ff LABORATOIRE DE BIOLOGIE UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU MOLECULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE --------------- MOLÉCULAIRE (LABIOGENE) UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE EN SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE (UFR/SVT) Mémoire Présenté Par : Prosper BADO Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université de Ouagadougou SUR LE THEME: Caractérisation moléculaire par PCR en temps réel de 14 génotypes de Papillomavirus Humains à haut risque dans des cas cancers du col de l’utérus à Ouagadougou (Burkina Faso). Soutenu le 28/07/2015 devant le jury composé de : Présidente : Prof Olga M. LOMPO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Prof Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Dr Florencia W.DJIGMA, Assistant, Université de Ouagadougou Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester. Le master en Biologie Moléculaire et en génétique moléculairs appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires. Le master BioGeMA est : Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité. Professeur Jacques SIMPORE Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologies Université de Ouagadougou – Burkina Faso Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO i Dédicaces Je dédie ce mémoire à mon grand-père Baka Ambroise (in memoriam) et à ma grand-mère Clémentine KANDIEL, pour m’avoir forgé à la persévérance! Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO ii Remerciements Ce travail a été réalisé au Centre Médical Saint Camille, au service d’Anatomie pathologieUnité de Médecine Légale (CHU/YO) et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) de l’Université de Ouagadougou (Burkina Faso) sous la direction du Pr Jacques SIMPORE. Je tiens à remercier vivement : Le Professeur Jacques SIMPORE, notre directeur de mémoire, pour m’avoir accepté dans son laboratoire et d’accepter guider mes premiers pas dans la recherche. C’est ici l’occasion pour nous de vous témoigner notre reconnaissance de la rigueur scientifique de votre encadrement, votre disponibilité constante et de votre soutien moral et matériel; Pr Olga M. LOMPO, Professeur titulaire en Anatomie et cytologie Pathologie, Université de Ouagadougou pour avoir facilité la collecte de nos données dans votre service et d’avoir accepté juger ce travail malgré vos multiples occupations. Soyez-en remercié; Dr DJIGMA Wendkuuni Florencia, Assistante en Biologie Moléculaire pour la disponibilité et la contribution à la réalisation de ce travail et pour avoir accepté le juger ; Le corps professoral de l’UFR/SVT et celui du Master II de BioGeMA en particulier, pour la qualité des enseignements ; Aux Docteurs, Djénéba OUERMI, Issouf TAO pour leur disponibilité, leurs conseils et leur contribution à la réalisation de ce travail ; Dr Théodora ZOHONCON qui nous a fasciné par sa rigueur scientifique, son amour pour le travail bien fait. Nous avons bénéficié de vous, de façon constante, des conseils, enseignements et un encadrement pertinent. Veuillez trouver en si peu de mots, le témoignage de ma profonde gratitude. Les ainés, Père Albert YONLI, SOUBEIGA R. S. Théophile, COMPAORE T. Rébéca, OUATTARA Abdoul Karim, Valérie BAZIE… pour leur assistance constante ; Les responsables et le personnel du laboratoire d’Anatomie et cytologie pathologie (CHUYO) : Dr OUATTARA, Mr Noufou OUEDRAOGO, Mr Issa TAPSOBA ; A la Commission de l’UEMOA pour leur soutien financier du master BioGeMa ; Ma famille pour toute l’affection, tout le soutien, toutes les prières, toute la patience et tous les sacrifices que vous m’avez généreusement consentis. Mes camarades du master pour leur bonne collaboration et l’ensemble de mes camarades de l’UGEB pour leur soutien tout au long de ce mémoire Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO iii Résumé Introduction : Le cancer du col de l’utérus est dans 99% des cas dû à un HPV à haut risque. Avec une incidence de 493000 cas dont 80% en Afrique, le cancer du col de l’utérus constitue respectivement la deuxième et la première cause de mortalité par cancer chez la femme dans le monde et en Afrique. Et pourtant, de la quinzaine de HR-HPV, seuls les HPV16 et 18 sont couverts par les deux vaccins existant. C’est pourquoi nous visons à travers cette étude évaluer la fréquence des HR-HPV dans des cas de cancer chez des femmes à Ouagadougou. Méthodes : Par PCR multiplex en temps réel, nous avons recherché 14 génotypes HR-HPV dans 106 pièces cancéreuses du col de l’utérus. Ces pièces conservées dans des blocs solides de paraffine ont été coupés en des sections de 20µm. L’ADN extrait de ces sections déparaffinés a été utilisé pour la PCR. Résultats : Des 106 échantillons testés, seulement 55,64% (59/106) avaient un résultat adéquat. Le génotypage a révélé la présence de 11 