Determinations regionales dans Faire cardiaque pr

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15. 2, pp. 153-167, April 1966
With 1 plate
Printed in Great Britain
\ 53
Determinations regionales dans Faire cardiaque
pr^somptive mises en Evidence chez Fembryon de
poulet par la m&hode micro6lectrophysiologique
Par GEORGES LE DOUARIN, 1 GENEVlfiVE OBRECHT2
ET EDOUARD CORABCEUF2
Institut d'Embryologie experimentale du C.N.R.S.
(Directeur: Professeur Etienne Wolff) et
Laboratoire de Physiologie comparee de la Faculte des Sciences d'Orsay
(Directeur: Professeur Edouard Coraboeuf)
La repartition des potentialites cardiogenetiques dans le blastoderme d'oiseau
aux stades precoces du developpement a ete etudiee par de nombreux auteurs.
Au stade du blastoderme non incube les parties peripheriques, mais non les
parties centrales, peuvent fournir en culture in vitro du tissu cardiaque spontanement pulsatile (Olivo, 1928). Les cellules cardiaques presomptives sont plus
abondantes dans la region posterieure que dans les regions laterales et anterieure
du blastoderme (Butler, 1935). Pendant les premieres heures de l'incubation
l'aptitude a former du cceur est encore tres largement repandue dans le blastoderme mais tend a se concentrer dans la region posterieure (Spratt, 1942). Les
potentialites cardiogenetiques se localisent ensuite de part et d'autre de la ligne
primitive definitive (Rudnick, 1938; Hunt, 1932). Au stade du prolongement
cephalique, les limites du territoire cardiaque presomptif ont ete precisees par
Rawles (1936, 1943). Les deux aires cardiaques occupent alors une situation
bilaterale de part et d'autre du prolongement cephalique et du tiers ant£rieur
de la ligne primitive.
Rawles a egalement observe que l'aptitude au developpement et a la differenciation cardiaque de fragments de blastoderme en greffe chorio-allantoidienne
augmente avec l'etendue du fragment greffe. La differenciation cardiaque est
d'ailleurs histologiquement uniforme et independante de la partie de l'aire
cardiaque prelevee: elle aboutit a la formation d'un tissu myocardique compact,
sans aucune trace des cavites cardiaques.
De Haan (1963) a egalement fractionne les aires cardiaques d'embryons de
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie experimentale du C.N.R.S., 49 bis, Avenue de
la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, Seine, France.
2
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Physiologie comparee, Faculte des Sciences, Orsay,
France.
154
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
poulet de stades 4 a 8 (Hamburger & Hamilton, 1951). Les fragments de blastodermes ont ensuite ete cultives in vitro pendant 48 heures. Les resultats obtenus
par cet auteur indiquent que l'aptitude a former des vesicules pulsatiles in vitro
est d'autant plus precoce que l'explant provient d'une region situee plus en
arriere dans l'aire cardiaque. De plus le tissu cardiaque forme par les fragments
posterieurs pulse a un rythme plus rapide que celui qui se differencie dans les
fragments moyens. Quant aux fragments anterieurs, ils produisent du, tissu
cardiaque battant a un rythme tres lent.
Ainsi, il semble que des un stade precoce l'aire cardiaque n'est pas homogene
en ce qui concerne ses potentialites histogenetiques. Cependant, les criteres
morphologiques de la differentiation du cceur en ses chambres sino-atriale,
ventriculaire et bulbaire ne sont pas applicables aux vesicules pulsatiles formees
en culture. Ces criteres ne peuvent done pas etre utilises pour analyser la
regionalisation de l'aire cardiaque presomptive.
Dans un travail anterieur (Le Douarin, Obrecht & Corabceuf, 1964) nous
avons etabli par la methode des microelectrodes transmembranaires que chaque
region du cceur de l'embryon de 3 ou 4 jours presente une activite electrique
cellulaire caracteristique que Ton peut enregistrer pendant plusieurs jours dans
les conditions de la culture organotypique de Wolff & Haffen (1952).
II nous a done paru possible d'utiliser les criteres electrophysiologiques pour
la mise en evidence des categories cellulaires presentes dans le tissu myocardique
forme par differents fragments de l'aire cardiaque presomptive. Des resultats
preliminaries ont fait l'objet d'une note recente (Le Douarin, Obrecht & Corabceuf, 1965). Deux questions connexes ont ete abordees. La premiere consistait
a savoir si les futures cellules sino-atriales, ventriculaires et bulbaires subissent
une segregation dans l'aire cardiaque presomptive des un stade precoce, et la
seconde a savoir si des processus de regulation interviennent lorsqu'une partie
de l'aire cardiaque est experimentalement isolee.
