TP surrenalectomie

TP surrenalectomie
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Simonnet Jean
Chateigner Aurélien

Introduction
Les glandes surrénales, situées dans la partie postérieure des reins, sont des glandes endocrines
impliquées dans différents phénomènes. Anatomiquement, on distingue deux parties qui
correspondent en fait à deux glandes distinctes. La partie extérieure constitue la corticosurrénale et
la partie intérieure est la médullosurrénale. Ces deux parties sécrètent des hormones différentes,
d’une part des stéroïdes, et d’autre part des catécholamines.
On va donc tenter de déterminer le rôle des sécrétions de cette glande sur l’organisme, en
déterminant les conséquences de l’ablation de ces glandes, chez la souris, sur des paramètres
biologiques et métaboliques (métabolisme glucidique). On corrèlera les résultats, relatifs à la
variation de poids des souris et à l’activité du métabolisme glucidique, avec l’action des différentes
hormones sécrétées par la surrénale pour déterminer les molécules impliquées dans les variations
observées.
Matériel et méthode
On va créer 3 lots de souris : les surrénalectomisées, les « opérées à blanc » ou « Sham » et les souris
témoins. Les surrénalectomisées (S) sont les souris « test », et on va comparer les résultats obtenus
pour ce lot avec les souris Témoins (T), qui ne sont pas opérées du tout, et avec les Sham (Sh), qui
subissent les mêmes opérations chirurgicales, à la différence que les surrénales ne sont pas retirées.
L’utilisation de ce dernier lot de souris permet de montrer les conséquences d’un simple geste invasif
similaire à l’opération effectuée sur les souris S, pour reproduire ce que l’on appelle communément
le stress de l’opération : on élimine des variables pour la comparaison des lots. Le rôle des sécrétions
de la surrénale pourra être en partie apprécié de cette façon (on ne testera pas tout les paramètres
physiologiques sur lesquels ces sécrétions jouent un rôle).
Manipulations pré-opératoires
Avant l’opération (pour les animaux opérés ou non), il faut peser l’animal, pour être capable
d’observer la variation de poids 15 jours après l’opération. La pesée se fait simplement, en déposant
la souris dans une boite posée sur une balance tarée (balance adaptée à ce type de mesure, car
l’animal bougeant sans cesse, une balance « normale » ne pourrait pas se stabiliser à une valeur
précise). L’animal passant alors son temps à renifler la boite, sa pesée se fait facilement.
Opération
Cette opération, assez délicate à effectuer car les reins sont des organes essentiels au bon
fonctionnement de l’organisme et qui ne doivent pas être lésés lors de la manipulation, s’effectue
sous anesthésie générale de la souris à l’isoflurane. Le but de cette anesthésie est d’abaisser la
conscience de l’animal, d’arrêter la douleur (effet antalgique) et d’entrainer une myorelaxation. En
effet, ceci est essentiel pour un bon déroulement de l’opération (l’animal ne bouge pas et ne souffre
pas). De plus, la myorelaxation apporte du confort à l’expérimentateur. On utilise un anesthésique
gazeux, administré grâce à un compresseur et une série de tuyaux : l’isoflurane. C’est un gaz
halogéné, qui permet une induction anesthésique rapide : on place la souris dans une chambre
d’anesthésie où le gaz est apporté. Une fois la narcose induite, on transfère l’animal sur une plaque
d’opération comportant une arrivée de gaz s’apparentant à un masque, adapté à la souris.
L’anesthésie est donc maintenue grâce à ce système, durant toute l’opération (le système employé
permet une récupération du gaz, de ce fait l’expérimentateur n’est pas exposé).

L’anesthésique utilisé permet un réveil rapide de l’animal. Au bout d’environ 30 minutes, il est
possible de juger si l’animal est rétabli ou non. S’il souffre, l’euthanasie est inévitable.
Le dosage d’isoflurane employé permet de préserver les centres nerveux végétatifs, nécessaires à la
survie de l’animal, notamment une préservation des centres de la respiration.
Précautions à prendre lors des manipulations : Les expériences pratiquées sont des expériences avec
réveil, et donc les manipulations ne se font pas dans les mêmes conditions qu’en cas d’euthanasie en
fin d’opération. Il faut ici respecter des consignes d’hygiène plus strictes, bien désinfecter les zones à
risque, et utiliser une poudre antiseptique avant de refermer. Toutes ces consignes sont à suivre
dans le but du réveil de l’animal, et d’éviter toute complication. De même, par exemple, il vaut mieux
couper la peau de façon nette, de sorte qu’il est plus facile de suturer en fin d’opération.
Déroulement de l’opération : On doit donc retirer les surrénales aux souris, après avoir réalisé une
ouverture du plan musculaire juste en dessous des côtes, dans la partie dorsale (droite ou gauche).
Les côtes sont un très bon repère, et une incision au bon endroit donne directement accès aux
glandes, qui sont d’une coloration légèrement plus rouge que la graisse les entourant. On doit
prendre des précautions pour ne pas léser les reins lors de l’opération, car ceux-ci dont très fragiles,
et une manipulation non précautionneuse entrainerait un disfonctionnement des reins, qui
n’assureraient plus leur rôle de nettoyage du sang, ce qui entrainerait la mort de l’animal. Pour les
shams, on effectue les mêmes gestes, sans retirer les surrénales.
Mesure
Quinze jours après l’opération, on réalise des prélèvements qui vont nous permettre d’apprécier les
conséquences de la surrénalectomie. On réalise les mesures pour les souris opérées, les shams et les
témoins.
On commence par peser l’animal, on observera la variation de poids causée par cette opération.
On réalise ensuite une perfusion intracardiaque de sang (méthode la plus rapide pour un
prélèvement sanguin de cet importance sur la souris, mais pas des plus évidentes, réalisée par le
professeur), sur la souris anesthésiée à l’isoflurane, qui nous permettra de mesurer la glycémie.
Directement après avoir prélevé, on dilue au 10ème l’échantillon sanguin, pour éviter toute
coagulation ou hémolyse. Pour ce faire, on prélève 100µL de sang que l’on place dans 900µl de
sérum physiologique. On centrifuge ensuite (3000 t/min à 15°C pendant 5min) pour récupérer un
surnageant de plasma sanguin (ici c’est du plasma et non du sérum car c’est du sang non coagulé)
dilué 10 fois. C’est dans ce surnageant que le glucose sanguin est présent. On lit l’absorbance à
505nm. On réalise des solutions de glucose à diverses concentrations, entre 1 et 0 g/L, puis on fait
réagir le Trinder, dans les mêmes conditions que précédemment. On mesure ensuite l’absorbance de
chaque solution à 505nm. On réalise donc une courbe de l’absorbance en fonction de la
concentration en glucose (courbe étalon). On pourra ainsi déterminer la glycémie.
On prélève le foie après sacrifice de la souris. On place une certaine quantité de celui-ci dans de
l’acide perchlorique (HClO4), à raison de 5µl par mg. On prend environ 500mg de foie dans un souci
d’économie de solution. La solution est ensuite passée au sonicateur, pour broyer les tissus. L’action
de l’acide perchlorique ainsi que la sonication vont permettre une libération des contenus cellulaires.
notament le glucose, le glycogène et les protéines. On dilue par moitié cette solution avec du tampon