génotypes HR-HPV ; les 3 génotypes absents étaient les HPV33, 66, 68. Parmi ces génotypes retrouvés, les plus fréquents étaient HPV18 (41,4%), HPV39 (21,95%), HPV31 (26,83%), HPV16 (17,1%), et HPV45 (17,1%), HPV58 (9,8%) et HPV35 (9,8%). Dans 41,5% (17/41) des cas, les échantillons étaient infectés uniquement par l’un des HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,59 ou en infection multiple. Le nombre de génotypes HPV à haut risque variait de 1 à 4 par individu avec 39% (16/41) d’infections multiples. Conclusion : Le HPV18 était le plus fréquent dans les échantillons de cancers. Nous avons noté une prévalence élevée des cancers dus uniquement au HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,59. Mots clés : HPV à haut risque, cancer du col de l’utérus, PCR multiplexe en temps réel, Burkina Faso. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO iv Summary Introduction: The HPV-HR account 99% of cervix cancer. With an estimation of 493.000 new cases each year whose 80% in Africa, cervix cancer respectively, constitute the second and thirst women’s death caused by cancer in the world and in Africa. Yet, on the fifteen HRHPV, only HPV16 and 18 are covered by the two available HPV vaccines. We aim through this study, to estimate the prevalence of HPV in the cervix cancer cases of women in Ouagadougou. Methods: By multiplex real time PCR, we searched 14 genotypes HR-HPV in 106 cervical cancer FFPE tissues. We cut sections up to 20µm thick from the interior of an FFPE tissue block. DNA extracted from these deparaffined sections has been used for PCR-RT. Results: We obtained 55.64% (59/106) of adequate tests on the 106 samples tested. Eleven genotypes HR-HPV are present on the 14 searched. The most frequent genotypes were HPV18 (41,4%), HPV39 (21,95%), HPV31 (26,83%), HPV16 (17,1%), et HPV45 (17,1%), HPV58 (9,8%) et HPV35 (9,8%). In the 41,5% (17/41) of cases, the samples were infected by only one of HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59. The genotype number varies from 1 to 4 and 39% of multiple infections was observed. Conclusion: HPV18 was the most frequent in cancers samples. We remarked a high prevalence of cancer caused only by HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 and 59. Key words: high risk HPV, cervical cancer, multiplex real time PCR, Burkina Faso. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO v Table des matières Dédicaces .............................................................................................................................. ii Remerciements ................................................................................................................... iii Résumé ................................................................................................................................ iv Summary ...............................................................................................................................v Table des matières .............................................................................................................. vi Liste des figures .................................................................................................................. ix Liste des abréviations .................................................................... Erreur ! Signet non défini. Introduction ..........................................................................................................................1 1. Revue de littérature ..........................................................................................................4 1.1. Généralités sur le cancer du col utérin ......................................................................4 1.1.1. Anatomie du col utérin ...........................................................................................4 1.1.2. Histologie du col utérin ..........................................................................................4 1.1.3.Anatomo-pathologique du cancer du col .................................................................5 1.1.4.Carcinogénèse du cancer du col de l’utérus .............................................................5 1.1.5.Dépistage ................................................................................................................6 1.1.6.Traitement des lésions précancéreuses et cancéreuses .............................................8 1.2.Généralités sur les papillomavirus humains (HPV) ...................................................... 10 1.2.1.Historique de la découverte des HPV .................................................................... 10 1.2.2.Organisation structurale et génomique .................................................................. 