Moyens d`étude de la réponse immunitaire locale après

ARTICLE DE REVUE
Progrès en Urologie (1993), 3, 745-751
Moyens d'étude de la réponse immunitaire locale
après traitement endovésical par BCG : Revue
Jean-Jacques PATARD, Claude ABBOU, Dominique CHOPIN
Service d'Urologie, Hôpital Henri Mondor, 94010 Créteil
nologiques simplement quantifiables liés à l’action
antitumorale du BCG qui pourraient avoir un intérêt potentiel dans la conduite du traitement (dosimétrie et marqueurs pronostiques). Ce travail tentera par ailleurs de situer le rôle de ces paramètres
dans les mécanismes d’action du BCG et dans le
cadre plus général du rejet des tumeurs.
RESUME
L’évaluation de la réponse immunitaire après
traitement prophylactique des tumeurs superficielles de vessie par BCG a plusieurs objectifs:
définir de nouveaux paramètres pronostiques et
mettre au point des outils de rationalisation du
traitement. Après l’étude initiale de la valeur
des infiltrats inflammatoires vésicaux et de la
conversion des tests cutanés, plusieurs auteurs
s’orientent maintenant vers des techniques plus
spécifiques: analyse immunohistochimique et
cytofluorométrique des s ous populations lymp h o c y t a i res activées local ement, dosage des
cytokines urinaires.
MOYENS D'ETUDE
1. Tests cutanés, histologie (infiltrats vésicaux)
La première évaluation de la réponse immunitaire
au BCG intra-vés ical a porté sur la conversion
positive de tests cutanés et l’apparition d’infiltrats
inflammatoires vésicaux témoignant d’une activation du sys tème immunitaire locale et générale.
Les auteurs ont alors voulu faire de ces tests des
marqueurs pronostiques. Ainsi LA M M en 1982,
notait que 6% des patients qui avaient une conversion de leurs tests cutanés récidivaient comparés à
38% pour ceux dont les tests restaient négatifs
(p=0,022) [20]. KELLEY en 1986, notait que 77%
des patients qui avaient une conversion cutanée
étaient sans tumeur contre 34% de ceux dont les
tests restaient négatifs. De même il montrait que
77% des patients qui avaient des infiltrats vésicaux
étaient sans t umeur contre 32% pour ceux qui
n’avaient p a s d'infiltrat inflammatoire [18]. Ces
résul tats soulignaient le lien qui existe entre la
réponse i mmunitaire et la réponse antitumorale
mais ne sont pas apparus suffisamment spécifiques
pour servir de marqueurs pronostiques. TORRENCE
en 1988, montrait qu’avec un recul plus important
la réponse granulomateuse locale perdait sa signifi-
Cet article fait une revue de ces différentes techniques, discute la signification de leurs résultats
et leurs intérêts potentiels dans la conduite du
traitement et la compréhension des mécanismes
d’action du BCG.
Mots clés : cancer de v essie, immunothérapie, BC G,
cytokines urinaires.
Progrès en Urologie (1993), 3, 745-751
INTRODUCTION
L’évaluation de la réponse immunitaire après traitement endo-vésical par BCG a tout d’abord porté
sur l’étude de la valeur pronostique des infiltrats
inflammatoires vésicaux et de la conversion des
tests cutanés. De nouvelles approches tendent à
développer des méthodes plus fines d’analyse de la
répons e immunitaire locale: immunohistochimie,
dosage des cytokines urinaires, cytométrie de flux.
Le but de ce travail est de passer en revue ces nouveaux outils et d’identifier des paramètres immu-
Manuscrit reçu le 10 janvier 1993
Ad res se p o ur co rres p on dan ce : Dr. J . J . Patard , Serv ice
d'Urologie, Hôpital Henri Mondor, 94010 Créteil.
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Tableau 1. Etude immunohistochimique de la réponse au BCG. Données de la littérature.
