MEMOIRE
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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique UNIVERSITE de TLEMCEN Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de l’Univers Département de Biologie MEMOIRE Présenté par Ziane Manel En vue de l’obtention du Diplôme de MASTER En Microbiologie Appliquée Thème Etude de la flore constitutive de la plaque supra-gingivale chez les adultes sains et cariés Soutenu le 29/06/2016, devant le jury composé de : Président Benammar Chahid maitre de conférences classe A Université de Tlemcen Promotrice Khelil Nihel maitre de conférences classe A Université de Tlemcen Examinatrice Malek Fadéla maitre de conférences classe B Université de Tlemcen Année universitaire : 2015-2016 :ملخص حسبخ فً ًسٍج خلىي هي، فهً حٌخج ػي حشاكن هخخلف البكخٍشٌب للفلىسا الفوىٌت، ًىع هي البكخٍشٌب300 حضن اللىدت فىق اللثىٌت أكثش هي ، هسببت للخسىس هثل الؼقذٌبث، ً حخكىى هذٍ اللىدت هي بكخٍشٌب هىائٍت و ال هىائٍت اخخٍبسٌت راث جشام اٌجبب.أطل لؼببً و بكخٍشي .الخ...الؼظٍبث اللبٌٍت و الوكىساث الوؼىٌت الهذف.هذا الؼول الوخىاضغ لخض فً دساست هظهشٌت لبؼض الؼٌٍبث للفلىسا الفوىٌت لثالثت أشخبص أطذبء و ثالثت لهن أسٌبى هخسىست هذا. سٌت30 و22 الوطلىة هى الخذذٌذ الوظهشي للفلىسا الوكىًت للىدت فىق اللثىية ػٌذ هؤالء األشخبص اللزٌي حخشاوح أػوبسهن هب بٍي 8 هذا هب سوخ لٌب بخذذٌذ. الخظبئض البٍىكٍوٍبئٍت و دسبسٍت الوضبداث الذٍىٌت، خظبئض الٌوى، الخذذٌذ سكز ػلى الخظبئض الوجهشٌت .أًىاع بكخٍشٌت الهىائٍت الوخؼبٌشت فً الخجىٌف الفوىي والخً ٌوكي أى حظبخ هضشة هسببت أهشاضب فوىٌت دسجت هئىٌت) إضبفت إلى اخخببساث بٍىكٍوٍبئٍت و دسبسٍت37 أٌبم فً دسجت دشاسة حقذس ة7 إلى2 الذساست حوج فً وسط الهىائً ( هي .الوضبداث الذٍىٌت الكلمات المفتاحية . دساست هظهشٌت، ، حسىس، ، اللىدت فىق اللثىٌت،فلىسا فوىٌت،الخجىٌف الفوىي Résumé : La plaque supra-gingivale renferme plus de 300 espèces bactériennes; Elle se résulte de l’accumulation de diverses bactéries de la flore buccale, baignant dans une matrice d’origine salivaire et bactérienne. Elle se compose de bactéries aérobies et anaérobies facultatives à Gram positif, cariogènes telles que les Streptocoques, les lactobacilles et les entérocoques… etc. Ce modeste travail se résume en une étude phénotypique d’un échantillon réduit de la flore buccale de trois adultes sains et trois cariés. Le but recherché est l’identification phénotypique de la flore constitutive de la plaque supra-gingivale chez ces individus dont l’intervalle d’âge est entre 22 et 30 ans. Cette identification est basée sur les caractères morphologiques, culturaux, biochimiques et test de sensibilité aux antibiotiques. Cela nous a permis d’identifier 08 espèces de bactéries anaérobies commensales de la cavité buccale et qui peuvent devenir pathogène en causant des infections buccales. Des cultures en milieu anoxique (en anaérobiose pendant 2 à 7 jours à température de 37ºC) ont été faites, avec des tests biochimiques et l’antibiogramme. Mots clés La cavité buccale, flore buccale, plaque supra-gingivale, caries, étude phénotypique. Abstract: The supragingival plaque contains more than 300 bacterial species; it results from accumulation of various bacteria of the oral flora, bathed in salivary and bacterial original template. It consists of aerobic and facultative anaerobic bacteria Gram-positif, cariogenic such as Streptococci, Lactobacilli, Enterococci… This modest work is summarized in a phenotypical study of a reduce sample of the oral flora of three healthy adults and three decayed adults. The aim is phenotypical identification of the constitutive flora of the supragingival plaque for these individuals aged of 22 and 30 years. This identification is based on the microscopic characters, cropping, biochemical and antibiotics test sensivity. This allowed us to identify 8 species of commensal anaerobic bacteria in the oral cavity and which may become pathogenic, causing oral infections. Anoxic cultures in medium (anaerobically for 2 to 7 days at 37ºC) were made with biochemical tests and the antibiogramme. Keywords The oral cavity, oral flora, supragingival plaque, caries, phenotypic study. Je dédie ce travail… A mes très chers parents Pour m’avoir toujours soutenue et encouragée, pour leur présence de tous les instants, et pour m’avoir toujours entourée de leur amour, qu’ils trouvent à travers ce travail les fruits et la récompense de leurs efforts. Qu’Allah vous protège. A ma grande mère paternelle Pour l’affection et le soutien tout au long de mes études, toujours présente au fond de moi-même. A ma grande mère maternelle Pour ses prières et sa bénédiction A mes très chers frères, A mes oncles et mes tantes A mes chères copines : Fatima, Zahra, Souad, Samira, Amina, Imène avec qui j’ai partagé des moments inoubliables de folie et de joie, et à tous mes amis et mes collègues. A la doctorante Amina qui m’a beaucoup aidé A toute la promo de microbiologie appliquée A tous ceux qui, par un mot, m’ont donné la force de continuer. A toutes celles et tous ceux qui m’ont aidé dans mes études. A tous ceux qui j’aime et qui m’aiment de prés ou de loin. A tous ceux que je connais et que je n’ai pas pu citer. Remerciements A Monsieur BenammarChahid, maitre de conférences classe A, Université de Tlemcen ; C’est un véritable honneur que vous me faites d’accepter de présider ce jury. Trouvez ici le témoignage de ma gratitude et de mon respect. A Madame Malek Fadéla, maitrede conférences classe B, Université de Tlemcen ; Je suis très touchée du grand honneur que vous me faites de juger ce mémoire. Je vous adresse mes plus sincères remerciements et vous assure de mon profond respect. A notre directrice de projets de fin d’étude, Dr KhelilNihel, maitre de conférences classe A, Université de Tlemcen ; Nous vous remercions d’avoir accepté de diriger notre travail. Tout au long de nos études, votre connaissance et vos conseils nous ont poussés à toujours nous perfectionner, Permettez nous de vous exprimer toute notre gratitude et notre admiration. A Hoceini Amina, doctorante en Microbiologie, Université de Tlemcen ; Nous vous remercions Pour votre aide et votre gentillesse. Recevez ici toute ma gratitude. Sommaire Liste des figures Liste des tableaux Introduction ………………………………………………………………...01 Partie 1 : synthèse bibliographique I. Ecologie buccale……………….…………………………………03 I.1. Distribution des bactéries dans la cavité buccale……………………………….03 I.2. Les facteurs physico-chimique…………………………………………………...03 I.3. Accroissement de la diversité……………………………………………………..05 I.4. la plaque dentaire (biofilm)………………………………………………………05 I.4.1. Formation de la plaque …………………………………………………….06 I.4.1.1. Pellicule acquise exogène (=PAE)…………………………………...06 I.4.1.2. Colonisation de la PAE par les bactéries…………………………...06 I.4.2. Classification du biofilm……………………………………………………07 I.4.2.1. Biofilm supra-gingival……………………………………………….07 I.4.2.2. Biofilm sous-gingival………………………………………………...08 I.4.3. Architecture de biofilm supra-gingival……………………………………09 I.4.4. Potentiel pathogène du biofilm…………………………………………….10 I.4.5. Évolution du biofilm vers le tartre………………………………………...11 I.5. Composition de la flore orale……………………………………………………11 I.5.1. Bactéries Gram positif …………………………………………………….12 I.5.2. Bactéries Gram négatif…………………………………………………….13 1 II. Microbiologie des pathologies infectieuses buccales………15 II.1. Microbiologie de la carie……………………………………………………..15 II.1.1. Epidémiologie…………………………………………………………...15 II.1.2. Définition, Etiopathogénie……………………………………………..15 II.1.3. Evolution de la carie…………………………………………………...16 II.1.4. La flore carcinogène…………………………………………………...18 II.1.4.1. Les streptocoques buccaux…………………………………..18 II.1.4.2. Lactobacillus sp……………………………………………….19 II.1.4.3. Actinomyces…………………………………………………...19 II.1.4.4. Candida albicans………………………………………………19 II.1.5. Le mode d’action des bactéries cariogènes……………………………20 II.2. Microbiologie des maladies parodontales……………………………………20 II.2.1. Gingivite…………………………………………………………………20 II.2.2. Parodontite……………………………………………………………...21 Partie 2 : matériels et méthodes I. Lieu et période d’étude………………………………………………………...22 II. Type d’étude……………………………………………………………………22 III. Les critères d’inclusion et d’exclusion………………………………………..22 III.1. Les critères d’inclusion………………………………………………………22 III.2. Les critères d’exclusion ……………………………………………………..22 IV. Matériels ……………………………………………………………………….22 V. Méthodes ……………………………………………………………………....22 V.1. Echantillonnage ……………………………………………………………....22 V.2. Analyse des prélèvements…………………………………………………….24 V.2.1. Isolement ………………………………………………………………...24 Atmosphère anaérobie………………………………………………….24 Mode d’emploi de la jarre……………………………………………...25 V.2.2. Repiquage……………………………………………………………....26 V.2.3. Identification……………………………………………………………26 V.2.3.1. Caractères microscopiques…………………………………..26 V.2.3.1.1. L’état frais……….……………………………………..26 2 V.2.3.1.2. Coloration de Gram………………………………….26 V.2.3.2. Caractères macroscopiques………………………………...27 V.2.3.3. Caractères biochimiques …………………………………..27 V.2.3.3.1. Test de la catalase…………………………………....27 V.2.3.3.2. Test de cytochrome-oxydase………………………...27 V.2.3.3.3. Type respiratoire………………………………….....27 V.2.3.3.4. Galerie biochimique commercialisée : API 20 STREP………………………………………………27 Principe …………………………………………………28 Préparation de la galerie……………………………….28 Préparation de l’inoculum……………………………..28 Inoculation de la galerie………………………………..28 Lecture de la galerie…………………………………….29 V.2.3.4. Test de sensibilité aux antibiotiques ……………………...29 Principe ………………………………………………….29 Mode opératoire………………………………………...29 Partie 3 : Résultats et discussion I. Résultats…………………………………………………………30 I.1. Isolement et purification des isolats………………………………………….30 I.2. Caractérisation phénotypique des isolats……………………………………30 I.2.1. Caractérisation microscopique………………………………….30 I.2.1.1. L’état frais………………………………………………..30 I.2.1.2. Coloration de Gram……………………………………..31 I.2.2. Caractérisation macroscopique………………………..