RAPPORT DE STAGE De la synthèse d`une molécule
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Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologies RAPPORT DE STAGE _____________________________________________ De la synthèse d’une molécule organique fluorescente à l’élaboration de nanoparticules hybrides cœur-coquille Bidal Jennifer Laboratoire d’accueil : Institut Néel Directeur du laboratoire : Alain SCHUHL Responsable du stage : Fabien DUBOIS Licence mention Chimie et procédés - 1ère année - Chimie Biologie Année Universitaire : 2012 - 2013 Remerciements Tout d’abord, mes sincères remerciements sont destinés au directeur du département MCMF, Alain IBANEZ, le responsable de l’équipe MatONLP, Benoit BOULANGER, et enfin mon responsable de stage, Fabien DUBOIS, qui ont répondu à ma demande et m’ont permis d’effectuer ce stage au sein de l’Institut Néel afin que je me fasse une première idée du monde des laboratoires et de l’environnement de la recherche. Je remercie également pour leur patience et leur encadrement mon responsable Fabien DUBOIS, Marine LIOTAUD et Joséphine ZIMMERMANN, ainsi que pour toutes les explications et enseignements qu’ils m’ont apportés au cours de mon stage. De plus, chacun de leurs conseils, remarques ou explications ont contribué à mon enrichissement tout au long de ce mois. Enfin, je leur suis très reconnaissante pour la confiance qu’ils m’ont accordée malgré mon manque d’expérience en termes de manipulation. Je les remercie pour m’avoir tous trois témoigné de leur entière disponibilité à tout instant. Pour finir je remercie profondément l’équipe toute entière ainsi que tout le personnel du bâtiment F de l’Institut Néel pour leurs sourires, leur accueil au sein de leur équipe ainsi que toute leur bienveillance, favorisant de la sorte le bon déroulement de mon stage et faisant de lui une expérience enrichissante, passionnante, marquante et mémorable. Sommaire I) Introduction .................................................................................................... 1 II) Présentation de la structure d’accueil 1. Présentation du CNRS …..………………………………….……... 2 2. Présentation de l’Institut Néel ………..…………………………… 3 III) Déroulement du stage : travail réalisé et connaissances acquises 1. Synthèse et purification d’une molécule fluorescente à l’état cristallin : le CMONS a) Principe de la réaction de synthèse du CMONS …………….... 4 b) Protocole expérimental et observations ……………...……….. 7 c) Principe des techniques utilisées ……………………………… 9 2. Nanocristallisation de molécules organiques en matrice sol-gel a) Généralités …..……………………………………………..…. 11 b) Synthèse des nanocristaux organiques en matrice sol-gel ….... 13 IV) Apports du stage ………………………………………………………... 14 V) Conclusion ……………………………………………………………....... 15 VI) Références bibliographiques ……………………………………….…... 16 VII) Annexes ……..………………………………………………………….. 1 I) Introduction Envisageant une poursuite d’étude dans le domaine de la biologie ou de la chimie, je cherchais un stage dans une de ces deux matières. Ayant appris que mon professeur de chimie organique, Fabien DUBOIS, travaille en tant qu’enseignant-chercheur à l’Institut Néel, j'ai voulu savoir s’il était possible d’effectuer mon stage dans ce laboratoire. J'espérais ainsi découvrir le monde de la recherche ainsi que l’organisation au sein d'une si grande structure et j'ai eu le plaisir d'apprendre qu'il pouvait me proposer ce stage. Durant ce mois, mon projet fut d’effectuer les différentes étapes de synthèse et de purification d’une molécule organique appelée (α-[(4'-méthoxyphényl) méthylène]-4-nitrobenzèneacétonitrile) ou CMONS. Cette molécule aromatique appartenant à la famille des stilbènes a la particularité de posséder des propriétés fluorescentes à l’état cristallin mais aucune en solution (Annexe 2). Le but de cette synthèse était de me montrer les différentes méthodes types qu’utilise un chimiste organicien mais également de resynthétiser une molécule qui est utilisée par l’équipe pour une thèse (préparée par Joséphine ZIMMERMANN) au sujet de nanocristaux organiques fluorescents insérés dans une coquille sol-gel. Ce projet de recherche consiste en l’élaboration et l’optimisation de nanoparticules enfermant un nanocristal de diverses molécules organiques insérées dans une coquille silicatée grâce à un réacteur pneumatique associé à un four tubulaire et un filtre électrostatique [1,4]. Pour cela, les molécules organiques doivent pouvoir être fluorescentes à l’état cristallin lorsqu’elles sont observées sous lampe UV à 365 nm. De plus, on veut que ces nanoparticules soient les plus petites possibles, les plus fluorescentes possibles et qu’elles soient biocompatibles dans le but de s’en servir comme agent imageant de la micro vascularisation des tumeurs cancéreuses du cortex cérébral des petits animaux, tels que la souris, à injecter dans leur circulation sanguine (projet ARN "Ultrabright", en cours). Ces nanoparticules doivent être petites et furtives de sorte que le système immunitaire ne puisse les détecter comme étant des corps étrangers et les éliminer ensuite par les organes épurateurs : le foie et les reins. C’est pourquoi le but est de fonctionnaliser la surface des particules pour augmenter leur furtivité ou encore de leur ajouter une fonction de ciblage grâce à des biomolécules afin de détecter des tumeurs spécifiques. 