Le déséquilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales dû à l'infection active du placenta par P. falciparum, est une stratégie possible utilisée par le parasite pour échapper à la réponse immunitaire de l’hôte. Elle implique les Tregs à travers leur production d’IL-10, comme le révèlent leur déplétion et l’inhibition de l’IL-10 qui restaurent la production d’IFN-. Nos résultats suggèrent que la réduction de la production de l’IFN- pourrait être incriminée à la fois aux CPA par leur faible production d’IL-12 et aux Tregs à travers l’IL-10, d’où une exacerbation de la polarisation Th2. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 85 III.2. Article II. Un variant de la protéine de 19 kilodaltons de l’extrémité C-terminal du Merozoite Surface Protein 1 de Plasmodium falciparum candidat vaccin induit des taux élevés d’IFN-gamma associés à des réponses immunitaires cellulaires à des séquences peptidiques spécifiques chez les adultes gambiens naturellement exposés au paludisme Cyrille Bisseye*‡, Louis M. Yindom*, Jacques Simporé‡, William D. Morgan†, Anthony A. Holder† and Jamila Ismaili*2# * Medical Research Council Laboratories, PO Box 273, Banjul, The Gambia; †Division of Parasitology, MRC National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, United Kingdom; ‡Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Ouagadougou, Burkina Faso. Clinical and Experimental Immunology (2011), 166 (3):366-73 III.2.1. But de l’étude La protéine de 19 kDa de MSP119 de P. falciparum est un important candidat vaccin du stade sanguin du paludisme. Elle est la cible des réponses immunitaires humorales et cellulaires chez les individus naturellement infectés par P. falciparum. Des variants génétiquement modifiés de cette protéine ont été conçus pour être potentiellement de meilleurs candidats vaccins. Cependant, la réponse immunitaire humaine à ces protéines n'a pas encore été entièrement caractérisée. Nous avons donc étudié d’une part, l'antigénicité d'une protéine triple mutant de MSP119 par rapport à celle de la protéine sauvage, et d’autre part l’antigénicité des peptides mutés par rapport aux peptides non mutés chez les adultes vivant dans une zone endémique en Gambie. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 86 III.2.2. Population Quarante trois (43) adultes gambiens ont été recrutés dans cette étude. L’antigénicité des protéines et peptides de MSP119 a été évaluée par ELISPOT en culture et par ELISA en mesurant respectivement, les cellules T CD4+ sécrétrices d’IFN- et les cytokines Th1 et Th2 produites en réponses à ces derniers. III.2.3. Résultats III.2.3.1. Réponses des adultes gambiens aux protéines MSP119 par ELISPOT en culture La réponse des cellules des adultes gambiens aux protéines MSP119 a été évaluée en premier par ELISPOT en culture, en mesurant le nombre de cellules T CD4+ productrices d’IFN- après stimulation par ces protéines (mutant et sauvage). Nous avons obtenu 27% (11/43) de répondeurs pour la protéine normale contre 30% (13/43) pour la protéine triple mutant, la différence n’était pas significative (654 ± 189 et 721 ± 299 SFU/106 PBMCs respectivement, pour la protéine sauvage et le triple mutant). III.2.3.2. Production des cytokines en réponses aux protéines MSP119 Nous avons ensuite mesuré la production de l’IFN-, de l’IL-13 et du marqueur Th2 CD30 soluble par les PBMCs d’adultes gambiens en réponse aux protéines normale et triple mutant. Les réponses obtenues sont indiquées sur les figures 16 ci- dessous. Une production significativement élevée d’IFN- par les PBMCs a été obtenue en réponse à la protéine triple mutant par rapport à la protéine sauvage (4500 ± 256 et 3186 ± 267, P* = 0,015) (figure 16a). La production d’IL-13 et de CD30 soluble induite en réponse aux deux protéines était identique (Figures 16b et 16c). III.2.3.3. Réponses des adultes gambiens aux peptides MSP119 par ELISPOT en culture Nous avons évalué la fréquence des répondeurs aux peptides normaux ou mutants de MSP119 (Tableau II) chez les adultes gambiens pour déterminer le ou les peptides Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 87 immunodominants. Les fréquences des répondeurs et des cellules T CD4+ sécrétrices d’IFN- en réponse aux peptides sont représentées dans les figures 17a et 17b. Le peptide P16 est le peptide immunodominant car reconnu par la majorité des donneurs (27/43 soit 63%), alors que le peptide P13 n’a été reconnu que par 26% des donneurs. Aucune différence statistiquement significative n’a été observée en comparant le nombre de répondeurs aux peptides sauvages et mutants de MSP119. Tableau II. Séquence des peptides mutants et sauvages de MSP119 Bisseye C et al, 2011, Clinical and Experimental immunology in press Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 88 Figure 16. Production de cytokines par les PBMC en réponse aux protéines MSP119. Les PBMCs de 43 adultes ont été cultivées pendant 3 jours en présence de protéines MSP119. Les cytokines Th1 (IFN-) (a) et Th0/Th2 (IL-13 et sCD30) (b et c) ont été mesurées par ELISA. Les résultats sont présentés comme moyenne ± écart-type. (a) Une production significative de l'IFN- par les PBMCs a été obtenue en réponse à la protéine triple mutant de MSP119 (barre hachurée à droite) par rapport à la protéine normale (barre hachurée à gauche) (4500 ± 256 et 3186 ± 267, p* = 0,015). (b et c) En revanche, les mêmes quantités d'IL-13 et de sCD30 ont été produites par les PBMCs en réponse aux protéines triple mutant et sauvage de MSP119. Comme le montre la figure 17b, le nombre de cellules T sécrétrices d’IFN- est le plus élevé en réponse aux peptides P16 et P21 (531 ± 598 et 400 ± 689 SFU/106 de PBMC) chez les adultes gambiens semi immuns. Il n'y avait aucune différence dans la fréquence des cellules T sécrétrices d’IFN- entre les peptides sauvages et mutants. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 89 Figure 17. (a) Fréquence des donneurs et des cellules sécrétrices d’IFN- en réponse aux peptides de MSP-119 chez 43 adultes gambiens exposés au Plasmodium. Les donneurs dont le nombre de cellules productrices d’IFN- était significativement différent (Loi binomiale, P <0,05) au milieu de culture en réponse aux peptides ont été considérés comme répondeurs. Les résultats sont présentés en pourcentage de répondeurs pour les peptides de MSP-119 de type sauvage (barres vides) ou de type muté (barres hachurées), 27/43 (63%) des adultes ont répondu au peptide immunodominant P16 et seulement 11/43 (26%) ont répondu au peptide P13. Aucune différence dans le nombre de répondeurs n’a été observée en comparant les réponses des peptides mutés et sauvages. (b) Fréquences des cellules T sécrétrices d’IFN- en réponse aux peptides sauvages (barres vides) et mutés 6 (barres hachurées) de MSP-119. Les résultats sont présentés comme moyenne ± SD SFU/10 PBMC. Un nombre plus élevé de cellules sécrétrices d’IFN- a été obtenu en réponse aux peptides P16 et P21 (531 ± 598 et 400 ± 689 SFU/106 PBMC). Aucune différence n'a été trouvée pour la fréquence des cellules T sécrétrices d’IFN- en réponse aux peptides sauvages et mutants. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 90 III.2.3.4. Production de cytokines en réponse aux peptides mutants et sauvages de MSP119 Nous avons également mesuré la sécrétion d'IFN- (Th1), d’IL-13 et de CD30 soluble (Th0/Th2) en réponse aux peptides sauvages et mutants de MSP119 comme indiquée sur les figures 18a à 18c. Aucune différence n’a été observée dans la production d’IFN- entre les peptides sauvages et mutants. La production d’IFN- était significativement plus élevée en réponse au peptide P16 comparativement aux autres peptides (sauf pour les peptides P14, P14M, P15M, P16M, P17M, et P21) (Figure 18a). La production d’IL-13 était plus élevée en réponse aux peptides mutants par rapport aux peptides sauvages (P13M vs P13, P = 0,025; P15M vs P15, P = 0,001; P17M vs P17, P = 0,03) (Figure 18b). La production d’IL-13 a été significativement plus élevée en réponse au peptide P19 comparativement aux autres peptides [P13M (p = 0,033); P14 (p = 0,046); P14M (p = 0,003); P15M (p < 0,001); P16 (p = 0,030); P16M (p = 0,003); P17 (p < 0,0001); P17M (p = 0,019); P18 (p = 0,002) et P21 (p = 0,019)], sauf pour les peptides P13, P15 et P20. La production de sCD30 par les PBMCs d’adultes gambiens était identique en réponse aux peptides mutants et sauvages de MSP119. Elle a été significativement plus élevée en réponse au P19 comparativement à tous les autres peptides (Figure 18c). Les peptides P16 et P19 induisent deux types distincts de réponses cytokiniques. P16 induit une forte sécrétion d’IFN- (Th1) alors P19 provoque une forte production d’IL-13 et de CD30 soluble (Th0/Th2). III.2.3.5.Typage HLA-DR et présentation des peptides MSP119 aux cellules T CD4+ La réponse cellulaire T CD4+ est souvent restreinte par les molécules HLA classe II. Les loci HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DR5 et HLA-DQB1 ont été typés chez 30 adultes gambiens. Le tableau III montre la fréquence des allèles dans la population étudiée. Aucun participant de l’étude n’était porteur d’allèles HLA DRB4 et DRB5. Onze allèles DRB1 ont été trouvés parmi les participants de l'étude: 19 sur 30 (63%), 10 sur 30 (33%) et 7 sur 30 (23%) des donneurs portaient respectivement les allèles DRB1*13, DRB1*11 et DRB1*10. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 91 Figure 18. Production de cytokines par les PBMCs en réponse aux peptides MSP119. Les PBMCs de 43 adultes ont été cultivées pendant 3 jours avec les peptides de MSP-119. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± Ecart-type (moyenne ± écart-type). (a) Des quantités significativement plus élevés d'IFN- ont été produites par les PBMCs en réponse au peptide P16 comparativement aux peptides suivants : [P13 (p* <0,001); P13M (p** = 0,02); P15 (p# = 0,02); P17 (p## = § §§ & 0,008); P18 (p = 0,005); P19 (p = 0,017); P20 (p = 0,045)]. (b) Les peptides mutés de MSP-119 produisent plus d’IL-13 que les peptides sauvages [P13M vs P13 (p* = 0,025); P15M vs P15 (p** = 0,001); P17M vs P17 (p*** = 0,03)]. (c) La production de sCD30 est identique en réponse aux peptides mutés et sauvages. Le peptide P19 induit la sécrétion la plus élevée de sCD30 comparativement à tous les autres peptides. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 92 Tableau III. Allèles HLA-DR Class II détectés dans la population d’étude. Bisseye C et al, 2011, Clinical and Experimental Immunology in press La réponse aux peptides de MSP119 était hétérogène et aucun peptide n’était restreint à un allèle DRB1 particulier. Dans cette population, trois allèles DRB3 ont été trouvés: DRB3*01 (n = 2), DRB3*02 (n = 18) et DRB3*03 (n = 9) comme indiqué dans le tableau III. Les personnes porteurs de l'allèle DRB3*01 sont répondeurs uniquement des formes mutantes des peptides P14 et P15 (P14M et P15M). Les personnes porteuses d'autres allèles DRB3 ont répondu à tous les peptides et aucun peptide n’était restreint à un allèle particulier de DRB3. Tous les 5 allèles spécifiques du groupe DQB1 étaient présents dans la population étudiée (Tableau III). Un seul participant (D39) était homozygote pour DQB1*03, mais tous les autres étaient hétérozygotes. Les personnes porteuses de l’allèle DQB1*02 n'ont pas répondu aux peptides P13, P14 et surtout P21 situé dans le second domaine EGF (Epidermal Growth factor). Aucun peptide de MSP119 n’était restreint aux allèles particuliers de DQB1*05 et de DQB1*06. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 93 III.2.4. Conclusion Nous avons montré que les adultes gambiens naturellement exposés au Plasmodium présentent de fortes réponses cytokiniques Th1 et Th2 en réponses aux formes sauvages et mutantes des protéines et peptides MSP119. Aucune différence n’a été trouvée dans notre étude, en termes de nombre de répondeurs pour la production d’IFN-. Cependant, la protéine triple mutant de MSP119 a induit une réponse cytokinique Th1 (IFN-) plus élevée que la protéine sauvage. En outre, nous avons identifié le peptide P16 comme étant immunodominant parce que reconnu par 63% des participants de l'étude. Aucun peptide MSP119 n’était restreint par les allèles DRB1, DRB3 et DQB1 particuliers. Fait intéressant, les peptides P16 et P19 de MSP119 sont responsables de réponses différentes; P16 induit une plus forte réponse Th1 (IFN-) et P19 stimule des taux élevés d'IL-13 et sCD30. Nos résultats pourraient être utiles dans le développement de futurs vaccins et dans les études d’immunomodulation Th1/Th2, en utilisant soit les formes sauvages ou mutantes des protéines ou en association avec leurs peptides. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 94 III.3. Article III. Comparaison des réponses humorales dirigées contre CSP, AMA1 et MSP119 et la susceptibilité au paludisme chez les Peuls, Wolofs et Mandingues de Gambie Jamila Ismaili1*†, Cyrille Bisseye1,4‡, Dongmei liu2, Hanif Ismael1, Musa Jawara1, Mathurin Diatta1, Giorgio Sirugo1, Margaret Pinder1, Sam dunyo1, William D. Morgan3, Michael J. Blackman3, Anthony A. Holder3, Jacques Simporé4 and Paul Milligan1,2. Medical Research Council Laboratories, PO Box 273, Banjul, The Gambia1; Department of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Keppel Street, London, WC1E 7HT, United Kingdom2; Division of Parasitology, MRC National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, United Kingdom3; and Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Ouagadougou, Burkina Faso4 Article soumis pour publication III.3.1. But de l’étude Les Peuls du Burkina Faso sont plus résistants au paludisme que les groupes ethniques sympatriques Mossi et Rimaibé. Cette résistance a été associée à une réponse humorale immunitaire plus élevée dirigée contre les antigènes de P. falciparum. Peu d’études sur la résistance au paludisme par les Peuls ont été faites ailleurs en Afrique de l’Ouest. Par conséquent, nous avons mené cette étude en Gambie sur un grand groupe de participants appartenant aux groupes ethniques Peul, Wolof et Mandingue afin d’étudier la réponse humorale interethnique, la prévalence parasitaire et la résistance au paludisme. Nous avons étudié les réponses humorales aux protéines CSP, AMA1 et MSP119. Toutes ces protéines sont des candidats vaccins contre le paludisme à P. falciparum en cours de développement. Notre étude avait pour but de tester l’hypothèse de la résistance des Peuls de Gambie au paludisme comparativement aux groupes ethniques sympatriques Wolof et Mandingue. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 95 III.3.2. Population L’étude a été réalisée dans un groupe stratifiée de 658 enfants et adultes âgés de 6 mois à 45 ans recrutés parmi les trois groupes ethniques Peul, Wolof et Mandingue. Les participants ont bénéficié d’un suivi clinique actif de 23 semaines à partir de la date de leur inclusion dans l’étude. III.3.3. Résultats III.3.3.1. Caractéristiques des participants de l’étude Les caractéristiques démographiques des participants de l’étude sont résumées dans le tableau II. La cohorte a été constituée pour être représentative des trois principaux groupes ethniques dans chaque tranche d’âge. Les Wolofs, les Peuls et les Mandingues représentaient respectivement 31,26%, 36,39% et 32,35% des participants à l’étude. Ils ont été classés en trois catégories d’âge < 5ans, 6-15 ans et > 15 ans avec respectivement 20.88%, 42.39% et 36.73% des sujets. Parmi les participants de l’étude, près de 60% étaient de sexe féminin, 25% utilisaient une moustiquaire et 1% une moustiquaire imprégnée d’insecticide. Le taux d'inoculation entomologique (EIR) était supérieur à 50 dans 18% des sites de résidence. En ce qui concerne les facteurs génétiques de l’hôte affectant la protection contre le paludisme, 1/5 des sujets étaient hétérozygotes HbAS et environ 1% étaient homozygotes HbSS. La déficience en G6PD affectait respectivement environ 4% et 1% des hommes hémizygotes et des femmes hétérozygotes. L'immunité acquise à P. falciparum a été évaluée lors de l’enrôlement dans l’étude. Les anticorps dirigés contre les antigènes CSP, MSP119 et AMA1 ont été retrouvés respectivement chez 76,75%, 64,29% et 50% des participants à l’étude (Tableau IV). III.3.3.2. Comparaisons interethniques de l'incidence du paludisme Nous avons étudié les différences interethniques de l'incidence du paludisme chez les trois principaux groupes ethniques de la Gambie, Peul (n = 234), mandingue (n = 208) et wolof (n = 201). Le taux d'incidence du paludisme était similaire dans les trois groupes ethniques. Cependant, les EIRs enregistrés dans les villages et les génotypes G6PD et Hb ont été associés à un risque accru de paludisme et à l'ethnicité. En effet, les Peuls vivaient plus souvent dans les villages où l’EIR était faible. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 96 Tableau IV. Caractéristiques des participants de l’étude et de la réponse humorale aux antigènes de P. falciparum CSP, AMA1 et MSP119 à l’inclusion N = 658 Groupe ethnique Age n % Wolof 201/643 31,26 Peul 234/643 36,39 Mandingue 208/643 32,35 <5 ans 133/637 20,88 5-15 ans 270/637 42,39 >15 ans 234/637 36,73 Négatif 146/628 23,25 Positif 482/628 76,75 Négatif 315/630 50,00 Positif 315/630 50,00 Négatif 225/630 35,71 Positif 405/630 64,29 Homme 280/654 42,81 Femme 374/654 57,19 Non 494/658 75,08 Oui 164/658 24,92 Non 651/658 98,94 Oui 7/658 1,06 0 90/606 14,85 ≤50 409/606 67,49 >50 107/606 17,66 Normal 533/656 94,34 A-hétérozygote 25/656 4,42 A- 7/656 1,24 AA 467/592 78,89 AS 118/592 19,93 SS 7/592 1,18 Ac anti-CSP Ac anti-AMA1 Ac anti-MSP119 Sexe Moustiquaire Moustiquaire imprégnée EIR G6PD Type Hb Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 97 Après ajustement pour les effets des covariables, l’ethnicité Peule a été associée à un risque légèrement accru de paludisme par rapport aux deux autres groupes ethniques. Des estimations corrigées de l'incidence du paludisme, en association avec les caractéristiques de base décrites dans le tableau V et en particulier la présence de la parasitémie lors de l'enrôlement abolissent les différences interethniques de susceptibilité au paludisme clinique et aucune différence significative de l'incidence du paludisme a été trouvée entre les trois groupes ethniques [estimations brutes (4.226; ST dev: 0,325; Pr (> | z |): 0.000) et les estimations ajustées pour tous les facteurs confondants (3,972; ST dev: 0,344; Pr (> | z |): 0)]. III.3.3.3. Comparaisons interethniques dans la réponse humorale à CSP, AMA1 et MSP119 La réponse humorale anti-CSP, MSP119 et AMA1 (IgG, IgG1 et IgG3), augmente avec l'âge. Aucune association significative n'a été trouvée d’une part, entre la réponse humorale et l'utilisation de moustiquaires et d’autre part, entre la réponse humorale et l'EIR, ni en utilisant la régression logistique, ou la régression log-linéaire (non représentée). La proportion de patients ayant répondu à AMA1 était similaire dans les 3 groupes ethniques. Elle était cependant plus faible chez les Mandingues pour CSP et MSP119 comparativement aux 2 autres groupes ethniques (Tableau VI). Les concentrations en IgG totales et sous-classes (IgG1 et IgG3) anti-CSP, AMA1 et MSP119 ont été comparées chez les participants des différents groupes ethniques. Les concentrations en IgG et IgG1 anti-MSP119 étaient plus élevées chez les Peuls (figure 19) tandis que les IgG, IgG1 et IgG3 anti- AMA1 étaient similaires dans les 3 groupes ethniques. Comme le montre la figure 19, la concentration en IgG anti-CSP était plus faible chez les Mandingues comparativement aux Peuls et Wolofs, qui avaient des concentrations anticorpales similaires. Les participants des 3 groupes ethniques avaient les mêmes concentrations en IgG1 et IgG3 anti-CSP. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 98 Tableau V. Caractéristiques des participants du groupe à l’enrôlement et incidence du paludisme en association avec les taux d’IgG anti-AMA1, anti-MSP119 et anti-CSP ajustés pour les facteurs confondants. Groupe d’âge Groupe ethnique EIR Caractéristiques N Personne mois/100 Cas de Paludisme Taux/100 personnes mois Taux brut ratio (95%IC) Taux ajusté ratio (95%IC) <5 ans 133 7,16 94 13,14 1 1 5-15 ans 270 14,56 115 7,90 0,60 (0,46-0,79) 0,73 (0,52-1,02) 0,065 >15 ans 234 12,50 25 2,00 0,15 (0,10-0,24) 0,23 (0,14-0,40) 0,001 Peul 225 7,03 87 12,37 1 1 Mandingue 201 6,90 73 10,58 0,98 (0,72-1,34) 0,56 (0,36-0,87) 0,009 Wolof 200 6,46 69 10,68 0,92 (0,67-1,26) 0,68 (0,45-1,01) 0,059 Bas 90 5,17 20 3,87 1 1 Moyen 409 21,87 154 7,04 1,82 (1,14-2,90) 2,15 (1,23-3,78) 0,008 Haut 138 7,18 60 8,35 2,16 (1,30-3,58) 2,54 (1,29-4,97) 0,007 Non 473 25,36 164 6,47 1 1 Oui 164 8,87 70 7,89 1,22 (0,92-1,61) 1,14 (0,82-1,59) AS 465 6,33 26 4,11 1 1 AA 117 25,02 184 7,36 1,79 (1,19-2,70) 1,62 (1,05-2,51) 0,030 SS 7 0,38 5 13,15 3,20 (1,23-8,33) 2,47 (0,91-6,69) 0,076 Non 570 30,53 211 6,91 1 1 Oui 32 1,71 6 3,51 0,51 (0,23-1,14) 0,47 (0,21-1,09) P Moustiquaire Génotype Hb Déficience en G6PD Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE 0,435 0,079 Page 99 RL IgG antiAMA1 IgG antiMSP119 0 276 14,85 139 9,36 1 1 >0 <260 87 4,69 35 7,46 0,80 (0,55-1,15) 1,20 (0,78-1,85) 0,399 260-729 88 4,73 18 3,80 0,41 (0,25-0,66) 0,67 (0,39-1,15) 0,143 X2=12,19 P=0,0160 730-1100 87 4,65 24 5,16 0,55 (0,36-0,85) 0,98 (0,58-1,65) 0,942 >1100 88 4,72 9 1,91 0,20 (0,10-0,40) 0,37 (0,17-0,79) 0,010 0 205 10,96 104 9,49 1 1 >0 <60 105 5,58 55 9,85 1,04 (0,75-1,44) 1,23 (0,82-1,85) 0,312 61-220 106 5,70 38 6,67 0,70 (0,48-1,02) 0,96 (0,63-1,46) 0,850 221-840 105 5,64 18 3,19 0,34 (0,20-0,55) 0,43 (0,23-0,81) 0,008 >840 106 5,82 11 1,89 0,20 (0,11-0,37) 0,52 (0,26-1,03) 0,062 0 153 8,19 67 8,18 1 1 >0 <200 117 7,31 46 6,29 0,89 (0,61-1,30) 1,12 (0,74-1,70) 0,592 210-600 118 4,85 31 6,40 0,59 (0,39-0,91) 0,78 (0,49-1,25) 0,306 X2=15,15 P=0,0044 X2=4,75 IgG anti-CSP P=0,314 601-1050 118 7,45 47 6,31 0,91 (0,63-1,32) 1,15 (0,75-1,76) 0,513 >1050 118 5,51 35 6,35 0,67 (0,45-1,01) 0,79 (0,49-1,27) 0,337 TOTAL 640 34,22 234 6,84 RL: Regression logistique ; IC: Intervalle de confiance ; X2: Khi-carré ; N: nombre d’individus testés. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 100 Tableau VI. Réponses immunitaires humorales à P. falciparum à l'enrôlement dans les 3 groupes ethniques Ac anti-CSP† Ac anti-MSP119‡ Ac anti-AMA-1§ (N=658) * Groupe ethnique n % pvalue n % pvalue n % pvalue Wolof 162/197 82,23 <0,001 173/197 87,82 <0.001 92/196 46,94 0,566 Peul 188/223 84,30 155/223 69,51 115/224 51,34 Mandingue 123/197 62,44 72/199 36,18 103/199 51,76 † ‡ * Nombre total des participants de l’étude ; CSP: Protéine Circumsporozoite ; MSP119 : Merozoite Surface Protein 1 ; § AMA1: Apical Membrane Antigen 1 III.3.3.4. Association anticorps et incidence du paludisme et de la parasitémie Comme l’indique les courbes de survie de Kaplan-Meier (figure 20), les taux élevés d’anticorps sont associés à un temps prolongé avant la première attaque clinique du paludisme. Des concentrations élevées d'anticorps anti-CSP, AMA1 et MSP119 sont protectrices contre l'infection palustre. L'analyse brute a également montré une association significative entre les Ac dirigés contre les antigènes CSP (IgG1 et IgG3), AMA1 (IgG) et MSP119 (IgG, IgG1 et IgG3) et la protection contre le paludisme (non représentée). Comme le montre le tableau V, après ajustement pour l'âge, les variables d'exposition, les génotypes Hb et G6PD (hormis la parasitémie au moment de l’enrôlement) pour les 3 antigènes (IgG anti-AMA1, MSP119 et CSP), il y avait seulement une association significative entre l'incidence du paludisme et la concentration en anticorps anti-MSP119 et AMA1. Considérant les sous-classes d’IgG (Tableau VII), les concentrations en IgG1 anti-AMA1 et anti-CSP étaient associées à l’incidence du paludisme. Aucune association entre IgG1 antiMSP119 et IgG3 dirigés contre les 3 antigènes et l’incidence du paludisme n’a été observée. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 101 700 F u la M a n d in k a W o lo f CSP Antibody titers 600 500 400 300 200 100 0 AMA-1 Antibody titers 1000 800 600 400 200 0 MSP1-19 Antibody titers 800 600 400 200 0 T o ta l Ig G Ig G 1 Ig G 3 Figure 19. Concentration en IgG, IgG1 et IgG3 anti-CSP, anti-AMA1 et anti-MSP119 chez les Peuls, Wolofs et Mandingues. Après ajustement de l’effet des IgG sur les 3 antigènes, l'ethnicité était indépendamment associée à l'incidence du paludisme. Les sujets des groupes ethniques Mandingue et Wolof avaient une incidence palustre réduite par rapport aux Peuls. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 102 Tableau VII. Incidence du paludisme en association avec les taux des sous-classes d’IgG anti-AMA1, CSP et MSP119 ajustés pour tous les facteurs confondants Sous-classe Ac IgG1 antiAMA1 IgG3 antiAMA1 IgG1 Anti-MSP119 IgG3 AntiMSP119 IgG1 Anti-CSP IgG3 Anti-CSP concentration Ac (µg/ml) Ratio brut (95%IC) Ajusté pour les facteurs confondants 0-368 1 1 369-905 0,78 (0,48-1,26) 0,79 (0,45-1,37) >905 0,48 (0,28-0,85) 0,39 (0,19-0,81) 0-11 1 1 12-65 0,59 (0,35-0,97) 1,15 (0,64-2,07) >65 0,46 (0,27-0,79) 0,85 (0,43-1,71) 0-28 1 1 29-173 0,66 (0,42-1,04) 0,97 (0,58-1,65) >173 0,25 (0,13-0,47) 0,57 (0,27-1,20) 0-6 1 1 7-27 0,43 (0,26-0,71) 0,59 (0,34-1,05) >27 0,35 (0,20-0,60) 0,73 (0,37-1,41) <2 1 1 2-93 0,51 (0,34-0,77) 0,68 (0,41-1,13) >93 0,22 (0,12-0,39) 0,39 (0,20-0,76) <2 1 1 2-99 0,45 (0,29-0,70) 0,79 (0,47-1,34) >99 0,59 (0,40-0,88) 1,10 (0,68-1,79) RL X2=6,91 (2), P=0,0316 N=299 X2=0,77 (2), P=0,6792 N=299 X2=2,75 (2), P=0,2534 N=320 X2=3,43 (2), P=0,1799 N=320 X2=9,2 (2), P=0,0101 N=401 X2=1,41 (2), P=0,4932 N=401 En incluant la parasitémie au moment de l’enrôlement comme un facteur confondant dans les analyses, toutes les associations observées ont été abolies (données non présentées). Nous avons regardé les effets cumulatifs des différents anticorps sur la protection contre le paludisme. Aucune interaction significative entre la protection liée à CSP et les antigènes du stade sanguin AMA1 et MSP119 n’a été observée, que ce soit en présence ou en absence de parasitémie. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 103 Figure 20. Courbe de survie de Kaplan-Meier représentant les réponses humorales et l’incidence du paludisme dans les 3 groupes ethniques Peul (trait noir), Mandingue (trait rouge) et Wolof (trait vert). Les données des parasitémies issues des 3 enquêtes transversales (données non montrées), Juillet 2003, Octobre-Novembre 2003 et Décembre 2003, ont montré la tendance d’une parasitémie à P. falciparum plus élevée chez les Wolofs par rapport aux autres groupes ethniques. Cependant, les faibles prévalences et les fluctuations des densités parasitaires n’ont montré aucune différence interethnique cohérente. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 104 III.3.4. Conclusion Nous rapportons ici la première étude sur les différences interethniques sur l’incidence du paludisme et les réponses humorales chez lez Peuls, les Wolofs et les Mandingues de Gambie. Nous avons prouvé que la réponse humorale dirigée contre les antigènes de P. falciparum est plus élevée chez les Peuls de Gambie comparativement aux Wolofs et aux Mandingues; cependant l’incidence du paludisme et la prévalence et la densité parasitaires étaient les mêmes dans les trois (3) groupes ethniques. Contrairement aux études antérieures, l’inclusion de la parasitémie comme facteur confondant a aboli l’association entre la réponse humorale aux antigènes AMA1, CSP et MSP119 et la protection contre le paludisme clinique. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 105 IV. Discussion générale La présente thèse avait trois principaux objectifs spécifiques à savoir : L’étude du rôle des cellules T régulatrices dans le biais Th1/Th2 des cellules T néonatales L’évaluation de l’antigénicité des peptides et des protéines du candidat vaccin MSP119. La comparaison des réponses humorales dirigées contre les antigènes candidats vaccins MSP119, AMA1 et CSP chez des sujets appartenant aux principaux groupes ethniques de Gambie : Peul, Wolof et Mandinka. Cette thèse a permis de préciser un rôle possible joué par les Tregs dans le biais Th1/Th2 des cellules T néonatales dans l’infection placentaire par P. falciparum. Rôle des cellules T régulatrices dans le biais Th1/Th2 des cellules T néonatales De nombreuses études avaient déjà montré que l’infection placentaire par P. falciparum affecte les réponses immunitaires du nouveau-né en agissant sur la différentiation Th1 et Th2 des lymphocytes T néonatales (Ismaili et al, 2003; Malhotra et al, 2008). Dans la présente thèse, les échantillons des femmes gambiennes primipares et multipares utilisés provenaient d’une étude ayant montré que l’infection active du placenta par P. falciparum entraînait une diminution de la production d’IFN- et d’IL-12 par les cellules T néonatales (Ismaili et al, 2003). L’étude d’Ismaili et coll., ainsi que celles montrant l’altération de la fonction de l’IL-12 chez les nouveau-nés (Goriely et al, 2001) et l'effet inhibiteur de P. falciparum sur la maturation des cellules dendritiques (CD) (Urban et al, 1999), pourraient attribuer la réduction de la production de l’IFN- à une inhibition des cellules présentatrices d'antigène (CPA) dans les cultures des sujets parasités. Des études précédentes ont montré que les Tregs pouvaient être impliquées dans le maintien de l’infection palustre à travers la production élevée d’IL-10 et de TGF-β (Walter et Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 106 al, 2005, 2006). Ces cytokines connues pour être communes aux Tregs et aux CPA, sont des molécules immunomodulatrices et pourraient être impliquées dans l’inhibition de la production de cytokines Th1 par les CMSCs dans le groupe de placenta parasité. Nous avons donc évalué le rôle possible des Tregs dans le déséquilibre Th1/Th2 observé. En Utilisation le même groupe de femmes qu’Ismaili et coll. (2003), nous avons comparé les fréquences des cellules T CD4+CD25+Foxp3+ et les cultures de CMSCs d’échantillons sélectionnés avant et après déplétion des cellules T CD4+CD25+FoxP3low en présence de PHA, d'extraits de schizontes Pf164, MSP119, parasites vivants et nous avons testé leur capacité à sécréter l'IFN-, le sCD30 et l'IL-10. Nos résultats confirment les observations précédentes d’Ismaili et al (2003) que l’infection active du placenta par P. falciparum exacerbe le biais Th2 des lymphocytes T néonatales, comme le témoigne la baisse de sécrétion d’IFN- en réponse à tous les antigènes, et l’augmentation de la production de sCD30 en réponse aux antigènes protéiques et au parasite vivant par les cellules du groupe parasité. Nous avons trouvé une production d'IL-10 plus élevée en réponse à tous les antigènes ainsi que l'augmentation de l'IL-10 par la population de cellules T CD4+CD25+ en réponse à la PHA, ce qui confirme leur phénotype de cellules T régulatrices. La production de l’IL-10 pouvant être assurée aussi bien par les CPA que par les Tregs CD4+CD25+Foxp3+ (Walther et al, 2005; Hisaeda et al, 2004), le rôle de chaque population de cellules a été établi en délestant les CMSCs en cellules T CD4+CD25+ et leur production en cytokines Th1/Th2 réévaluée in vitro. Nous avons montré que la déplétion des Tregs conduit à la baisse de la production de l'IL-10 et à la restauration de la production d'IFN- en réponse à tous les stimuli testés. La production des cytokines a été aussi évaluée en stimulant les cellules T néonales par le parasite vivant (éthrocytes infectés) et par les antigènes plasmodiaux (extrait de schizonte et antigène MSP119). Nous avons observé une production plus élevée de cytokines induites par les parasites vivants comparativement à celle provoquée par les antigènes protéiques ainsi que d’une différentiation Th2 antigène-dépendant suggérant un mécanisme complexe des CPA avec tous ces différents stimuli. Dans la présente thèse, contrairement à l’étude de Brustoski et coll. (2006), nous avons montré que la fréquence des Tregs est la même dans les CMSCs des placentas parasités et Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 107 non parasités, et que la déplétion de cette population influe sur les cytokines Th1/Th2 in vitro. Cette différence entre les fréquences des Tregs pourrait être attribuée à des différences au niveau des taux de parasitémie placentaire, du type d’infection placentaire, active et/ou chronique entre les deux groupes de femmes (Brustoski et al, 2006) et que les effets post-déplétions observés dans notre groupe de femmes pourraient être le fait d’un état différent d’activation des cellules T CD4+CD25+, d’un effet synergique avec les CPA ou d’une interaction avec d’autres populations de lymphocytes T. Dans un modèle murin d’infection, il a été montré que les Tregs maternelles traversent le placenta (Mold et al, 2008). Cependant, nos expériences de déplétion des Tregs n’ont pas eu d’incidence sur les réactions allo leucocytaires mixtes (allo-MLR) dirigés contre les lymphocytes T des mères tel que rapporté par Mold et coll., suggérant que les antigènes de P. falciparum et les cytokines inflammatoires placentaires amorcent principalement les Tregs des CMSCs. Nous avons ensuite évalué le rôle de l'IL-10 sur la sécrétion des cytokines ou des marqueurs Th1 et Th2, en privilégiant les parasites vivants par rapport aux antigènes protéiques, car ils ont induit des taux plus élevés de cytokines et une différence de production significative en présence ou en absence des Tregs. Le blocage de l'IL-10 par un anticorps monoclonal anti-IL-10 produit le même effet que la déplétion des Tregs, notamment, la restauration de la production d’IFN-. Ce résultat suggère que les cellules T CD4+CD25+Foxp3+ du groupe parasité, pourrait par leur forte production d’IL-10 avoir réduit la production d’IL-12 (Peng et al, 2006) par les CPA qui, à son tour, diminue la production de l’IFN- et augmente celle du sCD30 par les cellules T. Dans la présente thèse, le rôle de la réponse immune cellulaire dans l’infection palustre par P. falciparum a été aussi évalué en étudiant la réponse cellulaire anti-MSP119 (peptides et protéines) chez les adultes gambiens naturellement exposés au paludisme. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 108 Immunité cellulaire induite contre les peptides et protéines du candidat vaccin MSP119 chez les adultes gambiens Nous avons évalué l’antigenicité de la protéine MSP119 triple mutant qui est un candidat vaccin synthétisé pour améliorer l’efficacité et la spécificité de la réponse immunitaire humorale induite chez l’hôte. Toutefois, sa capacité à induire une réponse cellulaire T CD4+ par rapport à la protéine de type sauvage était inconnue. En effet, Il est possible que la substitution d'acides aminés dans une protéine affecte l’apprêtement et la présentation des peptides par les CPA, elle peut aussi créer ou détruire des épitopes de lymphocytes T; ces épitopes reconnus par des individus naturellement exposés au parasite sont particulièrement intéressants. Les Modifications de MSP119 qui améliorent à la fois la qualité des réponses cellulaire et humorale de la protéine pourraient être bénéfiques. Nous avons donc étudié les réponses immunitaires cellulaires dirigées contre la protéine MSP119 triple mutant comparée à la protéine de type sauvage et identifié les peptides immunodominants chez les individus naturellement exposés au paludisme à P. falciparum. Comme il a été rapporté que l'IFN- est la cytokine dominante induite en réponse à l'antigène MSP119 aussi bien chez les adultes naturellement exposés au Plasmodium que chez les volontaires vaccinés (Lee et al, 2002); nous avons testé en premier par la méthode ELISPOT, la production d’IFN- par les PBMCs d’adultes gambiens en réponse à la stimulation par les formes sauvage et triple mutant de la protéine MSP119. Nous avons constaté qu'environ un tiers d’adultes gambiens avait répondu aux deux types de protéines. Nos résultats sont similaires à ceux obtenus dans deux études antérieures réalisées en Gambie et au Kenya où la prolifération des cellules T en réponse à des peptides chevauchants de MSP119 avait été mesurée (Egan et al, 1997; Udhayakumar et al, 1995). Un nombre égal de cellules T sécrétrices d'IFN- a aussi été obtenu en réponse aux deux types de protéines MSP119 chez les adultes naturellement exposés au Plasmodium. Nous avons également évalué la production d'IFN- par les PBMCs d’adultes Gambiens par ELISPOT en réponse aux peptides sauvages ou mutants chevauchants de MSP119. Nos Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 109 résultats ont permis de mettre en évidence que le nombre de répondeurs aux peptites (mutants et sauvages) variait de 26% (pour le peptide P13) à 63% (pour le peptide P16). La séquence de MSP119 de P. falciparum est très largement conservée, avec une diversité portant seulement sur quatre acides aminés sur les 96 (Miller et al, 1993) qui précèdent l’ancrage GPI C-terminal (Gerold et al, 1996). Dans le premier domaine EGF, le résidu 14 est soit une Gln ou une Glu et dans le second domaine EGF, les résidus 61, 70 et 71 sont soient des Lys, Asn, Gly ou des Thr, Ser, Arg, respectivement. À partir du variant Q-KNG un panel de protéines modifiées a été conçu dans le but d'améliorer l'immunogénicité de MSP119. Le premier aspect du changement d’un ou plusieurs résidus d’acides aminés de la protéine a été d’examiner les conséquences sur la liaison d’anticorps inhibiteurs ou bloquants. Le deuxième aspect envisageable est l’amélioration de l’apprêtement et de la présentation des peptides en supprimant un ou plusieurs ponts disulfure ou en introduisant des sites de clivage de la protéase. Cependant de telles modifications peuvent modifier ou supprimer les épitopes des lymphocytes T. Dans la présente thèse le deuxième aspect concernant l’amélioration de l’apprêtement et de la présentation des protéines et peptides ont été évaluées. Nous montrons qu’aucune différence significative n’a été trouvée dans les réponses aux protéines sauvage ou triple mutant et aux peptides sauvage ou mutant de MSP119. Le nombre de cellules T sécrétrices d'IFN- était également similaire après stimulation soit par les protéines ou les peptides de type sauvage ou mutant de MSP119. Nous avons démontré ainsi, que les épitopes antigéniques linéaires de MSP119 des peptides et des protéines n'ont pas été modifiés par les substitutions d’acides aminés choisis. Dans une précédente étude, une plus forte prolifération des lymphocytes T a été induite en réponse aux protéines modifiées de MSP119 comparativement à la protéine sauvage chez les individus naturellement exposés au Plasmodium (Okafor et al, 2009). Ce résultat diffère du nôtre et pourrait s'expliquer par quelques différences entre les deux études : notamment par le type de sujets inclus (asymptomatique contre symptomatique), la nature des protéines MSP119 choisies et le type d’essai utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire T. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 110 Nous avons également mesuré la production des cytokines de type Th1 (IFN-) et Th0/Th2 (IL-13 et sCD30) par les lymphocytes T stimulées par les formes sauvages et modifiées des protéines et peptides de MSP119. Différents profiles de réponses cytokiniques ont été observés en utilisant les protéines et les peptides. Une plus forte production d'IFN- a été obtenue avec la protéine triple mutant comparativement au type sauvage de MSP119. Une production plus élevée d'IFN- pourrait augmenter la résistance à la réinfection par Plasmodium (Luty et al, 1999). En revanche, les protéines de type sauvage et triple mutant ont montré les mêmes tendances pour la production d’IL-13 et de sCD30. En ce qui concerne les réponses aux stimulations par les peptides de MSP119, aucune différence n'a été observée pour la production d’IFN- et de sCD30 par les peptides mutants par rapport aux peptides de type sauvage. Cependant, il a été intéressant de constater que les individus naturellement exposés au Plasmodium produisaient plus d'IL-13 en réponse aux peptides mutants par rapport aux peptides de type sauvage. Les peptides mutants suscitant une réponse de type Th0 à travers l'IL-13 pourrait activer plus efficacement la production d'anticorps (Hirunpetcharat et al, 1999). Nos résultats ont montré également que deux peptides conservés de MSP119 (P16 et P19) induisaient différents modèles de réponses cytokiniques. Le peptide conservé P16 et sa forme modifiée P16M ont stimulé la plus forte production d'IFN- parmi les peptides de MSP119, tandis que la plus grande induction d’IL-13 a été obtenue en réponse au peptide P19. Ces différences pourraient être utiles pour les expérimentations immunologiques dans l’optique de la vaccination. Il est possible que la substitution d'acides aminés modifie la cinétique de l’apprêtement et de la présentation des peptides MSP119 associés aux molécules HLA de classe II par les CPA. Les molécules HLA de classe II sont importantes dans la protection ou la sensibilité à l'infection palustre (Beck et al, 1995; May et al, 2001; OsafoAddo et al, 2008). Les molécules HLA de classe II peuvent affecter le taux d’anticorps dirigé Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 111 contre le Plasmodium. Dans une précédente étude, il a été montré que les personnes porteuses d’allèles HLA DRB1*1201 avaient des taux plus élevés d’anticorps dirigés contre un variant recombinant d’AMA1 que les individus porteurs des autres types d’allèles HLA (John et al, 2004). Nous avons étudié la prévalence des locus HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLADR4, HLA-DR5 et HLA-DQB1 dans notre population d'étude. Aucun des sujets inclus dans notre étude n’était porteur des allèles HLA-DR4 et HLA-DR5. L’allèle DRB1*13 était le plus représenté avec 63% des individus porteurs de ce dernier. L’allèle HLA-DRB1*04 associé à l'anémie palustre (Osafo-Addo et al, 2008) a été retrouvé chez 13% d’individus. Les réponses des individus aux peptides MSP119 n’étaient pas restreintes par les allèles HLA DRB1, DRB3 et DQB1 particuliers. L’infection par P. falciparum induit une forte réponse humorale. Différents antigènes du parasite sont des candidats vaccins à diffirents stades d’essais cliniques. Nous avons évalué Les réponses humorales de trois antigènes candidats vaccins (AMA1, CSP et MSP119) dans les principaux groupes ethniques de Gambie : Peul, Wolof et Mandingue. Comparaison interethnique des réponses immunitaires humorales dirigées contre les antigènes candidats vaccins AMA1, CSP et MSP119 dans les principaux ethniques de Gambie Le but de cette étude étude était de tester l’hypothèse de la différence interethnique des réponses humorales dirigées contre les antigènes de P. falciparum candidats vaccins (AMA1, CSP et MSP119) chez les Peuls de Gambie et les groupes ethniques Wolof et Mandingue. En effet, une précédente étude avait montré que les Peuls du Burkina Faso avaient de plus fortes réponses humorales contre le Plasmodium tout en étant moins fréquemment parasitées et moins sensibles au paludisme clinique (Modiano et al, 1996) par rapport aux groupes ethniques sympatriques Mossi et Rimaibé. Les différentes études immunologiques menées sur différents sites, ont donné des résultats contradictoires sur l'association entre les réponses humorales anti-AMA1, anti-CSP et antiMSP119 et l’immunité clinique (Egan et al, 1996; Polley et al, 2004; Dodoo et al, 1999). Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 112 La présente thèse a donc réevalué l'association des réponses anticorpales contre les antigènes AMA1, CSP et MSP119 et l’immunité clinique en intégrant les facteurs génétiques et la parasitémie comme facteurs confondants dans les différentes analyses. Nous avons montré que l’incidence du paludisme était plus élevée chez les Peuls de Gambie comparativement aux groupes ethniques Mandingue et Wolof. Toutefois, après ajustement par tous les facteurs confondants, aucune différence significative n’était plus observée entre les 3 groupes ethniques. La comparaison du risque de paludisme entre les groupes ethniques est souvent compliquée du fait de l’existence de nombreux facteurs confondants. Il est important de tenir compte des différences dans l'EIR et d'autres facteurs associés à l'exposition comme le type d’habitat. Nous avons trouvé une différence géographique dans l’exposition au Plasmodium; les Peuls vivant généralement dans les villages à faible EIR. La concentration moyenne d'IgG anti-MSP119 qui présentait la plus forte association avec l’incidence du paludisme était la plus élevée chez les Peuls. Après ajustement pour les IgG totales et des facteurs environnementaux et génétiques associés au risque de paludisme, les groupes ethniques Mandingue et wolof ont montré une plus faible incidence contre le paludisme. Ce résultat obtenu pourrait refléter des différences génétiques (Koch et al, 2002), ou l’effet résiduel des facteurs confondants. En effet, nous n’avons pas observé que les sujets vivant dans les zones où l’EIR est élevé avaient de plus fortes concentrations d‘IgG contre l’un des 3 antigènes, ou étaient de meilleurs répondeurs aux antigènes. La réponse était similaire dans les 3 groupes ethniques ; cependant, après ajustement pour ces facteurs, les Peuls avaient une incidence élevée et une plus forte réponse immunitaire. Les réponses immunitaires pourraient refléter en partie une plus grande exposition au parasite. Une précédente comparaison interethnique faite au Burkina Faso (Modiano et al, 1996) a montré que les réponses humorales étaient constamment plus élevées chez les Peuls que dans les groupes ethniques Mossi et Rimaibé. Dans notre étude, l'analyse brute de la réponse humorale a révélé des taux plus élevés d'anticorps chez les Peuls comparativement aux 2 autres groupes ethniques, ce qui est en accord avec les conclusions de l’étude conduite au Burkina Faso. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 113 En effet, les concentrations d’IgG anti-CSP étaient plus faibles chez les Mandingues comparativement aux Peuls et aux Wolofs qui avaient des concentrations équivalentes. Toutefois, des taux similaires d’IgG1 et d’IgG3 anti-CSP ont été trouvés dans les 3 groupes ethniques. Les taux d’IgG et IgG1 étaient similaires dans les 3 groupes ethniques ; alors que les taux d’IgG3 étaient plus élevés chez les Peuls, moyens chez les Wolofs et faibles chez les Mandingues. Ceci est en accord avec l’étude de Bolad et coll. (2005) qui avaient montré des taux élevés d’IgG3 chez les Peuls du Burkina Faso et du Mali comparativement aux Mossis et Dogons. En revanche, les taux d’IgG, d’IgG1 et d’IgG3 anti-MSP119 étaient plus élevés chez les Peuls par rapport aux groupes ethniques Mandingue et Wolof, confortant ainsi les conclusions de Modiano et coll. (1996). En effet, dans leur étude une plus grande résistance des Peuls à P. falciparum a été associée à leur forte réactivité humorale contre les antigènes du parasite tels que: TRAP, MSP-1, Pf155 (RESA) et Pf332. Nous avons examiné la réponse humorale dirigée contre les antigènes CSP, MSP119 et AMA1 et leur association avec la protection contre le paludisme clinique, en incluant les traits génétiques de l’hôte comme un nouveau facteur confondant. L’analyse brute des données a révélé une association entre les IgG dirigées contre les 3 antigènes (CSP, AMA1 et MSP119), les IgG1 et IgG3 (CSP et MSP119) et la protection contre le paludisme. L’ajustement des résultats avec toutes les covariables, hormis la parasitémie lors de l’enrôlement réduit cette association pour l’antigène CSP. Aucune interaction significative ou protection supplémentaire n’a été observée chez les sujets ayant une double ou une triple réponse aux Ig ou sous-classes dirigées contre les antigènes CSP, AMA1 et MSP119. La parasitémie au