Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude bernard lyon1
2009-2010
Mise au point d’une bioanode
Fonctionnant avec les déshydrogènases à NAD +.
Sofiène Abdellaoui
Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaire (ICBMS)
UMR 5246 ; Laboratoire de Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et
Assemblages Supramoléculaires (GEMBAS).
Sous la responsabilité du Dr Bastien Doumèche
Résumé :
L’utilisation d’éléments biologiques impliqués dans des réactions de transferts électroniques
biochimiques permet la mise en place de dispositifs bioélectroniques. Des biomolécules telles
que des enzymes et leurs cofacteurs ont été fréquemment utilisées dans le développement de
biocapteurs électrochimiques et de piles à combustibles biochimiques (biopiles). Dans ces
approches, il est nécessaire de réaliser un assemblage biomoléculaire favorisant le transfert
électronique vectorisé d’une biomolécule vers une
électrode
Le sujet présenté porte sur la mise au point d’une
stratégie aisée et reproductible d’assemblage d’une
bioanode fonctionnant avec des déshydrogénases à
NAD+ (Figure). Ce système est développé sur des
supports peu onéreux que sont les électrodes de
carbone sérigraphiées, à partir d’un assemblage
moléculaire entre du NAD+ et le bleu de toluidine,
un médiateur redox (navette électronique entre le
cofacteur et l’électrode). Cet assemblage serait
réalisé à l’aide d’une molécule intermédiaire «
linker », permettant de lier le cofacteur
nicotinamidique au TBO. Le 4-aminophenylboronate
ester de pinacol, possédant à la fois une fonction acide boronique capable de se lier aux diols
de certains sucres tels que les riboses du NAD+, et une fonction aryl amine pouvant servir de
base pour un électro-greffage par diazotation, a été choisi comme molécule « linker ».
L’optimisation de l’électro-greffage de TBO diazoté sur électrode sérigraphiée a permis de
mettre au point une couche sensible au NADH, fonctionnelle et reproductible. Après avoir
caractérisé cette couche sensible par des mesures électrochimiques, une méthode de fixation
du NAD+ avec l’acide boronique sur le 4-aminophenylboronique pinacol ester a été élaborée
par déplacement d’équilibre en milieu basique. Cependant, l’électro-adressage de la molécule
« linker » sur la couche sensible altère ses propriétés redox, ce qui ne permet pas d’obtenir un
dispositif fonctionnel à ce jour.
Afin de comprendre les raisons de cette perte d’activité électrochimique, une étude structurale
des molécules électro-greffées sur une surface de carbone est envisagée. De plus d’autres
stratégies d’assemblage du NAD+ sur la couche sensible sont en cours d’essai.
Figure :
Exemple d’une bioanode fonctionnant
avec une formiate déshydrogénase.

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard Lyon 1
2009-2010
Les bases structurales de l’interaction entre PCPE-1 et le propeptide
C-terminale du procollagène fibrillaire de type III
AFRACHE Hassnae
UMR 5086, équipe « Mécanismes moléculaires du remodelage tissulaire »
Maître de stage : Jean-Marie Bourhis
[email protected]
Résumé :
PCPE-1 (Procollagen C-Proteinase Enhancer)
est une protéine de la matrice extracellulaire qui
stimule l’activité des protéases Tolloïdes telle que
BMP-1 spécifiquement pour le clivage du propeptide
C-terminal des procollagènes fibrillaires. Ce
processus de maturation du collagène fibrillaire est
impliqué dans des pathologies graves telles que les
fibroses qui sont caractérisées par un dépôt excessif
des collagènes fibrillaires. PCPE-1 est constituée de
deux domaines CUB (CUB1 et CUB2) et d’un
domaine NTR. L’activation des protéases Tolloïdes
se fait via une interaction directe entre les deux
domaines CUB de PCPE-1 et le propeptide C-
terminal du procollagène fibrillaire. Cependant, le
mécanisme exact de cette interaction reste à élucider.
Durant ce stage nous nous sommes intéressés à
l’aspect structural de cette interaction.
Pour cela, nous avons cloné, exprimé par le
système baculovirus et purifié une protéine
recombinante correspondant aux domaines
CUB1CUB2 de PCPE-1 non glycosylée. Ce système
nous a permi de montrer que le site de N-
glycosylation n’était nécessaire ni à l’interaction
avec le propeptide C-terminal, ni à l’activation de
BMP-1. Nous avons aussi mené des études
structurales à basse résolution par la technique de
SAXS (Small Angle X-ray Scattering) de
CUB1CUB2 seul et en complexe (figure) avec le
propeptide C-terminal.
La détermination des zones d’interaction entre
ces deux protéines va contribuer à la compréhension
du mécanisme d’activation de la protéase BMP-1 par
PCPE-1 ouvrant de nouvelles perspectives pour la
conception d’antagonistes de PCPE-1.
Structure du complexe CUB1CUB2/C-
propeptide générée ab initio à partir des
données SAXS.