1 A plus long terme, ce nouvel agent permettrait facilement de suivre l’évolution d’une tumeur au cours d’un traitement chez le petit animal et d'évaluer l’efficacité de ce traitement. Actuellement, l’enjeu est d’augmenter la furtivité des nanoparticules en travaillant par exemple sur la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules, celle-ci permettant également d’augmenter les propriétés de ciblage des tumeurs cancéreuses. D'autre part, il est possible d’étudier de nouveaux fluorophores car cette technique de synthèse est une méthode générique pouvant être étendue à de nombreuses autres molécules organiques dans la mesure où l'on prend en compte leurs caractéristiques propres [2,3]. Par exemple, on s'intéresse aux fluorophores qui émettent dans le rouge, correspondant à la fenêtre biologique dans laquelle l’absorption et l’auto fluorescence des tissus biologiques sont faibles. Quant à l’organisation de mon rapport, j’ai voulu dans un premier temps présenter la structure d’accueil où a eu lieu ce stage, puis j’ai détaillé le déroulement de celui-ci en ce qui concerne le travail que j’ai réalisé et ce qui m’a été présenté durant ce mois. Ensuite, j’ai cherché à prendre du recul et à réfléchir à propos des apports de ce stage et ce qu’il m’a enseigné à propos du monde professionnel dans cet environnement particulier qu’est la recherche. II) Présentation de la structure d'accueil Mon stage s’est déroulé à l’Institut Néel situé sur le polygone scientifique de Grenoble. Il s’agit d’un laboratoire appartenant au CNRS, c’est pourquoi je vais dans un premier temps le présenter, puis j'axerai ma présentation sur l’Institut Néel plus particulièrement. 1. Présentation du CNRS Le CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique, voit sa création en octobre 1939 et regroupait à l'époque tous les organismes d'État de recherche fondamentale ou appliquée [6]. Ainsi, pendant la guerre, le CNRS s’orientait vers la recherche appliquée. Toutefois, le CNRS s'oriente à la fin de la guerre vers la recherche fondamentale, ce qui marque un essor important pour cet organisme. 2 Actuellement, le CNRS est un organisme public sous la tutelle du Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche, dirigé par Alain FUCHS (président du CNRS) et assisté de deux directeurs généraux délégués, Joël BERTRAND (délégué à la science) et Xavier INGLEBERT (délégué aux ressources), tout trois constituant le Directoire du CNRS. C’est avec plus de 34 000 personnes et près de 3,4 milliards d’euros que le CNRS s’occupe de très nombreux domaines de recherche, devenant ainsi l’un des principaux organismes de recherche pluridisciplinaire en France. En effet, le vaste panel de disciplines que couvre le CNRS est composé par exemple de mathématiques, de physique, de chimie, de sciences du vivant ou encore de sciences humaines et sociales. Le CNRS est organisé de telle sorte que l’ensemble des domaines scientifiques soient partagés entre 10 instituts. De plus, les 19 délégations en région permettent la gestion locale des laboratoires (ou unités de recherche) qui constituent la « structure de base » de l’organisme. Au total, le CNRS accueille ainsi plus de 1100 unités de recherche et de service. Finalement, le CNRS est un organisme très actif et notamment ouvert sur le plan international avec l’accueil de chercheurs étrangers, la création de laboratoires internationaux et la coopération scientifique avec des laboratoires étrangers. 2. Présentation de l’Institut Néel Créé en 2007, l‘Institut Néel porte le nom de Louis Néel, un physicien français lauréat du prix Nobel de physique en 1970. L’Institut Néel est alors le rassemblement de quatre laboratoires implantés sur le polygone scientifique [7]. Ce laboratoire qui appartient au CNRS (dirigé par Alain SCHUHL) s’occupe de nombreux domaines scientifiques tels que la supraconductivité, les nouveaux matériaux, la cristallographie, la science des surfaces et le magnétisme. De plus, il entretient des relations interdisciplinaires avec la chimie, l’ingénierie et les sciences du vivant, ces dernières tendant à prendre de l’ampleur au sein du laboratoire. Néanmoins, le domaine scientifique principal de l’Institut Néel se trouve être la recherche fondamentale en physique de la Matière Condensée. L’Institut Néel étant situé sur Grenoble, il entretient une coopération à