moment du recrutement a été associée soit à des taux réduits d’anticorps soit à l’incidence du paludisme; mais aucune association entre les anticorps anti-CSP, AMA1 et MSP119 avec la protection et la parasitémie n’a été trouvée à l’inclusion. En incluant la parasitémie à l’enrôlement dans notre étude comme facteur confondant, elle a aboli toutes les autres associations observées. Ceci est en divergence avec les résultats Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 114 d’une étude réalisée au Kenya, où la présence d'anticorps anti-AMA1 avait été associée à la protection de sujets porteurs de P. falciparum au moment du recrutement (Polley et al, 2004). Nous avons également analysé la prévalence et la densité parasitaire d’échantillons issus des trois enquêtes transversales : au début de la saison de transmission (Juillet), la période de haute transmission (Octobre-Novembre) et à la fin de la période de transmission (Décembre). La prévalence d’une parasitémie à P. falciparum légèrement plus élevée a été observée chez les Wolofs. Toutefois, nous n’avons pas pu établir de différence interethnique claire du fait de la faible parasitémie observée dans notre groupe. Des études antérieures avaient également signalé une faible prévalence parasitaire dans les échantillons majoritairement constitués de Peuls du nord du Nigeria (Oomen et al, 1979) et de Gambie (Riley et al, 1992b). Nos résultats diffèrent de ceux rapportés antérieurement au Burkina Faso. Cette différence peut s’expliquer d’une part, par le fait que les Peuls du Burkina Faso et de Gambie sont génétiquement très éloignés et d’autre part, par une grande distance génétique entre les Peuls du Burkina Faso et les groupes ethniques sympatriques Mossi et Rimaibé alors qu’il existe une faible distance génétique entre les Peuls de Gambie et les groupes ethniques sympatriques Mandingue et Wolof (Modiano et al, 2001). En effet, les études du polymorphisme de GM dans l'Est du Sénégal (Allsopp et al, 1992) et des molécules HLA de classe I (Blanc et al, 1990) et de classe II (Riley et al, 1992a) en Gambie indiquent plutôt de faibles distances génétiques entre les Peuls et leurs voisins; au contraire l'analyse préliminaire des individus du Burkina Faso suggère un degré relativement élevé de divergence génétique. La réponse anticorpale élevée observée chez les Peuls peut être attribuée à des facteurs codés par des gènes situés en dehors de la région HLA de classe II et impliqués dans la régulation des réponses immunitaires humorales dirigées contre les antigènes de P. falciparum (Sjoberg et al, 1992). Dans notre étude, de fortes réponses humorales ont également été observées chez les Peuls de Gambie, même si elles n’étaient pas corrélées avec la protection contre le paludisme. Ainsi, d’autres mécanismes immunologiques impliquant des gènes liés à la fonction des Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 115 cellules B, l’apprêtement de l’antigène (Farouk et al, 2005 ; Arama et al, 2011), la production d'IL-4 (Luoni et al, 2001), ou la différenciation des Tregs (Torcia et al, 2008) pourraient expliquer les différences interethniques et être partagés par les Peuls d’Afrique occidentale. En conséquence, les études interethniques en cours sur les polymorphismes des cytokines Th1/Th2 pourraient apporter des réponses sur les gènes impliqués dans la régulation des réponses immunitaires humorales (G. Sirugo, en préparation), communs aux Peuls d’Afrique de l'Ouest. Il est intéressant d’observer notamment que la parasitémie à l'inclusion en tant que facteur de confusion abolit l'association des réponses humorales à tous les candidats vaccins, MSP119, CSP et AMA1, ce qui est en contradiction avec une étude antérieure. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 116 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 117 V. Conclusion générale L’objectif principal de cette thèse est l’étude des réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre les antigènes de P. falciparum candidats vaccins dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière. Le premier objectif était d’évaluer le rôle des Tregs dans le biais Th1/Th2 des cellules T néonatales provenant du sang de cordon de placentas parasités par P. falciparum. Nous avons montré comme dans l’étude d’Ismaili et al, (2003) que l’infection placentaire par P. falciparum entraîne une diminution de la production d’IFN- et une augmentation de celle du sCD30 par les cellules T néonatales. Cette infection est aussi responsable de l’augmentation de la production d’IL-10 par les cellules mononuclées du sang de cordon provenant de placentas parasités. Cette production d’IL-10 est assurée par les Tregs comme le révèle les expériences de déplétion de ces dernières. En effet, la déplétion des Tregs entraîne la réduction de la production d’IL-10 et par conséquent la restauration de celle de l’IFN- par les CMSCs en réponse aux antigènes du parasite (extrait de schizontes, érythrocytes parasités et la protéine MSP119). Un effet similaire à la déplétion des Tregs sur la production des cytokines par les CMSCs a été obtenu en utilisant un anticorps monoclonal anti-IL-10. Nos résultats suggèrent que l’infection par P. falciparum influence la différenciation Th1 des cellules T néonatales en impliquant les Tregs à travers leur production d’IL-10. Le second objectif de cette thèse était d’évaluer l’antigénicité d’une protéine triple mutant et des peptides synthétisés à partir des séquences normale et mutée du candidat vaccin MSP119. En effet, la protéine triple mutant a été synthétisée afin d’améliorer l’antigénicité du candidat vaccin MSP119. Cependant, la réponse antigénique de cette protéine n’était pas connue dans une population vivant en zone d’endémie palustre. Nous avons montré que les adultes gambiens produisaient à la fois des taux élevés de cytokines Th1 (IFN-) et Th0/Th2 (IL-13 et sCD30) en réponses aux protéines normale et triple mutant et aux peptides dérivant des ces deux formes. La protéine MSP119 triple mutant (Glu27Tyr, Leu31Arg et Glu43Leu) a induit une plus forte production d’IFN- par rapport au type sauvage chez les adultes Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 118 gambiens naturellement exposés au Plasmodium. Nous avons aussi montré que les peptides modifiés induisent une forte production d'IL-13 que les peptides sauvages, tandis que les peptides conservés P16 et P19 stimulent les taux les plus élevés d'IFN- et d'IL-13 et / ou de sCD30 comparativement à la majorité des peptides MSP119. Nous avons identifié le peptide P16 comme porteur d’un épitope immuno dominant parce que reconnu par 63% de la population étudiée. Le peptide P16 n’était restreint par un type de HLA-DR particulier. Nos résultats ont fourni des informations nouvelles et très utiles pour le développement futur d’un vaccin ainsi que l’immunomodulation Th1/Th2 en utilisant soit la protéine sauvage ou mutée en combinaison avec leurs peptides. Le dernier objectif de cette thèse était d’évaluer les différences interethniques des réponses humorales dirigées contre les antigènes candidats vaccins CSP, AMA1 et MSP119 chez les Peuls, les Wolofs et les Mandingues de Gambie. En effet, les études antérieures ont montré que les Peuls du Burkina Faso et du Mali semblaient plus résistants au paludisme que les autres groupes ethniques ceci, en raison de leurs fortes réponses humorales à plusieurs antigènes de P. falciparum. Cependant, peu d’études avaient étudié la différence interethnique de la réponse humorale impliquant les Peuls dans un autre pays d’Afrique de l’Ouest. Contrairement à la situation observée au Burkina Faso, nous avons trouvé la même incidence du paludisme, la même prévalence parasitaire chez les Peuls de Gambie comparativement aux groupes ethniques sympatriques Wolofs et Mandingues. Nous avons montré que de fortes réponses humorales anti- MSP119 et anti-AMA1, et non anti-CSP étaient associées à la protection contre le paludisme Clinique. Le fait nouveau est que la prise en compte de la parasitémie à l’inclusion a annulé toutes les associations entre réponses humorales dirigées contres tous les antigènes candidats vaccins et la protection contre le paludisme clinique. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 119 VI. Perspectives La présente thèse ouvre différentes perspectives à savoir : Etudier l’immunogénicité de la protéine triple mutant de MSP119 et des peptides immunodominants dans des populations résidant dans les zones palustres d’endémie différentes. Etudier la corrélation entre la réponse immunitaire humorale dirigée contre la protéine triple mutant de MSP119 conçue pour améliorer la production d’anticorps inhibiteurs de P. falciparum et réduire la production d’anticorps bloquants et augmenter la protection contre le paludisme clinique à P. falciparum. Recherche des facteurs génétiques liés aux différences interethniques des réponses immunitaires humorales observées entre les Peuls de Gambie et les groupes ethniques Wolof et Mandingue. Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 120 Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 121 Bibliographie ABDULLA, S., OBERHOLZER, R., JUMA, O., KUBHOJA, S., MACHERA, F., MEMBI, C., OMARI, S., URASSA, A., MSHINDA, H., JUMANNE, A., SALIM, N., SHOMARI, M., AEBI, T., SCHELLENBERG, D. M., CARTER, T., VILLAFANA, T., DEMOITIE, M. A., DUBOIS, M. C., LEACH, A., LIEVENS, M., VEKEMANS, J., COHEN, J., BALLOU, W. R. & TANNER, M. (2008) Safety and immunogenicity of RTS,S/AS02D malaria vaccine in infants. N Engl J Med, 359, 2533-44. ACHTMAN, A. H., BULL, P. C., STEPHENS, R. & LANGHORNE, J. (2005) Longevity of the immune response and memory to blood-stage malaria infection. Curr Top Microbiol Immunol, 297, 71-102. AGARWAL, A., GUINDO, A., CISSOKO, Y., TAYLOR, J. G., COULIBALY, D., KONE, A., KAYENTAO, K., DJIMDE, A., PLOWE, C. V., DOUMBO, O., WELLEMS, T. E. & DIALLO, D. 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Medical Research Council Laboratories, PO Box 273, Banjul, The Gambia1 ; Department of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Keppel Street, London, WC1E 7HT, United Kingdom2; Division of Parasitology, MRC National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, United Kingdom3; and Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Ouagadougou, Burkina Faso4 Running Title: vaccine candidates and malaria incidence in Gambian Fulani Key words: Malaria, Antibody, Ethnic group, CSP, AMA1 and MSP119 Footnotes: Corresponding author*. Mailing address: IBL, Institut Pasteur, Lille, France. Phone: 33-320 871121 Fax: 33-320 871158 E-mails: [email protected]; [email protected] Present addresses: †IBL, Institut Pasteur, Lille, France. ‡ Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA), Ouagadougou, Burkina Faso 181 Abstract The Fulani of Burkina Faso and Mali seem to be more resistant to malaria than other groups due to their higher levels of antibody responses to several malaria antigens. Few studies have investigated this finding elsewhere in West Africa. We used a large cohort of individuals aged 6 months to 45 years and living in The Gambia to assess interethnic differences in malaria incidence and humoral responses to malaria antigens (CSP, MSP119 and AMA1) between Fulani and the sympatric Mandinka and Wolof. In contrast to the situation in Burkina Faso and Mali, we found similar malaria incidence, and parasite prevalence in the three groups, although the humoral response to MSP119 in the Gambian Fulani was higher than that of their sympatric groups. High responses to MSP119 and AMA1, but not to CSP, were associated with protection against malaria. Interestingly, adjusting for parasitaemia at enrolment abolished the association of responses to all vaccine candidates with protection against clinical malaria. 