11 1.2.3.Classification ........................................................................................................ 12 1.2.4.Maladies causées par les papillomavirus humains ................................................. 15 1.2.5.Mode de transmission du HPV .............................................................................. 16 1.2.6.Propriétés biologiques des protéines de HPV ........................................................ 16 1.2.7.Histoire naturelle des infections par le HPV .......................................................... 19 1.2.8.Cellules cibles et mécanisme d’infection du HPV ................................................. 19 1.2.9.Mécanisme de la carcinogenèse ............................................................................ 20 1.2.10.Facteurs influençant la progression des infections génitales au HPV ................... 21 1.2.11.Réponse immunitaire de l’hôte face à l’infection du HPV ................................... 22 1.2.12.Prévention et traitement ...................................................................................... 23 1.2.13.Prévalence des infections au papillomavirus dans la population .......................... 25 Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO vi 1.2.14.Diagnostic des infections à HPV ......................................................................... 25 2.Objectifs de l’étude ..........................................................................................................27 2.1.Objectif principal ........................................................................................................ 27 2.2.Objectifs spécifiques ................................................................................................... 27 3.Matériels et Méthodes ..................................................................................................... 29 3.1.Le cadre de l’étude ......................................................................................................29 3.2.Matériels ..................................................................................................................... 29 3.2.1.Réactifs................................................................................................................. 29 3.2.2.Appareillage ......................................................................................................... 29 3.3.Méthode ...................................................................................................................... 30 3.3.1.Type et période de l’étude ..................................................................................... 30 3.3.2.Population d’étude et échantillonage ..................................................................... 30 3.3.3.Détection des génotypes du HPV ..........................................................................31 3.3.4.Analyse des données ............................................................................................. 33 3.3.5.Considérations éthiques ........................................................................................ 33 4.Résultats ........................................................................................................................... 35 4.1.La population .............................................................................................................. 35 4.2.Génotypage et prévalence de 14 génotypes HPV à haut risque par PCR en temps réel . 36 5.Discussion ......................................................................................................................... 41 Conclusion et perspectives ................................................................................................. 45 Réferences bibliographiques .............................................................................................. 49 Annexe ................................................................................................................................ 57 Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO vii Liste des tableaux Tableau I: Différentes terminologies employées pour le compte-rendu des résultats de la cytologie et de l’histologie. .....................................................................................................7 Tableau II: Système de classification du cancer recommandé par la Fédération internationale d’Obstétrique et de Gynécologie. ............................................................................................9 Tableau III: Programme d’amplification sur SaCycler-96 pour la PCR-RT du HPV............. 32 Tableau IV: Répartition du cancer du col de l’utérus selon le stade ....................................... 35 Tableau V: Répartition des types histologiques du cancer du col selon la tranche d’âge ........ 