tous niveaux avec les universités et écoles grenobloises telles que l’université Joseph Fourier et GrenobleINP. En outre, le laboratoire possède des partenariats avec des entreprises et des liens étroits avec le CEA situé tout près de l’Institut Néel. 3 Cette grande structure s’organise de telle sorte que ses 450 membres sont départagés au sein de trois départements scientifiques : "Nanosciences (NANO)", "Matière Condensée et Basses Températures (MCBT)" et "Matière Condensée, Matériaux & Fonctions (MCMF)". De plus, les membres sont réunis en une vingtaine d’équipes de recherche et groupes de soutien technologique, rattachés à ces départements scientifiques (Annexe 1). Au cours de mon stage, j’ai travaillé au sein du département Matière Condensée Matériaux et Fonctions (MCMF, dirigé par Alain IBANEZ) qui s’occupe de l’élaboration, des études cristallographiques ou spectroscopiques et de la modélisation de matériaux fonctionnels. Au sein de ce département, j’ai évolué dans l’une des cinq équipes de recherche : "l’équipe Matériaux, Optique Non Linéaire et Plasmonique (MatONLP)" qui étudie les matériaux nouveaux de leur synthèse à leur élaboration ainsi que les propriétés optiques non linéaires et plasmoniques. III) Déroulement du stage : travail réalisé et connaissances acquises Ce stage m’a permis de découvrir les différentes étapes de ce projet de recherche, allant de la synthèse de la molécule organique jusqu’à l’élaboration des nanoparticules souhaitées. C’est pourquoi dans un premier temps je vais axer mon étude sur la synthèse de la molécule organique particulière et enfin sur la nanocristallisation de cette molécule au sein d’une matrice sol-gel. 2. Synthèse et purification d’une molécule fluorescente à l’état cristallin : le CMONS La synthèse de cette molécule organique est relativement simple et rapide, mais il est nécessaire d’effectuer plusieurs étapes de purification de cette molécule synthétisée car la fluorescence du CMONS peut être altérée ou inhibée par la présence d’impuretés dans les cristaux. a) Principe de la réaction de synthèse du CMONS La synthèse du CMONS consiste en la réaction du 4-méthoxybenzaldéhyde (aussi appelé p-Anisaldéhyde) et de la 4-nitrophenylacetonitrile en présence de pyridine et d’un catalyseur : la pipéridine (figure 1). 4 N H3C H 3C O O + + O 4-méthoxybenzaldéhyde Pyridine O O + N N - - O O Pipéridine (cat.) N 4-nitrophénylacétonitrile CMONS Figure 1 – Réaction de synthèse du CMONS. Cette réaction de synthèse, dite de Knoevenagel, passe par la formation d’un intermédiaire réactionnel très stabilisé : un carbanion. Le mécanisme de la réaction est le suivant : La pipéridine est un catalyseur qui a une propriété plus basique que la pyridine (le solvant) (figure 2). N H N Pipéridine Pyridine Figure 2 – Formules chimiques du catalyseur, la pipéridine, et du solvant : la pyridine. Cette différence de propriété s’explique par la présence d’un effet mésomère attracteur délocalisant le doublet non liant de l'azote. Cette mésomérie entraine une diminution de la basicité dans le cas de la pyridine. Le catalyseur étant une base, il entraine une réaction acide-base et arrache donc un proton à la molécule 4-nitrophenylacetonitrile (figure 3). H N N H Pipéridine O N H + O - 4-nitrophénylacétonitrile Figure 3 – Réaction acide base entre la 4-nitrophenylacetonitrile et la pipéridine. Cette réaction engendre la formation d’un intermédiaire réactionnel. Ce carbanion est extrêmement stabilisé par effet mésomère (figure 4) et son apparition dans le milieu se remarque par une coloration rouge de la solution. 5 N O - + + CH N - + N H2 O Figure 4 – Stabilisation du carbanion par la mésomérie. Ensuite a lieu une addition nucléophile du carbone nucléophile de la molécule 4nitrophenylacetonitrile sur le carbone devenu électrophile par effet mésomère de la molécule 4-méthoxybenzaldéhyde (figure 5). De plus, la régénération du catalyseur à lieu à la suite d’une réaction acide-base le mettant en jeu. N Regénération O CH - N + O + N H2 - O H 3C H3C O Addition nucléophile du catalyseur - O O N O + O - N Figure 5 – Addition nucléophile de la molécule 4-nitrophenylacetonitrile sur le 4méthoxybenzaldéhyde et régénération du catalyseur. Enfin, l’élimination d’une molécule d’eau permet la formation d’une double liaison pour obtenir la molécule de CMONS (Figure 6). N H CMONS HO H 3C H O O N N H 3C O O + O H Elimination H2O N - + O - N Figure 6 – Formation du CMONS après déshydratation. En fonction de la vitesse de cristallisation du CMONS, ce composé a la particularité de présenter plusieurs polymorphes à l'état cristallin, caractérisés par des propriétés de fluorescences distinctes. En effet, observé sous ultra-violet à 365 nm, le CMONS est capable d’exprimer une fluorescence jaune, orange, ou verte, respectivement de longueur d’onde d’émission 539 nm, 560 nm et 557 nm. La forme la plus stable thermodynamiquement est orange et nous avons pu l’obtenir par recristallisation lente et progressive. 