Auteurs
El Demiry
Prescott
Bohle
Leong
Patients
7 CIS
9 Ta, T1, CIS
6 Ta, T1
19 Ta, T1, CIS
Urothélium
normal : Ts > TH
avant traitement
TH > TS
après traitement
TH/TS x 4
Urothélium
normal
TH/TS = 0,68
après traitement
TH/TS = 3,13
Avant traitement
TH/TS = 1/2
après traitement
TH/TS = 2/1
Après
traitement
TH/TS = 2/1
Infiltrats sous
muqueux
Infiltrats sous
Muqueux
Infiltrats sous
muqueux
Infiltrats
muqueux
Urothélium
normal: (-)
avant traitement
9%
après traitement
28,2%
+ dans les
infiltrats
Urothélium
normal : (-)
avant traitement
(+)
après traitement
(++)
pic 6-12 S
persiste
à 3 mois
TH/TS
CD4/CD8
Macrophages
Lymphocytes B
IL2 R
HLDR
Urothélium
normal: (-)
lymphocytes
et cellules
urothéliales
(++)
cation statistique et que la signification statistique
des test cutanés était trop peu nette pour faire de ce
critère un marqueur pronostique [35].
2. Immunohistochimie
Deux études ont été consacrées à la répartition des
lym phocyt es dans la ves sie normale [13, 15].
Ceux-ci se trouvent en pl us grand nom bre au
contact de la membrane basale versant chorion et
sont essentiellement des lymphocytes de phénotype CD8. On trouve également quelques macrophages et quelques cel lul es NK mais en peti t
nombre. Les cellules urothéliales n’expriment que
des antigènes de classe I du CMH et pas les antigènes de classe II. Plusieurs études se sont attachées à définir la réponse immunitaire après instillations endovésicales. Des biopsies vésicales, avant
et après traitement, avec marquage immunohistochi mique afi n d’étudie r l es sous-popul ations
immunocompétentes, ont été réalisées. Des anticorps monoclonaux spécifiques de chacune des
sous populations ont été utilisés: anti MHC de
8/18
classe I, anti MHC de classe II, anti CD4, anti CD8
(lymphocytes T), anti CD25 (récepteur à l’IL2),
anti CD22 (lymphocytes B), anti CD 68 (macrophages), anti CD 57, anti CD 16 (NK). Il a été
montré une inversion de la répartition de ces cellules avec prédominance de lymphocytes T auxilliaires sur les cellules T suppresseurs dans la sous
muqueuse (CD 4 > CD 8), la présence de cellules
B, de macrophages et de cellules NK en plus petit
nombre. Les cellules T exprimaient le récepteur à
l’IL2 qui persiste à distance du traitement. Les cellules immunitaires et urothéliales exprimaient des
antigènes de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité [3, 14, 22, 28, 29]. Ces données sont
résumées dans le Tableau 1.
BÖHLE récemment a montré que cette activation locale des cellules immunocompétentes pouvait persister
à long terme. Par une technique d’immunohistochimie avec amplificatio n (APAAP) sur du matériel
biopsique il a montré que 4 patients sur 8 traités par
BCG avaient encore une réactivité contre l’ILl, le
TNF, L’IL2 deux ans après le traitement [5].
746
Tableau 2. Cytokines après BCG : données de la littérature.
Auteurs
Ratliff
Cytokine
IL2
Patients
Ta, T1, CIS
18 patients
Dosage
HT2 (IL2
dépendante)
Cinétique
- Négatif avant
traitement
- apparaît
3ème semaine
- Pic 4-8h
- rarement
après 24 h
Böhle
Prescott
Dejong
Thalman
IF gamma
IL2
IL8
Ta, T1, CIS
10 patients
laser YAG
CIS
6 BCG
7 MMC
Ta, T1
11 patients
Ta, T1, CIS
Culture de
fibroblastes
ELISA
RIA
CTLL 16
ELISA
- Après 3ème
semaine
- Pic 2-6h
6/13 MMC:
taux faible
- Après 3ème
semaine
- Pic 2-6h
- jamais après
24 h
Pic dans les 24h
après BCG et
RTU avec
différence
significative entre
les deux groupes
IL1, IL2, TNF
IL1 : pic 4-8h
IL2 : pic 2-8h
TNF : pic 2-4h
3. Cytométrie de flux (CMF)
féron gamma, et du TNF [24, 25]. Dans l’infection
urinaire à E. Coli, le taux d’IL6 urinaire a pu être
corrélé au nombre de bactéries [17]. Dans les
néphropathies à IgA, le taux d’IL6 urinaire évolue
paral lèl ement aux pouss ées de la mal adi e et
s’annule sous traitement [12]. De même, dans les
greffes rénales, le taux de cytokines urinaires IL2,
IL6 a une valeur pronost ique pui squ’il s’élève
après l’intervention pour se normaliser en deux à
trois semaines, le rejet étant précédé d’une réascension de ces taux [8, 32, 38].
