TP surrenalectomie

TP surrenalectomie
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Simonnet Jean
Chateigner Aurélien
Introduction
Les glandes surrénales, situées dans la partie postérieure des reins, sont des glandes endocrines
impliquées dans différents phénomènes. Anatomiquement, on distingue deux parties qui
correspondent en fait à deux glandes distinctes. La partie extérieure constitue la corticosurrénale et
la partie intérieure est la médullosurrénale. Ces deux parties sécrètent des hormones différentes,
d’une part des stéroïdes, et d’autre part des catécholamines.
On va donc tenter de déterminer le rôle des sécrétions de cette glande sur l’organisme, en
déterminant les conséquences de l’ablation de ces glandes, chez la souris, sur des paramètres
biologiques et métaboliques (métabolisme glucidique). On corrèlera les résultats, relatifs à la
variation de poids des souris et à l’activité du métabolisme glucidique, avec l’action des différentes
hormones sécrétées par la surrénale pour déterminer les molécules impliquées dans les variations
observées.
Matériel et méthode
On va créer 3 lots de souris : les surrénalectomisées, les « opérées à blanc » ou « Sham » et les souris
témoins. Les surrénalectomisées (S) sont les souris « test », et on va comparer les résultats obtenus
pour ce lot avec les souris Témoins (T), qui ne sont pas opérées du tout, et avec les Sham (Sh), qui
subissent les mêmes opérations chirurgicales, à la différence que les surrénales ne sont pas retirées.
L’utilisation de ce dernier lot de souris permet de montrer les conséquences d’un simple geste invasif
similaire à l’opération effectuée sur les souris S, pour reproduire ce que l’on appelle communément
le stress de l’opération : on élimine des variables pour la comparaison des lots. Le rôle des sécrétions
de la surrénale pourra être en partie apprécié de cette façon (on ne testera pas tout les paramètres
physiologiques sur lesquels ces sécrétions jouent un rôle).
Manipulations pré-opératoires
Avant l’opération (pour les animaux opérés ou non), il faut peser l’animal, pour être capable
d’observer la variation de poids 15 jours après l’opération. La pesée se fait simplement, en déposant
la souris dans une boite posée sur une balance tarée (balance adaptée à ce type de mesure, car
l’animal bougeant sans cesse, une balance « normale » ne pourrait pas se stabiliser à une valeur
précise). L’animal passant alors son temps à renifler la boite, sa pesée se fait facilement.
Opération
Cette opération, assez délicate à effectuer car les reins sont des organes essentiels au bon
fonctionnement de l’organisme et qui ne doivent pas être lésés lors de la manipulation, s’effectue
sous anesthésie générale de la souris à l’isoflurane. Le but de cette anesthésie est d’abaisser la
conscience de l’animal, d’arrêter la douleur (effet antalgique) et d’entrainer une myorelaxation. En
effet, ceci est essentiel pour un bon déroulement de l’opération (l’animal ne bouge pas et ne souffre
pas). De plus, la myorelaxation apporte du confort à l’expérimentateur. On utilise un anesthésique
gazeux, administré grâce à un compresseur et une série de tuyaux : l’isoflurane. C’est un gaz
halogéné, qui permet une induction anesthésique rapide : on place la souris dans une chambre
d’anesthésie où le gaz est apporté. Une fois la narcose induite, on transfère l’animal sur une plaque
d’opération comportant une arrivée de gaz s’apparentant à un masque, adapté à la souris.
L’anesthésie est donc maintenue grâce à ce système, durant toute l’opération (le système employé
permet une récupération du gaz, de ce fait l’expérimentateur n’est pas exposé).
L’anesthésique utilisé permet un réveil rapide de l’animal. Au bout d’environ 30 minutes, il est
possible de juger si l’animal est rétabli ou non. S’il souffre, l’euthanasie est inévitable.
Le dosage d’isoflurane employé permet de préserver les centres nerveux végétatifs, nécessaires à la
survie de l’animal, notamment une préservation des centres de la respiration.
