Determinations regionales dans Faire cardiaque pr

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 15. 2, pp. 153-167, April 1966 \ 53
With 1 plate
Printed in Great Britain
Determinations regionales dans Faire cardiaque
pr^somptive mises en Evidence chez Fembryon de
poulet par la m&hode micro6lectrophysiologique
Par GEORGES LE DOUARIN,1 GENEVlfiVE OBRECHT2
ET EDOUARD CORABCEUF2
Institut d'Embryologie experimentale du C.N.R.S.
(Directeur: Professeur Etienne Wolff) et
Laboratoire de Physiologie comparee de la Faculte des Sciences d'Orsay
(Directeur: Professeur Edouard
Coraboeuf)
La repartition des potentialites cardiogenetiques dans le blastoderme d'oiseau
aux stades precoces du developpement a ete etudiee par de nombreux auteurs.
Au stade du blastoderme non incube les parties peripheriques, mais non les
parties centrales, peuvent fournir en culture in vitro du tissu cardiaque spon-
tanement pulsatile (Olivo, 1928). Les cellules cardiaques presomptives sont plus
abondantes dans la region posterieure que dans les regions laterales et anterieure
du blastoderme (Butler, 1935). Pendant les premieres heures de l'incubation
l'aptitude a former du cceur est encore tres largement repandue dans le blasto-
derme mais tend a se concentrer dans la region posterieure (Spratt, 1942). Les
potentialites cardiogenetiques se localisent ensuite de part et d'autre de la ligne
primitive definitive (Rudnick, 1938; Hunt, 1932). Au stade du prolongement
cephalique, les limites du territoire cardiaque presomptif ont ete precisees par
Rawles (1936, 1943). Les deux aires cardiaques occupent alors une situation
bilaterale de part et d'autre du prolongement cephalique et du tiers ant£rieur
de la ligne primitive.
Rawles a egalement observe que l'aptitude au developpement et a la differencia-
tion cardiaque de fragments de blastoderme en greffe chorio-allantoidienne
augmente avec l'etendue du fragment greffe. La differenciation cardiaque est
d'ailleurs histologiquement uniforme et independante de la partie de l'aire
cardiaque prelevee: elle aboutit a la formation d'un tissu myocardique compact,
sans aucune trace des cavites cardiaques.
De Haan (1963) a egalement fractionne les aires cardiaques d'embryons de
1
Adresse de Vauteur: Institut d'Embryologie experimentale du C.N.R.S., 49 bis, Avenue de
la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, Seine, France.
2
Adresse de Vauteur: Laboratoire de Physiologie comparee, Faculte des Sciences, Orsay,
France.

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poulet de stades 4 a 8 (Hamburger & Hamilton, 1951). Les fragments de blasto-
dermes ont ensuite ete cultives in vitro pendant 48 heures. Les resultats obtenus
par cet auteur indiquent que l'aptitude a former des vesicules pulsatiles in vitro
est d'autant plus precoce que l'explant provient d'une region situee plus en
arriere dans l'aire cardiaque. De plus le tissu cardiaque forme par les fragments
posterieurs pulse a un rythme plus rapide que celui qui se differencie dans les
fragments moyens. Quant aux fragments anterieurs, ils produisent du, tissu
cardiaque battant a un rythme tres lent.
Ainsi, il semble que des un stade precoce l'aire cardiaque n'est pas homogene
en ce qui concerne ses potentialites histogenetiques. Cependant, les criteres
morphologiques de la differentiation du cceur en ses chambres sino-atriale,
ventriculaire et bulbaire ne sont pas applicables aux vesicules pulsatiles formees
en culture. Ces criteres ne peuvent done pas etre utilises pour analyser la
regionalisation de l'aire cardiaque presomptive.
Dans un travail anterieur (Le Douarin, Obrecht & Corabceuf, 1964) nous
avons etabli par la methode des microelectrodes transmembranaires que chaque
region du cceur de l'embryon de 3 ou 4 jours presente une activite electrique
cellulaire caracteristique que Ton peut enregistrer pendant plusieurs jours dans
les conditions de la culture organotypique de Wolff & Haffen (1952).
II nous a done paru possible d'utiliser les criteres electrophysiologiques pour
la mise en evidence des categories cellulaires presentes dans le tissu myocardique
forme par differents fragments de l'aire cardiaque presomptive. Des resultats
preliminaries ont fait l'objet d'une note recente (Le Douarin, Obrecht & Cora-
bceuf, 1965). Deux questions connexes ont ete abordees. La premiere consistait
a savoir si les futures cellules sino-atriales, ventriculaires et bulbaires subissent
une segregation dans l'aire cardiaque presomptive des un stade precoce, et la
seconde a savoir si des processus de regulation interviennent lorsqu'une partie
de l'aire cardiaque est experimentalement isolee.
MATERIEL ET METHODES
Les experiences ont ete effectuees sur l'embryon de poulet. Le procede
experimental consiste a fragmenter l'aire cardiaque et a cultiver isolement in
vitro les portions de blastoderme obtenues. Puis, lorsque ces dernieres ont dif-
ferencie du tissu myocardique spontanement pulsatile, on pratique l'analyse
electrophysiologique en enregistrant les potentiels d'action. Les blastodermes
ont ete preleves a des stades variant du prolongement cephalique a 5 somites.
Trois stades ont ete particulierement retenus: celui du repli cephalique transverse
(head fold), celui de 3 somites et celui de 4-5 somites.
Dans une premiere serie experimentale chaque moitie laterale de l'aire
cardiaque a ete cultivee en entier. Dans les series suivantes le territoire cardio-
genique a ete decoupe en 6 fragments dont les limites sont celles qui ont ete
utilisees par De Haan (1963). La figure 1 schematise la fragmentation realisee