C-propeptide. CUB1CUB2

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude-Bernard Lyon I
2009-2010
Expression de la protéine virale non structurale NS3 du virus de l’hépatite C pour des
études d'interactions avec la matrice extracellulaire
Marjolaine Beaudoin
Institut de Biologie et Chimie des Protéines UMR 5086 – Université Lyon 1
Responsables de stage : Lionel Ballut et Sylvie Ricard-Blum
Les protéines NS3 et NS5A du virus de l’hépatite C sont des protéines qui participent à
l’infection chronique par ce virus. NS3 contient une sérine protéase (NS3p) qui permet de
cliver la polyprotéine codée par le génome du virus et intervient dans l’inactivation de
protéines cellulaires impliquées dans l’immunité innée. NS3 contient également une hélicase
(NS3h) nécessaire à la réplication du génome et à l’assemblage du virion. La protéine NS5A
intervient notamment dans la réplication du virus et dans la résistance à la réponse antivirale.
Le but de ce stage était d'exprimer sous forme recombinante la protéine NS3 et ses deux
domaines NS3h et NS3p pour étudier leurs interactions avec les protéines extracellulaires et
avec les glycosaminoglycanes qui sont des constituants majeurs de la matrice extracellulaire et
jouent un rôle dans l'entrée de certains virus dans les cellules de l'hôte. Nous avons exprimé les
protéines NS3, NS3p et NS3h dans des cellules eucaryotes. La production très limitée nous a
conduit à exprimer ces protéines dans un système procaryote. Nous avons dû développer des
protocoles pour solubiliser
ces protéines qui ont une
forte tendance à s'agréger et
pour les purifier par
chromatographie d’affinité et
d’exclusion.
Nous avons élaboré
une puce à protéines et à
glycosaminoglycanes sur
laquelle la protéine NS3h a
été injectée. L'analyse par
résonance plasmonique de
surface n'a pas permis de
mettre en évidence des
interactions à cause
d'interférence avec le tampon
utilisé pour solubiliser la
protéine NS3h. Des essais
sont en cours pour optimiser
les conditions
expérimentales et établir le
réseau d'interactions de NS3
et de ses domaines avec la matrice extracellulaire. Cela permettra d'identifier les protéines
extracellulaires et les glycosaminoglycanes ciblés par le virus et de mieux comprendre les
mécanismes conduisant à la perte de l'homéostasie tissulaire et à la fibrose hépatique qui est
susceptible d'évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire chez certains patients.
Réseau d’interactions des protéines virales NS3 et NS5A du virus de
l’hépatite C avec des protéines extracellulaires ou sécrétées et leurs
récepteurs ( établi à partir de la base de donnéesVirHostNet

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard
2009-2010
Etude par microscopie optique des mécanismes moléculaires de l’entrée du virus
de l’hépatite C dans les hépatocytes
Julie Blaising
Equipe RMN et Virus de l’hépatite C, UMR CNRS 5086
Eve-Isabelle Pécheur
Résumé
Le virus de l’hépatite C (HCV) est un virus enveloppé à ARN
positif appartenant à la famille des Flaviviridae. Il est une des
causes majeures d’hépatite chronique, de cirrhose du foie, et
d’hépatocarcinome. A ce jour, les traitements ne sont efficaces que
sur la moitié des patients. HCV porte à sa surface 2 glycoprotéines
d’enveloppe, E1 et E2, impliquées dans la reconnaissance des
récepteurs cellulaires et dans la fusion membranaire.
Notre objectif est d’étudier les étapes précoces de l’entrée de HCV
dans les cellules hépatiques par microscopie optique ; nous avons
pour cela mené à bien deux approches complémentaires permettant
d’effectuer des études in vitro et in cellulo.
Notre approche in vitro a consisté à visualiser les interactions entre
pseudoparticules HCV (HCVpp) et vésicules unilamellaires
géantes, des GUVs (Giant Unilamellar Vesicles), en vue d’étudier
les interactions protéine virale/lipides et protéine virale/récepteur.
Nous avons mis au point les conditions optimales d’obtention de
ces GUV qui ont ensuite servi de modèle pour réaliser les
premières expériences de visualisation de la fusion des HCVpp par
microscopie optique confocale. A pH 5.2 et 37°C, nous observons
un processus de fusion se traduisant optiquement par un mélange
des lipides de la membrane des GUVs (marqués par la sonde verte
DiO) et celle des HCVpp (marquées par la sonde rouge DiD ou
R18) donnant lieu à une fluorescence jaune.
Notre approche in cellulo vise à étudier la dynamique de l’entrée de HCV dans ses cellules-
cible, et en particulier à comprendre le rôle éventuel joué par le cytosquelette. Nous avons tout
d’abord défini sur cellules fixées les conditions expérimentales requises, et réalisé des essais
d’infection par HCVpp en présence ou non de nocodazole, un agent perturbateur des
microtubules. Nos résultats préliminaires semblent indiquer que le cytosquelette joue un rôle
dans les étapes précoces de l’internalisation du virus, lors du transport du virus de la membrane
plasmique vers les compartiments intracellulaires.