Certains auteurs utilisant la cytométrie de flux se
sont attachés à étudier dans les urines le profil cellulaire (9) après BCG-thérapie. Ils ont mis en évidence une forte augmentation du nombre des cellules du culot urinaire. Ces cellules étaient: des
granulocytes, des monocytes, des macrophages,
des cellules NK et, en plus petit nombre, des lymphocytes. Les lymphocytes ont pu être étudiés
grâce à un panel d’anticorps [10], il s’agis sait
essentiellement de lymphocytes T auxillaires prédom inant sur les lymphocytes T s uppres seurs,
exprimant le récepteur à l’interleukine 2 et les antigènes du CM H de classe II, donc sensibil isés.
Cette répartition des sous-populations lymphocytaires après BCG endovésical confirmait les données des biopsies après traitement.
Dans les tumeurs superficielles de vessie la cinétique des cytokines urinaires après instillations de
BCG endovésical a été bien étudiée. Les cytokines
mises en évidence ont été ILl, IL2,TNF, IFNγ, IL6,
IL8 [4, 11, 30, 31].
Le Tableau 2 résume ces études. Les méthodes de
dosage ont été le plus s ouvent des tests biologiques, des techniques RIA ou ELISA. Les cinétiques retrouvées ont été comparables: I’ILl et
l’IL6 avaient une élévation précoce dès les premières insti ll ations, I’IL2, I’IFNγ et l e TNF
n’étaient retrouvées qu’à partir de la troisième instillation. Le pic était en général observé à la 6ème
heure. L’IL8 a été mise en évidence dans les urines
des patients traités par résection seule ou par BCG
avec néanmoins des taux significativement plus
élevés dans le groupe BCG [34].
4. Dosage des cytokines (Bioassay, RIA, ELISA)
La réponse immunitaire met en jeu des cellules qui
interagissent et communiquent entre elles grâce à
des facteurs solubles appelés cytokines.
Des cytokines ont été mises en évidence dans les
urines dans certaines circonstances normales et
pathologiques. Un inhibiteur du récepteur à l’interleukine 1 est détectable dans les urines normales
[19], de même que des récepteurs solubles de
l’interleukine 2 [23], de l’interleukine 6, de l’inter-
747
DISCUSSION
La présence de récepteurs solubles aux cytokines
dans l es ur i nes s em bl e cor re s pondre à un
phénomène général de régulation immunitaire dans
les fluides. On a attribué à ces récepteurs des rôles
d’inhibiteurs, de transporteurs ou encore de ligants
[25]. Leur présence n’a pas été explorée durant le
traitement endovésical par BCG.
Les cytokines peuvent maintenant être dosées dans
les urines par des techniques simples et reproductibles. En effet les techniques ELISA (immunoenzymatiques) sont plus simples à mettre en oeuvre
que les tests biologiques initialement utilisés (cultures cellulaires cytokines dépendantes) ou encore
RIA (radioimmunologiques) plus contraignantes
car nécessitant l’utilisation de produits radioactifs.
Différents kits ELISA commercialisés permettent
donc une approche quantitative simple des différentes cytokines libérées dans les urines par les cellules immunitaires activées. Les techniques immunohistochimiques pratiquées sur du matériel biopsique après trai tement fourniss ent une analys e
semi-quantitative des différents évènements immunitaires importants à considérer (CD4 / CD8, CMH
CLII). L’analyse en cytométrie de flux de ces tissus
ou encore du culot urinaire pourrait permet tre
d’évaluer ces critères sur le plan de la dosimétrie et
de la réponse au traitement.
Parmi les différentes cytokines qui ont été mises en
évidence dans les urines après BCG, toutes ne semblent pas avoir la m ême signification. L’ILl, l e
TNFα, I’IL6, I’IL8, s ont libérés par les macrophages dans un certain nombre de circonstances
non spécifiques: maladies inflammatoires, infection urinaire, intervention chirurgicale. La présence
d’IL2, de TNFβ, d’IFNγ en revanche traduit l’activation lymphocytaire. Ces cytokines pourraient être
au centre de l’activité antitumorale du BCG par
leur cytotoxicité directe mais aussi par leur capacité
à s timuler certai nes populati ons cytotoxiques .
L’interféron gamma à cet égard est un bon exemple
puisque cette cytokine a des capacités d’immunomodulation et des propriétés cytotoxiques. En effet
l’IFNγ entraîne une surexpression des antigènes
associés aux tumeurs dans certains modèles tumoraux [26, 36] et module l’expression des antigènes
de classe II [2, 16]. Cette expression des antigènes
de classe II du CMH signifie pour les cellules urothéliales la capacité acquise par immunostimulation
748
de présenter un antigène aux cellules effectrices.