acétate pour rétablir un pH plus ou moins neutre, pour permettre ensuite les différents dosages
(réactions doivent se faire à un pH particulier).
Pour le dosage du glucose hépatique, on prend de l’homogénat dans un tube Eppendorf que l’on
centrifuge. On récupère le surnageant pour doser le glucose. On utilise la même méthode de dosage
que pour la glycémie. Pour le glycogène hépatique, on réalise un protocole relativement similaire, qui
diffère juste par la digestion par l’amyloglucosidase. L’action de cette enzyme va permettre une
dégradation du glycogène en glucose. On pourra ensuite doser le glucose total présent (toujours en
utilisant la même méthode), dans la solution, qui correspond alors au glycogène dégradé en glucose
et au glucose déjà présent dans la cellule. On aura ensuite seulement à soustraire à cette valeur, le
taux de glucose hépatique. On réalise ensuite un dosage des protéines par la méthode utilisant le
réactif de Bradford (lecture d’absorbance à 595 nm), et on pourra alors ramener les valeurs des
précédents dosages par rapport au taux de protéines. Ceci permet de pouvoir comparer les résultats
entre eux par la suite, car le taux de protéine évalue la quantité de tissu et de cellules.
Résultats
Nous avons exclu beaucoup de résultats de notre étude, et de par leur nombre important, nous nous
devons de donner quelques explications. Pour 3 raisons diverses, on a clairement 3 types de résultats
à exclure :
 Le taux de glucose hépatique est faiblement inférieur au taux de glycogène hépatique : c’est
le cas pour le Témoin 1, les Sham 2 et 5 et les surrénalectomisés 3, 6 et 7.
 Le taux de glucose hépatique est égal au taux de glycogène hépatique : c’est le cas du Sham 4
et du surrénalectomisé 4.
 Le taux de glucose hépatique est supérieur au taux de glycogène hépatique : c’est le cas du
Sham 3 et du surrénalectomisé 5.
Chez les témoins dont on conserve les résultats (témoins 2 et 3), on trouve un rapport glycogène
intracellulaire/glucose intracellulaire moyen de 10 pour les cellules hépatiques. Cela s’explique par le
fait que la souris a normalement des réserves de glycogène dans les cellules de son foie, qui servent à
pallier à un manque ; ainsi, le taux de glucose présent dans la cellule, et qui va sortir ou être stocké,
est nécessairement largement inférieur. Ce rapport n’est pas respecté pour un bon nombre de
souris, d’où leur exclusion. Tous ces cas sont dus à une erreur principale lors des manipulations : dans
l’un des groupes d’expérimentateurs, on a utilisé deux fois la même solution, et non une fois celle de
glucose et une fois celle de glycogène dégradé. C’est pour cette raison que l’on n’obtient pas de
différence significative pour certains résultats.
Glycémie
Glucose hépatique
Glycogène hépatique
Poids avant
Poids après
Témoin 2
1,25
133
1050
28,4
26,7
Témoin 3
1,25
92
1105
26,6
21,5
Moyenne
1,25
112,5
1077,5
27,5
24,1
Sham 1
0,85
60
820
35,6
33,7
Sham 6
1,28
263
1879
24,6
25,8
Moyenne
1,065
161,5
1349,5
30,1
29,75
Surrénalectomisé 1
0,85
19
88
28,2
22,3
Surrénalectomisé 2
0,85
39
190
29,5
22,7
Moyenne
0,85
29
139
28,85
22,5

Synthèse des résultats
Globalement, on observe donc une très nette diminution du glycogène et du glucose hépatique, une
glycémie qui ne varie pas significativement. On observe également une perte de poids relativement
importante pour les surrénalectomisées mais pas pour les shams et les témoins