36 Tableau VI: Proportion des issues des tests moléculaires ...................................................... 36 Tableau VII: Fréquence des 14 génotypes HPV à haut risque dans l’échantillon caractérisé .. 37 Tableau VIII: Infections uniques et infections multiples par des génotypes HPV à haut risque détectés ................................................................................................................................ 38 Tableau IX: Nombre de génotypes HPV à haut risque par femme infectée ............................ 38 Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO viii Liste des figures Figure 1: A : utérus d’une femme en âge de procréer ; B : Les deux types d’épithélium du col et la jonction pavimento-cylindrique .......................................................................................4 Figure 2: Organisation structurale et génomique des HPV .................................................... 12 Figure 3: Arbre phylogénétique de 118 types de papillomavirus construit par l’analyse de séquences partielles du gène L1. ........................................................................................... 14 Figure 4: Réalisation des coupes des tissus contenus dans les blocs de paraffines et appareils pour PCR-RT ....................................................................................................................... 30 Figure 6: Répartition des cancers selon la tranche d’âge ....................................................... 35 Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO ix Liste des abréviations AGUS : Atypical Glandular Cell of Undetermined Significance ARN : Acide ribonucléique ASCUS : Atypical Squamous Cell of Undetermined Significance ASCH : Atypical Squamous Cell High grade CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni CHU-YO : Centre Hospitalier universitaire Yalgado Ouedraogo CIN : Cervical Intraepithelial Neoplasia CIS : Carcinome In Situ CMH I : Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I CMSC : Centre Médical Saint Camille CRPV : Cottontail Rabbit Papillomavirus DBD : DNA Binding Domain EGF : Epidermal growth factor FIGO : Fédération Internationale de Gynécologie-Obstétrique HLA : Human Leukocyte Antigen HPV : Human papillomavirus HR-HPV : High Risk Human papillomavirus hTERT : Human Telomerase reverse transcriptase ICC : Invasif Cervix Cancer ICTV : International Committee on the Taxonomy of Viruses IRAC : International Agency for Research on Cancer IVA : Inspection Visuelle à Acide acétique IVL : Inspection Visuelle au Lugol JPC : Jonction Pavimento-Cylindrique KIR : Killer-cell Immunoglobulin-like receptor LABIOGENE : Laboratoire de Biologie Moléculaire et Génétique Moléculaire LCR : Long Control Region LEEP : Loop electrosurgical excision procedure LPIBG : Lésions Intra épithéliales Pavimenteuses de Bas Grade LPIHG : Lésions Intra-épithéliales Pavimenteuses de Haut Grade OMS : Organisation Mondiale de la Santé ORF : open reading frame Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO x Pap-test : Test de papanicolaou PCR : Polymerase Chain Reaction RT-PCR : SPSS : Statistical Package for the Social Sciences TAP : Transporteur associed with Antigen processing UEMOA : Union Economique et Monétaire Ouest Africaine UNICEF : United Nations International Children's Emergency Fund VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine VLP : Virus-like-particles Real time Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérisation en chaine en temps réel) Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO xi Introduction Virus à ADN, les Papillomavirus Humains (HPV) appartiennent à la famille des Papillomaviridae. On dénombre plus de 200 types dont environ 100 types différents infectent l’homme. Parmi ces derniers, plus d’une quarantaine ont un tropisme pour les muqueuses ano-génitales (Schiffman et Kjaer, 2003). Les HPV, d’un point de vue pouvoir carcinogène, sont subdivisés en deux catégories, les HPV à haut risque (16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,66, 68,…) et les HPV à bas risque (6,11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 67, 69, 70, 71, 72, 73,…). Les HPV sont responsables de condylomes acuminés, de verrues et de cancers (Chelimo et al., 2013). Le cancer du col de l’utérus est un néoplasme viro-induit dans 99% des cas par HPV (Ly, 2009) et que H.Z.Hausen en 1976 désigna comme étant l’agent responsable. Dans la majorité des cas, il y a clairance de ces virus au cours des 12 à 18 mois, après infection. On observe une persistance du virus qui reste en phase latente chez 10% des femmes infectées (Ly, 2009). Cette persistance est lié à plusieurs facteurs tels que une immunodépression due au VIH (Strickler et al., 2005), un nombre de grossesse élevé (Munoz et al., 2002) et la prise de contraceptifs oraux (Shi et al., 2012). Cette persistance peut aboutir