MATERIEL ET METHODES
Les experiences ont ete effectuees sur l'embryon de poulet. Le procede
experimental consiste a fragmenter l'aire cardiaque et a cultiver isolement in
vitro les portions de blastoderme obtenues. Puis, lorsque ces dernieres ont differencie du tissu myocardique spontanement pulsatile, on pratique l'analyse
electrophysiologique en enregistrant les potentiels d'action. Les blastodermes
ont ete preleves a des stades variant du prolongement cephalique a 5 somites.
Trois stades ont ete particulierement retenus: celui du repli cephalique transverse
(head fold), celui de 3 somites et celui de 4-5 somites.
Dans une premiere serie experimentale chaque moitie laterale de l'aire
cardiaque a ete cultivee en entier. Dans les series suivantes le territoire cardiogenique a ete decoupe en 6 fragments dont les limites sont celles qui ont ete
utilisees par De Haan (1963). La figure 1 schematise la fragmentation realisee
Determinations dans Vaire cardiaque
155
au stade du repli cephalique transverse. L'aire cardiaque est ainsi divisee selon
des niveaux respectivement anterieur, moyen et posterieur, et pour chaque
niveau nous avons explante separement les fragments droit et gauche. Ce procede empeche la differentiation de structures axiales dans les explants.
Les explants sont cultives selon la methode de Wolff & Haffen (1952) sur le
milieu standard de ces auteurs. La duree de culture varie de 3 a 8 jours.
A.d.
M.d.
P.d.
Fig. 1. Schema de la fragmentation du blastoderme de poulet au stade du repli
cephalique transverse, definissant six types d'explants qui sont ensuite cultives
separement. A.d., A.g.: Fragments anterieurs droit et gauche. M.d., M.g.: Fragments
moyens droit et gauche. P.d., P.g.: Fragments posterieurs droit et gauche.
L'activite electrique transmembranaire est enregistree par la methode des
microelectrodes fixes de Corabceuf & Weidmann (1949). La petite taille des
cellules du myocarde embryonnaire rend necessaire l'utilisation de microelectrodes dont le diametre de pointe est inferieur au demi-micron. Pendant
les enregistrements les preparations sont maintenues a 38 °C. L'installation,
schematised sur la figure 2, comprend une cuve thermostatee qui maintient a
la temperature de 38 °C une chambre humide dans laquelle circule un courant
d'oxygene. La preparation est placee dans cette chambre. Le circuit d'enregistrement se compose d'une electrode d'argent chlorure introduite dans le milieu
de culture (electrode 'indifferente') et d'une microelectrode (15 a 20 MO) fixee
au bras d'un micromanipulateur. Le phenomene est enregistre sur un oscillographe par l'intermediaire d'un changeur d'impedance. Un second micromanipulateur permet d'amener au contact de la preparation deux electrodes de
stimulation en argent. La preparation est stimulee par des chocs rectangulaires
d'une duree de 5 a 10 ms.
Les recipients de culture sont obtures par un couvercle perce d'un orifice
central permettant le passage des electrodes dont le deplacement est suivi a la
loupe binoculaire.
Enfin, nous avons observe dans quelques cas le degre de differenciation atteint
par le tissu myocardique pulsatile forme en culture. L'ultrastructure des explants
a ete examinee au microscope electronique.
156
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABOEUF
RESULTATS
I. La differenciation in vitro defragments de Vaire cardiaque
(a) Aspect morphologique
Lorsque les fragments de blastoderme dont les limites sont representees sur
la figure 1 sont explantes sur le milieu de culture, du tissu myocardique
spontanement pulsatile s'y differencie dans un certain nombre de cas. D'une
facon generate les explants arrondissent leurs contours dans les heures qui
suivent l'explantation. La differenciation du mesoderme de l'aire cardiaque en
myocarde spontanement pulsatile requiert le plus souvent 24 a 48 heures. Cette
differenciation donne naissance soit a une plage de tissu musculaire compact,
soit, plus frequemment, a une petite vesicule dans laquelle quelques couches
cellulaires entourent la cavite centrale. La croissance ulterieure est tres faible
ou nulle et aucune differenciation morphologique ne permet de reconnaitre les
vesicules pulsatiles formees par les differents fragments de l'aire cardiaque.