Précautions à prendre lors des manipulations : Les expériences pratiquées sont des expériences avec
réveil, et donc les manipulations ne se font pas dans les mêmes conditions qu’en cas d’euthanasie en
fin d’opération. Il faut ici respecter des consignes d’hygiène plus strictes, bien désinfecter les zones à
risque, et utiliser une poudre antiseptique avant de refermer. Toutes ces consignes sont à suivre
dans le but du réveil de l’animal, et d’éviter toute complication. De même, par exemple, il vaut mieux
couper la peau de façon nette, de sorte qu’il est plus facile de suturer en fin d’opération.
Déroulement de l’opération : On doit donc retirer les surrénales aux souris, après avoir réalisé une
ouverture du plan musculaire juste en dessous des côtes, dans la partie dorsale (droite ou gauche).
Les côtes sont un très bon repère, et une incision au bon endroit donne directement accès aux
glandes, qui sont d’une coloration légèrement plus rouge que la graisse les entourant. On doit
prendre des précautions pour ne pas léser les reins lors de l’opération, car ceux-ci dont très fragiles,
et une manipulation non précautionneuse entrainerait un disfonctionnement des reins, qui
n’assureraient plus leur rôle de nettoyage du sang, ce qui entrainerait la mort de l’animal. Pour les
shams, on effectue les mêmes gestes, sans retirer les surrénales.
Mesure
Quinze jours après l’opération, on réalise des prélèvements qui vont nous permettre d’apprécier les
conséquences de la surrénalectomie. On réalise les mesures pour les souris opérées, les shams et les
témoins.
On commence par peser l’animal, on observera la variation de poids causée par cette opération.
On réalise ensuite une perfusion intracardiaque de sang (méthode la plus rapide pour un
prélèvement sanguin de cet importance sur la souris, mais pas des plus évidentes, réalisée par le
professeur), sur la souris anesthésiée à l’isoflurane, qui nous permettra de mesurer la glycémie.
Directement après avoir prélevé, on dilue au 10ème l’échantillon sanguin, pour éviter toute
coagulation ou hémolyse. Pour ce faire, on prélève 100µL de sang que l’on place dans 900µl de
sérum physiologique. On centrifuge ensuite (3000 t/min à 15°C pendant 5min) pour récupérer un
surnageant de plasma sanguin (ici c’est du plasma et non du sérum car c’est du sang non coagulé)
dilué 10 fois. C’est dans ce surnageant que le glucose sanguin est présent. On lit l’absorbance à
505nm. On réalise des solutions de glucose à diverses concentrations, entre 1 et 0 g/L, puis on fait
réagir le Trinder, dans les mêmes conditions que précédemment. On mesure ensuite l’absorbance de
chaque solution à 505nm. On réalise donc une courbe de l’absorbance en fonction de la
concentration en glucose (courbe étalon). On pourra ainsi déterminer la glycémie.
On prélève le foie après sacrifice de la souris. On place une certaine quantité de celui-ci dans de
l’acide perchlorique (HClO4), à raison de 5µl par mg. On prend environ 500mg de foie dans un souci
d’économie de solution. La solution est ensuite passée au sonicateur, pour broyer les tissus. L’action
de l’acide perchlorique ainsi que la sonication vont permettre une libération des contenus cellulaires.
notament le glucose, le glycogène et les protéines. On dilue par moitié cette solution avec du tampon
acétate pour rétablir un pH plus ou moins neutre, pour permettre ensuite les différents dosages
(réactions doivent se faire à un pH particulier).
