Apport de la biologie moléculaire dans le diagnostic bactériologique d’Helicobacter pylori DJENNANE F*, BACHTARZI M.A, LAYAIDA K, ALI AROUSS N, BERKANE S, NAKMOUCHE M, RAMDANI-BOUGUESSA.N, TAZIR.M *Laboratoire de microbiologie du CHU Mustapha d’Alger Infection à Hp : Epidémiolgie L’infection à Hp est acquise dans l’enfance et perdure pendant des 10aines années C’est l’infection bactérienne la plus répandue, près de la moitié de la population mondiale en est infectée. Prévalence à H.pylori : 2 profils épidémiologiques distincts : - Pays industrialisés : 25 à 50 % - Pays en voie de développement : 60 à 90% Infection à Hp : Epidémiolgie En Algérie: Etudes de séroprévalence Ouest à Oran (Mégraud et al)* 1989 : 78% Centre à Alger (Guechi et al)** 2008 : 87,7% Sud à Ghardaia (Guechi et al)*** 2009: 79% Pays à haute prévalence de l’infection à Hp *Megraud F et al. Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J Clin Microbiol. 1989; 27: 1870-1873. **Guechi Z et al. Seroprevalence of Helicobacter pylori infection in Algiers region. (Absract 0430). Helicobacter. 2004; 9: 487-604. ***Guechi Z et al. Seroprévalence de l’infection à Helicobacter pylori dans l’Algérois. Journal Algérien de médecine. 2008; XVI (1): 12-14. Diagnostic d’H.pylori Nombreuses méthodes Anapath Examen Direct (ED) Méthodes invasives (Biopsie gastrique) Test rapide urée (TRU) PCR Sérologie Culture Méthodes non invasives Ag Selles Test respiratoire Objectif de l’étude : • Mettre en place le diagnostic moléculaire par PCR d’H.pylori et d’en évaluer l’apport par rapport aux techniques conventionnelles : détection d’H.pylori et sa résistance à la Clarithromycine (Au laboratoire de microbiologie du CHU Mustapha-Alger) Méthodologie: Critères de l’étude Etude rétro-prospective 6ans de 2008 à 2014 Multicentrique : 3 services, pratiquant l’endoscopie digestive haute, d’Alger (CHU Mustapha , CHU BEO, EPH Bologhine) Patients: Adulte, symptomatique consultant pour une EDH (Douleurs épigastriques), jamais traités Biopsies gastriques : 320 263 sélectionnées (PCR vs Culture) Méthodologie: Diagnostic au laboratoire Diagnostic conventionnel : Sur fragement biopsique 1ère paire TRU Gram Culture Test de sensibilité Cl Biopsies gastriques (2 paires) 2ème paire Diagnostic moléculaire : Sur éxtrait d’ADN PCR H.pylori + Résistance à Cl PCR multiplex : Détection du gène ureA et des mutations àgènes l’origine PCR de de la résistance à la virulence H.pylori Clarithromycine (A2143G,A2142G) (CagA + vacA) Culture Broyat de biopsie Etalement sur gélose Columbia + (Dent, sang frais humain, PVX) Incubation : 12jrs en jarre avec générateur de microaérophilie à 37°C Lecture : J4, J8 et J12 Colonie suspecte : Gram , uréase, Oxydase, Catalase Antibiogramme : Subculture sur MH-CMI par E-test (CLSI) Méthodologie: Diagnostic au laboratoire Diagnostic conventionnel : Sur fragement biopsique 1ère paire TRU Gram Culture Test de sensibilité Cl Biopsies gastriques (2 paires) 2ème paire Diagnostic moléculaire : Sur éxtrait d’ADN PCR H.pylori + Résistance à Cl PCR multiplex : Détection du gène ureA et des mutations àgènes l’origine PCR de de la résistance à la virulence H.pylori Clarithromycine (A2143G,A2142G) (CagA + vacA) PCR multiplex ( Hp et résistance Cl) Broyat de biopsie Extrait d’ADN Amplification d’ADN Kit commerciaux Révélation 24H Résultats Résultats : Détection de l’Hp Résultats de la culture d’Hp N=263 Résultats de la PCR N=263 61% 62,40% 24% 37,60% 62,4% Vs 24% 15% Positive N=164 Négative N=99 Positive N=63 Négative N=160 Contaminée N=40 Optimisation du taux de détection de 101 cas supplémentaires : 38,4% Résultats : Détection d’Hp: cas appariés culture/PCR Culture Positive Négative Positive Négative Contaminée Contaminée PCR Positive Négative Négative Positive Positive Négative Nombre 63 93 00 67 34 06 Commentaire Vrai positif 24% Vrai négatif 36% / Formes coccoïdes Pb de transport et de prélèvement 101 cas Résultat: Sensibilité à la CL 263 Bx gastriques 63 164 