Les résultats de ces tous premiers travaux sont extrêmement encourageants. Nous avons ainsi
visualisé par microscopie optique le processus de fusion HCVpp/membrane in vitro, et montré
la proximité entre HCVpp et réseau de microtubules lors des interactions précoces entre virus et
cellules hépatiques, laissant suggérer un rôle-clé joué par le cytosquelette dans le cheminement
intracellulaire du virus. Ces résultats constituent donc des bases fermes sur lesquelles nous nous
appuierons pour le développement de nos futures études.

Master 2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle
Université Claude Bernard Lyon 1 – 2009/2010
Analyse du niveau d’expression de la ménine
dans des lignées de cellules thyroïdiennes murines et humaines.
Melle Sourour CHAIB
Unité Mixte de Recherche 664 de l’INSERM -UCBL.
Equipe de génomique fonctionnelle et diagnostique des cancers de la thyroïde et leurs métastases.
Dirigée par : Pr B. ROUSSET.
Responsables de stage : Dr F. VALENTIN et Dr S. RUBY.
La ménine est une protéine ubiquitaire de 610 amino-acides, de localisation nucléaire. La
fonction biologique de cette protéine est encore inconnue et elle ne présente pas d’homologie avec
d’autres protéines dont la fonction est identifiée. Des altérations géniques du gène codant la ménine
sont responsables de néoplasies endocriniennes multiples de type 1 (NEM1).
Nous avons examiné le contenu en ménine de 3 lignées murines : une lignée de thyrocytes
dédifférenciés : FRT, et deux lignées différenciées (TSH-dépendantes) : FRTL-5 et PCCL3, et de 5
lignées de thyrocytes humains : trois lignées de thyrocytes différenciés : BCPAP (issues d’un cancer
papillaire), WRO et FTC133 (cancer folliculaire) et deux lignées de thyrocytes dédifférenciés : FRO
et ARO (cancer anaplasique). Nous observons que la ménine est présente, dans le noyau de toutes les
lignées de thyrocytes testées, et que le niveau de cette expression varie d’une lignée à l’autre. Pour
les lignées de thyrocytes normaux d’origine murine : la lignée FRT (lignée dédifférenciée), exprime
environ 2 fois plus de ménine que deux autres lignées différenciées, FRTL-5 et PCCL3, sensibles à
la TSH. Le contenu en ménine est plus élevé dans les cellules dédifférenciées FRO par rapport aux
cellules différenciées FTC133, alors que les cellules dédifférenciées ARO expriment 1,5 fois moins
de ménine que les deux autres lignées de thyrocytes différenciés humains WRO et BCPAP. Pour
déterminer s’il existe une corrélation entre l’état de dédifférenciation des cellules et le niveau
d’expression de la ménine, nous avons choisi de modifier son état d’expression en utilisant deux
approches complémentaires : la 1ère consiste à stimuler le niveau d’expression de la ménine, dans les
cellules différenciées FRTL-5 et PCCL3, par la TSH et la 2e à réduire le niveau d’expression de la
ménine par une approche de siRNA dans les lignées de thyrocytes humains.
1- Nous avons observé que la privation de TSH des cellules PCCL3 conduit à une
augmentation du niveau d’expression de la ménine. Ce résultat suggère que la TSH régule
négativement l’expression de la ménine dans les cellules thyroïdiennes normales.
2- Pour déterminer les conditions optimales de transfection avec un siRNA, plusieurs
paramètres ont été testés. Nous avons choisi d’utiliser la lignée de thyrocytes humains WRO, pour
son contenu en ménine et son taux de prolifération élevés. La transfection a été réalisée par
lipofection d’un siRNA couplé à un fluorophore (Alexa488) sur des cellules en suspension ou
adhérentes, en présence ou en absence du sérum. A ce jour, l’efficacité de transfection n’atteint que
65 % ce qui nécessite de tester des conditions plus efficaces afin d’appliquer cette technique sur ces
cellules avec un siRNA anti-ménine.
Le développement de ce travail devrait permettre d’analyser les conséquences de la
surexpression et/ou de l’inhibition de l’expression de la ménine sur l’état de différenciation, la
prolifération cellulaire et l’apoptose.
Lignées de thyrocytes de rat Lignées de thyrocytes humains
FRT FRTL-5 PCCL3 ARO WRO FRO BCPAP FTC133
Notre
travail s’inscrit dans l’étude de la fonction
de gènes suppresseurs de tumeurs dans la glande
thyroïde. L’étude porte dans une 1ère
partie sur l’analyse
du niveau d’expression de la ménine dans des lignées de
cellules thyroïdiennes murines et humaines. Da
ns une
2ème
partie, nous avons recherché les conditions
expérimentales permettant de réduire le niveau
d’expression de la ménine par une approche de siRNA.
Immunodétection de la ménine par western
-
blot par la
technique ECL (Enhanced-Chemiluminescent).