6 b) Protocole expérimental et observations Durant ce stage, j’ai effectué cette réaction de synthèse dans le but de produire 2 g de CMONS, sachant que la réaction de synthèse et les étapes de purifications induisent un rendement final d’environ 60-70%. Pour cela, j’ai dissous dans un ballon 1.392 g de 4-méthoxybenzaldéhyde dans 100 mL de pyridine, puis j’ai ajouté sous agitation 1.658 g de 4-nitrophenylacetonitrile. Après y avoir additionné 5 gouttes de pipéridine, j’ai laissé chauffer le milieu réactionnel pendant une nuit (sous agitation et avec montage à reflux) à 120°C, qui est une température supérieure à la température d’ébullition de la pyridine (115°C) et de la pipéridine (105°C) [8]. Pendant la synthèse, on remarque que la solution prend une couleur fuchsia qui tourne au rouge, due au déplacement de la charge négative sur le carbanion formé. A la fin de la réaction, la solution a une couleur jaune très foncée. Après avoir laissé refroidir le mélange réactionnel à température ambiante, j’ai effectué une chromatographie sur couche mince (C.C.M., voir III.1.c) avec comme éluant un mélange dichlorométhane/cyclohexane (en proportion 8:2), grâce à laquelle j’ai pu comparer le composé synthétisé par rapport à un composé qui avait déjà été synthétisé et entièrement purifié (C.C.M. analytique). Après révélation sous lampe UV à 365 nm, la C.C.M. indique la présence du produit désiré (Rf : 0.7) et la présence d'impuretés caractérisées par l'observation d'une autre tâche sur la C.C.M. présentant une faible migration après élution. J’en ai conclu qu’il restait des impuretés ou bien des réactifs de départ dans mon produit synthétisé. Ensuite, j’ai stoppé la réaction en ajoutant de l’eau dans le milieu réactionnel, après quoi j’ai effectué à deux reprises une extraction de la phase aqueuse en ajoutant du dichlorométhane dans une ampoule à décanter, pour ne récupérer que la phase organique située dans la phase inférieure. Après avoir recueilli cette phase organique, je l’ai traité par du sulfate de magnésium anhydre afin d'éliminer l'eau résiduelle. Pour supprimer le sulfate de magnésium, j’ai filtré la solution sur papier filtre et pour finir, j’ai éliminé le solvant par évaporation au Rotavapor. Afin de purifier le produit obtenu, j’ai effectué une recristallisation en ajoutant un peu d’acide acétique dans le ballon et je l’ai laissé chauffer à 120°C (température d’ébullition de l’acide acétique) sous agitation et montage à reflux. 7 Lorsque tous les cristaux ont été dissous dans le solvant, j’ai laissé refroidir progressivement et lentement la solution, de sorte que le composé n’emprisonne pas les impuretés en cristallisant trop rapidement. Suite à cette recristallisation, j’ai effectué une filtration sur Büchner pour éliminer le solvant puis j’ai laissé sécher le composé. Ensuite, j’ai effectué une seconde chromatographie sur couche mince afin de vérifier l'intérêt de cette étape de recristallisation sur la pureté du produit obtenu en le comparant à la référence. Le résultat de cette chromatographie d’adsorption montre une très bonne purification, mais comme indiqué précédemment, il est préférable d’effectuer d’avantage d’étapes de purification pour s’assurer que peu d’impuretés inhiberont la fluorescence du CMONS. De plus, il est possible que certaines impuretés ne soient pas visibles par C.C.M. C’est pourquoi, j’ai ensuite purifié le produit par chromatographie sur colonne de silice en utilisant comme éluant un mélange dichlorométhane/cyclohexane en proportion 8 : 2. Cette fois-ci, une C.C.M. m’a permis de vérifier la présence du CMONS purifié dans chaque tube à essai. Puis, j’ai effectué une évaporation du contenu des tubes au Rotavapor pour obtenir finalement une poudre jaune (cristallisation rapide). Enfin, la dernière étape de purification est à nouveau une recristallisation mais cette fois-ci, j’ai utilisé comme solvant du toluène de la même manière que j’ai utilisé l’acide acétique pour la première recristallisation. J’ai effectué pour finir une filtration sur Büchner pour éliminer ce solvant et j’ai laissé sécher le CMONS. J’ai réalisé plusieurs fois ces manipulations et j’ai pu en effet constater que la couleur des produits obtenus variait selon la durée et la manière qu’a le CMONS de cristalliser (Annexe 3). La première fois, nous avons obtenu un CMONS de couleur orange, qui semblait très "aéré " et léger. La cristallisation du composé ayant été très lente, le CMONS a pu former de magnifiques cristaux en forme de baguettes, donnant un résultat très impressionnant. Par la suite, les cristallisations ayant été plus rapides, j’ai obtenu du CMONS de couleur jaune formant des pétales minces et lisses. Le rendement moyen obtenu est compris entre 55 et 65 % (faible en raison du nombre important d'étapes de purification). Pour finir, le CMONS purifié est analysé par RMN (résonnance Magnétique Nucléaire) du proton dans le CDCL3 (Annexe 4), dont voici l'analyse : 1 H RMN (CDCl3, 300 MHz) : δ 3,92 ppm (s, 3H, O-CH3) ; 7,05 ppm (d, 2H, Ar) ; 7,63 ppm (s, 1H, R-CH=CR2) ; 7,85 ppm (d, 2H, Ar) ; 7,90 ppm (d, 2H, Ar) ; 8,3 ppm (d, 2H, Ar). Cette RMN montre une très bonne purification du composé. 