Culture + PCR + 31 CMI réalisées (49,2%) 64 Résistant Cl 100 Sensible Cl 61% 25 Sensible Cl 06 Résistant Cl 81% 19% 39% 20% Résultat: PCR Hp La PCR a permis en plus de déterminer la taux de résistance à la Clarithromycine mais aussi de savoir la principale mutation à l’origine de cette résistance qui est la A2143G (87,5%) qui confère une résistance de haut niveau à la Clarithromycine Discussion Le taux faible de détection d’Hp par les techniques conventionnelles (culture) de 24% est étroitement lié aux exigences atmosphériques et culturales de la bactéries (1ere expérience dans le domaine) -En Fr ce taux est de 39,2%* (984 bx) dans une étude réalisée en 2014 au Centre de référence des Helicobacters à Bordeaux -En Turquie: 29,6%** (149 patients) de 2012 -Au Maroc: 26%*** (64 patients) de 2002 La PCR a optimisé les taux de détection de l’Hp de 30% (101 cas supp) palliant ainsi aux contraintes culturales liées à la bactérie. -En Fr la PCR a permis d’optimiser le taux de détection de 3% avec 42,3%* (30 cas supp) *Lehous P, Ducournau A, Bénédjat L, Sifré E, Bessède E, Mégraud F.Résistance de Helicobacter pylori aux antibiotiques. Bilan d’une étude nationale menée en 2014. (Communication orale N°74).Ricai; 2015 Dec 14-15; Paris, France. **Cağdaş U et al. Detection of Helicobacter pylori and antimicrobial resistance in gastric biopsy specimens. Mikrobiyol Bul. 2012 Jul; 46(3): 398-409. ***Seffar M et al. Helicobacter pylori : diagnostic biologique. Med Mal Infect. 2002; 32: 735–737. Discussion La résistance primaire d’Hp à la Clarithromycine est de 19% par antibiogramme standard, ce taux est passé à Alger de 6%* en 2004 à 12% **en 2008 (LNRH) Cependant par technique moléculaire (PCR) on obtient un taux de 39%*** largement optimisé et étudié pour la première à l’aide de cette technique en Algérie. *Touchene , Résumé SNFGE 2004 **Mouffok F et al. Résistances primaires et secondaires de Helicobacter pylori aux antibiotiques : épidémiologie et impact sur l’efficacité du traitement éradicateur de l’infection. Saidal Santé. Fev 2013; 14: 32-37. *** High-level primary clarithromycin resistance of Helicobacter pylori in Algiers, Algeria: a prospective multicenter molecular study. Microbial Drug Resistance .2015 Situation mondiale de la résistance primaire à la Clarithromycine Europe Asie Maghreb Pays Taux de résistance primaire Année de publication / Période d’étude Nombre éch Auteur /Journal Allemagne 3,3% 2002 /1995-2000 - Wolle K (JMM) Finlande 4% 2011/2000-2008 505 Pirkko Kostamo (IJAA) Bulgarie 20% 2014 /NP 50 Boyanova.L (DMID) France 19,1% 29,3% 530 - Raymond.J (Helicobacter 2010) Burucoa.C (Ricai 2014) 22,2% 2010 /2004-2007 2012 /2010-2012 Pylorikine 2015/ 2014 CNR Hp 416 Lehous (Ricai 2015) Italie 23% 2003 /1998-2002 406 Turquie 30% 2010/NP 40 Demet Kaya (CTR) Iran 14,3% 2012/ 2010-2011 112 Milani (JIC) Vietnam 34,2% 2014/2012-2014 92 Trung Nam Phan (IJAA) Chine 37,5% 2014/2008-2012 600 Zhiqiaang Song (DLD) Pakistan 37% 2012/2009-2010 162 Rajper (JPMA) Tunisie 15,4% 2010/2005-2007 273 Ben Mansour (ACMA) Maroc 25% 2012/-NP 144 Alaoui (Ricai 2012) Au final …. La PCR contribue sans doute à l’optimisation de la détection au laboratoire d’Hp et de sa résistance à la Cl. Progression du Taux de résistance primaire à la Cl : Actualisation des données locales charge thérapeutique Notre espoir : Pour une meilleure prise ne charge de ces patients impact sur la prise en -La disponibilité du diagnostic bactériologique d’Hp dans les laboratoires : Réseau de biologiste ( diagnostic , surveillance et études comparatives) -Adapter le traitement d’éradication de l’Hp en fonction des données locales de sa résistance à la Cl en accord avec les recommandations internationales* -Privilégier une thérapeutique guidée par PCR ou Antibiogramme. *Malfertheiner P, Mégraud F, O’Morain C and al. Management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht IV/Florence Consensus Report. Gut 2012; 61: 646-664. Merci de votre attention