………..31 I.2.3. Caractérisation biochimique……………………………………33 I.2.3.1. Mise en évidence des enzymes respiratoires…………..33 Test de la catalase……………………………………...33 Test cytochrome oxydase……………………………...33 Type respiratoire………………………………………33 3 I.2.3.2. Les plaques API 20 STREP………………………………..33 I.2.4. La sensibilité aux antibiotiques…………………………………....34 II. DISCUSSION………………………………………………………………...38 Conclusion générale …………………………………………………………….44 Références bibliographiques ………………………………………..45 Annexes 4 Liste de figures Figure01 : formation du biofilm dentaire……………………………………………………07 Figure 02 : diagramme illustrant les différentes surfaces de la dent facilitant la colonisation microbienne…………………………………………………………………………………...08 Figure 03 : visualisation de la répartition des nombreuses espèces composant le biofilm supra gingival…………………………………………………………………………………….....10 Figure 04 : diagramme de Keyes…………………………………………………………….16 Figure 05 : évolution de la carie……………………………………………………………..16 Figure 06 : photos de prélèvement (prise par un Smartphone galaxy s3)…………………...24 Figure 07 : photos de jarres contenant les sachets générateurs d’anaérobiose (prises par un téléphone condor G4)………………………………………………………………………...25 Figure 08 : photos d’un sachet générateur d’anaérobiose (BD GasPack™ EZ) (photo prise par un smart phone condor G4)…………………………………………………………..25 Figure 09 : observation microscopique de coloration de Gram (photo prise par appareil photo….) (grossissement x10)……………………………………………………………….31 Figure 10 : aspect macroscopique d’un isolat sur gélose Columbia au sang après une semaine d’incubation à 37ºC (photo prise par un Smartphone condor G4)………………....32 Figure 11: résultats de quelques plaques API20 Strep (photo prise par un Smartphone condor G4)…………………………………………………………………………………………...34 Figure 12: résultats de l’antibiogramme de quelques souches (photo prise par un Smartphone condor G4)…………………………………………………………………………………..35 Liste de tableaux Tableau 01: les résultats de la forme, la sporulation, la mobilité et le mode de regroupement de différents isolats…………………………………………………………………………...30 Tableau 02: résultat de la coloration de Gram pour les anaérobies………………………….31 Tableau 03: résultats des aspects macroscopiques des isolats…………………………….....32 Tableau 04 : résumé des résultats des enzymes respiratoires et du type respiratoire………..33 Tableau 05 : résultats de la galerie Api 20 Strep………………………………………….....34 Tableau 06 : résultats de test de sensibilité aux antibiotiques…………………………….....34 Tableau 07 : les résultats généraux de l’étude bactériologique des différents isolats étudiés………………………………………………………………………………………...36 Introduction Introduction Nous vivons dans un monde peuplé de bactéries. Notre corps est un réservoir où se mêlent des micro-organismes commensaux et parfois des pathogènes. Depuis Pasteur, les progrès des techniques modernes de la biologie moléculaire ont évolués. C’est ainsi qu’aujourd’hui il a été identifié environ 1000 espèces différentes de bactéries dans la cavité buccale. Celle-ci est colonisée par des bactéries qui adhèrent sur les dents et forment la plaque dentaire (amas bactérien, sans organisation particulière) qui prend le nom aujourd’hui de biofilm (accumulation structurée et ordonnée de bactéries) (Aas et al., 2005). A ce jour, on connait que la formation de ces biofilms est le mode de croissance le plus préférable pour les microorganismes, et le plus important pour le développement des pathologies (Seneviratne et al., 2012) : environ 80 % des infections microbiennes sont associées aux biofilms (Shafahi et al., 2010), les biofilms buccodentaires (plaque dentaire) ne sont pas une exception, ils jouent un rôle très important dans le développement des caries dentaires des infections parodontales (Basri et al., 2012). La carie apparait lorsqu’il existe une combinaison critique entre les 3 paramètres : - Les bactéries buccales cariogènes (Streptocoques mutans, lactobacilles), dont lemétabolisme produit des acides. - Le terrain (ou l’hôte). - Le régime alimentaire cariogène (Fejershov et al., 2008 ; Chardin et al., 2006). Il n’existe donc qu’un nombre restreint de bactéries cariogènes : elles appartiennent aux genres Streptococcus, Lactobacillus et Actinomyces. Les streptocoques sont présents sur les surfaces dentaires, et apparaissent dans la cavité buccale dès l’éruption dentaire, qui leur offre des surfaces à coloniser (Transmission maternelle). Ils jouent un rôle dans l’initiation du processus carieux. On note une corrélation entre le nombre de Streptococcus mutans (germe le plus actif concernant le mécanisme cariogène) et l’incidence carieuse. 1 Introduction Les Lactobacilles sont retrouvés dans les lésions carieuses profondes et seraient plutôt responsables de la progression des lésions que de leur initiation. Ce sont des bactéries très acidogènes et aciduriques (Lupi-Pegurier et al., 2009 ; De La Dure-Molla et al., 2012). La maladie carieuse est un problème majeur de santé publique. Elle est le 3ème fléau de morbidité mondiale et est classée parmi les 10 maladies les plus chroniques de l’homme. D’après l’OMS, en avril 2012, 60 à 90% des enfants scolarisés dans le monde en étaient atteints, et près de 100% des adultes (OMS, 2012). Un mauvais état dentaire peut avoir d’importantes répercussions sur l’état de santé général ainsi que sur la qualité de vie. En effet, la douleur, les abcès dentaires, les difficultés de mastication, les dents absentes ont des effets non négligeables sur la vie quotidienne et le bien-être des individus. La prévention est la meilleure façon de traiter la maladie carieuse. Une surveillance active, constituée de visites régulières chez les dentistes, doit être systématisée (Petersen, 2003 ; OMS, 2004). A travers ce mémoire, une étude phénotypique de la flore bactérienne constitutive de la plaque supra-gingivale chez 3 adultes sains et 3 cariés a été réalisée. Cette étude a été réalisée au niveau du (L.A.M.A.A.B.E) ; Laboratoire de Microbiologie Appliquée en l’Agroalimentaire, au Biomédical et à l’Environnement, Université Abou Bakr Belkaid – Tlemcen, en collaboration avec le laboratoire de Chirurgie Expérimentale de la faculté de la médecine dirigé par Pr Benkalfat sous la direction de la promotrice Dr.KHELIL N. Maitre de conférence, Université de Tlemcen. 2 Introduction 3 Synthèse bibliographique Synthèse bibliographique I. Ecologie buccale I.1. Distribution des bactéries selon les habitats La cavité buccale est un habitat complexe, auquel les dents, la salive, et le fluide gingival confèrent un caractère unique. La distribution des streptocoques dans la bouche illustre bien le tropisme de chacune des espèces de ce groupe pour son habitat préférentiel. La charge bactérienne totale est très variable d'un site à l'autre. On compte de 5 à 50 bactéries par cellule épithéliale de la joue, alors qu'une cellule épithéliale de la langue peut en compter jusqu'à 100. L'épithélium buccal peut être kératinisé (gencive), les kératinocytes contribuant à l'élimination des bactéries, ou non (sillon gingivo-dentaire), les bactéries pouvant adhérer et pénétrer. Le dos de la langue du fait de sa morphologie et du passage des aliments, constitue une bonne réserve de bactéries aérobies et anaérobies. Elles y sont plus nombreuses que sur les autres muqueuses (100/cellule). Il y a, en moyenne, 108 bactéries par ml de salive et 108 bactéries par mg de biofilm nouvellement formé (Robert, 2012). I.2. Facteurs physico-chimiques La croissance des micro–organismes dépend de variables importantes : l’environnement humide (hydrométrie), la température relativement constante, le pH, la disponibilité des nutriments. Ces facteurs varient dans le temps et entre sites proches les uns des autres. Température ● Elle est en moyenne de 34 à 36°C. Les bactéries prédominantes sont de type mésophilique (25- 40°C). ● Elle subit de très fortes variations, en particulier sur la langue, avec des extrêmes de 0°C à 60°C. La fin d'un repas peut associer crème glacée et café. Les bactéries orales supportent une grande différence de température de l’état congelé (-70°) à la température de 120°C pour être détruites en chaleur humide en 15 minutes (Robert, 2012). 3 Synthèse bibliographique Humidité : ● La salive totale et le fluide gingival saturent en humidité le milieu buccal. ● Le débit salivaire de 0,40 ml/min au repos peut passer, en l'espace de quelques secondes, à plus de 3 ml/min. ● Une hyposialie ou une asialie entraînent des modifications considérables de la flore, causes fréquentes de pathologies. Les surfaces orales sont constamment baignées par le fluide oral l, ce dernier est essentiel dans le maintien de l’écosystème buccal puisqu’il procure de l’eau, des nutriments, des facteurs d’adhérence, et des facteurs antimicrobiens. L’environnement supra-gingival est plutôt baigné par de la salive, tandis que l’environnement sous-gingival (sillon gingivodentaire) l’est plutôt par le fluide gingival (Robert, 2012). pH ● La majorité des bactéries buccales ont un pH optimal de croissance entre pH 6 et pH 7,8. ● Dans les bouches carieuses, en présence de sucres fermentescibles, certaines bactéries dites acidogènes, produisent de grandes quantités d'acides qui vont abaisser le pH (pH 4 à 5,5). Dans le milieu acide ainsi obtenu, seules certaines bactéries dites aciduriques sont capables de survie. Les bactéries cariogènes sont des bactéries à la fois acidogènes et aciduriques (ROBERT, 2012). Potentiel d'oxydo-réduction (Eh) ● Il traduit la capacité d'un milieu à oxyder ou à réduire une molécule par addition ou soustraction d'électrons. Dans la majorité des habitats microbiens, l'oxygène est l'accepteur d'électrons le plus commun et le plus facilement réduit, et sa présence entraîne une oxydation du milieu. La concentration en oxygène est le facteur limitatif le plus important pour la croissance des bactéries anaérobies (Robert, 2012). Gaz ● La pression partielle d'oxygène dans l'air est de 21%. Elle peut tomber à 1 à 2% dans une poche parodontale. 4 Synthèse bibliographique ● La concentration en CO2 est plus forte dans la cavité buccale que dans l'air à cause d'une grande différence de pression partielle en CO2 entre la salive et l'air. ● Ce gaz est indispensable à la croissance et à l'implantation de certaines bactéries, dites capnophiles comme Capnocytophaga (Robert, 2012). La disponibilité des nutriments est l’un des paramètres importants dans le développement et la composition du biofilm dentaire. Chaque espèce bactérienne a ses exigences nutritionnelles (Chardin et al., 2006 ; Aoullay et al., 2000). I.3. Accroissement de la diversité La diversification se poursuit par le recrutement de nouvelles espèces, principalement par adhésion interbactérienne hétérotypique, et la plaque se développe plus en épaisseur qu'en surface s'enrichissant de bactéries facultatives et anaérobies stricts : Veillonella, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas et des mobiles telles que Treponema. La prolifération des cellules déjà présentes s'effectue en foyers ou en colonnes ; après deux jours, 10 à 20 couches cellulaires se superposent, la densité bactérienne est d'environ 107 /mm2 et la plupart des morphotypes sont déjà présents : cocci, bacilles et filaments. Les proportions entre actinomyces et streptocoques varient dans les premières 24 heures (ROBERT, 2012). I.4. Le biofilm ou la plaque dentaire Au XVIIème siècle, Antoine Van Leeuwenhoek est le premier à mettre en évidence la présence d’ « animalcules », c’est-à-dire de bactéries, dans la substance blanche qu’il avait récoltée sur ses dents, et qu’il a observée au microscope (Kaqueler et al., 1998). Cette substance est en réalité le biofilm ; que nous appelons aujourd’hui « plaque dentaire ». Celle-ci résulte de l’accumulation de diverses bactéries de la flore buccale (aérobies ou anaérobies), baignant dans une matrice d’origine salivaire et bactérienne, composée d’eau et d’une phase solide. La plaque dentaire est un dépôt mou, terne et de couleur blanc-jaunâtre, qui adhère à la surface des dents et des différents matériaux présents dans la cavité buccale (Albert et al., 1994 ; Mouton et al., 1993). 