à des lésions précancéreuses qui se répartissent en deux types selon BETHESDA : les lésions ou dysplasies de bas grade et les lésions de haut grade. Ces dysplasies peuvent évoluer vers un carcinome cervical invasif (Piccini et al., 1997). L’incidence mondiale du cancer du col de l’utérus est de 493 000 nouveaux cas chaque année, dont 80% des femmes touchées vivent dans les pays en développement (Ly, 2009). La prévalence du cancer du col utérin en Afrique Sub-saharienne est 10 à 20 fois plus élevée que dans la plupart des pays européens et ceux de l’Asie de l’Est. Cette prévalence est fortement corrélée aux facteurs socio-économiques tels la pauvreté, les dépenses de santé par habitant, l'urbanisation et le taux d'alphabétisation (Singh et al., 2012). Le cancer du col de l’utérus constitue la deuxième cause de mortalité par cancer chez les femmes dans le monde et la première en Afrique ; plus de 270.000 femmes meurent chaque année de ce cancer et plus de 85% d’entre elles sont issues des pays à revenu faible ou intermédiaire (OMS, 2013). Dans le monde et en Afrique, des études menées sur des femmes VIH séropositives et séronégatives ont montré des prévalences très variées selon les types de HPV rencontrés, la présence du VIH et les régions géographiques. Au Rwanda, Singh et al ( 2009) ont rapporté 69% de HPV chez les femmes VIH séropositives ; en Afrique du Sud, 90% des femmes VIH Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 1 séropositives avaient une infection au HPV (Adler et al., 2008). Au Chili, Ferreccio et al., (2013) ont rapporté que 10,7 % des femmes étaient positives au HPV. Au Burkina Faso, des études antérieures ont montré une prévalence élevée de certains génotypes des HPV à haut risque. Environ 59,6% des femmes VIH+ étaient infectées par au moins un type de HPV contre 24,3% chez les femmes prises dans la population générale (Djigma et al., 2011). En 2013, Zohoncon et al, ont trouvé que les génotypes HPV 35, 52, 31, 18, 58, 56, 51, 59, 45 et 33 sont les plus fréquents dans la population générale et ce dans l’ordre décroissant (Zohoncon et al., 2013). Cette étude signale une possible émergence de génotypes à haut risque non pris en compte par les deux vaccins existants (Cervarix et Gardasil). Mais ces études ont été réalisées chez des femmes dont le statut carcinopathologique du col de l’utérus n’était pas connu. C’est pourquoi, nous envisageons dans cette étude, travailler sur des pièces de tissus cancéreux du col de l’utérus, afin de déterminer la prévalence des HPV à haut risque. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 2 Revue de littérature Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 3 1. Revue de littérature 1.1. Généralités sur le cancer du col utérin 1.1.1 Anatomie du col utérin Le col de l’utérus correspond au tiers inférieur de l’utérus, il est constitué d’un tissu fibromusculaire dense tapissé de deux types d’épithélium (voir figure1). Il comprend deux parties : le tiers inférieur du col (col extérieur ou exocol) fait saillit dans le vagin et les deux tiers supérieurs du col (col intérieur ou endocol) au-dessus du vagin. 1.1.2 Histologie du col utérin L’histologie est importante pour comprendre la physiopathologie du col. Deux types d’épithélium tapissent la surface du col de l’utérus : L’épithélium pavimenteux (épithélium malpighien) : pluristratifié, sa couche inférieure est séparée du fibro-musculaire par une membrane basale. Il tapit normalement la plus grande partie de l’exocol. Il s’amincit, se fragilise et devient rose blanchâtre après la ménopause. L’épithélium cylindrique (épithélium glandulaire): unistratifié, il tapit le canal endocervical et une portion variable de l’exocol. Les cellules qui le constituent sont hautes et cylindriques. La jonction pavimento-cylindrique (JPC) : correspond à une ligne étroite ou les deux épithéliums s’unissent. Sa localisation originelle sera modifiée grâce à plusieurs facteurs : l’âge, le statut hormonal, le traumatisme de l’accouchement et de la contraception orale etc. Figure 1: A : utérus d’une femme en âge de procréer ; B : Les deux types d’épithélium du col et la jonction pavimento-cylindrique (JPC), (OMS, 2007) Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 4 1.1.3. Anatomo-pathologie du cancer du col Le point de départ de la plupart des tumeurs du col utérin est la jonction cylindro- pavimenteuse. Une colposcopie peut suffire à déceler un carcinome in situ. Le cancer invasif, peut se présenter sous différentes formes macroscopiques: la forme bourgeonnante, plus ou moins volumineuse, friable et hémorragique ; la forme infiltrante avec un col augmenté de volume et infiltré ; et la forme ulcérative avec un cratère plus ou moins volumineux, hémorragique, à base induré. 