Determinations dans Vaire cardiaque 155
au stade du repli cephalique transverse. L'aire cardiaque est ainsi divisee selon
des niveaux respectivement anterieur, moyen et posterieur, et pour chaque
niveau nous avons explante separement les fragments droit et gauche. Ce pro-
cede empeche la differentiation de structures axiales dans les explants.
Les explants sont cultives selon la methode de Wolff & Haffen (1952) sur le
milieu standard de ces auteurs. La duree de culture varie de 3 a 8 jours.
A.d.
M.d.
P.d.
Fig. 1. Schema de la fragmentation du blastoderme de poulet au stade du repli
cephalique transverse, definissant six types d'explants qui sont ensuite cultives
separement. A.d., A.g.: Fragments anterieurs droit et gauche. M.d., M.g.: Fragments
moyens droit et gauche. P.d., P.g.: Fragments posterieurs droit et gauche.
L'activite electrique transmembranaire est enregistree par la methode des
microelectrodes fixes de Corabceuf & Weidmann (1949). La petite taille des
cellules du myocarde embryonnaire rend necessaire l'utilisation de micro-
electrodes dont le diametre de pointe est inferieur au demi-micron. Pendant
les enregistrements les preparations sont maintenues a 38 °C. L'installation,
schematised sur la figure 2, comprend une cuve thermostatee qui maintient a
la temperature de 38 °C une chambre humide dans laquelle circule un courant
d'oxygene. La preparation est placee dans cette chambre. Le circuit d'enregistre-
ment se compose d'une electrode d'argent chlorure introduite dans le milieu
de culture (electrode 'indifferente') et d'une microelectrode (15 a 20 MO) fixee
au bras d'un micromanipulateur. Le phenomene est enregistre sur un oscillo-
graphe par l'intermediaire d'un changeur d'impedance. Un second micro-
manipulateur permet d'amener au contact de la preparation deux electrodes de
stimulation en argent. La preparation est stimulee par des chocs rectangulaires
d'une duree de 5 a 10 ms.
Les recipients de culture sont obtures par un couvercle perce d'un orifice
central permettant le passage des electrodes dont le deplacement est suivi a la
loupe binoculaire.
Enfin, nous avons observe dans quelques cas le degre de differenciation atteint
par le tissu myocardique pulsatile forme en culture. L'ultrastructure des explants
a ete examinee au microscope electronique.

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RESULTATS
I. La differenciation in vitro defragments de Vaire cardiaque
(a) Aspect morphologique
Lorsque les fragments de blastoderme dont les limites sont representees sur
la figure 1 sont explantes sur le milieu de culture, du tissu myocardique
spontanement pulsatile s'y differencie dans un certain nombre de cas. D'une
facon generate les explants arrondissent leurs contours dans les heures qui
suivent l'explantation. La differenciation du mesoderme de l'aire cardiaque en
myocarde spontanement pulsatile requiert le plus souvent 24 a 48 heures. Cette
differenciation donne naissance soit a une plage de tissu musculaire compact,
soit, plus frequemment, a une petite vesicule dans laquelle quelques couches
cellulaires entourent la cavite centrale. La croissance ulterieure est tres faible
ou nulle et aucune differenciation morphologique ne permet de reconnaitre les
vesicules pulsatiles formees par les differents fragments de l'aire cardiaque.
Fig. 2. Schema de Installation utilisee. L'explant (Ex.) est place dans une
enceinte thermostatee reglee a 38 °C. Un barbotage d'oxygene (O2) dans de l'eau
permet d'humidifier et d'oxygener l'atmosphere entourant la preparation. On en-
registre sur un oscilloscope l'activite electrique transmembranaire recueillie par
une microelectrode (jiE.). E.L: Electrode indifferente. E.s.: Electrodes d'argent per-
mettant l'entrainement electrique de la preparation par un stimulateur.
(b) Aspect cytologique ultrastructural
L'ultrastructure du mesoderme de l'aire cardiaque au stade du prolongement
cephalique a ete decrite par l'un de nous (Le Douarin, 1965). A ce stade du
developpement on observe dans les cellules du mesenchyme precardiaque des
myofilaments de 50 A de diametre, generalement disperses irregulierement dans
le cytoplasme. Ces myofilaments deviennent plus abondants et s'organisent
progressivement au cours du developpement.

J. Embryo!. exp. Morph., Vol. 15, Part 2 PLANCHE 1
Ultrastructure du tissu myocardique qui
s'est differencie en 3 jours de culture. Les myofibrilles
se sont constituees normalement et presentent des lignes Z et des bandes I et A. (Fixation au
liquide de Palade, inclusion dans I'epon, coloration par I'acetate d'uranyle. G: x 12.000.)
G. LE DOUARIN, G. OBRECHT & E. CORABCEUFfacing p. 157