5 Synthèse bibliographique I.4.1. Formation de la plaque En quelques heures, la plaque dentaire se développe en 2 étapes à la surface des dents : - Formation de la pellicule acquise exogène - Adhérence des bactéries sur la pellicule I.4.1.1. Pellicule acquise exogène (=PAE) Après un nettoyage des dents, il se forme spontanément à leur surface un mince film (épaisseur < 1μm) acellulaire et amicrobien, d’origine salivaire : la pellicule acquise exogène. Sa formation résulte de l’adsorption de glycoprotéines salivaires à la surface de l’émail. C’est un revêtement insoluble qui ne peut être éliminé facilement. La PAE peut être bénéfique à la santé dentaire, en protégeant contre la décalcification due aux acides alimentaires, ou participer à son déséquilibre. Indispensable à la fixation de bactéries qui ne peuvent adhérer directement à l’émail, elle est la première étape menant à la formation de la plaque dentaire (Marsh et al., 2009 ; Albert et al., 1994 ; Mouton et al., 1993). I.4.1.2. Colonisation de la PAE par les bactéries La colonisation de la pellicule est progressive. La première étape se déroule en 4-5h après nettoyage, c’est la fixation de bactéries dites « pionnières », essentiellement des Streptocoques et des Actinomycètes. Dans un premier temps, ils se fixent grâce à des forces électrostatiques faibles (forces de Van der Waals par exemple) et réversibles. Ensuite, par des interactions moléculaires spécifiques irréversibles, mettant en jeu les adhésines de la membrane bactérienne et les récepteurs glycoprotéiques de la PAE (Kaqueler et al., 1998). La croissance et la présence de bactéries pionnières crée de nouvelles conditions environnementales (comme par exemple une diminution de la disponibilité en O2), plus adaptées au métabolisme de certaines bactéries. Cela favorise alors le recrutement de nouvelles espèces, et accroit la diversité au sein de la plaque. C’est la colonisation secondaire : elle contribue à la succession des populations bactériennes. On verra ainsi apparaitre des germes anaérobies, et des Gram négatif comme Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Veillonella, Prevotella, Treponema,… (Chardin et al., 2006 ; Marsh et al., 2009). 6 Synthèse bibliographique La plaque dentaire atteint ensuite une étape de maturation avec l’accroissement des populations microbiennes, par la fixation de nouvelles bactéries et la multiplication de celles déjà fixées. Volume et épaisseur de la plaque augmentent. C’est alors qu’il se crée un équilibre, entre l’augmentation de population, et l’élimination des bactéries par détachement. L’apparition de maladies telles que la carie dentaire et la parodontite sont dues à la rupture de cet équilibre (Chardin et al., 2006). 1. Attachement 2. Colonisation 3. Développement du biofilm Figure 01: formation du biofilm dentaire (Nicolas et al., 2011) I.4.2. Classification du biofilm I.4.2.1. Biofilm supra-gingival : N’est cliniquement détectable que lorsqu’il atteint une certaine épaisseur, il apparait alors comme un enduit blanc jaunâtre localisé tout d’abord le long du rebord gingival. Son identification se réalise soit à l’aide d’une sonde déplacée sur la surface dentaire soit par coloration. La plaque débutante (moins de 7 jours) est caractérisée par de forte proportions d’espèces des complexes jaune, pourpre et orange, la plaque d’épaisseur modérée contient d’importantes proportions d’actinomyces et d’espèces du complexe pourpre, tandis que les plaques épaisses, matures, contiennent de fortes proportions de complexes vert et orange (Berceyet et al., 1996 ; Ouhayoun et al., 2012). 7 Synthèse bibliographique La plaque supra-gingivale est la première à se former. Elle se compose de bactéries aérobies et anaérobies facultatives à Gram positif, cariogènes telles que les Streptocoques mutans, S. salivarius et S. sanguis (aujourd’hui sanguinis) (Walker et al., 2007) et il est possible de trouver plus de 300 espèces bactériennes différentes dans un biofilm dentaire supra-gingivale (Moore et al., 2000). I.4.2.2. Biofilm sous-gingival : Il constitue la continuité apicale du biofilm supra-gingival, il est à l’origine des maladies parodontales. Une colonisation initiale par des bactéries des complexes jaune, vert et pourpre en même temps que les actinomyces modifient l’environnement dans le biofilm, permettent aux bactéries du complexe orange d’abord, puis enfin à celle du complexe rouge de se développer et de devenir majoritaires dans les biofilms sous-gingivaux (Berceyet et al., 1996 ; Ouhayoun et al., 2012). Il est beaucoup plus difficilement évaluable cliniquement et qui n’est pas accessible au patient. Il contient des bactéries anaérobies, plus virulentes, qui se développent en pH basique (Zijnge et al., 2010)(Voir figure 02). Figure 02: diagramme illustrant les différentes surfaces de la dent facilitant la colonisation microbienne (Marsh et al., 2009). 8 Synthèse bibliographique I.4.3. Architecture de biofilm supra-gingival En général, son architecture, plus hétérogène, se compose de deux couches différentes avec toujours une couche basale, à la surface de la dent. Selon les patients et les bactéries en présence, on peut décrire différents types de biofilm selon 4 couches basales (Figure 03). Tout d'abord, un biofilm constitué seulement de bâtonnets : Actinomyces sp., perpendiculairement orientés vers la surface des dents (panneau D). Le second type est un mélange d'Actinomyces sp. et de chaînes de cocci, non identifiées, comme les Streptocoques, perpendiculairement orientées à la surface de la dent (panneau E). Le troisième type montre un biofilm de bactéries filamenteuses, des Streptocoques et les levures, où les Streptocoques forment des colonies distinctes autour des cellules de levure (panneau F). Le quatrième type est composé essentiellement de Streptocoques grandissant à proximité immédiate de Lactobacillus sp. qui sont orientés perpendiculairement à la surface de la dent (panneau G). Une deuxième couche peut recouvrir la couche basale de n'importe quel type de biofilm. Streptococcus sp. peut alors être présent sous forme de cellules dispersées, sans organisation apparente (panneau A3), ou ils peuvent être alignés en une fine couche (panneau A1). Les Lactobacillus sp., qui s'éloignent de la surface des dents, sont entourées par des cellules présentant différentes morphologies (panneau C) (Zijnge et al., 2010). 9 Synthèse bibliographique Figure 03 : visualisation de la répartition des nombreuses espèces composant le biofilm supra gingival (Zijnge et al., 2010). I.4.4. Potentiel pathogène de la plaque La plaque est en perpétuelle formation dans la cavité buccale. Aussi, dans une même bouche, on note, selon la présence ou non d’une hygiène bucco-dentaire satisfaisante, une variation d’un facteur 10 concernant la quantité de plaque (Kaqueler et al., 1998). Ainsi, une hygiène bucco-dentaire régulière permet de maintenir la plaque à un stade de « plaque dentaire non pathogène », où son développement est contrôlé et où les caries et maladies parodontales n’ont qu’une faible incidence (Albert et al., 1994). Au contraire, avec une hygiène insuffisante, la plaque n’est pas contrôlée, et des bactéries pathogènes (exogènes ou endogènes opportunistes) peuvent se développer, 10 Synthèse bibliographique entrainant la formation des plaques (Devals et al., 2013 ; Albert et al., 1994 ; Kaqueler et al., 1998) - Cariogène : elle aura une action pathogène au niveau des tissus minéralisés de la dent, entrainant des caries. Elle est favorisée par une forte consommation de sucres, à partir desquels les bactéries formeront des acides organiques déminéralisant l’émail. - Parodontopathique : on y retrouve une flore plutôt Gram négatif et anaérobie, caractéristique des maladies parodontales, et qui sera pathogène pour les tissus de soutien de la dent, en synthétisant notamment des toxines et enzymes. Cette action pathogène des bactéries sera détaillée dans les chapitres suivants. En l’absence d’hygiène bucco-dentaire, la plaque dentaire revêt un caractère pathogène menant donc au développement de pathologies telles que la carie ou les maladies parodontales. De plus, elle sera à l’origine de la formation du tartre. I.4.5. Évolution du biofilm vers le tartre Le tartre est défini comme la minéralisation du biofilm produisant des cristaux de différents phosphates de calcium. Le tartre dentaire est principalement compose de minéral, de composants organiques et inorganiques. Les phospholipides représentent 10 % des lipides totaux avec des phosphatidylethanolamines et des phosphatidylinositols. Ces derniers jouent un rôle important dans la minéralisation de la plaque dentaire. Ils proviennent a la fois de la salive et des constituants membranaires des bactéries (Gracieux et al., 2006). I.5. Composition de la flore orale La flore et l’hôte sont en équilibre. Toutefois, toute perturbation ou changement de la microflore entraine une rupture de cet équilibre. Le déséquilibre peut être créé par un changement biologique dans la bouche, comme la prise d’antibiotiques, une prise fréquente d’aliments sucrés, ou encore l’altération des défenses de l’hôte, Cela pourra se traduire par une modification qualitative ou quantitative de la flore, avec le développement de microorganismes pathogènes, ou avec la transformation de la flore résidente en pathogènes opportunistes, et ainsi la survenue de maladies, caries ou maladies parodontales par exemple (Devals et al., 2003 ; Philip et al.,2006). 