Fig. 2. Schema de Installation utilisee. L'explant (Ex.) est place dans une
enceinte thermostatee reglee a 38 °C. Un barbotage d'oxygene (O2) dans de l'eau
permet d'humidifier et d'oxygener l'atmosphere entourant la preparation. On enregistre sur un oscilloscope l'activite electrique transmembranaire recueillie par
une microelectrode (jiE.). E.L: Electrode indifferente. E.s.: Electrodes d'argent permettant l'entrainement electrique de la preparation par un stimulateur.
(b) Aspect cytologique ultrastructural
L'ultrastructure du mesoderme de l'aire cardiaque au stade du prolongement
cephalique a ete decrite par l'un de nous (Le Douarin, 1965). A ce stade du
developpement on observe dans les cellules du mesenchyme precardiaque des
myofilaments de 50 A de diametre, generalement disperses irregulierement dans
le cytoplasme. Ces myofilaments deviennent plus abondants et s'organisent
progressivement au cours du developpement.
J. Embryo!. exp. Morph., Vol. 15, Part 2
PLANCHE 1
Ultrastructure du tissu myocardique qui s'est differencie en 3 jours de culture. Les myofibrilles
se sont constituees normalement et presentent des lignes Z et des bandes I et A. (Fixation au
liquide de Palade, inclusion dans I'epon, coloration par I'acetate d'uranyle. G: x 12.000.)
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
facing p. 157
Determinations dans Vaire cardiaque
157
En culture in vitro cette cytodifferenciation se produit et aboutit a la constitution de myofibrilles striees parfaitement normales (Planche 1). Un point
important de la differentiation concerne les relations entre myoblastes voisins.
Les liaisons cellulaires s'etablissent non seulement par des desmosomes d'aspect
banal, mais egalement par des ebauches de disques intercalaires au niveau
desquels une myofibrille traverse les membranes cellulaires. Chaque vesicule
pulsatile differenciee en culture se comporte done comme une unite fonctionnelle
dont il est possible de pratiquer l'analyse electrophysiologique comme nous
l'avons fait dans un travail anterieur pour l'ebauche cardiaque explantee in
vitro a un stade ou elle est deja bien differenciee.
(c) Rythme des pulsations
En ce qui concerne le pourcentage d'explants de chaque categorie formant
in vitro du tissu cardiaque spontanement pulsatile, les cultures provenant
d'embryons de stade repli cephalique fournissent les resultats les moins bons.
Nous n'avons pas observe de differences significatives entre les explants provenant d'embryons de stade 4-5 somites. Le tableau 1 indique les resultats
obtenus.
Tableau 1. Formation de vesicules pulsatiles par des fragments de
Vaire cardiaque preleves a differents stades du developpement
Fragments
Stade de l'embryon
Repli cephalique (22 cas)
3 somites (14 cas)
4-5 somites (23 cas)
Anterieurs
Moyens
Posterieurs
8
9
14
10
14
12
8
7
11
Nous n'avons pas constate de variations importantes du rythme des pulsations
spontanees, compte a 38 °C au 2eme ou au 3eme jour de culture, selon l'age
de l'embryon donneur. Nous retrouvons par contre la difference deja observee
par De Haan (1963) entre les explants provenant des differents niveaux de l'aire
precardiaque. Les valeurs moyennes que nous avons obtenues dans une serie
experimentale portant sur 46 explants de chaque categorie sont les suivantes:
fragments anterieurs, 40 pulsations par minute; fragments moyens, 61 pulsations
par minute; fragments posterieurs, 82 pulsations par minute.
II. Activite electrique transmembranaire
Nous avons utilise pour comparer les activites electriques enregistrees dans
les vesicules pulsatiles les caracteristiques des potentiels d'action des differentes
regions du coeur, que nous avons etablies dans un travail anterieur. La figure 3
montre des traces correspondant a 1'atrium, au ventricule et au bulbe arteriel,
enregistres dans le cas d'un coeur de 3 jours d'incubation explante en culture organotypique. Dans 1'atrium les potientiels d'action sont de duree
158
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
breve et, lorsque la microelectrode est placee dans la region voisine du sinus,
ils presentent une phase de depolarisation lente diastolique. Les potentiels ventriculaires, de plus longue duree, sont caracterises par une repolarisation comprenant deux phases dont la premiere constitue un plateau. Dans le cas des
potentiels bulbaires la duree est encore plus grande et le plateau est accentue.