L’ I F Nγ a, de plus, des capacit és cytotoxi ques
directes comme cela a été montré sur des lignées
tumorales vésicales [16] et indirectes par activation
synergique avec d’autres cytokines de populations
cytotoxiques (macrophages, LAK, NK, CTL) [37].
La prédominance des cellules de phénotype CD4
(lymphocytes T auxiliaires) au sein des infiltrats
inflammatoires vésicaux coïncide avec des travaux
expérimentaux récents [21] qui ont montré que la
cellule urothéliale tumorale était capable de présenter par l’intermédiaire des antigènes de classe II du
CMH les antigènes du BCG à des lymphocytes de
phénotype CD4. Ces lymphocytes auxilliaires en
réponse libéraient un certain nombre de cytokines
dont l’IL2 et l’IFNγ, activant d’autres populations
cytotoxiques et pourraient en eux même avoir des
propriétés cytotoxiques.
Ces différents éléments s’intègrent bien dans les
connaissances actuelles des phénomènes de présentation antigénique et de rejet des tumeurs. En effet,
on sait que le récepteur T reconnait un complexe
constitué par un petit fragment peptidique antigénique et une st ructure codée par le com plexe
majeur d’histocompatibilité (CMH) [39]. Le CMH
code pour deux types de molécules membranaires:
les molécules de classe I qui sont exprimées sur
toutes les cellules de l’organisme et les molécules
de classe II qui ne sont exprimées que sur les cellules class iquement présent atrices d’ant igènes
(APC). Les antigènes des peptides exogènes sont
habi tuellement présentés aux cellules T par les
macrophages et les autres cellules présentatrices
(macrophages, lymphocytes B, lymphocytes T activés) en association avec les molécules de classe II.
La présentation de ces peptides nécessite une endocytose de la protéine et une dégradation endosomale en courts peptides [l]. Ces peptides se lient aux
molécules de classe II et le complexe est présenté à
la surface cellulaire [7]. Ces complexes CMH-peptide sont reconnus par les lymphocytes CD4 [33].
Les peptides endogènes sont habituellement présentés en association avec les molécules de classe I
du CM H. Les lymphocytes T qui reconnaiss ent
l’association peptide endogène molécules de classe
I sont de phénotype CD8 [27].
L’imm unothérapie par B CG s e prés ent e donc
comme un modèle d’immunothérapie non spécifique: un antigène bactérien après dégradation est
présenté par des cellules spécialisées ou encore par
les cellules urot héliales par l’i ntermédiaire des
molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de class e II aux lymphocytes T auxili aires
(CD4). Ces lymphocytes CD4 activent les autres
populations cytotoxiques notamment par la libération de cytokines. En revanche certains des peptides présentés par les molécules de CMH ont été
identifiés comme antigènes de rejet des tumeurs
(TRA). L’identification de ces antigènes de rejet
des tumeurs a été réalisée en particulier dans le
mélanome humain (antigène Mage) et permet
d’envisager une immunothérapie cette fois spécifique: vaccination, génération de clones de lymphocytes T cytolytiques spécifiques par immunosélection [6].
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CONCLUSIONS, PERSPECTIVES
On peut donc maintenant disposer d’outils quantitatifs permettant d’évaluer la réponse immunitaire
locale après BCG endovésical. La cytométrie de
flux sur des urines ou encore sur des prélèvements
tissulaires vésicaux pourrait quantifier les différentes populations immunitaires mises en jeu: le
rapport CD4/ CD8, l’expression des antigènes de
classe II du CMH, notamment au vu de la littérature semblent intéressants à mesurer. Le dosage des
cytokines spécifiques dont le rôle semble important dans l’activit é antit umorale du BCG: IL2,
TNF, IFNγ, peut être réalisé par technique ELISA.
Ce dosage pourrait fournir un moyen simple de
suivi et de rationalisation du traitement : adaptation
des doses et de la durée du traitement en fonction
du profil de réponse de chaque malade. Ces critères enfin devraient être évalués comme marqueurs pronostiques.
L’utilisation du BCG comme agent antitumoral sur
un modèle de tumeurs immunogéniques telles que les
tumeurs de vessie est une bonne approche des phénomènes d’immunité antitu morale. L’identification
d’antigènes de rejet des tumeurs dans les tumeurs
urot héliales devrait permettre de développer des
méthodologies d’immunothérapie spécifique.