11 Synthèse bibliographique Ces bactéries peuvent être aérobies ou anaérobies, facultatives ou obligatoires (Chardin et al., 2006 ; Philip et al., 2009). I.5.1. Bactéries à gram positif Bacilles Genre Actinomyces : groupe hétérogène de bactéries anaérobies strictes ou facultatives, colonisateurs précoces de la cavité buccale, en particulier au niveau de la plaque dentaire. Ils permettent l’adhésion d’autres bactéries. Les espèces buccales anaérobies facultatives sont : A. graevenitzii, A. radicenti, A. naeslundii, A. viscosus Genre Lactobacillus : Anaérobies, mais aérotolérants, ces bactéries ne possèdent pas de catalase, Habitat normal : la plaque dentaire, la salive et sur les tissus mous, impliqués dans le processus carieux, et plus particulièrement dans la progression de la lésion au sein de la dentine, du fait de leurs caractères acidophiles et acidogènes, Résistance à la vancomycine très fréquente. Plusieurs espèces buccales dont : L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. oris, L. salivarius. Genre Bifidobacterium, espèce B. dentium : en petit nombre dans la plaque, impliqué dans la carie dentaire. Genre Eubacterium, espèces buccales dont : E. brachy, E. nodatum, E. saburreum, E. yurii. Genre Propionibacterium est un indigène majoritaire dans la flore buccale, isolés de caries. Les espèces retrouvées sont : P. acnes, P. avidum, P. freudenreichii, P. granulosum, P. jensenii, P. propionicum (Robert, 2012). Cocci Genre Enterococcus , espèce E. faecalis a été isolée d’infections endodontiques et à la parodontite (Dumitrescu et al., 2010). Genre Gemella, espèces G. morbillorum et G. bergeri sont parfois isolées d’infections endodontiques avec abcès péri-apicaux. Les streptocoques oraux appartiennent à la flore commensale de la cavité buccale et du tractus respiratoire (représentent plus de 20% de la flore buccale). Ils jouent un rôle important dans la formation de la plaque dentaire, regroupées en paires ou en chaînettes, Immobiles, 12 Synthèse bibliographique anaérobies mais aérotolérantes, isolés de caries, de nécroses pulpaires, de gingivites, de parodontites. S. mutans et S. sobrinus sont fortement impliqués dans la carie dentaire. Genre Peptococcus, espèce P. niger Genre Anaerococcus, espèce A. prevotii (Robert, 2012). 2.2. Bactéries à gram négatif 2.2.1. Bacilles à Gram négatif, anaérobies, non-mobiles Genre Leptotrichia regroupe quelques espèces dont L. buccalis retrouvé dans plaque dentaire de sujets sains. Genre Fusobacterium : commensaux de la cavité buccale, retrouvé dans les pathologies bucco-dentaires espèces F. nucleatum (serait la principale et la plus fréquente cause de l’inflammation gingivale et initierait la maladie parodontale), F. periodonticum, F. necrophorum. Genre Haemophilus : retrouvé dans la salive et la plaque dentaire, espèces buccales : H. influenzae, H. parainfluenzae Bactéries à Pigmentation Noire (BPN) : Anaérobies strictes, forme de bacilles ou de coccobacilles, non mobiles : Genre Prevotella : espèces pigmentées : P. denticola, P. intermedia, P. loescheii, P. melaninogenica et P. nigrescens, colonies beiges puis noires, culture difficile et à croissance lente, présent dans tous les biofilms oraux, les lésions carieuses et endodontiques, les poches parodontales (Robert, 2012). Les espèces non pigmentées notamment P. oralis, P. oris, P.oulora, P. veroralis, P. dentalis (Listgarten, 2000). Genre Porphyromonas, espèces P. gingivalis, P. endodontalis, P. asaccharolytica. P. gingivalis est un agent pathogène majeur des parodontites (Robert, 2012). 2.2.5. Bacilles à Gram négatif, facultatifs, mobiles Genre Campylobacter : retrouvé au niveau du sillon gingival et la plaque dentaire, espèces buccales : C. consisus, C. sputorum, C. rectus, C. curvus (Robert, 2012). 13 Synthèse bibliographique 2.2.6. Cocci à Gram négatif, anaérobies Genre Veillonella , espèces buccales : V. atipyca, V. dispar, V. parvula dans la plaque dentaire des sites sains. Il figure parmi les premiers colonisateurs de la plaque, isolés de caries (Robert, 2012). 2.2.7. Cocci à Gram négatif, aérobies ou facultatifs Genre Neisseria présente une espèce buccale N. sicca, son habitat est la plaque dentaire, les lèvres et la langue (Robert, 2012). 14 Synthèse bibliographique II. Microbiologie des pathologies infectieuses buccales II.1. Microbiologie de la carie II.1.1. Epidémiologie La carie est actuellement classée par les experts de l’Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S) au troisième rang des fléaux mondiaux, immédiatement après les affections cancéreuses et les maladies cardio-vasculaires (Muller et al., 1997). Un indice épidémiologique permettant de mesurer de manière qualitative et quantitative l’état de santé bucco-dentaire d’un individu/ d’un échantillon de population, a été introduit en 1937 par Klein et Palmer (5). Il s’agit de l’indice CAO/D qui comptabilise le nombre de dents (D) définitives Cariées, Absentes ou Obturées d’un individu. Lorsque le dépistage intéresse une population d’enfants, il y a lieu de distinguer un indice pour les dents définitives (CAO/D) et un indice pour les dents de lait (cao/d) (Klein et al., 1940). II.1.2. Définition, Etiopathogénie La carie dentaire est une maladie infectieuse postéruptive des tissus durs de la dent. Elle est caractérisée par des périodes de déminéralisation alternant avec des périodes de reminéralisation. Elle est localisée, allant de l’extérieur vers l’intérieur de la dent. Elle affecte les tissus durs de la dent à des degrés variables, allant d’une simple perte de minéraux, non détectable à l’œil nu, à une destruction complète de la dent. Le processus carieux est généralement réversible aux stades initiaux et dans des conditions favorables, tandis qu’il est irréversible aux stades avancés (Charland et al., 2001). La lésion carieuse peut affecter l'émail, la dentine et le cément. Les destructions localisées des tissus durs dentaires, les lésions, sont ainsi les symptômes de la maladie. Ces symptômes vont de la perte initiale de minéral au niveau ultra structural à la destruction totale de la dent (Fejerskoy et al., 2003). La carie est une maladie complexe et multifactorielle, qui nécessite la conjonction de plusieurs facteurs pour initier son processus. Keyes (1962) a représenté sous forme de diagramme (Figure 04) une trilogie de facteurs étiologiques de la carie. Ces 3 facteurs sont : - Les bactéries buccales cariogènes (Streptocoques mutans, lactobacilles), dont le métabolisme produit des acides 15 Synthèse bibliographique - Le terrain (ou l’hôte) incluant les dents (morphologie, position, qualité de la minéralisation) et la salive (flux salivaire, capacité tampon, propriétés antibactériennes, ions fluorures, calcium, phosphore, protéines, enzymes) - Le régime alimentaire cariogène, dépendant de l’abondance et de la fréquence d’absorption de glucides fermentescibles. D’autres versions du diagramme de Keyes, y ajoutent le temps comme composant nécessaire. Figure 04 : diagramme de Keyes (1962) II.1.3. L’évolution de la carie Figure 05: évolution de la carie (Hauteville, 2015) 16 Synthèse bibliographique La carie est une lésion évolutive. On classifie les atteintes carieuses de la dent selon l’aspect clinique de la cavité et selon le degré d’atteinte des différents tissus touchés. Les cinq classes de carie sont (voir figure 05) : - carie initiale - carie superficielle - carie profonde - carie pénétrante - carie perforante La carie initiale ne présente pas de cavitation. C’est une déminéralisation partielle des cristaux sains de l’émail par les acides. À ce stade, les cristaux ne sont pas totalement dissous et la surface de l’émail reste intacte. L’aspect clinique est une tache crayeuse ou blanchâtre. Cette carie est la seule carie réversible, à condition d’améliorer l’hygiène et si possible, d'effectuer une fluoration. La carie superficielle est une carie qui n’atteint que l’émail et/ou le cément. La rupture superficielle de l’émail permet l’extension de la plaque dentaire dans la lésion, alors l’élimination mécanique de la plaque dentaire devient impossible. Les acides, provenant de la dégradation des hydrates de carbone par les bactéries de la plaque dentaire, peuvent facilement atteindre la limite jonction émail-dentine. Le processus de reminéralisation est ainsi impossible et la lésion progresse rapidement. La carie profonde est une lésion qui atteint l'émail et la dentine. La cavité qui est présente au niveau de l’émail est plus petite que la cavité interne. En effet, une fois que la carie a atteint la jonction émail-dentine, elle progresse plus rapidement dans la dentine car celle-ci est peu minéralisée. Lorsque la dentine est touchée, l’organe dentaire manifeste, pour la première fois, sa capacité de défense. La carie pénétrante est une carie qui a détruit l’émail et la dentine. La dentine réactionnelle est touchée à son tour, et la carie avance rapidement en direction de la pulpe. À ce stade, la pulpe est vivante, mais présente des troubles importants (douleurs aiguës). La présence d’une inflammation pulpaire indique que la pulpe est malade. La carie perforante est une carie où tous les tissus dentaires sont détruits (l’émail, la dentine, la dentine tertiaire, la dentine de la chambre pulpaire et parfois aussi la dentine radiculaire). La pulpe est nécrosée et les microorganismes de la carie ont envahi les tissus. En fonction du degré de nécrose et du stade d'infection chronique, le patient présente des douleurs qui peuvent être intolérables ou pas. 17 Synthèse bibliographique En conclusion, le patient commence à ressentir les effets délétères de la carie au stade de carie profonde. A ce niveau, l’émail est complètement détruit et le soin restaurateur est inévitable. Afin de diagnostiquer au plus tôt les lésions carieuses, il est nécessaire d’entrevoir les aspects macroscopiques et microscopiques de la carie (Anceaux, 2011). II.1.4. La flore cariogène Bien que la carie soit considérée comme un processus multifactoriel, il apparaît que cette affection est due à l’activité métabolique des bactéries dites ≪ cariogènes » qui colonisent les surfaces dentaires et qui par glycolyse, élaborent des acides organiques susceptibles de détruire la surface minéralisée de la dent. Un grand nombre d’espèces bactériennes sont retrouvées dans les caries mais les principales bactéries impliquées sont les streptocoques du groupe mutans (Streptococcus mutans et S. sobrinus), les lactobacilles et les actinomyces (Seow, 2007). II.1.4.1. Les streptocoques buccaux Le genre Streptococcus est fortement présent dans tous les sites de la cavité buccale. La plupart de ces streptocoques commensaux oraux sont non groupables par la méthode de Lancefield car ils ne possèdent pas de polyoside C. Ils sont fréquemment appelés streptocoques « viridans » en raison du halo verdâtre qui apparaît autour de la colonie sur une gélose au sang (hémolyse de type α). Chez l’homme, certaines espèces de streptocoques jouent un rôle écologique important en raison de leur synthèse de polysaccharides extracellulaires (dextranes, levanes) qui interviennent dans la constitution de la plaque et son métabolisme (Sixou et al., 2007). Le genre Streptococcus est constitué de petits cocci, de forme sphérique ou ovoïde dont le diamètre varie entre 0,5 et 2μm. Ils sont immobiles, asporulés et à Gram positif et se retrouvent en paires (culture en boîte de Pétri) ou en chaînettes (milieu liquide). Ce sont des bactéries anaérobies facultatives qui nécessitent un milieu de croissance enrichi (Schlegel et al., 2000). Les principaux Streptococcus responsables de la carie sont : S.mutans (sérotypes c, e, f) et S. sobrinus (sérotypes d, g) (Seow et al., 2007) 18 Synthèse bibliographique II.1.4.2. Lactobacillus sp Les lactobacilles sont connus