8 c) Principe des techniques utilisées La synthèse et la purification de cette molécule organique m’ont permis de découvrir et d’approfondir de nombreuses techniques utilisées en chimie organique. La chromatographie d’adsorption Au cours de ces manipulations, j’ai effectué de nombreuses chromatographies sur couche mince (C.C.M.) et plusieurs chromatographies d’adsorption sur colonne de silice. La chromatographie est une méthode (analytique ou préparative) permettant de séparer les constituants d’un mélange de par leurs différences d’interactions entre une phase stationnaire et une phase mobile. Dans le cas de la chromatographie d’adsorption, le mélange à séparer est déposé à une extrémité de la phase stationnaire (un solide très divisé tel que la silice) et est entrainé par la phase mobile liquide (ou éluant), tel qu’un solvant organique ou un mélange de solvants. Les composés passent d’une phase à l’autre en continu et migrent différemment entre elles selon l’intensité des interactions (de type dipolaires et hydrogènes). La C.C.M. est composée d’une phase stationnaire sous forme de couche sur un support inerte (aluminium) que l’éluant parcourt par capillarité. Ensuite, on localise les différents constituants au niveau de la phase stationnaire par une méthode de révélation (par exemple : UV à 365 nm). Dans des conditions précises, on peut caractériser un composé grâce à son Rf (retarding factor) calculé par le rapport de la distance qu’il a parcourue et celle parcourue par le front du solvant. Quant à la chromatographie sur colonne, le mélange est déposé en haut d’une colonne cylindrique de phase stationnaire et est adsorbé en formant un disque. Contrairement à la C.C.M., l’éluant descend par gravité ou par ajout d'une pression. La recristallisation Cette méthode a pour but de purifier des composés solides à température ambiante. Le principe de cette méthode est basé sur les différences de solubilités en fonction de la température. En effet, le composé à purifier doit être bien soluble à chaud mais très peu à froid, tandis que les impuretés organiques doivent être solubles à froid. La recristallisation s’effectue en cinq étapes : tout d’abord, on ajoute un minimum de solvant à chaud afin de mettre en solution tout le composé solide, puis on laisse refroidir lentement la solution, pour éviter que les impuretés ne restent piégées dans le réseau cristallin. 9 Ensuite, on effectue l’essorage des cristaux ainsi formés (sur Büchner par exemple) puis on les "lave" avec du solvant froid afin d’éliminer les impuretés en surface et ne pas solubiliser les cristaux. Pour finir, on laisse sécher ces cristaux. Dans notre cas, l’acide acétique et le toluène sont de bons solvants à chaud pour le CMONS et mauvais à froid. De plus, leurs températures d’ébullition (respectivement 118°C et 111°C [8]) sont inférieures à celle du CMONS qui est de 160°C [4]. Ces solvants sont donc bien adaptés à cette méthode. Principaux matériels utilisés En premier lieu, le chauffage à reflux permet d’accélérer ou de rendre possible une réaction chimique (les synthèses organiques étant généralement lentes). Il n’y a pas de perte de matière (produit ou réactif) par évaporation grâce au réfrigérant à boules à l’intérieur duquel les vapeurs se condensent pour retomber dans la vase de réaction. J’ai également utilisé une ampoule à décanter pour effectuer une extraction liquideliquide. Il s’agit d’une méthode de séparation (par gravité) de plusieurs phases non-miscibles, qui repose sur la différence de densités des deux phases. Dans notre cas, le solvant halogéné (dichlorométhane) constitue la phase organique et se trouve en dessous de la phase aqueuse car sa densité est supérieure à 1. Ainsi il a été facile de ne récupérer que la phase organique. Ensuite, la filtration sous vide avec Büchner permet à la fois d’isoler rapidement le produit de synthèse solide de la solution, de le sécher plus efficacement mais encore de le purifier de toutes les impuretés solubles dans le solvant qui seront ensuite emportées dans le filtrat. Pour finir, l’évaporateur rotatif ou rotavap permet, entre autre, de distiller des suspensions ou des solutions dans le but de les concentrer à sec en enlevant tout le solvant. Cet appareil assure une rotation pour homogénéiser le milieu, un chauffage en fonction de la température d’ébullition du solvant à évaporer pour accélérer l’évaporation, ainsi qu’un réfrigérant pour éviter la perte de matière, et enfin permet une distillation sous vide pour diminuer la température nécessaire à l’évaporation. 