(c)
Fig. 3. Potentiels d'action caracteristiques des differentes regions du coeur de l'embryon de 3 jours, (a) atrium, pres du sinus; (6) autre region de Patrium; (c) ventricule;
(rf)bulbe arteriel. Calibration: verticalement, 50 mV; horizontalement, 400 ms.
Fig. 4. Potentiels d'action enregistres au 5eme jour de culture a differents niveaux
de la vesicule pulsatile formee in vitro par l'aire cardiaque explantee au stade de
3 somites. A: trace de type atrial. Duree: 110 ms. B: trace de type ventriculaire.
Duree: 250 ms. C: trace de type bulbaire. Duree: 460 ms. Calibration: verticalement,
50 mV; horizontalement, 250 ms.
(a) Enregistrement de Vactivite electrique du myocarde differencie in vitro
Nous avons tout d'abord observe que, lorsque la moitie laterale de l'aire
cardiaque presomptive est explantee en entier au stade du repli cephalique
transverse ou a des stades plus avances, les trois categories cellulaires du myocarde (cellules atriales, ventriculaires et bulbaires) se differencient in vitro. En
effet, apres quelques jours de culture on enregistre les trois types de potentiels
d'action correspondant a ces categories cellulaires (figure 4).
Ainsi, bien que la vesicule pulsatile formee en culture n'evolue pas selon la
morphogenese cardiaque normale, les caracteristiques electrophysiologiques
Determinations dans Vaire cardiaque
159
montrent que tout le materiel precardiaque present dans l'explant s'est diflferencie
au cours de la culture.
Le probleme de la determination dans l'aire cardiaque des categories cellulaires
atriale, ventriculaire et bulbaire a ainsi pu etre aborde par la methode electrophysiologique. Nous avons fragmente l'aire cardiaque de jeunes embryons
comme l'indique la figure 1 et nous avons etudie l'activite electrique transmembranaire des vesicules pulsatiles obtenues apres 24 a 48 heures de culture.
R.C.T.
3 s.
5 s.
M
— ]
Fig. 5. Exemples de potentiels d'action enregistres dans les vesicules formees
par les divers fragments de l'aire precardiaque preleves sur des blastodermes de
differents stades. R.C.T.: stade du repli cephalique transverse. 3.s.: stade de 3 somites.
5s.: stade de 5 somites. A: fragments anterieurs. M: fragments moyens. P: fragments
posterieurs. Calibration: verticalement, 50 mV; horizontalement, 600 ms. L'un des
traces enregistres dans une vesicule formee par un fragment posterieur preleve chez
un embryon de 3^ est typiquement ventriculaire: dans ce cas, l'excision avait laisse
des cellules ventriculaires presomptives dans le fragment posterieur de l'aire
cardiaque.
La figure 5 donne quelques exemples de potentiels d'action enregistres dans
le tissu myocardique forme par les fragments anterieurs, moyens et posterieurs
de l'aire cardiaque d'embryons a differents stades: repli cephalique transverse,
3 somites et 5 somites. On ne constate pas de differences notables entre les
potentiels correspondant a une meme region de l'aire cardiaque d'embryons
160
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
d'ages varies. Par contre la morphologie des potentiels d'action varie avec la
partie de l'aire cardiaque ayant ete explantee. II en est de meme des durees
respectives de ces potentiels.
(b) Frequence des pulsations et duree du potentiel d'action
On sait que la duree du potentiel d'action diminue lorsque la frequence des
battements augmente. Selon Woodbury, Hecht & Christopherson (1951) la
duree du potentiel decroit comme la 0,8eme puissance du rythme. Or, comme
cela a ete indique precedemment, les vesicules pulsatiles ne se contractent pas
toutes au meme rythme. Sur la figure 6 nous avons porte la duree du potentiel
d'action en fonction du rythme dans le cas des trois categories d'explants:
fragments anterieurs, moyens et posterieurs de l'aire cardiaque presomptive.
800
700
600
J
x
-Xi
1
500
400
300
(,-.-.!
200
20
40
60
80
100
120
140
R
Fig. 6. Relation duree du potentiel d'action (D)—rythme des battements (R) dans
le cas de trois types de fragments. • , fragments anterieurs; x, fragments moyens;
O, fragments posterieurs. Le schema en haut et a droite indique la maniere dont a
«te determinee la duree (d) du potentiel d'action.