comme responsables de la carie dentaire par leur présence en nombre important au niveau des lésions carieuses. Selon Owen, la relation Lactobacilluscarie dentaire a été rapportée par Goadby en 1899. Il est maintenant considéré comme colonisateur secondaire plutôt qu’initiateur du processus carieux (Badet et al., 2008 ; Sixou et al., 2007). Les lactobacilles sont des bacilles rectilignes ou incurvés de longueur et d’épaisseur variables. Ils sont immobiles, à Gram positif, asporulés et acapsulés le plus souvent. Les espèces les plus fréquemment isolées dans la cavité buccale sont : L. acidophilus, L. casei, L. fermentum,L. crispatus, L. grasseri. Le genre Lactobacillus est classé dans les bactéries lactiques (Sixou et al., 2007 ; Vestman et al., 2013). II.1.4.3. Actinomyces Le genre Actinomyces est fortement représenté dans la cavité buccale et est présent sur l’ensemble des surfaces orales. Il forme une partie importante de la microflore du biofilm dentaire en particulier au niveau des zones proximaux et le sillon gingival (Marsh et al., 2009). Les Actinomyces sont des bacilles à Gram positif très polymorphes et non sporulés. Les espèces identifiées dans la cavité buccale humaine sont : A. georgiae, A. gerencseriae (semble être responsable de l’initiation de la carie), A. israelii, A. meyeri, A. odontolyticus, A. viscocus (Sixou et al., 2007). II.1.4.4. Candida albicans C’est un champignon saprophytes de la cavité buccale qui colonise plusieurs types de surfaces de la cavité buccale comme la langue, la muqueuse palatine, les lésions carieuses et la plaque dentaire ainsi que les tissus durs dentaires aussi bien chez l’adulte que chez l’enfant. C. albicans adhère aux surfaces dentaires, produit PES, forme le biofilm et il est acidogène et tolérant de l’acide (Sixou et al., 2007). 19 Synthèse bibliographique II.1.5. Le mode d’action des bactéries cariogènes Les premières bactéries à coloniser la surface dentaire, appelées non-S. mutans, sont Streptococcus sanguinis, oralis et mitis, représentent 95% de la population des streptocoques, soit 56% des bactéries du biofilm. Les streptocoques mutans quant à eux ne représentent que 2% de la population des streptocoques initiaux. Par la suite, ce biofilm primaire, streptocoques dominant, se modifie et devient actinomyces dominant. Lorsqu’un leucome précarieux, lésion primaire de l’émail (lésion blanche de l’émail) apparaît, le taux de S. mutans devient plus élevé mais le biofilm est encore majoritairement composé de non-S. mutans et d’Actinomyces. Dans les lésions cavitaires atteignant la dentine, S. mutans représentent alors 30% du biofilm bactérien, indiquant que cette bactérie est directement responsable de l’activité des lésions carieuses. Les bactéries non-S. mutans sont les plus adhésives aux protéines et aux sucres et produisent des polysaccharides initiant ainsi la formation du biofilm. Lorsque ce biofilm est soumis à une exposition prolongée aux sucres, l’acidogénicité des bactéries nonS.mutans et des Actinomyces augmente, transformant le biofilm au profit des bactéries à plus fort potentiel acidogène. Plus tard, après la formation d’une cavité les lactobacilles sont responsables de la progression de la lésion. Cette adhésion bactérienne est un facteur de virulence. Les bactéries cariogènes métabolisent les glucides d’origine alimentaire. Ce métabolisme produit des acides, notamment de l’acide lactique, de l’acide propionique et de l’acide formique, qui entraînent une baisse du pH. En dessous du seuil de 5,5 la phase minérale de la dent est susceptible de se déminéraliser (Dure-Molla et al., 2012). II.2. Microbiologie des maladies parodontales Les maladies parodontales ou parodontopathies peuvent être définies comme des affections infectieuses multifactorielles chroniques des tissus parodontaux (Mankodi et al., 2005). Elles constituent la principale cause de perte de dents chez l’adulte (Sixou et al., 1991). II.2.1. Les gingivites Les gingivites provoquées par la plaque bactérienne représentent l’atteinte gingivale la plus fréquente. Elle peut survenir à tout âge (enfants et adultes) avec une prévalence pouvant 20 Synthèse bibliographique atteindre 50 à 100% dans la population adulte (INSERM, 1999 ; Struillou, 2002). Le rôle étiologique de la plaque bactérienne est reconnu puisque chez des patients présentant un parodonte sain, l’arrêt du contrôle de plaque entraîne tout d’abord l’apparition d’une inflammation discrète au niveau de la gencive marginale, puis de plus en plus marquée dans le temps. Cette atteinte gingivale est réversible, le contrôle de la plaque permet un retour à la normale. Elle n’atteint que le parodonte superficiel (INSERM, 1999). L’aggravation de la gingivite conduit à la parodontite. II.2.2. Les parodontites Si la gingivite n’est pas traitée, elle peut évoluer en parodontite, la plaque et sa population bactérienne descendent de plus en plus profondément sous la zone du sulcus (le sillon situé entre le bord de la gencive et la dent). La réponse inflammatoire du corps provoque une rétraction des gencives et ainsi une séparation de la dent. Des espaces qui s’appellent des poches, se forment entre les gencives et les dents. Le contrôle de la plaque dentaire et de la gingivite est efficace pour prévenir la parodontite (Ciancie, 2003 ; Meurman et al., 2006). La plupart des microorganismes intervenant dans ces pathologies sont des bacilles à Gram négatif, anaérobies stricts (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tanarella forsythia, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus, Treponema denticola) ou capnophiles (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Capnocytophaga ochracea)(Sixo et al., 1994). 21 Matériel et méthodes Matériels et méthodes Dans ce deuxième chapitre, nous décrivons les méthodes utilisées ainsi que le matériel ayant servi dans l'élaboration, la réalisation et l'aboutissement de notre étude. Lieu et période d’étude I. Ce travail a été réalisé durant la période allant de février à mai 2016 en collaboration avec le laboratoire de chirurgie expérimentale dirigé par le Pr Benkalfat à la faculté de médecine,Université Abou BakrBelkaid-Tlemcen. Type d’étude II. Il s’agit d’une étude phénotypique de la flore bactérienne de la plaque supra-gingivale buccale chez 03adultes indemnes de caries et 03 ont une lésion carieuse (sous la responsabilité d’une dentiste). Les critères d’inclusion et d’exclusion III. III.1. Les critères d’inclusion Notre étude concerne des sujets âgés de 23-30 ans, Les 06 adultes sont soumis à un questionnaire médico-dentaire (voir annexe 01). Sujets ne présentant aucune atteinte parodontale (aucun signe d’inflammation ou de rougeur de la gencive) et/ou pathologie au niveau de l’état général. III.2. Les critères d’exclusion L’antibiothérapie dans les derniers 3 mois Présence des implants prosthétiques fixes ou mobiles Avoir moins de 24 dents permanentes Patients avec mauvaise hygiène (ne se brossent pas les dents) Présence de nombreuses malpositions dentaires Application de fluor dans les 48 heures qui précédent le prélèvement. IV. Matériels Milieux de culture - Gélose Columbia (Oxoid, England). - Bouillon Cœur Cervelle (BHIB), (Oxoid, Basingstoke,UK) 22 Matériels et méthodes - API 20 STREP Instruments et appareillage - Microscope optique - Etuve - Jarre anaérobie et générateurs de Gaz Jarre anaérobie (BD GasPack™ EZ container, USA) Sachets générateurs d’anaérobiose, GasPack (BD GasPack™ EZ, USA) Disques d’antibiotiques - Vancomycine - Amoxicilline - Kanamycine V. Méthodes V.1. Echantillonnage Deux règles importantes sont à respecter : Il ne faut pas contaminer l’échantillon prélevé par une flore normale ; Il faut réduire au maximum le contact avec l’oxygène de l’air. Les prélèvements concernent 3 sujets présentant des dents cariées et 3 sujets indemnes de caries dentaires, ces prélèvements ont été soigneusement effectués dans des conditions d’asepsie, par une dentiste et transportés immédiatement au laboratoire pour être analysés. Ils doivent être effectués le matin, 12h après le dernier brossage des dents, et 2h après le dernier repas. Le prélèvement se fait à l’aide d’un écouvillon stérile pour chaque sujet. Ce dernier doit être frotté sur les surfaces dentaires et inter-dentaires chez les sujets indemnes de carie, et aussi dans les lésions carieuses pour ceux qui ont des caries (voir figure) puis le mis dans un tube Eppendorf contenant le BHIB. 23 Matériels et méthodes Figure 06 : photos de prélèvement (prise par un Smartphone galaxy s3). V.2. Analyse des prélèvements Au niveau de laboratoire, l’inoculum va être ensemencé, et cultivé en anaérobiose sur milieu Columbia additionné de sang. V.2.1. Isolement - Bien homogénéiser le tube de prélèvement pendant 30 secondes à l’aide d’un vortex. - A partir de cette suspension mère, on prépare des dilutions décimales allant de 10 -1 à 10-4 dans des tubes Eppendorf contenant 900 µl du bouillon BHIB pré réduit. - Ensuite 100 µl de la solution mère et de dilution décimale 10 -2 et 10-4 sont ensemencés sur des boites de Pétri contenant la gélose Columbia au sang. - Puis, les boites sont incubées en anaérobiose dans des jarres à 37ºC pendant 5 jours en utilisant des sachets générateurs d’anaérobiose (GENbag, GENbox). Atmosphère anaérobie L’anaérobiose peut être obtenue de différentes manières. Elle permet de cultiver les bactéries les plus sensibles à l’oxygène. D’excellents résultats sont néanmoins obtenus, pour les bactéries rencontrées en clinique humaine, avec les jarres anaérobies. Des sachets générateurs d’anaérobiose sont introduits dans ces jarres. Ces jarres, faciles à utiliser, sont à la portée de tout laboratoire (Grollier et al., 2004) (voir figure 07 et 08). 24 Matériels et méthodes Figure 07: photos de jarres contenant les sachets générateurs d’anaérobiose (prises par un Smartphone condor G4). Mode d’emploi de la jarre - Placer les boîtes de Pétri dans la jarre ; - Ajouter l’indicateur d’anaérobiose ; - Ouvrir le sachet aluminium, sortir le générateur et le mettre immédiatement dedans ; - Fermer immédiatement la jarre et incuber. Figure 08: photos d’un sachet générateur d’anaérobiose (BD GasPack™ EZ) photo prise par un Smartphone condor G4). 