10 3. Nanocristallisation de molécules organiques en matrice sol-gel Au cours de ce stage, Joséphine ZIMMERMANN m’a présenté son sujet de thèse et m’a montré comment élaborer des nanoparticules hybrides cœur-coquilles. Cependant, je n’ai pas pu manipuler sur le réacteur pneumatique car ce matériel est beaucoup trop précieux pour sa thèse. Néanmoins, je consacre tout de même cette partie à l’étude de cette nanocristallisation, à l’intérieur de laquelle le CMONS est utilisé, du fait de ses propriétés de fluorescence a) Généralités Les nanoparticules étant des matériaux hybrides organo-minéraux, je vais d'abord donner une définition de ce type de matériaux. Ensuite, je vais expliquer et donner le principe d’un des procédés (appelé "sol-gel") qui permet d’élaborer ces matériaux. Définition des matériaux hybrides organo-minéraux Comme leur nom l’indique, les matériaux hybrides organo-minéraux sont constitués aussi bien de composants organiques qu'inorganiques et leurs propriétés résultent à la fois de celles de chacun des composants ainsi que de la nature de l’interface organo-minérale au sein de laquelle les interactions peuvent être des liaisons faibles (Van der Waal ou hydrogène) ou bien des liaisons chimiques fortes (covalentes ou iono-covalentes). De nos jours, la synthèse des matériaux hybrides liés de manière covalente est la plus répandue et consiste à greffer des molécules organiques à des chaînes polymères, permettant ainsi une très bonne association des propriétés à la fois optiques, thermiques et électriques des particules inorganiques ainsi que les propriétés physico-chimiques des matériaux polymères. On utilise par exemple ces matériaux pour les revêtements colorés, les revêtements des automobiles, la protection ou encore la résistance des surfaces. Une autre méthode d'élaboration de ces matériaux est de piéger des molécules organiques dans un réseau minéral par interaction faible et c'est celle-ci qui est utilisé lors de cette thèse. Définition et principe du procédé sol-gel Dans le cadre de la synthèse des nanoparticules hybrides composées d’un nanocristal organique fluorescent confiné dans une coquille silicatée (par méthode non covalente), la voie sol-gel est le procédé qui a permis cette élaboration de matériaux hybrides. 11 Au cours du procédé sol-gel (contraction de solution-gélification) le système passe par trois états : liquide, sol puis gel, où un sol est une dispersion stable de particules colloïdales dans un liquide et un gel un réseau tridimensionnel d’oxyde gonflé par le solvant. Ce procédé consiste à faire réagir entre eux des précurseurs (ici des alcoxydes de silicium) pour former un réseau amorphe silicaté par polymérisation permettant d’emprisonner les nanocristaux organiques. La chimie sol-gel se décompose en deux réactions : tout d’abord a lieu l’hydrolyse des groupements alcoxydes, puis la condensation qui fait croître les chaînes silicatées. Dans un premier temps, l’activation des réactions a lieu lors de la mise en contact des précurseurs et d’un mélange eau/solvant. L’hydrolyse (1) repose sur la conversion d’un R3Si-OR + H2O R3Si-OH + (1) ROH groupement alcoxyde (-OR) en un groupement hydroxyle (-OH) par substitution nucléophile sur l’atome de silicium et entraine la libération d’une molécule d’alcool. Lors de la condensation, des molécules hydrolysées silanols R3Si–OH (ou partiellement hydrolysées) réagissent entre elles ou avec des alcoxydes non hydrolysés afin de former des ponts siloxanes Si-O-Si. On distingue alors deux mécanismes : l'oxalation (2) qui a lieu entre deux alcoxydes hydrolysés et l'alcoxolation (3) qui survient entre un alcoxyde partiellement hydrolysé et un non hydrolysé. condensation avec déshydratation R3Si-OH + HO-SiR3 R3Si- O -SiR3 + H2O (2) ROH (3) hydrolyse condensation avec désalcoolisation R3Si-OR + HO-SiR3 R3Si- O -SiR3 + alcoolyse J'ai eu la possibilité de manipuler avec Marine LIOTAUD (ingénieur de recherche) dans une boîte à gant afin de préparer une solution sol-gel composé de deux alcoxydes de silicium : le tétraméthoxysilane (TMOS) et le 1,2-bis(triméthoxysilyl)éthane (TMSE). La réaction d'hydrolyse a été catalysée par ajout de HCL dans la solution. 