182 Introduction It is well established that Fulani from Burkina Faso and Mali, have lower parasite density and higher levels of antibodies to a variety of malaria antigens when compared to the other sympatric Mossi, Rimaibe and Dogon ethnic groups (Modiano et al, 1996; Dolo et al, 2005). Very few studies are available for Fulani from other West African countries. Riley et al. (1992a) reported a higher antibody response of the Gambian Fulani to the Pf155 ring-infected erythrocyte surface antigen (RESA), associated this immune response with resistance to clinical malaria and correlated it with class II DQA-DQB, which is common in the Fulani ethnic group. Other reports have referred to splenomegaly and higher IgM levels as more frequent in the Fulani from Nigeria (Oomen et al, 1979), Burkina Faso and Mali (Bolad et al, 2005) and The Gambia (Greenwood et al, 1987) compared to other sympatric ethnic groups. However, the latter studies did not provide parasitological or specific immunological data and did not verify to what extent the high antibody response to Plasmodium falciparum is a common trait of the Fulani ethnic group across West Africa. Consequently we have conducted a cohort study in the Gambia in a wide age range of participants from the three major ethnic groups: Mandinka, Fulani and Wolof, to investigate humoral responses, parasite prevalence, and resistance to malaria. We investigated the humoral response to the pre-erythrocytic stage circumsporozoite protein (CSP) and to the erythrocytic stage merozoite antigens, apical membrane antigen 1 (AMA1), and the 19 kDa C-terminal region of merozoite surface protein 1 (MSP119). All proteins are candidates in development for inclusion in a vaccine against P. falciparum malaria. Immune responses to these antigens may prevent or reduce malaria– related morbidity and mortality by inhibiting sporozoites invasion and development within hepatocytes or merozoite invasion of erythrocytes, thus eliminating or reducing the parasite load, as supported by evidence drawn from studies of malaria in humans and several animal 183 models (Heppner et al, 2005; Egan et al, 1996; Polley et al, 2004). However, there is conflicting evidence for the protective effects of responses to CSP and MSP119 in studies from different West African countries (Dodoo et al, 1999; Riley et al, 1992b). In addition, further evidence is needed for a broad protective effect of AMA1-specific antibodies, for example because of extensive antigenic polymorphism. Here we have used a cohort study to reassess the protective effects of responses to each of the vaccine candidates. We have reexamined antigen-specific IgG1/IgG3 subclass levels present before the malaria season to predict the proteins' potential efficacy as vaccine candidates, adjusting for the confounding effects of exposure and age, as well as the prevalence of parasites and ethnicity. This is also the first report of a cohort study designed to compare humoral responses to these antigens in blood samples from Gambians of Fulani, Mandinka and Wolof ethnicity and with reference to their susceptibility to clinical malaria. Materials and methods Study Design A cohort of 658 adults and children was recruited from 8 rural villages surrounding Farafenni, a town on the North bank of the River Gambia which experiences annual peak malaria transmission from August to December (October to November being the highest transmission period). We used the MRC Household Registration System to recruit a sample of children and adults aged from 6 months to 45 years, stratified by age and ethnicity so that the age distribution was the same in each group (Wolof, Mandinka and Fulani). Informed consent was obtained from all adult participants or the parent or guardian for the children below 18- 184 years old. Venous blood samples were collected during the period 14th to 28th July 2003 from each participant for analysis of their immune responses and parasitaemia. 500 µl of blood collected in EDTA tubes was used for sickle cell haemoglobin genotyping, packed cell volume (PCV) measurement and thick blood smear microscopy for parasite detection. The remainder of the blood was collected into a heparin tube for subsequent measurement of humoral and cell immune responses. Plasma samples were stored at –20°C prior to measurement of antibody levels. Following initial sampling in July 2003, each participant in the cohort was visited weekly by a field worker for a period of 23 weeks (up to January 2004). Axillary temperature was measured with a digital thermometer, and in cases of fever (temp >37.5°C), a rapid diagnostic test (ICT Malaria Pf/PvTM: histidine-rich protein antigen II- AMRAD, Australia) was performed and the person treated for malaria according to national guidelines (at that time, SP+CQ), if the test was positive. A blood film was also taken to determine parasite density by microscopy. Clinical malaria incidence for any cohort participant, who attended the Farafenni APFRC hospital or outpatients clinic, was also recorded. Cross-sectional surveys of all participants were also carried out; finger prick samples were collected at the end of October and the beginning of November (the peak of highest transmission) and during mid December (low transmission) for preparation of thick blood films. Parasitaemia was assessed by microscopic examination of Giemsa-stained smears; all slides were read twice by experienced microscopists and any discrepancy resolved by a third reader. One hundred fields at 1000x magnification were examined before declaring a slide negative (limit of detection, approximately 2 parasites/l). Malaria was defined as fever (axillary temperature >37.5oC) with a parasite density > 5000/µL (Migot-Nabias et al, 2000). Details of bed-net use and condition, insecticide use, and type of house were collected in July 2003. A surveillance was 185 carried out in the villages to estimate the entomological inoculation rate (EIR). The ethnicity of participants was determined from questionnaires to collect information on the ethnicity of their parents and grandparents. The study was approved by the Joint Gambia Government/MRC Ethical Committee. Sickle cell haemoglobin and G6PD genotyping Genomic DNA was extracted from the buffy coat cell fraction or whole blood using a standard salting out procedure, and sickle cell trait genotyping was performed by PCR, using an amplification refractory mutation system (ARMS), to detect the sickle cell mutation (an A to T transition in codon six of the β-globin gene). Primer sequences for typing HbS were as follows: HbS allele - 5'GGCAGTAACGGCAGACTTCTCCA 3' Normal HbA allele - 5' GGCAGTAACGGCAGACTTCTCCT 3' Reverse primer - 5' GCCAGTGCCAGAAGAGCCAA 3' Sixty 60 ng genomic DNA was mixed with 15 pmol of each forward and reverse primer, in a 15 µl reaction containing 16mM (NH4)2SO4, 67mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25ºC), 3.45 mM MgCl2, 0.6 mM each dNTP, and 0.5 U Taq DNA polymerase (Bioline Ltd., London, UK). Cycling conditions were 96oC 1 min; 5 cycles of 96oC 35 sec, 70oC 45 sec and 72oC 35 sec; then 21 cycles of 96oC 25 sec, 65oC 50 sec and 72oC 40 sec; then 6 cycles of 96oC 35sec, and 55ºC 1 min; followed by 72oC 90 sec. PCR products were electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide and digitally photographed using a Gel Doc System 2000 apparatus (Bio-Rad Laboratories Ltd. Hertfordshire, UK). 186 For G6PD status determination, samples (4 ng of DNA) were genotyped by Taqman assays (ABI, Applera International Inc, Foster City, CA, USA) in 10 µl reaction volume using the ABI 7500 real-time PCR systems. Fluorescence curves were analyzed with the 7500 Sequence Detection Software version 1.2.1 for allelic discrimination. Antibody responses to MSP119, AMA1 and R32LR Levels of antibody to MSP119 and AMA1 were measured in the plasma samples using ELISA. Briefly, ELISA plates (Immunlon4, Dynatech Laboratories Inc.) were coated with 1µg/ml of MSP119 or AMA1 in 100 µl carbonate buffer and incubated overnight at 4 ˚C, then washed with PBS-Tween (0.05%), flicked dry and 150 µl of PBS-1% BSA blocking solution was added. Plates were incubated at room temperature for 3 hours, then flicked dry and diluted plasma samples were added. The plasma samples in duplicate were assayed at 1:1000; 1:2000, 1:4000, and 1:8000 dilutions for MSP119 and at 1:1000 and 1: 2000 dilutions for AMA1. Serial dilutions of purified human IgG and anti human IgG-POD were used as standards on each plate to assess the relative concentration of antibody (Ab) to AMA1 and MSP119. The plates were incubated overnight at 4˚C, washed 6 times and horseradishperoxidase (HRP)-goat anti-human IgG (Dako A/S, Denmark) or horseradish-peroxidase (HRP)-rabbit anti-human IgG1 or anti-IgG3 for the subtype determination (The Binding Site, UK) were added at a 1:5000 dilution in PBS-1% BSA. The plates were incubated for 3 hours at room temperature, washed 6 times and the reaction developed by adding 100 µl tetramethyl-benzidine (TMB) (Sigma, UK). The reaction was stopped with 100 µl 2M H2SO4 and the plates read at 450 nm. Samples from donors resident in Brefet were used as positive controls and sera of European tourists with no previous exposure to malaria were used as negative controls. The mean + 3 187 standard deviation (SD) of the negative control European sera was used as the end point titre cut-off to define ‘responders’. To quantify IgG binding to the P. falciparum CSP NANP-repeat sequence, 0.1 µg of the R32LR recombinant antigen in 50µl PBS and casein (4 µl of boiled casein [0.5% casein with Phenol Red, Thimerosal, PBS, 5N NaOH; SIGMA] per 5 ml of diluted antigen) was used to coat each well on Immunlon plates. Following incubation overnight at room temperature, the wells were then blocked with 250 µl of blocking buffer (0.5% Boiled Casein and Tween) for one hour at room temperature. The contents of the well were removed by aspiration and 50 µl of an appropriate plasma dilution were added. Each plate contained the following wells: a blank, negative and positive serum (DGP) controls and the samples (in triplicate) starting at a 1:50 dilution and with further two-fold dilutions. Samples were incubated in the wells for two hours at room temperature and then the wells were washed with PBS-Tween 20. Goat antihuman IgG conjugated to horse radish peroxidase (Kierkegaard and Perry Laboratories) at a dilution of 1: 1000 was added at 50 µl/well and incubated for one hour at room temperature. Wells were washed four times with PBS-Tween 20 and 100ul of substrate solution (ABTS HRP Substrate Kit, Kierkegaard and Perry Laboratories) were added and incubated for one hour at room temperature. Ten µl of 20% SDS (SIGMA) were used to stop the reaction and then the absorbance was read at 414 nm. For each plasma sample tested three readings of a dilution which gave an OD value of around 1.0 were selected. The mean OD reading was calculated and this mean was multiplied by the dilution factor to obtain the weighted mean (WM). The corrected weighted mean (CWM) for each plate was calculated: CWM = Average WM DGP x WM sample / WM DGP. The IgG concentration (µg/ml) on each plate was calculated by the formula: IgG in sample (µg/ml) = known concentration for DGP (9.8) x CWM of sample / CWM of DGP standard. 