25 Matériels et méthodes V.2.2. Repiquage A partir des boites de pétri incubées, on effectue plusieurs repiquages en se basant sur l’aspect macroscopique des colonies dont chaque colonie fait l’objet de deux repiquages sur gélose Columbia au sang frais par la méthode des quadrants, qui ont ensuite incubées dans la jarre en anaérobiose à 37ºC pendant 5 jours. Après incubation, nous éliminons les boites contaminées et nous effectuons un deuxième repiquage s’il est nécessaire. V.2.3. Identification phénotypique des isolats L’identification bactérienne est basée sur l’examen microscopique et macroscopique, les tests biochimiques (galeries commercialisées API 20 Strep) et le test de sensibilité aux antibiotiques (Mégraud, 1994). V.2.3.1. Caractères microscopiques Les techniques d’examen microscopique permettent d’établir une pré- identification « carte d’identité » pour les microorganismes étudiés. V.2.3.1.1. L’état frais Cet examen permet d’apprécier la forme, la mobilité, et la présence de la spore des germes étudiés. Il faut éviter de confondre la mobilité d’une bactérie avec les mouvements de convention susceptibles de l’entrainer. Une goutte de l’eau distillée est déposée au centre de la lame, puis ensemencé par une pipette Pasteur contenant la culture pure de colonies suspectes puis la recouvrir par une lamelle au-dessous en évitant de créer de bulles d’air. L’observation se fait par microscope optique (grossissement x100). V.2.3.1.2. Coloration de Gram L’examen au microscope du prélèvement après coloration de Gram permet de repérer quelque fois la prédominance d’un type bactérien (cocci ou bacilles) et d’orienter le diagnostic (Delarras, 2014). Réalisation d’un frottis Coloration de Gram Observation 26 Matériels et méthodes V.2.3.2. Caractères macroscopiques L’aspect macroscopique des colonies (forme, taille, couleur) est déterminé après incubation à 37ºC sur gélose Columbia au sang pendant 5 jours. V.2.3.3. Caractères biochimiques V.2.3.3.1. Test de catalase Le test de catalase est utilisé pour détecter la présence de l'enzyme catalase. La catalase est une enzyme qui décompose le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en oxygène gazeux et en eau, un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse ou de bulles traduit la décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de la catalase. Pour mettre en évidence cette enzyme, une partie de la colonie suspecte est diluée dans une goutte d’eau oxygénée sur une lame stérile. Le dégagement de bulles de gaz indique la présence de la catalase (Allen et al., 2006 ; Tabak et al., 2012 ; Siboukeur, 2011). V.2.3.3.2. Test de cytochrome-oxydase Ce test permet de déterminer si un micro-organisme possède le système enzymatique (cytochrome c) lui permettant d'utiliser l'oxygène libre (O2) comme accepteur final d'électron dans la chaîne respiratoire. Il est réalisé à l’aide de disques prêts à l’emploi, imprégnés du réactif N-diméthyl paraphénylène diamine (Leyral et al., 2007 ; Joffin et al., 2006) : - A l’aide de pinces placer un disque d’oxydase sur une lame porte objet. - Choisir une colonie bien isolée et représentative de la culture fraiche à tester. - Prélever la colonie choisie à l’aide d’une anse de platine stérilisée. - Frotter doucement la colonie sur le disque et observer l’apparition d’une coloration violette dans un délai de 30 secondes. V.2.3.3.3. Type respiratoire Ensemencer le milieu viande foie par piqure centrale à partir d’une culture bactérienne pure sur boite de pétri (Joffin et al., 2006 ; Delarras, 2007). V.2.3.3.4. Galerie commercialisée API 20 Strep API 20 Strep est un système standardisé associant 20 tests biochimiques qui présentent un grand pouvoir discriminant. Il permet de faire un diagnostic de groupe ou d'espèce pour la plupart des streptocoques, entérocoques et pour les germes apparentés les plus courants. La 27 Matériels et méthodes liste complète des bactéries qu’il est possible d’identifier avec ce système est présente dans le tableau d’identification en fin de notice (biomérieux, 2010). Principe La galerie API 20 Strep comporte 20 microtubes contenant les substrats déshydratés pour la mise en évidence d'activités enzymatiques ou de fermentation de sucres. Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, réalisée à partir d'une culture pure, qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs. Les tests de fermentation sont inoculés avec un milieu enrichi (contenant un indicateur de pH) qui réhydrate les sucres. La fermentation des carbohydrates entraîne une acidification se traduisant par un virage spontané de l'indicateur coloré. La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de Lecture et l'identification est obtenue à l'aide du Catalogue Analytique ou d'un logiciel d'identification. Préparation de la galerie Réunir fond et couvercle d'une boîte d'incubation et répartir environ 5 ml d'eau distillée ou déminéralisée [ou toute eau sans additif ou dérivés susceptibles de libérer des gaz (Ex : Cl2, CO2 ...)] dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide. Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte. (Ne pas inscrire la référence sur le couvercle, celui-ci pouvant être déplacé lors de la manipulation). Sortir la galerie de son emballage individuel et placer la galerie dans la boîte d'incubation. Préparation de l'inoculum Ouvrir une ampoule d’API Suspension Medium (2 ml. A l'aide d'un écouvillon, prélever, toute la culture préalablement préparée. Réaliser une suspension très dense. Inoculation de la galerie - Dans la première moitié de la galerie (tests VP à ADH), nous avons réparti la suspension précédente en évitant la formation de bulles : pour les tests VP à LAP : environ 100 µl dans chaque cupule ; pour les tests ADH : remplir uniquement le tube. - Dans la deuxième moitié de la galerie tests RiB à GLYG : nous avons ouvert une ampoule d’APiGP Medium et y avons transféré le reste de la suspension, soit environ 0,5 ml ; nous avons réparti cette nouvelle suspension dans les tubes uniquement. 28 Matériels et méthodes - Nous avons rempli les cupules des tests soulignés ADH à GLYG avec de l’huile de paraffine puis refermé la boîte d’incubation à 37ºC en anaérobiose pendant 24h. Lecture de la galerie Après 24 heures d’incubation, nous avons ajouté les réactifs : test VP : 1 goutte de VP1 et VP2 test HiP : 2 gouttes de NIN test PYRA, α-GAL, β-GUR, β-GAL, PAL, LAP : 1 goutte de ZYM A et ZYM B. Après 10 mn, la lecture est effectuée en se référant au tableau de lecture. -Réaction positive = + ; -Réaction négative = ˗ V.2.3.4. Test de sensibilité aux antibiotiques Principe L’étude de la sensibilité aux antibiotiques a été réalisée par la méthode de diffusion des disques imprégnés d’antibiotiques en milieu Columbia au sang. Le but de la réalisation d’un antibiogramme est de prédire la sensibilité d’un germe à un ou plusieurs antibiotiques dans une optique essentiellement thérapeutique. Il sert également à l’identification bactérienne par la mise en évidence de résistances naturelles (Burnichon et al., 2003). Dans le cas particulier des bactéries anaérobies le teste de sensibilité aux antibiotiques est considéré comme un critère d’identification. Mode opératoire - A partir de la suspension bactérienne inoculée dans les galeries API 20 Strep, - Avec un écouvillon essoré, ensemencer toute la surface de la gélose Columbia au sang en stries serrées (successivement 3 orientations décalées de 60°). Déposer les disques à la surface de la gélose en les appliquant délicatement à la pince stérile (CASFM, 2004). Incuber les boites des souches anaérobies ou anaérobies facultatives en anaérobiose à 37°C pendant 48 heures. Dans notre antibiogramme on a utilisé juste 3 disques d’antibiotiques (amoxicilline, kanamycine, vancomycine) pour cause de la non-disponibilité. 29 Résultats et discussion Résultats et discussion I. Résultats Nous avons obtenu 17 isolats dont 8 souches ont des aspects différents. I.1. Isolement et purification des isolats Les colonies des souches bactériennes anaérobies poussées sur le milieu Columbia au sang dans une période de 5 jours à Tº de 37ºC sont d’aspects différents, de ce fait sont repiquées dans le même milieu d’isolement puis purifiées. I.2. Caractérisation phénotypique des isolats I.2.1. Caractérisation microscopique La détermination de la morphologie, l’arrangement cellulaire, la mobilité et le Gram des isolats. I.2.1.1. L’état frais Les résultats montrent que toutes les bactéries sont immobiles avec des formes différentes (cocci, bacille, coccobacille) regroupées en courte chainette ou en amas (voir tableau 01). Tableau 01: les résultats de la forme, la mobilité et le mode de regroupement de différents isolats Isolats Forme Mobilité Mode de regroupement 01 cocci Immobile En courte chainette 02 cocci Immobile En chainette 03 cocci Immobile En courte chainette 04 coccibacille Immobile En chainette/isolé 05 cocci Immobile En courte chainette 06 coccobacille Immobile En courte chainette 07 bacille Immobile En courte chainette 08 cocci Immobile En courte chainette 30 Résultats et discussion I.2.1.2. Coloration de Gram L’examen microscopique montre que nos isolats varient entre Gram (+) et Gram (-) (voir figure 09). Figure 09 : observation microscopique de coloration de Gram (photo prise par appareil photo….) (grossissement x100) Les résultats d’observation microscopique après coloration de Gram sont résumés dans le tableau suivant : Tableau 02: Résultat de la coloration de Gram pour les anaérobies Les isolats 1 2 3 4 5 6 7 8 Gram + + + + + + + I.2.2. Caractérisation macroscopique Après le repiquage sur milieu Columbia additionné de sang, les colonies obtenues ont des tailles différentes (petite, moyenne, grande) de forme variable (lisse, bombée, déchiquetée, aplatie…etc), de couleur différentes (jaune, blanche, grise, beige…ect) (voir figure10, tableau 03). 31 Résultats et discussion Figure 10 : aspect macroscopique d’un isolat sur gélose Columbia au sang après 5 jours d’incubation à 37ºC (photo prise par un Smartphone condor G4). Les caractères culturaux sont mentionnés dans le tableau suivant : Tableau 03: résultats des aspects macroscopiques des isolats Aspect macroscopique Nº de souches 1 taille forme relief contour surface opacité couleur petite ronde bombé+ hémolyse α régulier lisse opaque Jaune 2 petite ronde bombée+h émolyse β irréguli er lisse opaque blanche muqueuse 3 plate+hém olyse α bombée régulier lisse opaque jaune muqueuse 4 moye ronde nne petite ronde régulier Lisse brillant e opaque noire muqueuse 5 petite ronde Bombée+ hémolyse α régulier lisse opaque verte muqueuse 6 petite ronde plate régulier Lisse brillant e transluc blanche muqueuse ide 7 petite ronde bombée régulier lisse opaque beige muqueuse 8 petite ronde bombé régulier lisse opaque grise muqueuse 32 consistanc e muqueuse Résultats et discussion I.2.3. Caractérisation biochimique I.2.3.1. Mise en évidence des enzymes respiratoires Test de la catalase Les résultats du test indiquent que tous les isolats ne possèdent pas l’enzyme catalase, donc catalase (-). Test cytochrome oxydase Les résultats obtenus montrent qu’il n’ya pas un virage de couleur vers le violet, donc les isolats sont dépourvus d’oxydase. Type respiratoire L’apparition de colonies dans le font de gélose montrent que les isolats sont aéro-anaérobies facultatif et aérobies strictes (voir tableau 04). Tableau 04: résumé des résultats des enzymes respiratoires et du type respiratoire Souche Catalase Oxydase Type respiratoire 1 - - AF 2 - - AF 3 - - AF 4 - - AS 5 - - AF 6 - - AF 7 - - AS 8 - - AF AF : aéro-anaérobie facultative. AS : anaérobie stricte. (-) : négatif. I.2.3.2. Résultats de la galerie biochimique Api 20 Strep Lecture de la galerie L’identification des isolats n’a été faite que pour quelques souches à cause de la quasi-rareté des plaques Api 20 Strep. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant et quelques photos représentatives (voir tableau 05, figure 11). 33 Résultats et discussion Tableau 05 : résultats de la galerie Api 20 Strep so uc he s 1 V H E P P I S Y P C R A + - + - α G A L + β G U R - β G A L + P L A A L P A D H R I B A M S R A O A N R L A C - + + - - + + 2 + + + + + - + + + + + + + 3 - + - + - - - - + + - 4 - - - - - + - - - - - Résultats + T I R A G R N A M L E U F D Y G + + + + - + + + - + + + E.faecium - - + + + + - + - S.anginosis - - - - - - - - - Gemella morbillorum S .mutans Figure 11: résultats de quelques plaques API20 Strep (photo prise par un Smartphone condor G4). I.2.4. sensibilité aux antibiotiques Les tests de sensibilité aux antibiotiques des 8 isolats sont regroupés dans le tableau suivant et quelques photos représentatives de nos résultats (figure 12, tableau 06). Tableau 06 : résultats de test de sensibilité aux antibiotiques Les disques imprégnés d’antibiotiques Isolats Amoxicilline Vancomycine Kanamycine 1 S S R 2 S S R 3 S S R 4 S S R 5 S S R 6 S S R 34 Résultats et discussion 7 S R R 8 S S S NB : S : souche sensible aux antibiotiques. R : souche résistante aux antibiotiques. Figure 12 : résultats de l’antibiogramme de quelques souches (photo prise par un Smartphone condor G4). Nous avons donc obtenu les résultats suivants pour toutes nos souches isolées regroupés dans le tableau ci-dessous : 35 Résultats et discussion Tableau 07 : les résultats généraux de l’étude bactériologique des différents isolats étudiés Caractères morphologiques Patient s Indemne s de caries M1 Form e Cocci Cocci M2 Cocci Cocco bacill e Cocci M5 Cocci Cocci Cocci M3 Cariés Bacill e Cocci Cocci E.F Mobilité M.R Caractères culturaux Caractères biochimiques C. G taille forme Couleur c a o x T.R API 20 strep Ronde Jaune - - AF + Moyen ne Petite Ronde Jaune - - AF + Petite Ronde Jaune - - AF - - AF Streptococcus sp. Streptococcus mutans Streptococcus mutans Lactobacillus sp. - - AF Immobil e Immobil e Immobil e Immobil e En courte chainette En courte chainette En courte chainette En courte chainette + + Petite Ronde Immobil e Immobil e Immobil e Immobil e Immobil e Immobil e Immobil En courte chainette En courte chainette En courte chainette En courte chainette Chainette + Ronde + Moyen ne Petite Blanche transpare nte Jaune Ronde Grise - - AF + Petite Ronde Blanche - - AF + Moyen ne Petite Ronde Jaune - - AF Ronde Beige - - AS En courte chainette En courte + Moyen ne Petite Ronde Jaune - - AF Ronde Verte - - AF + + 36 Streptococcus sp. Gemella morbillorum Enterococcus faecium Streptococcus sp. Propionibacter ium sp. Streptococcus sp. Streptococcus ATB A M L S V A K S R S S R S S R S S R S S R S S S S S R S S R S R R S S R S S R Résultats et discussion M4 e Immobil e chainette En chainette/isolé Immobil e Immobil e Cocci Immoble Cocci Immobil e Immobil e Cocco bacill e Cocci Cocci M6 Cocci - Petite Ronde Noire - - AS En courte chainette En courte chainette + Ronde Jaune - - AF + Moyen ne Petite Ronde Jaune - - AF En courte chainette En courte chainette En chainette + Petite Ronde Blanche - - AF + Moyen ne Petite Ronde Jaune - - AF Ronde Blanche - - AF + 37 anginosus Porphyromona s sp. S S R Streptococcus sp. Streptococcus mutans S S R S S R Enterococcus faecium Streptococcus sp. Enterococcus faecium S S R S S R S S R Résultats et discussion II. Discussion Donc notre étude est basée sur l’identification phénotypique de la flore constitutive de la plaque supra-gingivale d’un échantillon réduit de patients sains et cariés, elle concerne les caractéristiques morphplogiques (l’état frais et coloration de Gram), macroscopique (caractères culturaux) et le test de sensibilité aux antibiotiques (Amoxicilline, Kanamycine et Vancomycine) de la flore buccale chez 03 adultes indemnes de caries et 03 cariés. Nous avons pu isolés 17 souches bactériennes après 5 jours d’incubation à 37ºC en culture anoxique. Nous avons obtenu 8 isolats dont l’aspect est différent, ces isolats appartiennent aux genres suivants (on n’a pas pu aller jusqu’à l’espèce pour quelques isolats pour cause de la quasi-rareté des plaques Api 20 Strep) : Chez les adultes indemnes de caries, on a trouvé : 3 souches de Streptococcus sp., 2 souches de Streptococcus mutans, une souche de Lactobacillus sp., une souche de Gemella morbillorum et une souche d’Enterococcus faecium. Chez les adultes cariés on a trouvé aussi : 3 souches de Streptococcus sp., une souches de Streptococcus mutans, une souche de Streptococcus anginosus, 2 souches d’Enterococcus faecium, une souche de Porphyromonas sp., une souche de Propionibacterium sp. L’identification des isolats doit se faire dans des conditions d’anaérobiose ces dernières peuvent être obtenues de différentes manières : la chambre anaérobie est le meilleur moyen qui permet de garder les bactéries EOS (extremely sensitive oxygen) en atmosphère anoxique. En outre, d’excellents résultats sont obtenus, pour l’isolement des bactéries anaérobies d’intérêt médical avec les jarres anaérobies. Des sachets générateurs d’anaérobiose sont introduits dans ces jarres ce qui était le cas de notre étude (Grollier et al., 2004). La caractérisation microscopique nous a permis d’observer les différentes formes des souches bactériennes isolées (cocci, bacille, coccobacille), sont tous non sporulées, immobiles, et Gram(+) ou Gram(-) selon l’espèce, cela a été rapporté aussi par Aas (2005). 38 Résultats et discussion Toutes les souches isolées dans cette étude sont similaires à celles retrouvées dans la majorité des études antécédentes comme celles de Hoceini (2016) qui a identifié la flore de la plaque supra-gingivale chez les adultes cariés, et celles de Ziouani (2015) qui a travaillé sur la flore de la plaque supra-gingivale et sous-gingivale chez les adultes sains. La caractérisation macroscopique de la famille des Streptocoques nous a permis d’observer de petites ou moyennes colonies blanchâtres ou parfois jaunâtres avec une activité hémolytique sur gélose au sang frais a été constaté. L’aspect de l’hémolyse permet de distinguer les Streptocoques β-hémolytiques et les non β-hémolytiques (Loubinoux, 2014). Les résultats de cette étude montrent l’abondance des cocci à Gram positif aéroanaérobies facultatifs dans la plaque supra-gingivale avec une prédominance du genre Streptococcus qui a été isolé en plusieurs espèces. Ces données corroborent avec celles signalées par Aas et al. (2005) et Sixou et al. (2007) qui ont déterminé la présence de ces bactéries dans la plaque dentaire supra-gingivale chez des adultes sains indemnes de caries et de parodontites. Les streptocoques buccaux peuvent être organisés en 4 groupes : mutans, salivarius, anginosus et mitis (Guillaume et al., 2011). Dans nos résultats on a trouvé 2 espèces seulement : S. mutans et S. anginosus en raison de la quasi-rareté de plaques Api 20 Strep et aussi notre échantillon est réduit. L’association entre S. mutans et la formation de caries dentaires a été reconnue dans les années 1960 (Fitzgerald et al., 1960). Cette association précoce provient de la forte corrélation généralement observée lors d’études épidémiologiques entre la présence de S. mutans et celle de caries, et en contre partie, de la faible abondance de bactéries S. mutans retrouve´es en l’absence de caries, ainsi que de sa capacité à générer des lésions carieuses dans les modèles animaux (Loesche, 1986). Ce qui en corrélation avec nos résultats. Aussi il semblerait qu’une grande diversité de bactéries soit présentes au sein même de la carie (Chhour et al., 2005). La littérature apporte ainsi que Streptococcus mutans évolue naturellement dans le biofilm que constitue la plaque dentaire (Kolenbrander et al., 2002). Ce qui confirme notre étude. 39 Résultats et discussion Les bactéries du genre Streptococcus sont résistantes à l’amoxicilline et à la vancomycine mais présentent une résistance naturelle aux aminosides (kanamycine), cette résistance naturelle est rapportée dans la littérature (CASFM, 2012). La présence de Streptococcus anginosus dans nos résultats comme rapporté dans la littérature. Cette espèce est isolée à partie de la plaque dentaire et les muqueuses, elle appartient au groupe des Streptocoques anginosus, couramment reconnus parmi les Streptocoques buccaux (Guillaume et al., 2011). Le genre Enterococcus a été aussi isolé comme il a été indiqué par les auteurs (Aas, 2005). L’espèce E. faecium qui est anciennement appelé Streptococcus faecium, il fait partie de la flore normale de la cavité buccale (Murray et al., 2006), et qui est caractérisé par une résistance naturelle aux aminosides (kanamycine) (CASFM, 2012), ils sont des cocci Gram(+) aéro-anaérobies facultatifs dans la plaque supra-gingivale (Aas et al., 2005 ; Sixou et al., 2007). C’est ce qu’on a obtenu dans nos résultats. E. faecium ont été plus fréquemment isolés de plaque supra-gingivale de sujets cariés que les sujets sains avec une différence significative Ils ont été connus par leur pouvoir acidogène et acidurique et elles ne sont généralement pas visibles dans la cavité buccale humaine (Tanez et al., 2001) jusqu'à ce que les études de Reyes et al. en 2012, qui a été le premier rapport connu de son isolement dans la cavité buccale de personnes cariés, néanmoins des travaux algériens très récents qui ont rapportés la présence de cette bactérie chez les sujets cariés (Hoceini et al., 2016). Cette bactérie a également été isolé avec une fréquence élevée dans les plaques supra-gingivales des adultes algériens sains (Ziouani et al., 2015). L’examen microscopique et l’identification par le test de sensibilité aux antibiotiques nous a permis de considérer que l’isolat qui se présente en coccobacille à Gram (+), en courte chainette, immobile et aéro-anaérobie facultatif et résistante à la kanamycine et sensible à la vancomycine on a pu déduire que cette souche s’agit de Lactobacillus sp. Ce qui est cité dans la littérature (Felis et al., 2007 ; Cannon et al., 2005 : CASFM, 2012). Étonnamment, le genre Lactobacillus (phylum Firmicutes), déjà identifié comme bactérie cariogène, était absent dans notre étude chez les adultes cariés, les genres Streptococcus et Lactobacillus comme les bactéries cariogènes produisent l’acide, ces deux genres étaient abondants dans les caries avancées dans les études précédentes (Corby et al., 2005 ; Chhour et al., 2005). 