12 b) Synthèse des nanocristaux organiques en matrice sol-gel Principe et montage La formation de nanoparticules hybrides cœur organique et coquille silicatée a lieu à partir d'une solution contenant : des alcoxydes de silicium (précurseurs, par exemple un mélange TMOS/TMSE [4]) hydrolysés et condensés, le solvant (ici le THF) ainsi que le fluorophore organique (par exemple du CMONS). Ce sol est nébulisé pour former de fines gouttelettes qui seront soumises à une forte évaporation dans un four tubulaire de façon à entrainer la formation d'un réseau silicaté dans chaque gouttelette (Annexe 5). Ce réseau va former une croûte dense en surface des gouttes au cœur desquelles aura lieu la nucléation et la croissance de la phase organique aboutissant ainsi à la conception d'un monocristal organique (contenu dans le cœur) et d'une matrice silicatée (coquille). Au cours de la seconde partie de mon stage, Joséphine ZIMMERMANN m'a présenté le réacteur pneumatique permettant de former les nanoparticules [4] (Annexe 5). On introduit notre solution à nébuliser dans un récipient hermétique d'où sortent 2 capillaires, l'un permettant de transporter la solution vers la buse de nébulisation et l'autre qui permet le retour du liquide n'ayant pas été nébulisé. La buse de nébulisation est utilisée pour fragmenter un film de solution grâce au flux perpendiculaire d'un gaz sous pression (ici de l'azote). A l'intérieur de la buse, un rétrécissement de la zone et l'arrivée du gaz sous pression crée une dépressurisation et permet d'aspirer le liquide par effet Venturi. A la sortie, l'aérosol rencontre un flux laminaire d'air comprimé servant à le transporter tout au long du four en évitant collisions et contacts entre particules. Le four chauffé à 150°C favorise l'évaporation du solvant et le séchage des gouttes. Pour finir, un filtre électrostatique se trouve à la sortie du four et permet de récolter les particules par application d'une tension. Celui-ci est chauffé à 140°C afin d'assurer un séchage total des particules et d'empêcher la condensation des vapeurs en sortie du four. Enfin, on récupère les particules dans une solution de soude (0,1 M). Ce traitement basique permet à la fois de dissocier les particules les unes des autres et de les charger négativement afin d'obtenir une suspension colloïdale stable. Observation des nanoparticules La microscopie électronique à balayage (MEB) permet d'observer avec précision la morphologie de surface des nanoparticules (forme, taille) et de s'assurer du bon conditionnement du nanocristal organique dans la coquille silicatée. De plus, ce microscope permet de déterminer la composition chimique des matériaux par interaction électron-matière. 13 Marine LIOTAUD m'a montré et expliqué le principe et le fonctionnement du microscope électronique à balayage. Nous avons observé des gouttelettes de progestérone que nous venions de former grâce à un tout autre appareil : le propulseur ultrasonique. Il s'agit d'une solution de progestérone injectée par une fine pipette en direction d'une sonde émettant des ultrasons de façon à observer la formation d'un nuage blanc de microgouttelettes. Nous avons remarqué grâce au MEB que lorsque la concentration de la solution diminuait, les gouttelettes devenaient rondes (900 nm à 3μm) au lieu de former des baguettes. Le principe de la microscopie électronique à balayage repose sur l'interaction électronmatière. Cette technique consiste en l'émission par un filament de tungstène d'un faisceau focalisé d'électrons à la surface de l'échantillon. Du fait de l'interaction entre les électrons du faisceau et ceux de la matière, différents électrons (secondaires, rétrodiffusés, rayon X) seront réémis. Les électrons secondaires donnent une information sur la topographie tandis que les électrons rétrodiffusés informent sur les couches profondes et dépendent des numéros atomiques des éléments qui composent l'échantillon. En annexe est présentée une image MEB issu d'une publication scientifique de l'équipe montrant des nanoparticules hybrides tout à fait sphériques, sans coalescence et dont la phase organique a parfaitement été encapsulée dans la coquille silicatée (a), ainsi que des particules non sphérique formant des amas (b) (Annexe 6). Chaque étape, de la synthèse du CMONS à la nanocristallisation, m'a beaucoup apporté et m'a fait découvrir de nouveaux procédés et techniques. C'est pourquoi j'ai voulu consacrer une partie de mon rapport aux apports de ce stage. IV) Apports du stage Tout d'abord, ce stage m'a beaucoup apporté au niveau des manipulations en laboratoire (surtout en ce qui concerne les étapes de purification) et m'a permis de découvrir de nouvelles méthodes telles que la chromatographie sur colonne, la spectroscopie de résonnance magnétique nucléaire (RMN) ou encore la microscopie électronique à balayage (qui m'a d'ailleurs beaucoup impressionné). De plus, la lecture d'une thèse et les enseignements des personnes m'encadrant m'ont permis d'acquérir des connaissances théoriques diverses (notamment en nanochimie). Pour finir, travailler un mois dans ce laboratoire m'a permis de me familiariser davantage avec les notions de sécurité, d'hygiène et d'environnement à respecter en chimie. 