188 Statistical analysis Incidence rate ratios for the association of immunological variables and ethnicity with malaria incidence were estimated by fitting a weibull model to the times of malaria episodes, this model was chosen because it allows for seasonality in the incidence of malaria. To allow for the lack of independence among repeated observations on the same individual, a random effect was included to allow for variation in individual baseline risk, which was assumed to follow a gamma distribution. Antibody concentrations were included in the model as category variables, with 5 levels, the first category for zero values, and the remaining 4 categories obtained by grouping the positive values according to quartiles; a likelihood ratio test was used to obtain a P-value for the association of each antibody level with malaria incidence. Covariates were specified in advance: EIR, net use, age group, sickle cell and glucose-6phosphate dehydrogenase (G6PD) genotype, and whether the house had open eaves. Several models were fitted. Firstly, to assess the independent effects of total IgG to AMA1, MSP119 and CSP, all three variables were included in the model with the covariates. Secondly, to examine the association with IgG subclasses, models were fitted for each antigen in turn, including the concentration of IgG1 and IgG3 (as category variables with three levels according to tertiles) and the same list of covariates. Association between antibody level and various effects was analysed using both one way analysis of variance and the Bernoulli lognormal model. In the Bernoulli lognormal model, we modelled the event that the antibody levels from a subject were zero or non zero with a Bernoulli variable, and modelled the non zero measurement on antibody level with a lognormal variable. In this dataset, antibody levels are left truncated, i.e. measurements that are less than 10 pg/ml are considered to be zero. The Bernoulli lognormal mixture model also considers this by incorporating a left-censoring process in the lognormal component. 189 To detect effects that are protective against malaria infection, we did Poisson regression analysis on malaria incidence vs. various effects, including age, ethnicity, antibody level, Hb type, entomology, and housing information. Antibody levels were included as an ordinal variable in the analysis, i.e. subjects were categorized into high, medium, or low responders based on the continuous antibody levels. To check how antibody levels were related to time to the first malaria incidence, Kaplan-Meier plots were made for each antibody, with 3 strata, high, medium, and low antibody levels. Results Baseline characteristics of study participants Demographic and baseline characteristics of study subjects are shown in Table 1. The cohort sample was made to be representative of each of the three main ethnic groups in each age group, the distribution of participants across ethnicity (31.26%, 36.39% and 32.35% in the Wolof, Fulani and Mandinka groups, respectively) and age categories (20.88%, 42.39% and 36.73% in the less than 5 years, 6-15 years and > 15 years old categories, respectively) was similar. Nearly 60% of study subjects were female. Reported insecticide-treated net (ITN) ownership at the beginning of the study was roughly 25%, whereas only 1% had had the net impregnated with insecticide. The entomological inoculation rate (EIR) was found to be higher than 50 in 18% of sites of residence and more than 50% of households reported having an eaves gap in their housing. Acquired immunity to P. falciparum was assessed at enrolment. Regarding genetic factors affecting protection against malaria, almost one fifth of subjects were found to be heterozygous for sickle-cell and around 1% was homozygous. Around 4% and 1% were identified as female heterozygous and male hemizygous for G6PD deficiency, 190 respectively. CSP, MSP119 and AMA1-specific antibodies were found to be present in 76.75%, 64.29% and 50% of participants, respectively. Comparison of malaria incidence among ethnic groups We investigated the interethnic differences of malaria incidence among the three major groups in the Gambia, Fulani (n= 234), Mandinka (n=208) and Wolof (n=201). Malaria incidence rates were similar in the three ethnic groups; however, the EIR recorded in the village, and the G6PD and sickle cell genotype, were associated with malaria risk and ethnicity. Fulani for example were more likely to live in villages where EIR was low, and after adjustment for the effects of covariates, Fula ethnicity was associated with a slightly increased risk of malaria compared to the two other ethnic groups. However, adjusted estimates of malaria incidence, in association with the baseline characteristics described in Table 2 and in particular parasitaemia at enrolment, abolished the interethnic differences of clinical malaria and no significant difference of malaria incidence was found between the three groups [Crude estimates (4.226; ST dev: 0.325; Pr(>|z|):0.000) and adjusted estimates for all confounders (3.972; ST dev: 0.344; Pr(>|z|):0)]. Comparison of humoral responses to CSP, AMA1 and MSP119 among ethnic groups. Antibody responses to CSP, MSP119 and AMA1 (total IgG, IgG1 and IgG3), increased with age, while no significant association was found with bed net use or EIR, neither in logistic regression nor in log linear regression (not shown). While the proportion of responders to AMA1 was similar in all ethnic groups, for CSP and MSP119, the proportion of responders was lower in the Mandinka group than in the other two groups (Table 3). The concentration of total IgG among the responders was compared between ethnic groups; the concentration of total IgG and IgG1 to MSP119 was higher in the Fulani group (Figure 1) while total IgG, IgG1 191 and IgG3 to AMA1 was similar in the three ethnic groups. As shown in Figure 1, the concentrations of total IgG specific to CSP were lower within the Mandinka group compared to Fulani and Wolof participants, who had similar levels of antibodies. In addition, the three ethnic groups had similar levels of anti-CSP IgG1 or IgG3. Antibody association with malaria incidence and parasitaemia Kaplan-Meier analysis (Figure 2) showed that high antibody levels are associated with prolonged time to the first malaria incidence, i.e. high antibody levels to CSP, AMA1 and MSP119 are protective against malaria infection. The crude analysis also showed significant association of antibodies to the individual antigens, CSP (IgG1 and IgG3), AMA1 (total IgG) and MSP119 (total IgG, IgG1 and IgG3) with malaria protection (not shown). As shown in Table 2, after adjustment for age, exposure variables, sickle cell genotype, and G6PD genotype (but not parasitaemia at recruitment) for all three antigens (total IgG to AMA1, MSP119 and CSP), there was only a significant association between malaria incidence and the concentration of total IgG anti-MSP119 and AMA1 antibodies, but not anti-CSP antibodies. When IgG subclasses were considered, (Table 4), the concentration of IgG1 to AMA1, and of IgG1 to CSP, were associated with the incidence of malaria, but there was no association of malaria incidence with IgG1 to MSP119, and no association of IgG3 with malaria for any of the antigens. After adjusting for the effects of total IgG to the three antigens, ethnicity was independently associated with malaria incidence; Mandinka and Wolof ethnicity was associated with reduced incidence compared to Fulani. 192 When parasitaemia at enrolment was included as a confounder factor, this abolished the observed associations (not shown). Looking at cumulative protective effects of the different antibodies, no significant interaction between the protection from CSP and the blood stage antigens AMA1 and MSP119 was observed, whether or not parasitaemia was included. The parasitological data from the three cross-sectional surveys (Figure 3), in July, OctoberNovember and December showed that amongst the three ethnic groups Wolof tended to have a higher prevalence of P. falciparum. However, low parasite prevalence, and the fluctuations of the parasite rates and densities show that there is no evidence of coherent interethnic differences. Discussion Fulani populations from Burkina Faso and Mali were reported to make stronger antibody responses to malaria while being less frequently parasitized and less susceptible to clinical malaria (Modiano et al, 1996) compared to other sympatric groups (Mossi and Rimaibé). Accordingly, our cohort study investigated interethnic differences in humoral responses, to the CSP, AMA1 and MSP119 vaccine candidates between Fulani and the sympatric Mandinka and Wolof in the Gambia. In addition, because different immunoepidemiological studies conducted at several sites have yielded conflicting evidence on the association of anti-CSP or anti-MSP119 antibodies with clinical immunity to malaria, and because the only cohort study described for anti-AMA1 was conducted in Kenya where the pattern of malaria transmission is different from that in the Gambia (Egan et al, 1996; Polley et al, 2004; Dodoo et al, 1999), we have also reassessed the association of antibody responses to these antigens with clinical immunity. To assess the reported discrepancies, with sufficient statistical power and to examine whether or not there was a real association with protection, the genetic background 193 and parasitaemia at enrolment, which had not been considered in previous studies, were included as confounders. The comparison of malaria risk between ethnic groups is complicated by many confounding factors. In this study, the crude analysis of malaria incidence in three ethnic groups showed that the Fulani had the highest malaria incidence compared to other ethnic groups in The Gambia. Whilst the Wolof group had the lowest malaria incidence, after adjustment for all confounders no significant difference was found between the three ethnic groups. It is important to allow for differences in EIR and other factors associated with exposure such as house construction. Although malaria incidence was similar in all three ethnic groups, there were local geographical differences in relation to EIR; and Fulani tended to live in villages with lower EIR. There was no evidence that people living in areas of higher EIR had higher IgG concentrations to any of the antigens or were more likely to be responders. The mean concentration of IgG to MSP119, which had the strongest association with malaria incidence of the antigens tested, was higher among Fulani. After adjusting for total IgG and environmental and genetic factors associated with malaria risk, Mandinka and Wolof ethnicity was associated with lower malaria incidence. This could reflect genetic differences (Koch et al, 2002), or residual confounding factors. We found similar overall rates but after adjusting for these factors Fulani were associated with higher incidence, and stronger immune responses as reported previously (Bolad et al, 2005). Immune responses could partly reflect greater exposure. The previous interethnic comparison (Modiano et al, 1996) revealed that humoral responses were consistently higher in the Fulani. In our study, the crude analysis of the level of humoral response showed higher levels of antibody in Fulani compared to other sympatric groups, which is in agreement with the findings in Burkina Faso. Concentrations of total IgG to CSP 194 were lower within the Mandinka compared to Fulani and Wolof groups, who had similar levels of antibodies. However, similar levels of CSP-specific IgG1 and IgG3 were present in all three groups. Levels of total anti AMA1 IgG and IgG1 were similar in the three groups, whilst IgG3 levels were highest among Fulani, medium in Wolof, and lowest in the Mandinka group. This finding is in accordance with a previous report which showed a high level of IgG3 among Fulani from Burkina Faso and Mali compared to Mossi and Dogon respectively (Bolad et al, 2005). In contrast, levels of total anti-MSP119, IgG1 and IgG3 Abs were all higher in Fulani compared to the Mandinka and Wolof groups, in support of Modiano’s findings (Modiano et al, 1996). In the previous study, parasitological and clinical evidence of a higher resistance of the Fulani to P. falciparum was associated with their stronger humoral reactivity against a different panel of parasite antigens: TRAP, MSP1, Pf155 (RESA), and Pf332 (Modiano et al, 1996). We have examined humoral responses to CSP, MSP119 and AMA1 and their association with protection against clinical malaria, including genetic traits as a new confounder. The crude analysis associated total IgG to CSP, AMA1 and MSP119 as well as IgG1 and IgG3 to CSP and MSP119 with protection against malaria. Adjusting for all covariates, except parasitaemia at recruitment reduced this association for CSP. Furthermore, there was no significant interaction or extra protection afforded to double or triple responders with total IgG, IgG1 or IgG3 to CSP, AMA1 or MSP119. Parasitaemia at enrolment was either associated with lower levels of antibodies or with malaria incidence; but no association of antibodies to CSP, AMA1 and MSP119 with protection and parasitaemia was found at enrolment. Interestingly, including parasitaemia at enrolment as a confounder completely abolished all the observed associations. This is in contrast to a study in Kenya, where presence of antibodies to AMA1 was associated with protection in subjects carrying P. falciparum at recruitment (Polley et al, 2004). 