Pour le dosage du glucose hépatique, on prend de l’homogénat dans un tube Eppendorf que l’on
centrifuge. On récupère le surnageant pour doser le glucose. On utilise la même méthode de dosage
que pour la glycémie. Pour le glycogène hépatique, on réalise un protocole relativement similaire, qui
diffère juste par la digestion par l’amyloglucosidase. L’action de cette enzyme va permettre une
dégradation du glycogène en glucose. On pourra ensuite doser le glucose total présent (toujours en
utilisant la même méthode), dans la solution, qui correspond alors au glycogène dégradé en glucose
et au glucose déjà présent dans la cellule. On aura ensuite seulement à soustraire à cette valeur, le
taux de glucose hépatique. On réalise ensuite un dosage des protéines par la méthode utilisant le
réactif de Bradford (lecture d’absorbance à 595 nm), et on pourra alors ramener les valeurs des
précédents dosages par rapport au taux de protéines. Ceci permet de pouvoir comparer les résultats
entre eux par la suite, car le taux de protéine évalue la quantité de tissu et de cellules.
Résultats
Nous avons exclu beaucoup de résultats de notre étude, et de par leur nombre important, nous nous
devons de donner quelques explications. Pour 3 raisons diverses, on a clairement 3 types de résultats
à exclure :



Le taux de glucose hépatique est faiblement inférieur au taux de glycogène hépatique : c’est
le cas pour le Témoin 1, les Sham 2 et 5 et les surrénalectomisés 3, 6 et 7.
Le taux de glucose hépatique est égal au taux de glycogène hépatique : c’est le cas du Sham 4
et du surrénalectomisé 4.
Le taux de glucose hépatique est supérieur au taux de glycogène hépatique : c’est le cas du
Sham 3 et du surrénalectomisé 5.
Chez les témoins dont on conserve les résultats (témoins 2 et 3), on trouve un rapport glycogène
intracellulaire/glucose intracellulaire moyen de 10 pour les cellules hépatiques. Cela s’explique par le
fait que la souris a normalement des réserves de glycogène dans les cellules de son foie, qui servent à
pallier à un manque ; ainsi, le taux de glucose présent dans la cellule, et qui va sortir ou être stocké,
est nécessairement largement inférieur. Ce rapport n’est pas respecté pour un bon nombre de
souris, d’où leur exclusion. Tous ces cas sont dus à une erreur principale lors des manipulations : dans
l’un des groupes d’expérimentateurs, on a utilisé deux fois la même solution, et non une fois celle de
glucose et une fois celle de glycogène dégradé. C’est pour cette raison que l’on n’obtient pas de
différence significative pour certains résultats.
Témoin 2
Témoin 3
Moyenne
Sham 1
Sham 6
Moyenne
Surrénalectomisé 1
Surrénalectomisé 2
Moyenne
Glycémie Glucose hépatique Glycogène hépatique Poids avant Poids après
1,25
133
1050
28,4
26,7
1,25
92
1105
26,6
21,5
1,25
112,5
1077,5
27,5
24,1
0,85
60
820
35,6
33,7
1,28
263
1879
24,6
25,8
1,065
161,5
1349,5
30,1
29,75
0,85
19
88
28,2
22,3
0,85
39
190
29,5
22,7
0,85
29
139
28,85
22,5
Synthèse des résultats
Globalement, on observe donc une très nette diminution du glycogène et du glucose hépatique, une
glycémie qui ne varie pas significativement. On observe également une perte de poids relativement
importante pour les surrénalectomisées mais pas pour les shams et les témoins
Discussion
Notons tout d’abord que la perte de poids observée chez les souris opérées est bien due à l’ablation
des surrénales car les shams ne voient pas leur poids varier significativement, ce qui montre bien que
ce n’est pas le stress opératoire qui cause la variation de poids. Les variations de glucose et de
glycogène hépatique sont également significatives pour les mêmes raisons.
Le retrait de la surrénale provoque une chute brutale de la concentration tous les composés qu’elle
synthétise. La corticosurrénale comporte différentes couches qui sont chacune responsables de
synthèses de différentes hormones stéroïdes. La zone appelée zone glomérulée sécrète les
minéralocorticoïdes. La couche fasciculée et la zone réticulée sont elles responsables de la synthèse
de glucocorticoïdes, et d’une partie des stéroïdes sexuels synthétisés par le corps (la plus grande
partie étant synthétisée par les gonades).Toutes ces hormones dérivent bien entendu du cholestérol.