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vitro T cell media- ted cytotoxicity in Iymphocytic choriomeningitis with in a s yng en ic or s emiallo genic s ys tem.
Nature, 1974, 248, 701-702.
REMERCIEMENTS
Travail réalisé grâce à l’Association Claude B ernard et
l’Université Paris XII.
Manuscrit dactylographié par C. Petit.
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SUMMARY
A review of techniques used to study the local immune response following intravesical BCG instillation.
Initial reports focused on purifled protein derivative skin
test reactivity and granuloma formation in patients trea te d with intravesical bacillus Calmette- Guérin. Then
some investigators using immunohisto-chemical methods
showed that some lymphocyte phenotypes where predo minant in such infiltrates and that HL A DR antigens
w h e re strongly e xpresse d follow ing BC G the rapy.
Similar results where obtained in urine using flow cyto metric analysis. Additionaly some cytokines where found
at signifiant levels in urine afte r BCG instillations. In
this paper we reviewed these studies, we discussed the
me aning of these re sults and the potential v alue for
treatment monitoring.
Key words : vesical cancer, immunotherapy, BCG, uri nary cytokines.
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ZUSAMMENFASSUNG
Untersuchungstechnik en zur Bestimmung der lokale n Imm un an t wor t n ac h in t r ave si ka le r B CG Behandlung : eine Übersicht.
Die Erfassung der Immunantwort nach prophylaktischer
Behandlung des oberflächlichen Blasenkarzinoms durch
BCG hat als Ziel, neue prognostische Parameter und die
Entw ick lung v on Ra tionali sier ungste c hnik en zur
Therapie zu definieren. Nach der initialen Untersuchung
bezüglich der Bedeutung entzündlicher Infiltrate in der
Blase und der Konversion von Hauttests orientieren sich
jetzt me hre re Autore n in Richtung sppe zifische re r
Techniken, nämlich der immunhistochemischen Abalyse,
de r F lo w z y to m e tr i e v o n l o k al a k ti v i e r t e n
Lymphozytensubpopulationen und der Bestimmung von
Zytokininen im Urin. Diese Arbeit besc hre ibt die ver sc hie denen Techniken, diskutie rt die Bedeutung der
E rgebn isse und ihr p oten tiel les In tere sse für die
Be han dl ung sst rat eg ie u nd das Ver stä ndn is de r
Wirkungsweise des BCG.
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RESUMEN
Medios de estudio de la respuesta immunitaria local
despu ès de tr at amien to en dove sic al con e l BCG :
revista.
Varios son los objetivos de la evaluacion de la respuesta
immunitaria despuès de un tratamiento profilàctico de
los tumores superficiales de la vejiga con el BCG : defi nir nuevos paràmetros pronosticos y poner a punto her ramientas de racionalizacion del tratamiento. Despuès
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del estudio inicial del valor de los infiltrados inflamato rios vesicales y de la conversion de los tests cutaneos,
varios autores se orientan en la actualidad hacia técni cas màs espe cificas : anàlisis immunohistoquimico y
citofluorimè trico de las subpoblaciones linfocitarias
localmente activadas, dosificacion de las citoquinas uri narias.
El presnete articulo pasa en revista estas diferentes tèc nicas, disc ute el significado de sus re sultados y sus
intereses potenciales para la conduccion del tratamiento
y la comprension de los mecanismos de accion del BCG.
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RIASSUNTO
Me zzi d i studio d ella risposta immu nitaria locale
dopo trattamento endovescicale con BCG : rivista.
La valutazione della risposta immunitaria dopo tratta mento profilattico dei tumori superficiali della vescica
con BCG ha div ersi scopi : definire nuov i parametri
pronostici e mettere a punto dei mezzi di razionalizzazio ne del trattamento. Dopo lo studio iniziale del v alore
degli infiltrati infiammatori vescicali e della conversio ne dei tests cutanei, i diversi autori si rientano attual mente verso delle tecniche più specifiche : analisi immu noistochimica e citofluorometrica delle sotto-popolazio ni linfocitarie attivate localme nte, dosaggio delle cito chine urinarie.
Quest'articolo passa in rivista queste differenti tecniche,
discute il significato dei loro risultati e il loro interesse
potenziale nella direzione del trattamento e la compren sione dei meccanismi d'azione del BCG.
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