En se placant dans une gamme commune de frequence des pulsations (45 a 75
battements par minute) on s'apercoit que les valeurs obtenues definissent trois
populations cellulaires. Les durees des potentiels d'action des differents explants
peuvent etre comparees a celles qui ont ete obtenues pour les regions anatomiques du coeur de l'embryon de trois jours (Tableau 2).
On constate que les cellules myocardiques differenciees a partir des fragments
anterieurs de l'aire cardiaque fournissent les potentiels de plus longue duree,
Determinations dans Vaire cardiaque
161
ce qui est le cas du bulbe dans l'embryon de 3 jours. Les potentiels enregistres
dans les fragments moyens ont une duree qui rappelle celle des potentiels
ventriculaires. Quant aux vesicules des fragments posterieurs elles presentent
les potentiels les plus brefs comme on l'observe egalement dans l'activite
electrique de 1'atrium du coeur de 3 jours. Les valeurs moyennes des durees des
potentiels d'action sont nettement plus elevees dans le cas des vesicules pulsatiles
Tableau 2. Durees moyennes des potentiels d'action en ms
Fragment de blastoderme
Coeur de 3 jours
f Anterieur: 630
Fragment i Moyen:
387
[Posterieur: 246
432: Bulbe
I
316: Ventriculej- Region
124: Atrium j
differenciees en culture que dans celui du coeur de l'embryon de 3 jours. Les
cellules cardiaques qui se forment en culture a partir du mesenchyme precardiaque ont done une evolution physiologique ralentie, puisque Ton sait que la
duree du potentiel d'action d'une region donnee du coeur diminue au cours du
developpement.
(c) Morphologie des potentiels d'action
L'etude du decours des potentiels d'action a confirme que les trois categories
cellulaires caracterisees par la duree des potentiels correspondent bien a des
cellules respectivement atriales, ventriculaires et bulbaires. Pour eliminer l'influence de la frequence des pulsations sur le potentiel d'action, la comparaison
des enregistrements a ete faite en utilisant des vesicules pulsant a des rythmes
identiques ou tres voisins, soit spontanement, soit par suite d'un entrainement
electrique.
Fig. 7. Enregistrements des potentiels d'action de deux vesicules pulsatiles
provenant respectivement d'un fragment anterieur (trace superieur) et d'un fragment
moyen (trace inferieur). Le premier est de type bulbaire, avec un plateau accentue et
le second est ventriculaire. Calibration: verticalement, 50 mV; horizontalement,
200 ms.
1. Potentiels d'action des explants anterieurs et moyens. La figure 7 donne
des traces correspondant a renregistrement des potentiels d'action dans les
vesicules pulsatiles formees par un fragment anterieur et un fragment moyen.
II
J EEM
15
162
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
Ces vesicules pulsaient spontanement a des rythmes tres voisins d'environ 60
battements par minute. On observe que dans le cas du fragment anterieur le
potentiel d'action, dont la duree est de 530 ms, presente une phase initiale de
repolarisation constituant un plateau tres marque. La pente de ce plateau est
de 0,08 mV/ms. Le potentiel est done de type bulbaire. Le trace correspondant
au fragment moyen est nettement different du precedent: la duree est plus breve
(300 ms) et la premiere phase de repolarisation est plus rapide (0,23 mV/ms).
II s'agit d'un potentiel de type ventriculaire.
2. Potentiels faction des explants moyens et posterieurs. La figure 8 montre
les potentiels d'action enregistres au niveau du tissu myocardique forme par un
explant posterieur de l'aire cardiaque. Le rythme spontane des battements est
180 par minute. Dans cette experience nous avons entraine electriquement a ce
meme rythme une vesicule formee par un fragment moyen. On constate que
dans la vesicule du fragment moyen on retrouve un trace de type ventriculaire
avec un plateau. La duree du potentiel est 240 ms. Cette valeur est inferieure a
la duree moyenne des potentiels d'action ventriculaire obtenue lorsque le rythme
des battements est compris entre 45 et 75 par minute, ce qu'explique le rythme
rapide qui est ici impose a l'explant. Dans la vesicule du fragment posterieur le
trace ne presente pratiquement pas de phase lente initiale de repolarisation, ce
qui lui confere une allure triangulaire typiquement atriale.