195 We analysed the parasite prevalence and density, using samples from three cross sectional surveys at the beginning of the transmission season (July), at the highest transmission period (October-November) and at the end of the transmission season (December). We found that the Wolof group had a slightly higher prevalence of P. falciparum. However, no clear conclusion of interethnic differences could be drawn because of the low parasite prevalence in our cohort. Previous studies had also reported low parasite prevalence in population samples mostly constituted by Fulani in northern Nigeria (Oomen et al, 1979) and The Gambia (Riley et al, 1992b). Our data are different from those reported previously from Burkina Faso. This discrepancy may be attributed to large genetic differences between the Burkina Faso and Gambian Fulani, or greater genetic differences between the Fulani and the sympatric Raimbé and Mossi groups in Burkina Faso compared with the Fulani and the sympatric Mandinka and Wolof groups in The Gambia (Modiano et al, 2001). Indeed, recent studies of GM polymorphism in Eastern Senegal (Allsopp et al, 1992) and of HLA class I (Blanc et al, 1990) and II (Riley et al, 1992a) in The Gambia indicate rather small genetic distances between the Fulani and their neighbours; in contrast preliminary analysis of individuals from Burkina Faso suggests a relatively higher degree of genetic divergence. The reported higher antibody response of the Fulani may be attributed to factors encoded by genes outside the HLA class II region and involved in the regulation of humoral immune responses against P. falciparum antigens (Sjoberg et al, 1992). Higher humoral responses were also observed in the Gambian Fulani population, even though no association with protection to malaria was found. Possible immunological mechanisms involving genes related to B-cell function, antigen-presenting cell (Farouk et al, 2005; Arama et al, 2011), interleukin 4 production (Luoni et al, 2001), or regulatory T cell differentiation (Torcia et al, 2008) may 196 still show interethnic differences and be shared by Fulani across West Africa. Accordingly, ongoing investigation into interethnic polymorphisms in Th1/Th2 cell cytokine genes may provide insights into genes involved in regulation of humoral responses (G. Sirugo, in preparation). In summary, we report here for the first time studies on interethnic differences of malaria incidence and humoral responses of Fulani, Mandinka and Wolof in The Gambia. We have shown that Fulani compared to Mandinka and Wolof had a higher antibody response but a similar pattern of malaria incidence and parasite prevalence and density. Interestingly, including parasitaemia at enrolment as a confounder abolished the association of humoral responses to all three vaccine candidates: MSP119, CSP and AMA1, which is in contrast to reports of previous studies. Acknowledgements: We are grateful to the all participants enrolled into the cohort study, to the staff of Farafenni Health Centre and to the Department of State for Health. We thank all Farfenni field workers as well as Simon Correa, Idrissa Sambou and Saikou Keita for the technical support. The work was supported in part by the MRC through U117532067 and U117532063 197 References Arama C, Giusti P, Boström S, Dara V, Traore B, Dolo A, Doumbo O, Varani S, TroyeBlomberg M: Interethnic differences in antigen-presenting cell acrivation and TLR responses in Malian children during Plasmodium falciparum malaria. PlosOne 2011, 6 (3):e18319 Allsopp CE, Harding RM, Taylor C, Bunce M, Kwiatkowski D, Anstey N, Brewster D, McMichael AJ, Greenwood BM, Hill AV: Interethnic genetic differentiation in Africa: HLA class I antigens in The Gambia. Am J Hum Genet 1992, 50(2):411-421. Blanc M, Sanchez-Mazas A, Van Blyenburgh NH, Sevin A, Pison G, Langaney A: Interethnic genetic differentiation: GM polymorphism in eastern Senegal. Am J Hum Genet 1990, 46(2):383-392. 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Baseline characteristics of the cohort study subjects at recruitment (N=658) * Ethnic group Age n % Wolof 201/643 31.26 Fulani 234/643 36.39 Mandinka 208/643 32.35 <5 years 133/637 20.88 5-15 years 270/637 42.39 > 15 years 234/637 36.73 negative 146/628 23.25 positive 482/628 76.75 negative 225/630 35.71 positive 405/630 64.29 negative 315/630 50.00 positive 315/630 50.00 male 280/654 42.81 female 374/654 57.19 no 494/658 75.08 yes 164/658 24.92 no 651/658 98.94 yes 7/658 1.06 0 90/606 14.85 ≤ 50 409/606 67.49 > 50 107/606 17.66 Not deficient 533/565 94.34 A- heterozygote 25/565 4.42 A- 7/565 1.24 AA 467/592 78.89 AS 118/592 19.93 SS 7/592 1.18 no 305/658 46.35 yes 353/658 53.65 CSP antibodies † MSP119 antibodies ‡ AMA1 antibodies § Sex Net ownership Net impregnated with insecticide Entomological inoculation rate (EIR) G6PD deficiency ¶ Sickle-cell disease Eaves gap in the household 201 Malaria treatment in the 30 days before cross 1 ║ no 408/606 67.33 yes 198/606 32.67 no 401/587 68.31 yes 186/587 31.69 Malaria treatment in the 30 days before cross 2 * Number of subjects included in the analysis † CSP: Circumsporozoite Surface Protein ‡ MSP119: Conserved C terminal region of Merozoite Surface Protein 1 § AMA1: Apical Membrane Antigen 1 ¶ G6PD: Glucose-6-phosphate dehydrogenase ║ This information is not strictly baseline data 202 Table 2. Baseline characteristics of the cohort study subjects at enrolment and malaria incidence in association with AMA1, MSP119 and CSP total IgG antibody levels adjusted for confounders Characteristics Age group Ethnic group EIR bed net Eaves Gap Sickle cell genotype G6PD deficient AMA1 Total IgG N Person month s/100 Malaria cases Rate/100 person months Crude Rate ratio (95%CI) Adjusted rate ratio (95%CI) <5years 133 7.16 94 13.14 1 1 5-15years 270 14.56 115 7.90 0.60 (0.46-0.79) 0.73 (0.52-1.02) 0.065 >15 years 234 12.50 25 2.00 0.15 (0.10-0.24) 0.23 (0.14-0.40) 0.001 Fulani 225 7.03 87 12.37 1 1 Mandinka 201 6.90 73 10.58 0.98 (0.72-1.34) 0.56 (0.36-0.87) 0.009 Wolof 200 6.46 69 10.68 0.92 (0.67-1.26) 0.68 (0.45-1.01) 0.059 Low 90 5.17 20 3.87 1 1 Medium 409 21.87 154 7.04 1.82 (1.14-2.90) 2.15 (1.23-3.78) 0.008 High 138 7.18 60 8.35 2.16 (1.30-3.58) 2.54 (1.29-4.97) 0.007 No 473 25.36 164 6.47 1 1 Yes 164 8.87 70 7.89 1.22 (0.92-1.61) 1.14 (0.82-1.59) No 284 15.42 98 6.36 1 1 Yes 353 18.81 136 7.23 1.14 (0.88-1.47) 1.26 (0.92-1.74) AS 465 6.33 26 4.11 1 1 AA 117 25.02 184 7.36 1.79 (1.19-2.70) 1.62 (1.05-2.51) 0.030 SS 7 0.38 5 13.15 3.20 (1.23-8.33) 2.47 (0.91-6.69) 0.076 No 570 30.53 211 6.91 1 1 Yes 32 1.71 6 3.51 0.51 (0.23-1.14) 0.47 (0.21-1.09) 0 276 14.85 139 9.36 1 1 >0 <260 87 4.69 35 7.46 0.80 (0.55-1.15) 1.20 (0.78-1.85) 203 P-values 0.435 0.150 0.079 0.399 LR X2=12.19 260-729 88 4.73 18 3.80 0.41 (0.25-0.66) 0.67 (0.39-1.15) 0.143 P=0.0160 MSP119 Total IgG CSP Total IgG 730-1100 87 4.65 24 5.16 0.55 (0.36-0.85) 0.98 (0.58-1.65) 0.942 >1100 88 4.72 9 1.91 0.20 (0.10-0.40) 0.37 (0.17-0.79) 0.010 0 205 10.96 104 9.49 1 1 >0 <60 105 5.58 55 9.85 1.04 (0.75-1.44) 1.23 (0.82-1.85) 0.312 61-220 106 5.70 38 6.67 0.70 (0.48-1.02) 0.96 (0.63-1.46) 0.850 221-840 105 5.64 18 3.19 0.34 (0.20-0.55) 0.43 (0.23-0.81) 0.008 >840 106 5.82 11 1.89 0.20 (0.11-0.37) 0.52 (0.26-1.03) 0.062 0 153 8.19 67 8.18 1 1 >0 <200 117 7.31 46 6.29 0.89 (0.61-1.30) 1.12 (0.74-1.70) 0.592 210-600 118 4.85 31 6.40 0.59 (0.39-0.91) 0.78 (0.49-1.25) 0.306 X2=15.15 P=0.0044 X2=4.75 P=0.314 601-1050 118 7.45 47 6.31 0.91 (0.63-1.32) 1.15 (0.75-1.76) 0.513 >1050 118 5.51 35 6.35 0.67 (0.45-1.01) 0.79 (0.49-1.27) 0.337 TOTAL 640 34.22 234 6.84 LR: logistic regression; CI: confidence Interval; X2: Chi squared; P: p-value; N: number of individuals tested 204 Table 3. Immune responses to P.falciparum at enrolment across ethnic groups CSP antibodies† MSP119 antibodies‡ AMA1 antibodies§ (N=658) * Ethnic p-value n % group p-value n % ¶ Wolof 162/197 82.23 Fulani 188/223 Mandinka 123/197 <0.001 p-value n % ¶ 173/197 87.82 84.30 155/223 62.44 72/199 <0.001 ¶ 92/196 46.94 69.51 115/224 51.34 36.18 103/199 51.76 * Total number of study participants/observations † CSP: Circumsporozoite Surface Protein ‡ MSP119 : Conserved C terminal region of Merozoite Surface Protein 1 § AMA1: Apical Membrane Antigen 1 ¶ P-values from Chi-square test of the association of independent variables and presence of parasitaemia at 1st survey 205 0.566 Table 4. Malaria incidence in association with AMA1, CSP and MSP119 antibody subclasses levels adjusted for all confounders Ab subclasses AMA1 IgG1 AMA1 IgG3 MSP119 IgG1 Ab concentration (µg/ml) Crude rate ratio (95%CI) Adjusted for confounders 0-368 1 1 369-905 0.78 (0.48-1.26) 0.79 (0.45-1.37) >905 0.48 (0.28-0.85) 0.39 (0.19-0.81) 0-11 1 1 12-65 0.59 (0.35-0.97) 1.15 (0.64-2.07) >65 0.46 (0.27-0.79) 0.85 (0.43-1.71) 0-28 1 1 29-173 0.66 (0.42-1.04) 0.97 (0.58-1.65) >173 0.25 (0.13-0.47) 0.57 (0.27-1.20) 0-6 1 1 7-27 0.43 (0.26-0.71) 0.59 (0.34-1.05) >27 0.35 (0.20-0.60) 0.73 (0.37-1.41) <2 1 1 MSP119 IgG3 206 LR test X2=6.91 (2), P=0.0316 N=299 X2=0.77 (2), P=0.6792 N=299 X2=2.75 (2), P=0.2534 N=320 X2=3.43 (2), P=0.1799 N=320 CSP IgG1 CSP IgG3 2-93 0.51 (0.34-0.77) 0.68 (0.41-1.13) >93 0.22 (0.12-0.39) 0.39 (0.20-0.76) <2 1 1 2-99 0.45 (0.29-0.70) 0.79 (0.47-1.34) >99 0.59 (0.40-0.88) 1.10 (0.68-1.79) LR: logistic regression CI: confidence Interval X2: Chi squared P: p-value N: number of individuals tested 207 X2=9.2 (2), P=0.0101 N=401 X2=1.41 (2), P=0.4932 N=401 700 Fula Mandinka Wolof CSP Antibody titers 600 500 400 300 200 100 0 AMA-1 Antibody titers 1000 800 600 400 200 0 MSP1-19 Antibody titers 800 600 400 200 0 Total IgG IgG1 Figure 1 208 IgG3 Figure 2 209 Figure 3A 210 Figure 3B 211 Figure 3C 212 Figure legends Figure 1. A comparison of the total IgG, IgG1 and IgG3 levels to CSP, AMA1 and MSP119 in plasma. The samples were from three groups: Fulani (black bar), Mandinka (light gray bar) and Wolof (dark gray). Antibodies titres (pg/ml) were measured by ELISA. The total anti-CSP IgG concentration was higher among Fulani and Wolof compared to Mandinka samples, although there was no significant difference in the levels of IgG1 and IgG3. The concentrations of anti-AMA1 total IgG, IgG1 and IgG3 were not significantly different between the three groups. Higher concentrations of both anti-MSP119 total IgG and IgG1 were observed for the Fulani compared to the Mandinka and Wolof samples. Figure 2. Kaplan-Meier plot to show the relationship between time to first incidence of malaria (days since enrolment) and level of specific antibodies. Dotted red (Mandinka), dotted green (Wolof) and solid black (Fulani). The analysis showed that high antibody levels were associated with prolonged time to the first malaria incidence. Figure 3A. Parsite rate and density among Fulani, Mandinka and Wolof at the time of the inclusion in the study (July 2003). Figure 3B. Parasite rate and density among Fulani, Mandinka and Wolof during the first cross sectional survey (October 2003). Figure 3C. Parasite rate and density during the second cross sectional survey (December 2003) 213 214 215