40 Résultats et discussion Cette identification phénotypique nous a permis aussi d’identifier d’autre espèce telle que : Gemella morbillorum qui appartient au genre Gemella, elle fait partie de la flore normale de la cavité buccale et des voies supérieures (Facklam et al., 1995 ; Collin, 2006). Les résultats de l’examen microscopique et macroscopique ont montré que cette souche possède les caractères suivants : cocci à Gram (+), immobile, catalase (-), se regroupent en courte chainette et anaérobie facultatif ce qui corrobore les études antécédentes (Facklam, 1995 ; Ruoff, 2007). Les résultats de l’antibiogramme indiquent que cette souche sensible aux différents antibiotiques utilisés et cela est confirmé dans la littérature par le fait que G. morbillorum est sensible à la pénicilline, à l’ampicilline, aux céphalosporines, aux tétracyclines, au chloramphénicol, à la lincomycine (Facklam et al., 1995 ; Collin, 2006 ; Buu-Hoi et al., 1982), ces bactéries sont fortement inhibées par les macrolides, la vancomycine, la ristocétine, la novobiocine et la tyrothricine. Les résultats de notre antibiogramme ont révélé cette sensibilité aux bêta-lactamines (amoxicilline) et à la vancomycine et on n’a pas testé la sensibilité aux autres antibiotiques pour cause de la non-disponibilité. Ainsi d’autres genres de coccobacilles anaérobies à Gram négatif pigmentés en noir sont retrouvés c’est le cas de Porphyromonas, ce qui confirme les études antécédentes (Sédallian, 1990), il est souvent isolé de la plaque dentaire (Aas, 2005). Cette bactérie pourrait être impliquée dans la susceptibilité d'un individu à la maladie parodontale (Takeshita et al., 2009 ; Ready et al., 2008 ; Yilmaz, 2008). Avec cette bactérie les potentiels des bactéries cariogènes interagis les uns avec les autres dans la cavité buccale ont accéléré la formation de la plaque dentaire, et ont participé au processus de carie dentaire. Il a été clairement observé dans notre étude qu'il n'y avait pas d'agents pathogènes spécifiques mais les populations pathogènes dans la plaque supra-gingivale que significativement associée à la carie dentaire. Dans les études précédentes ont montré que le genre Porphyromonas est résistant aux : aminosides, sulfamides, quinolones et pas de résistance connue aux macrolides, chloramphénicols (Appelbaum et al., 1990 ; Sédallian et al., 1990). Nos résultats ont confirmé la résistance de ce genre à l’amoxicilline et aux aminosides (kanamycine) et pour les autres antibiotiques on a pas pu tester car ils ne sont pas disponibles. 41 Résultats et discussion Le genre Propionibacterium est retrouvé chez les sujets cariés, il colonise les lésions carieuses profondes et dans les plaques dentaires ce qui est aussi cité dans les études antécédentes (Hashimoto et al., 2001). Cette bactérie est résistante au métronidazole et sensible au linézolide et moxifloxacine et à l’amoxicilline (Dubreuil et al., 1999). Ce que corroborent nos résultats de l’antibiogramme qui présente une sensibilité à l’amoxicilline car parmi ces antibiotiques c’est le seul que nous sommes utilisé. De nombreux auteurs s’accordent à dire que le processus carieux s’initie dans le biofilm dentaire (Kidd et al., 2004). Pourtant, depuis quelques années, les chercheurs étudient plus précisément les bactéries responsables des caries dentaires et leur métabolisme ; les Streptocoques mutans ne seraient plus, pour certains auteurs, les principaux agents cariogènes. D’autres espèces telles que les streptocoques non mutans ou les Propionibacterium sp, également acidogènes, joueraient un rôle dans l’initiation et l’évolution des lésions carieuses. De plus, les bactéries retrouvées dans les tissus cariés seraient différentes en fonction du stade d’évolution de la lésion (Kleinberg, 2002). Selon les résultats de la présente étude, il est conclu qu'il y’a une différence significative dans la composition des genres bactériens isolés à partir de plaques supragingivales chez les adultes avec et sans caries du faite de la présence les genres Lactobacillus et Gemella chez les sujets sains par contre chez les sujets cariés il y a une diversification de flore telle que la présence de Propionibacterium et Porphyromonas. La plaque supra-gingivale est le siège d’un écosystème très complexe composé majoritairement d’une flore bactérienne diverse à Gram positif et négatif, anaérobie stricte et aéro-anaérobie facultative. Cette flore est sensible au certains antibiotiques et résistante à d’autres. La relation antagoniste qui existe entre les bactéries pathogènes et les bactéries de la microflore commensale créé un environnement qui favorise la colonisation d’un groupe sur l’autre, cela pourrait expliquer la faible abondance des bactéries parodontopathogènes au sein des biofilms dentaires chez les sujets sains. 42 Résultats et discussion En effet, certaines bactéries anaérobies isolées à partir de la plaque supra-gingivale buccale ont la capacité d’inhiber la croissance d’un large spectre de bactéries pathogènes par exclusion compétitive et/ou par la production de composés (Takahashi et al., 1999). En conclusion, la diversité microbienne constatée dans la présente étude devrait donc être pris en compte dans la stratégie de traitement de la carie chez les patients adultes. Les recherches relatives à ce sujet sont rares au niveau national, les travaux de Hoceini et Ziouani sont les pionniers en Algérie. 43 Conclusion Conclusion générale Etudier la microbiologie buccale s’avère donc extrêmement complexe. Rappelons en effet que la flore bucco-dentaire renferme plus de 50 milliards de bactéries, réparties sur plus de 500 espèces différentes, soit plus de 20 genres distincts, qui cohabitent au sein de l’écosystème buccal. Il faut donc distinguer dans la flore buccale les bactéries adhérentes fixées sur les différentes surfaces de la cavité buccale (surfaces dentaires). La flore bucco-dentaire varie dans le temps et d’un site à l’autre chez le même individu et constitue ce qu’on appelle le biofilm dentaire qui est un milieu protecteur qui assurer la croissance de nombreuses populations qui y trouvent l'entraide nécessaire et les conditions écologiques. La plaque supra-gingivale est constituée généralement d’une flore anaérobie facultative telle que les Streptocoques les Lactobacilles et une minorité de souches anaérobies strictes comme Porphyromonas sp. Chez les adultes sains on a obtenu une prédominance de genre Streptococcus et présence de Gemella et Lactobacillus, par contre les sujets cariés ont une abondance d’Enterococcus et présence de Propionibacterium et Porphyromonas. Parmi les maladies infectieuses buccales, la carie dentaire est la plus connue. Les bactéries les plus impliquées dans le développement du processus carieux sont les Streptocoques mutans et Enterocoques faecium. L'identification des espèces bactériennes ou des complexes bactériens à l'origine de la lésion carieuse et les maladies parodontales est devenue un nouvel enjeu. Elle permettrait non seulement de mieux comprendre l'étiopathogénie, mais essentiellement de proposer de nouvelles perspectives thérapeutiques afin de prévenir la pathologie, de rationaliser les traitements, et d'éviter les récidives. L’objectif essentiel de ce travail était d’identifier la flore constitutive de la plaque supra-gingivale chez les adultes sains et cariés (identification phénotypique). 44 Conclusion générale 45 Références bibliographiques Références bibliographiques Aas J. A., Paster B .J., Stokes L. N., Olsen I., Dewhirst F. E. (2005). Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology 43, 5721-5732. Albert., Olivier. (1994). Conseils à l'officine dans le domaine de l'hygiène buccodentaire. Thèse pour le diplome d'état de Docteur en Pharmacie. Toulouse : Université Paul Sabatier. Allen S., Washington C., Winn Jr., Janda W., Koneman E., Procop G., Schreckenberger B., and Woods G. (2006). 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Le motif de la consultation Soins contrôle Fréquence de brossage des dents - Régulière 1 fois - 2 fois 3 fois >3 fois Irrégulière Nettoyage inter dentaire: Soie dentaire (s) Cure-dents (cd) interdentaire Combinaison (s+cd) Type de dentifrice: Marque…………… Non fluorée fluorée Régime alimentaire glucidique Oui Non Grignotage entre les repas Oui Non rien utilisé brosse Tabagisme et alcoolisme Oui Présence de mauvaise haleine Non Oui Non Saignement de la gencive lors du brossage des dents Oui Non Oui Non Douleurs des dents Hygiène Acceptable Non acceptable Nombre de dents : Dents Cariées Dents Absentes Dents Obturées Indice CAO = Douleur lors de la mastication Oui Date de prélèvement : / Non / Signature ANNEXE 02 : Les milieux de culture Columbia au sang: Milieu hautement nutritif pour la culture des germes exigeants. COMPOSITION (gramme/litre) Peptone 32.0 Amidon 1.0 Chlorure de sodium 5.0 Agar 10.0 pH 7,3 ± 0,2 500 grammes permettent de préparer 12.8 litres de milieu. BHIB Formule par litre d’eau purifiée. Infusion cœur-cervelle (matières solides) 8.0 Digestion peptique de tissu animal 5.0 Digestion pancréatique de caséine 16.0 Chlorure de sodium 5.0 Glucose 2.0 Phosphate d’hydrogène disodique 2.5 Gélose 13.5 pH 7.4 ± 0.2 Viande Foie Le milieu viande foie est un milieu de culture pour la détermination du type respiratoire des micro-organismes. Composition (gramme/litre) -Peptone viande-foie 30,0 g - Glucose 2,0 g - Amidon soluble 2,0 g - Sulfite de sodium 2,5 g - Citrate de fer ammoniacal 0,5 g - Agar 11,0 g pH 7,6 ± 0,2. ANNEXE 03 : notice de la galerie API 20 Strep TABLEAU DE LECTURE 1) Lors d’une deuxième lecture après 24 heures d’incubation, on peut remarquer un dépôt un dépos dans les tubes où on été ajoutés les réactifs ZYM A et ZYM B. Ce phénomène est normal et ne doit pas etre pris consédération. 2) L’acidification de l’amidon est fréquement moins forte que celle des autres surces. 3) Une coloration rose pale obtenue après 10 minutes doit être considérée négative. Les quantités indiquées peuvent être ajustées en fonction des titres des matières premières. Certaines couples contiennent des composants d’origine animale, notamment des peptones. ANNEXE 04 : la composition d’API GP Medium Milieu (0) et positifs (GLU). * Les tests MNE et XLT peuvent être oranges, lorsqu'ils sont entourés ou précédés de tests positifs. On doit alors les considérer comme négatifs. ● Les quantités indiquées peuvent être ajustées en fonction des titres des matières premières. ● Certaines cupules contiennent des composants d’origine animale, notamment des Peptones. ANNEXE 05 : tableau de l’antibiogramme selon la recommandation du comité scientifique français. Antibiotique sigle Charge du disque Diamètres critiques (mm) Amoxicilline AML 25 μg ≥ 21 ˂ 17 Vancomycine VA ≥- ˂ 10 Kanamycine K 5 μg 1000 μg ≥- ˂10