Leur caractère hydrophobe fait que ces hormones agissent sur les tissus cibles via des récepteurs dit
« cytosolique et/ou nucléaire », et vont alors moduler l’expression génique. La médullosurrénale est
responsable de la synthèse de catécholamines, l’adrénaline (80% des hormones synthétisées) et de la
Noradrénaline (20%). De ces deux hormones, l’adrénaline possède l’effet le plus marqué.
Comme on le voit sur le schéma ci-dessus, chez l’homme, on trouve du tissu corticosurrénalien ou
médullosurrénalien à différents endroits (pas seulement au niveau de la surrénale). Notons que
l’homme ne peut pas vivre sans surrénale, alors que la souris survie. On peut penser que la souris
possède proportionnellement plus de tissu surrénalien « diffus » que l’homme, ce qui lui permet de
survivre sans sa surrénale.
Effet des glucocorticoïdes
Figure 1 : Molécule de cortisol : On reconnait le noyau de base du cholestérol, dont la
chaine à 27 atomes de carbones est tronquée, en une chaine possédant 21 carbones,
hydroxylée en C14, C17 et en C21.
Notons d’abord l’effet qu’engendrera le manque de glucocorticostéroïdes. On parlera du cortisol, qui
est l’hormone de ce type majoritairement synthétisée. Bien que cette hormone joue essentiellement
un rôle sur le métabolisme glucidique, comme son nom l’indique (et aussi lipidique). Elle se fixe, au
niveau des cellules cibles sur des récepteur GR (Glucocorticoid réceptor). Ceux-ci sont associés sous
forme d’hétérodimère (dans le cytoplasme ou le noyau, les recherches de ces dernières années
remettent parfois en cause certaines considérations relatives à l’emplacement précis de ces
récepteurs) avec des protéines de choc thermique, qui sont déplacées par fixation du cortisol, et
permettent alors au complexe ligand-récepteur de s’activer en formant un complexe homodimérique
(ligand-récepteur)2. Ce complexe va ensuite agir sur des séquences appelées GRE (Glucocorticoid
Response Element) de l’ADN, et va permettre l’expression génique.
Figure 2 : Action de l’Hormone agissant sur son récepteur et jouant alors le rôle de facteur de transcription. On voit ici
l'hormone stéroïde (H) qui se fixe sur son récepteur et déplace alors la protéine de choc thermique (Hsp90). Le complexe
homodimérique (Hormone-Récepteur)² est ensuite transloqué dans le noyau où il agit sur des séquences HRE, au niveau
des gène cibles, ce qui va induire la transcription de ceux-ci, ce qui abouti à la synthèse d’une protéine.
Figure 3 : Mise en évidence de réponse primaire et de réponse secondaire aux hormones. Le complexe active des gènes
qui vont synthétiser des protéines (réponse primaire) qui vont ensuite aller activer ou réprimer d'autres gènes (réponse
secondaire.
Grâce au cortisol, on aura une activation de la transcription de gènes codant pour des enzymes
intervenant dans le métabolisme glucidique, ce qui va permettre un déplacement de l’équilibre de
certaines réactions dans le sens voulu. Ici, les concentrations en cortisol n’étant plus aussi
importantes, on aura un déplacement de l’équilibre moins important, voir un renversement.
Le cortisol permet la synthèse d’enzymes nécessaires à la néoglucogenèse, synthèse de glucose à
partir de composés non glucidiques (glycérol et acides aminés), et d’enzymes responsables de la
synthèse de glycogènes. Les pools de ces enzymes sont donc plus importants en présence de cortisol.
Il permet également un rôle plus périphérique, en permettant la synthèse d’enzymes impliquées
dans la lipolyse, au niveau du tissu adipeux, et dans la protéolyse, au niveau des cellules musculaires.