1.1.4. Carcinogénèse du cancer du col de l’utérus La physiologie normale du col utérin commande que l’épithélium cylindrique soit remplacé par un épithélium pavimenteux stratifié, cela sous l’effet des oestrogènes. Ce processus normal de maturation aura pour conséquence l’apparition d’une seconde JPC ; entre les deux JPC (JPC originelle et nouvelle) on trouve des cellules pavimenteuses métaplasiques donnant ainsi lieu à la zone de remaniement (ZR). Au cours de l’adolescence et au moment de la première grossesse, quand se produit la métaplasie pavimenteuse, l’infection par le HPV est susceptible d’induire des changements dans les cellules nouvellement formées, avec notamment l’incorporation de particules virales dans l’ADN cellulaire. Si le virus persiste, il peut ainsi interférer avec le contrôle normal de la multiplication cellulaire et être à l’origine de lésions précancéreuses et, plus tard, d’un cancer. Les cancers du col utérin sont reparties en deux groupes selon le type histologique atteint : carcinome épidermoïde et adénocarcinome. Les carcinomes épidermoïdes qui débutent à partir de l’épithélium pavimenteux métaplasique (ZR) représentent 90% et les 10% restants sont des adénocarcinomes qui débutent à partir de l’épithélium cylindrique de l’endocol (OMS, 2007). Le cancer du col utérin peut être regroupé selon le stade d’évolution, on parle alors de cancer in situ et de cancer invasif. Le cancer in situ du col est une lésion de l’épithélium malpighien qui ne dépasse pas la membrane basale de l’épithélium (c’est un cancer intra-épithélial). On parle de cancer invasif quand des cellules anormales envahissent l’épaisseur du tissu conjonctif fibreux, sous-jacent à la membrane basale. Débutant par un stade micro-invasif (invisible à l’œil nu lors de l’examen au spéculum), il peut évoluer ensuite vers des lésions plus importantes qui s’étendent au vagin, aux parois pelviennes, à la vessie, au rectum et aux organes voisins. S’il n’est pas traité, le cancer du col évolue de façon tout à fait prévisible et Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 5 l’issue en sera presque toujours fatale. C’est le plus souvent un cancer épidermoïde et rarement un adénocarcinome. Dans sa progression, le cancer invasif suit quatre voies généralement séquentielles. La propagation à l’intérieur du col part d’un minuscule point de cancer microinvasif se manifestant par une tumeur ulcéreuse, exophytique (bourgeonnante) ou infiltrante (invasion en profondeur). La propagation directe aux structures voisines peut avoir lieu dans toutes les directions : vers le bas, dans le vagin ; vers le haut, dans l’utérus ; sur les côtés, dans les paramètres (tissus soutenant l’utérus dans le pelvis) et les uretères ; en arrière, vers le rectum ; et en avant, vers la vessie. La propagation par voie lymphatique va concerner d’abord les ganglions pelviens avant d’affecter plus tard la chaîne ganglionnaire le long de l’aorte pour atteindre finalement les fosses supraclaviculaires (espace au-dessus de la clavicule). La propagation à distance est assurée par les voies sanguine et lymphatique pour former des métastases à distance dans le foie, les os, les poumons et le cerveau. 1.1.5. Dépistage Le dépistage est une action de santé publique menée sur une population à risque (population cible) ne visant pas à diagnostiquer une maladie, mais à identifier les individus qui ont une forte probabilité de la contracter ou de la développer. Ainsi le dépistage du cancer du col cible des femmes qui peuvent se sentir en parfaite santé et ne voir aucune raison de solliciter les services médicaux. Les tests les plus utilisés pour le dépistage sont : cytologie conventionnelle (frottis de Papanicolaou) et en milieu liquide; inspection visuelle avec l’acide acétique ou avec le soluté iodé de Lugol (IVL) ; test de recherche d’ADN du HPV. Frottis cervico-vaginal (test de Papanicolaou) : le principe consiste à prélever un échantillon de cellules dans la zone de remaniement du col, à l’aide d’une spatule en bois ou d’une brosse. Ces cellules sont ensuite étalées sur une lame de verre, puis immédiatement fixées pour préserver leur état morphologique. La lame est ensuite envoyée au laboratoire de cytologie où elle sera colorée. La coloration de routine utilisée pour l’histologie est l'Hématoxyline-Eosine (H.E.), l’éosine colorant en rouge les cytoplasmes et l’hématoxyline permet de colorer les noyaux en bleu. C’est après ce processus, que les prélèvements une fois Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 6 techniqués, sont lues par les médecins anatomo-pathologistes au microscope pour déterminer si les cellules sont normales ou non et les classifier à l’aide du système Bethesda. La cytologie en milieu liquide semble plus avantageuse que la cytologie conventionnelle : limite le nombre de faux négatifs ; moins de frottis non satisfaisants, le rapport coût-efficacité amélioré et le même échantillon peut également