Ainsi, les trois populations cellulaires que nous avons distinguees par la duree
des potentiels d'action correspondent bien aux categories cellulaires du myocarde: atrial, ventriculaire et bulbaire. La figure 9 illustre cette correspondance.
CONCLUSIONS
Des fragments de l'aire cardiaque preleves chez des embryons de poulet aux
stades s'echelonnant du repli cephalique transverse a 4-5 somites fournissent
du tissu myocardique spontanement pulsatile lorsqu'ils sont explantes en culture
organotypique selon la methode de Wolff & Haffen (1952). L'etude de l'ultrastructure des explants montre que les myofibrilles striees se differencient
normalement en culture in vitro et que des liaisons cellulaires de type disque
intercalaire unissent les myoblastes.
Deux conclusions decoulent de l'analyse electrophysiologique du tissu cardiaque forme in vitro par des fragments definis de l'aire cardiaque.
1. Tout d'abord, la determination regionale dans l'aire precardiaque des
futures cellules atriales, ventriculaires et bulbaires se traduit par l'acquisition
des caracteristiques electrophysiologiques particulieres a chaque region du
coeur lorsque des fragments de cette aire sont explantes isolement in vitro.
De Haan (1963) a observe que les vesicules pulsatiles differenciees in vitro
pulsent a des rythmes d'autant plus rapides que l'explant provient d'une region
situee plus en arriere dans l'aire precardiaque. Nos resultats confirment a cet
egard ceux de De Haan, mais notre etude electrophysiologique montre que
Determinations dans Vaire cardiaque
163
Fig. 8. Enregistrement des potentiels d'action de deux vesicules pulsatiles provenant respectivement d'un fragment moyen (trace superieur) et d'un fragment
posterieur (trace inferieur). Le premier est stimule electriquement (fleches) a un
rythme voisin de 180 battements/min. Le trace superieur est de type ventriculaire,
le trace inferieur est de type atrial. Calibration: verticalement, lOmV; horizontalement 100 ms.
M
Fig. 9. Potentiels d'action caracteristiques des trois niveaux de fragmentation
de l'aire cardiaque. A: fragment anterieur. M: fragment moyen. P: fragment
posterieur. Les trois potentiels d'action montrent une phase de depolarisation lente
diastolique caracteristique de l'automaticite. Sur cettefigure,les pentes de depolarisation diastolique ont ete prolongees par un trait interrompu. Calibration: verticalement, lOmV; horizontalement, 200 ms.
164
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
l'heterogeneite de l'aire precardiaque doit etre interpreted d'une facon qui
differe de l'hypothese proposee par cet auteur. En effet, pour celui-ci les differences de rythme des pulsations, realisant un gradient croissant dans le sens
antero-posterieur, pourraient etre interpreters comme le resultat d'une localisation particuliere des cellules aptes a regler la frequence des pulsations ('prepacemaker cells'). D'apres nos resultats il apparait que ce sont les futurs
myoblastes eux-memes qui sont determines dans l'aire precardiaque. Des un
stade precoce, car nous rtavons pas observe de difference entre les explants
correspondant au stade du repli cephalique transverse et aux stades ulterieurs,
la par tie anterieure de Vaire cardiaque contient les futures cellules bulbaires, la
partie moyenne les futures cellules ventriculaires et enfin, les futures cellules
atriales sont localisees dans la partie posterieure.
Les potentiels d'action enregistres dans les trois categories d'explants ne nous
ont pas permis de reconnaitre l'existence de cellules particulieres responsables
de Pautomatisme. Dans des travaux anterieurs (Le Douarin et al. 1964; Obrecht,
Le Douarin & Corabceuf, 1964; Corabceuf, Le Douarin & Obrecht, 1965) nous
avons enregistre l'activite electrique transmembranaire de fragments atriaux ou
ventriculaires preleves sur l'ebauche cardiaque d'embryons de 3 jours et cultives
isolement. Le centre d'automatisme qui apparait dans ces conditions se traduit
par l'existence d'une phase de depolarisation lente diastolique. Une telle phase
de depolarisation diastolique a ete tres generalement observee dans les traces
correspondant aux vesicules pulsatiles formees en culture par les trois types de
fragments de l'aire cardiaque. L'automatisme n'apparait done pas dans ces
conditions resulter de l'activite physiologique de cellules particulieres mais etre
une propriete commune a tous les myoblastes cardiaques a ce stade du developpement, qu'ils soient de nature atriale, ventriculaire ou bulbaire. Ceci est d'ailleurs
en accord avec les resultats de Fange, Persson & Thesleff(1957), qui montrent
que tous les myoblastes cardiaques de l'embryon de 4 a 8 jours d'incubation
isoles par la trypsine ont une activite electrique transmembranaire presentant
un prepotentiel caracteristique de l'automatisme.