14 Mais les connaissances n'ont pas été le seul apport de ce stage car celui-ci m'a fait découvrir un univers qui m'était absolument inconnu auparavant. En effet, j'ai été agréablement surprise de remarquer que les relations interpersonnelles semblaient proches et pleines d'entraides et que l'environnement était très agréable et détendu. Le travail des professionnels semblait conséquent et chargé mais sans être continuellement stressant, ce qui m'a rassurée car, imaginant le contraire, cela m'angoissais pour ma carrière future. D'autre part, durant ce stage j'ai travaillé dans le bureau de trois stagiaires de niveau Master et cela a été très enrichissant de discuter avec eux de leur stage et de leur formation. J'ai aussi pu découvrir comment s'organisait leur stage et ce qui est attendu de celui-ci. De plus, j'ai assisté à la présentation de leur poster ainsi qu'à une soutenance en anglais et cela a été très passionnant et instructif d'y assister, du point de vue scientifique comme du déroulement d'un oral. V) Conclusion L'objectif de ce stage était de synthétiser et de purifier une molécule organique fluorescente à l'état cristallin qui est ensuite utilisée pour former des nanoparticules hybrides pour une utilisation en tant que traceur biologique. Ce premier objectif a été rempli et nous avons pu vérifier la pureté du produit synthétisée notamment par spectroscopie de résonnance magnétique nucléaire. D'autre part, un de mes objectifs personnels était de réfléchir à propos de mon choix d'étude et je peux désormais affirmer que ce stage m'a énormément motivée et a suscité chez moi un désir de continuer dans ma formation et de parvenir jusqu'au bout. De plus, j'ai à la fois découvert une nouvelle discipline (la nanochimie) qui m'a beaucoup émerveillé, mais également un métier qui m'était jusqu'alors inconnu (chercheur) et qui m'a semblé très passionnant. C'est pourquoi je pense que le dispositif de stage d'excellence est une occasion unique de se forger une première idée à propos d'un environnement que nous n'avons pas l'occasion de fréquenter quotidiennement : le monde de la recherche. Pour conclure sur ce mois de stage, celui-ci m'a autant apporté sur le point de vue intellectuel que relationnel et bien que ma timidité fut la difficulté majeure rencontrée, j'en retiens une formidable première expérience professionnelle, qui plus est dans un secteur m'attirant pour ma carrière future. 15 VI) Références bibliographiques [1] Publications : Fluorescent organic nanocrystal confined in sol-gel matric for bio-imaging. C.Philippot, F.Dubois, M. Bacia, E. Djurado, A. Ibanez, Conference information: 15th International Sol-gel conference (SOLGEL 2009), AUG 23-27, 2009 Porto de Galinhas, BRAZIL, J. Sol-gel Sci. technol., 2011, 57, 253-257. [2] Core-shell and doped silicate nanoparticles preparated by a spray-drying process for the development of biological luminescent tracers. C. Philippot, F. Dubois, A. Bourdolle, O. Maury, B. Boury, C. Andraud, A. Ibanez, Nonlinear optics and quantum optics, 45 (1-2), 141-151 (2012). [3] Doped silica nanoparticles containing two-photon luminescent Eu(III) complexes for the development of water stable bio-labels, C. Philippot, A. Bourdolle, O. Maury, F. Dubois, b. Boury, S. Brustlein, S. Brasselet, C. Andraud, A. Ibanez, J. Mat. Chem. 2011, 21, 18613-18622.7 [4] New core-shell hybrid nanoparticles for biophotonics: fluorescent organic nanocrystals confined in organosilicate spheres, C.Philippot, F. Dubois, M. Maurin, B. Boury, A.Prat, A. Ibanez, J. Mat. Chem. 2012, 22, 11370-11378 [5] Thèse : Cécile PHILIPPOT. Elaboration et caractérisation de nanocristaux organiques fluorescents insérés en coquille sol-gel : vers le développement d'un nouveau type d'agent imageant. Thèse Chimie Physique Moléculaire et Structurale. Grenoble : Université de Grenoble, 2010, 219 p. Sites internet : [6] Site web du CNRS : http://www.cnrs.fr/ [7] Site web de l'Institut Néel : http://neel.cnrs.fr/ [8] Site web du fournisseur Sigma Aldrich : http://www.sigmaaldrich.com/france.html 16 VII) ANNEXES 17 Annexe 1 Organigramme de l’Institut Néel. Annexe 2 H 3C O O N + O - N CMONS (α-[(4'-méthoxyphényl) méthylène]-4-nitro-benzèneacétonitrile) Photographies d'une poudre de nanoparticules dopées en CMONS sous lumière blanche (gauche) et sous UV à 365 nm (droite). Schéma du mécanisme de fluorescence. Annexe 3 Photographies du CMONS purifié ayant cristallisé lentement (haut) et rapidement (bas). 7.629 Annexe 4 8 . 3 8 2 . 9 3 0 7 0 . 8 5 5 7 . 8 2 4 3.0 2.0 2.02.0 2.0 1.0 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Analyse du CMONS purifié par RMN (Résonnance Magnétique Nucléaire) du proton dans le CDCl3. 0 Annexe 5 Schéma du montage de synthèse des nanoparticules et évolution dans le four tubulaire d'une goutte issue de la nébulisation. Photographie du montage représentant le réacteur pneumatique associé au four tubulaire et au filtre électrostatique. Annexe 6 Photographies au MEB (Microscope Electronique à Balayage) de nanoparticules hybrides cœur-coquille.
