Architecture de puces à anti-corps combinant haute sensibilité de

Architecture de puces à anti-corps combinant haute sensibilité de détection par
fluorescence, sélectivité vis-à-vis des adsorptions non spécifiques, et rendement amélioré
par immobilisation orientée des sondes.
Doctorant : Emmanuel PEREZ
Directeurs de thèse : François OZANAM, Anne-Chantal GOUGET-LAEMMEL
Les puces à protéines présentent un très grand intérêt pour les applications au diagnostic ou à la
détection d’agents toxiques. La capacité de reconnaissance moléculaire de ces puces est basée sur l’interaction
sélective d’une protéine ou d’une molécule cible en solution avec une sonde immobilisée sur une surface. En
dépit d’attentes fortes, des puces à protéines sensibles et fiables apparaissent beaucoup plus difficiles à obtenir
que les puces à ADN qui sont déjà largement utilisées. Une difficulté majeure est liée à la concentration
extrêmement faible des cibles au sein des échantillons biologiques réels et à la propension des protéines à
s’adsorber de manière non spécifique sur la plupart des surfaces.
L’utilisation du silicium comme substrat a permis des avancées spectaculaires pour la chimie de surface
des puces à ADN. Pour les puces à protéines, on peut espérer que, pareillement, le greffage covalent, par
hydrosilylation photochimique, d’une monocouche organique permettra l’immobilisation covalente des sondes et
la limitation de ces adsorptions non spécifiques. Pour ce faire, la couche organique sera composée de chaînes
moléculaires associant une partie alkyle passivant la surface et des unités de type polyéthylène glycol
hydrophiles connues pour limiter les adsorptions non spécifiques. Ces molécules sont nommées C
p
(EG)
n
X, où p
est le nombre de carbones de la chaîne alkyle, n le nombre d’unités éthylène glycol EG et X un groupement
terminal (par exemple hydrogène, méthyle ou acide carboxylique).
Plusieurs molécules ont été testées en faisant varier la longueur des chaînes PEG et alkyles. J’ai
optimisé les conditions de greffage (photochimique dans le toluène) et de rinçage en utilisant la spectroscopie IR
en mode ATR combinée à l’AFM. J’ai développé une méthode quantitative utilisant la spectroscopie infrarouge
pour déterminer la concentration superficielle en molécules greffées. Dans les conditions optimales, environ 15%
des atomes de silicium en surface sont liés aux chaînes C
p
(EG)
n
X.
L’analyse des résultats a montré que la couche organique de PEG limite l’adsorption des protéines
d’autant mieux que la chaîne PEG est suffisamment longue et la partie alkyle courte. Cette propension est
mesurée par spectroscopie infrarouge et identifiée au rapport de l’intensité des pics amides mesurée après
exposition à une solution de BSA (Bovine Serum Albumin) de la surface greffée C
p
(EG)
n
X et rinçage, à
l’intensité des mêmes pics mesurée sur une surface greffée par des molécules de décène et soumise au même
traitement (surface décylée). Ces surfaces décylées, très hydrophobes, sont très propices à l’adsorption non
spécifique des protéines.
Avec un rinçage basé sur du PBS (Phosphate Buffer Saline) et du SDS (Sodium Dodécyl Sulphate) les
surfaces C
5
(EG)
16
OMe ont une faculté d’adsorption de la BSA inférieure à 5% de celle des surfaces décylées.
Ces résultats ont été confirmés par fluorescence et étendus à d’autres protéines. Les expériences ont été
pratiquées sur des lames de verre où à été déposée par PECVD une couche de silicium amorphe exposée, après
greffage à des protéines marquées (BSA, Fibrinogène, Thrombine).
L’immobilisation sélective de protéines sondes pour la réalisation de puces à protéines nécessite
d’incorporer des points d’ancrage à la couche moléculaire greffée. On peut y parvenir en incorporant des
fonctions acides terminales sur lesquelles on peut ultérieurement ancrer les sondes par une réaction d’amidation.
Dans ce but, j’ai synthétisé des molécules C
p
(EG)
n
COOH à partir de précurseurs C
p
(EG)
n
OH par oxydation de
Jones. J’ai ensuite réalisé des surfaces mixtes C
p
(EG)
n
OMe/C
p
(EG)
n
COOH. Pour ancrer une sonde sur ces
couches, il suffit alors de pratiquer un couplage par activation et amidation avec un aptamère spécifique de la
sonde choisie. Des expériences sont actuellement en cours pour s’assurer que la sonde et l’aptamère se couplent
avec la spécificité voulue