2. Les resultats obtenus montrent que lorsqu'on isole en culture in vitro
une partie de l'aire cardiaque la differentiation du materiel mesodermique est
conforme a sa destinee normale. II est evident qu'il n'est pas possible de separer
exactement par un procede microchirurgical les regions atriale, ventriculaire
et bulbaire de l'aire cardiaque presomptive. C'est pourquoi dans certains cas
nous avons enregistre des traces de type ventriculaire dans des vesicules anterieures ou posterieures. Ces cas doivent etre interpretes comme resultant d'une
fragmentation imparfaite et non comme etant la manifestation d'une regulation.
D'ailleurs nous n'avons jamais obtenu de traces de type bulbaire dans les
vesicules posterieures ou de traces de type atrial dans les vesicules anterieures.
La determination regionale de l'aire cardiaque est done un phenomene tres
precoce. Stephan (1958) a montre que la regulation des septa cardiaques n'est
deja plus possible au stade de 8 somites. Nos resultats permettent d'ajouter que
Determinations dans Vaire cardiaque
165
des le stade du repli cephalique transverse les differentes regions du cceur sont
determinees et qu'il ne se produit pas de regulation lorsqu'une partie de l'aire
cardiaque est experimentalement isolee.
RESUME
Des fragments de l'aire cardiaque presomptive du blastoderme de poulet de
stades prolongement cephalique a 5 somites, ont ete explantes en culture in vitro
selon la methode de Wolff & Haffen. Nous avons etudie l'activite electrique
transmembranaire des vesicules pulsatiles formees par les explants.
1. Lorsqu'une aire cardiaque presomptive est prelevee en totalite et cultivee
in vitro, il se differencie dans l'explant les trois categories cellulaires du myocarde,
c'est-a-dire les cellules atriales, ventriculaires et bulbaires reconnaissables par
les caracteristiques de leurs potentiels d'action.
2. Lorsque les aires cardiaques sont divisees en trois categories de fragments:
anterieurs, moyens et posterieurs, les resultats obtenus different selon l'explant
considered La duree des potentiels d'action ainsi que leur decours permettent
de voir que la partie anterieure de l'aire cardiaque contient les futures cellules
bulbaires, la partie moyenne les futures cellules ventriculaires et la partie
posterieure les futures cellules atriales.
3. La phase de depolarisation lente diastolique observee pour les trois types
de fragments montre que l'automatisme ne resulte pas de l'activite de cellules
particulieres mais est une propriete commune a tous les myoblastes au stade du
developpement atteint en culture par les explants.
4. II resulte des faits observes que la determination regionale de l'aire
cardiaque est un phenomene tres precoce et que la fragmentation du territoire
cardiaque ne donne pas lieu a une regulation.
SUMMARY
Regional determination in the presumptive heart region of the
chick embryo as shown by microelectrophysiological methods
Different parts of presumptive cardiac area of the chick blastoderm (head
process to 5-somite stage) have been cultivated in vitro by the method of Wolff &
Haffen.
We have studied the transmembrane electric activity of the pulsating vesicles
formed by these explants.
1. When one presumptive cardiac area is cultivated in toto, the three kinds
of myocardial cells differentiate, i.e. atrial, ventricular and bulbar cells. These
different kinds of cells can be identified by the characteristics of their action
potentials.
2. When the cardiac areas are cut into three fragments (anterior, middle and
posterior) the results differ according to the kind of explant. The duration and
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G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUF
the morphology of the action potentials show that the anterior part of the cardiac
area contains the presumptive bulbar cells, while the middle part contains the
ventricular cells and the posterior part the atrial cells.
3. The diastolic depolarization ('prepotential') observed in the three kinds
of action potential shows that automatism is not restricted to particular cells
but is a general property of every cardiomyoblast, at least at the developmental
stage reached by the explants.
4. One can conclude that regional determination in the cardiac area occurs
at a very early stage of development. Furthermore, it appears that after fragmentation of the cardiac area there is no regulation.
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