Ceci favorisera la néoglucogenèse hépatique : certains des métabolites engendrés au niveau de ces
tissus, que sont des acides aminés et le glycérol, vont ensuite rejoindre le foie pour servir à la
néoglucogenèse. Le cortisol permet donc d’utiliser des stocks non glucidiques pour la synthèse
d’énergie en absence de glucose, ou quand son taux devient trop bas, et favorise d’autre part un
stockage rapide de celui-ci quand il est présent en grande quantité, en prévention d’un manque
futur. Ici la déplétion en cortisol engendre un taux faible des enzymes, dont il régule la synthèse,
dans la cellule hépatique ainsi que dans les cellules adipeuses et musculaires, ce qui ralentit la
branche du métabolisme dans laquelle l’enzyme est impliquée.
Il ne faut pas oublier que cette régulation par le cortisol est un effet à long terme, et que les enzymes
dont il permet la synthèse, ou les voies métaboliques qu’il favorise, subissent une régulation à court
terme qui est notamment dirigée par l’insuline, l’adrénaline ou encore le glucagon. Cette régulation
consiste en l’activation d’enzymes, déjà présentes à l’état latent dans la cellule.
Lors, d’une hyperglycémie (juste après un repas par exemple), l’insuline est sécrétée par le pancréas
et permet la régulation vers le bas de la glycémie et un stockage du glucose sous différentes formes.
Elle va notamment permettre l’activation du pool de glycogène synthétase présent dans la cellule
(notamment la cellule hépatique) et engendrer le stockage sous forme de glycogène. En l’absence de
cortisol, le taux en cet enzyme étant très faible, la synthèse de glycogène se fera moins rapidement
et on aura donc une synthèse plus faible, ce qui est montré par la concentration très faible en
glycogène hépatique.
Lors d’une hypoglycémie, le glucagon est sécrété et permet une régulation vers le haut de la
glycémie, en activant le catabolisme des stocks énergétiques. Il va bien sûr permettre la
glycogénolyse, libérant du glucose, et va activer la néoglucogenèse au niveau du foie, qui va
redonner également du glucose. Le cortisol étant absent, certains des enzymes impliqués dans la
néoglucogenèse présentent un taux moins important, ce qui va constituer un frein pour celle-ci,
expliquant notamment le faible taux de glucose présent dans le foie. De plus, le glucagon active la
lipolyse, mais dans notre cas, les enzymes nécessaires à cette réaction sont également présents à
très faible taux, ce qui engendre alors une faible utilisation des stocks du tissu adipeux. Remarquons
que le manque de glycérol engendré par la faible lipolyse, qui permet normalement la
néoglucogenèse hépatique, ne peut pas être compensé par la protéolyse musculaire, qui, elle aussi,
est inhibée par le manque de cortisol.
Notons que l’insuline activant la lipolyse lors d’une hyperglycémie, un déséquilibre se crée entre
synthèse et dégradation de triglycéride, ce qui engendre une augmentation du stockage de graisse.
On a ici une contradiction avec les résultats obtenus, où l’on constate une baisse de poids
significative.
Le cortisol possède également un rôle sur le maintient des volumes extracellulaires, du même type
que celui des minéralocorticoïdes, mais moins marqué que ceux-ci. Cette caractéristique, des
hormones telles que l’aldostérone, n’est pas à négliger et pourrait même expliquer la perte de poids.
Effet des minéralocorticoïdes
Figure 4 : Molécule d'aldostérone. Comme pour le cortisol, on reconnait la base
du cholestérol, tronquée en une chaine à 21 carbones, hydroxylée en C14, C18
et C21.
Le plus important est l’aldostérone, qui joue sur l’équilibre hydrique de l’organisme. Cette hormone
agit sur la diurèse, et permet sa réduction. Il agit sur le rein, plus exactement au niveau du tube
contourné distal (TCD), où elle induit une réabsorption, dite facultative, des ions sodium (Na+), et
donc de l’eau. Elle contrôle également les déperditions hydriques au niveau des cellules des glandes
sudoripares, du colon ou encore des glandes salivaires. Partout, elle permet une rétention de l’eau.
