Microscopie photonique - Site d`Olivier Sigwarth
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Microscopie photonique Plan • • • • • • • Lumière et interactions avec la matière Formation de l’image Microscopies en fond clair / fond noir Microscopies de phase et interférentielle Microscopie de fluorescence Microscopie confocale Capteurs d’images Nature de la lumière • L’élément constituant de la lumière est le photon • Le photon est de nature duale : onde / corpuscule – onde électromagnétique lors de son trajet – corpuscule lors d’une interaction avec la matière • Un rayon lumineux est un flux parallèle de photons Le photon : onde électromagnétique longueur d’onde (λ) E H Sens de propagation Le photon : longueur d’onde = couleur bleu λ ≅ 450 nm vert λ ≅ 520 nm rouge λ ≅ 680 nm Monochromatisme - Lumière blanche Faisceau monochromatique bleu ( λ ≅ 450±10 nm) Faisceau monochromatique rouge ( λ ≅ 650±10 nm) Faisceau polychromatique blanc ( λ [400..700] nm) Lumière : spectre visible 500nm 500nm 600nm 600nm 700nm 700nm Infrarouges Ultraviolets 400nm 400nm Lumière - polarisation E E H H axe de vibration Faisceau polarisé Faisceau non-polarisé Interactions lumière-matières • Absorption – atténuation, réduction du nombre de photons – filtrage, sélection de longueurs d’onde • Réfraction – retard, déphasage – déviation, séparation de longueurs d’onde – biréfringence • Réflexion • Diffraction – interférences, filtrage • Fluorescence - Transfert d’énergie Absorption de la lumière - Atténuation I I0 I < I0 Absorbance : I0 / I Matériau absorbant Absorption sélective (filtrage) Lumière filtrée Lumière blanche grandes longueurs d’onde Matériau absorbant sélectif Réfraction - vitesse de propagation n1 Indice de réfraction : n2 n1 ni = c / νi n1 ≅ 2,25 n2 ni varie en légèrement fonction de λ Réfraction - Déphasage n2 n1 Réfraction - Déviation (monochromatique) n1 sin α1 = n2 sin α2 α1 α1 n1 n1 n2 n2 α2 n1 > n2 α2 n1 < n2 Réfraction - Déviation (monochromatique) α1 n1 αc n1 n2 α2 n1 > n2 n2 angle critique ⇒ réflection Réfraction - Déviation (polychromatique) α1 n1 > n2 α1 n1 n1 n2 n2 Dispersion des couleurs Séparateur de longueurs d’onde Biréfringence Rayons parallèles polarisés orthogonalement Lumière monochromatique non-polarisée Milieu anisotrope (Calcite CaCO3) Diffraction - Dispersion de la lumière Rayons diffractés Rayon incident Diffraction et interférences x I franges d’interférence Ecran Fluorescence - principe e1 = hν1 Absorption e1 > e2 λ1 < λ2 noyau orbitale haute (état excité) Emission e2 = hν2 noyau orbitale basse (état de repos) Formation de l’image • Définition d’une lentille convergente – Chemins optiques • Optique limitée par la diffraction – Disque de Airy – Pouvoir séparateur • Ouverture numérique • Abérrations Lentille objectif Foyer objet Foyer image Fronts d’onde Optique limitée par la diffraction Source ponctuelle rayons diffractés Plan image Formation de l’image - Diffraction Image obtenue (disque de Airy) intensité intensité Image idéale d’un point distribution idéale fonction d’étalement (PSF) intensité intensité Pouvoir séparateur points résolus points non-résolus Effet de l’ouverture numérique α iris D α iris α Ouverture numérique NA = n sin α, D: distance de travail Résolution - Pouvoir séparateur d’un objectif Résolution latérale 1,22 λ 1,22 λ Rx = = 2 n sin α 2 NA intensité R points résolus Résolution axiale 4λ 4λ Rz = = 2 (n sin α) 2 NA Profondeur de champ λ ∆Z = NA 2 4n 1- 1- n [ ( )] Objectifs “à air” ou “à immersion” liquide d’immersion B C A B A C n n n n 3 2 1 1 n2 ≠ n1 n3 ≅ n1 Objectif à sec Objectif à immersion Abérration chromatique Sans correction Avec correction angles de réfraction : rouge < vert < magenta Lentille divergente Fond clair : illumination critique objet source lentille collectrice plan objet image de la source objectif