En son absence, il parait évident que les rétentions hydriques seront moins importantes, et que cette
perte d’eau pourra provoquer une perte de poids. On expliquerait alors la perte de poids, induite par
la surrénalectomie, par cette perte hydrique. Cependant, notons que les minéralocorticoïdes ne sont
pas les seules hormones contrôlant l’équilibre hydrique de l’organisme ; on trouve également l’ADH,
secrétée par l’hypophyse postérieure en cas d’hypotension qui permet une réabsorption de l’eau au
niveau du TCD également. La perte d’eau engendrée par le manque de minéralocorticoïdes (et de
corticoïdes) provoque une hypotension, qui doit normalement être rétablie par l’ADH. Cette
hypothèse émise quant à la perte de poids due à une éventuelle perte hydrique est donc à relativiser,
mais semble être la plus appropriée.
Effet des catécholamines
L’adrénaline est sécrété par la médullosurrénale dans le cas d’une réponse de fuite ou d’attaque,
quand l’animal doit réagir vite face à son environnement. Il est certain que les catécholamines
agissent sur les différents métabolismes, en jouant un rôle à court terme similaire au glucagon en
activant la lipolyse ou encore la glycogénolyse hépatique et musculaire, sollicitant les réserves
énergétiques de l’organisme pour répondre plus efficacement (à cela s’ajoute la réponse du système
nerveux sympathique). Celle-ci n’est normalement sécrétée qu’à des moments de stress, on ne peut
donc pas imputer un des effets observé au manque d’adrénaline, car elle engendre une régulation à
très court terme et très brève.
Conclusion
Grâce à la surrénalectomie, on a mis en évidence certains effets du manque en certaines substances
de cette glande double, sur la souris, et alors montré l’importance biologique de cette glande
endocrine.
On a pu montrer que certaines hormones sécrétées par la corticosurrénale, jouaient un rôle dans le
métabolisme glucidique. On note l’action des glucocorticoïdes qui facilitent la synthèse de glycogène
(montrée ici au niveau du foie) ou encore la néoglucogenèse hépatique, selon le contexte. En effet la
synthèse de glycogène surviendra lors d’une période postprandiale, où la glycémie augmente et ou le
corps fabrique des réserves. Le cortisol aura permis préalablement la synthèse des enzymes
nécessaires, permettant alors une synthèse efficace. La concentration en glycogène hépatique est
alors relativement importante par rapport au cas où le cortisol est moins présent (surrénalectomie).
Par contre la synthèse de glucose à partir de composés non glucidiques, ou néoglucogenèse, sera
enclenchée à distance des prises alimentaires. Ici le cortisol aura préalablement permis la synthèse
des enzymes nécessaires à cette réaction, ceci permettant alors une synthèse de glucose plus
importante, et donc une concentration hépatique plus importante que dans le cas où le cortisol est
présent en faible quantité (surrénalectomie). On a montré le rôle de ces hormones sur le
métabolisme, mais celle-ci joue également un rôle, notamment sur le système immunitaire, en
réduisant la réponse humorale. On utilise la cortisone, analogue bovin au cortisol, qui va empêcher
une trop forte réponse immunitaire notamment dans le cas des allergies, pour les soigner.
Une des conséquences de cette opération, la perte significative de poids, est associé ici à l’effet des
minéralocorticoïdes, comme l’aldostérone, qui régulent normalement l’équilibre hydrique de
l’organisme, notamment en contrôlant la perte d’eau. Cette hypothèse reste très controversée
notamment par l’action d’une autre substance, l’ADH, qui tendrait normalement à rééquilibrer la
balance dans le cas d’une perte hydrique trop importante. On aurait pu montrer les effets de ces
hormones en réalisant des dosages des différents électrolytes, car l’aldostérone, joue notamment sur
la réabsorption rénale du sodium, et provoque par la même occasion une sécrétion de potassium. Un
manque provoque alors une hyperkaliémie et une hyponatrémie, ce qui serait visible ici.
Le rôle des catécholamines n’a pas été montré ici. Il aurait été intéressant de faire subir aux souris
quelques tests comportementaux, comme par exemple les mettre dans une situation stressante pour
observer leur réaction, et leur capacité de répondre face au danger.