servir à la recherche d’ADN du HPV. Méthodes visuelles : l’inspection visuelle avec l’acide acétique (IVA) ; l’inspection visuelle avec le soluté iodé de Lugol (IVL). Ils permettent d’inspecter le col, sans grossissement optique, après l’avoir badigeonné d’acide acétique dilué ou de soluté de Lugol. En effet, avec l’acide acétique (vinaigre) le col est normal (résultat négatif) si pas de blanchissement ou anormal (résultat positif) si le col blanchi. Avec le soluté de Lugol, les lésions précancéreuses et cancéreuses apparaissent bien délimitées, épaisses et de couleur moutarde ou jaune safran, tandis que l’épithélium pavimenteux prend une coloration marron ou noire et que l’épithélium cylindrique reste rose. Méthodes de dépistage basées sur la recherche d’ADN (voir diagnostic moléculaire des HPV). Tableau I: Différentes terminologies employées pour le compte-rendu des résultats de la cytologie et de l’histologie (OMS, 2007). Classification cytologique (employée pour le dépistage) Pap (frottis) Système Bethesda Classification diagnostic) CIN Classe I Classe II Classe III Normal ASU-US ASU-H LIEBG Classe III Classe IV Classe V LIEBG LIEBG LIEBG Normal Atypie CIN1, y compris condylome plan CIN 2 CIN 3 CIN 3 histologique (employée pour le Classifications descriptives OMS Normal Atypie Koilocytose Dysplasie légère Dysplasie modérée Dysplasie sévère Carcinome in-situ Classe VI Cancer invasif Cancer invasif Cancer invasif CIN : néoplasie cervicale intraépithéliale ; LIEBG : Lésion intraépithéliale épidermoïde de bas grade ; LIEHG : Lésion intraépithéliale épidermoïde de haut grade ; ASC-US : cellules épidermoïdes atypiques de signification indéterminée ; ASC-H : cellules épidermoïdes atypiques ne permettant pas d’exclure une lésion intraépithéliale épidermoïde de haut grade. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 7 1.1.6. Traitement des lésions précancéreuses et cancéreuses Le traitement actuel des lésions précancéreuses est le plus souvent chirurgical (conisation). Le cancer cervical est, lui, traité par une combinaison de chirurgie et de radiothérapie avec une chimiothérapie adjuvante, efficace aux stades précoces. Des vaccins thérapeutiques qui permettraient de traiter les lésions précancéreuses et les cancers du col de l’utérus dus aux HPV16 et/ou au HPV18 sont en cours d’essais cliniques. L’exercice d’un traitement exige une confirmation histologique du cancer et la détermination du stade du cancer en utilisant le système de classification de la Fédération internationale d’obstétrique et de gynécologie. (FIGO). La chirurgie et la radiothérapie représentent les principales méthodes de traitement du cancer du col et ces traitements sont fonction du stade (OMS, 2007). La chirurgie curative du cancer du col vise à ôter la tumeur primaire et toutes ses extensions en une seule opération. Elle dépend du stade clinique de la tumeur et de ce que voit le chirurgien au fur et à mesure qu’il opère. La chirurgie emploie plusieurs méthodes dont l’hystérectomie radicale et la lymphadénectomie pelvienne qui sont les principales méthodes chirurgicales et l’hystérectomie simple et la trachélectomie étant seulement indiquées dans certains cas particuliers. La radiothérapie est une technique de traitement consistant à irradier la tumeur à l’aide d’un faisceau de lumière à très haute énergie servant à endommager et détruire les cellules cancéreuses. On l’utilise principalement pour traiter les tumeurs bourgeonnantes (stades IB et IIA jusqu’à IVB) et dans les cas où on constate une atteinte importante des ganglions lymphatiques. Il existe deux grandes catégories de radiothérapie selon le positionnement de la source d’irradiation par rapport au patient : téléthérapie (source d’irradiation éloignée du patient) ; curiethérapie (petites sources radioactives placées dans les cavités corporelles). La chimiothérapie c’est le type de traitement qui utilise les agents médicamenteux induisant la mort cellulaire par interférence dans le cycle cellulaire. Elle n’est pas utilisée comme traitement de première ligne du cancer du col et est généralement combinée avec la chirurgie ou la radiothérapie pour traiter les tumeurs bourgeonnantes (OMS, 2007). Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 8 Tableau II: Système de classification du cancer recommandé par la Fédération internationale d’Obstétrique et de Gynécologie (FIGO). Le système de classification FIGO détermine le stade du cancer d’après la taille de la tumeur et son extension au pelvis et aux organes distants. Stades et description Stade 0 : Carcinome in situ IA1 : Invasion du stroma inférieur à 3 mm IA : Carcinome invasif en profondeur préclinique horizontalement inférieure à 7 mm IA2 : du stroma entre 3 et 5 mm en Stade I : Carcinome profondeur limité au col horizontalement et et inférieure à 7 mm IB : Tumeur limitée au IB1 : Tumeur limitée au col de moins de 4 cm col mais supérieure à IB2 : Tumeur limitée au col de plus de 4 cm un IA2 Stade II : Tumeur dépassant le col mais IIA : Sans envahissement du paramètre n'atteignant pas la paroi pelvienne ni le tiers inférieur du vagin IIB : Avec envahissement du paramètre Stade III : Lésion atteignant la paroi pelvienne IIIA : Lésion atteignant le tiers inférieur du et/ou le tiers inférieur du vagin et/ou présence vagin sans atteindre la paroi pelvienne d'une hydronéphrose IIIB : Lésion atteignant la paroi pelvienne et/ou présence d'une hydronéphrose Stade IV : Dissemination du cancer IVA : Lésion atteignant la vessie ou le rectum IVB : Métastase à distance Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 9 1.2. Généralités sur les papillomavirus humains (HPV) Le Papillomavirus Humain (HPV) est un petit virus d’environ 55 nm de diamètre, nonenveloppé et de forme icosaédrique ; de la famille des Papovaviridae. 1.2.1. Historique de la découverte des HPV La recherche sur les papillomes et papillomavirus a commencé il y a plus de 100 ans. Depuis lors des travaux se sont succédés avec une flambée des activités de recherche à partir de la mise en évidence d'une relation entre les infections à HPV spécifiques et le cancer du col utérin. La recherche de papillomavirus a essentiellement quatre racines historiques. Des études sur le développement de papillomes chez les bovins et l’induction des sarcoïdes par ces verrues transmises à d’autre espèce (cheval), ont servis à démontrer l'origine infectieuse des verrues bovines. Celles sur le développement de papillomes chez des lapins par Shope et Hurst, en 1933, ont permis d’isoler l’ADN de CRPV (cottontail rabbit papillomavirus), mettant en évidence le lien entre les papillomes cutanés observés chez les lapins et une infection virale (Shope et Hurst, 1933). Les verrues ont acquis un intérêt médical dès lors que Lewandowsky et Lutz en 1922, les ont liées à une maladie humaine héréditaire rare, épidermodysplasie verruciforme. En 1934, Rous et Beard ont noté que les papillomes de lapins domestiques sont souvent convertis à des carcinomes squameux. Il est en effet apparu dans la littérature la conversion maligne des verrues génitales. Rigoni Stern en analysant les certificats de décès de femmes à Vérone des années 1760 à 1839, avait noté que le cancer du col de l’utérus était fréquent chez les prostituées, les femmes mariées et les veuves ; mais rare chez les vierges et religieuses. Il en a conclu que le développement de ce cancer doit être lié à des contacts sexuels. Ces données épidémiologiques ont inspiré la recherche pour identifier un agent microbien comme facteur étiologique des néoplasies cervicales. En 1983, Zur Hausen découvre au sein de cellules cancéreuses de l'utérus le HPV 16, confirmant l’association entre le HPV et le cancer du col de l’utérus (Zur Hausen, 2009). En 1995, l’IARC (International Agency for Research on Cancer) classe les HPV-16 et 18 comme agents carcinogènes chez les humains (IARC, 1995). Toutes ces recherches ont abouti à la production de deux vaccins prophylactiques. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 10 1.2.2. Organisation structurale et génomique Les papillomavirus humains ou HPV (Human Papilloma Virus) sont des virus nus (non enveloppés) de petite taille (45 à 55 nm de diamètre), ayant une capside à symétrie cubique constituée de 72 capsomères en structure icosaédrique. Leur matériel génétique est constitué d’un et unique double brin d’ADN circulaire. Ce génome est entouré d’une capside constituée de pentons comportant une protéine majeure, L1, associée à une protéine mineure plus interne, L2. Lesquelles protéines portent des motifs antigéniques de groupe, constituants les cibles des anticorps neutralisants. L’unique ADN circulaire qui constitue leur génome comporte 7904 paires de bases environ codant 8 à 9 protéines (Alain, 2010), dont les séquences codant les protéines virales sont regroupées sur un seul brin. Le génome viral est divisé en trois régions principales : la région précoce, la région tardive et la région LCR (Long Control Region). Les gènes E1 à E7, indispensables à la transcription et à la réplication virale, font partie de la région précoce et sont placés sous le contrôle du promoteur précoce. Les gènes de capside L1 et L2, situés dans la région tardive, sont placés sous le contrôle du promoteur tardif. Le génome viral comporte une origine de réplication associée à une région régulatrice dite LCR portant des séquences cibles pour de nombreux facteurs de transcription cellulaire et pour la protéine E2. Les protéines précoces (E1, E2, E4, E5, E6 et E7) régulent la réplication virale et le maintien de l’infection. Parmi celles-ci, les protéines E1 (hélicase) et E2 sont impliquées dans la réplication du génome viral, et les protéines E5, E6 et E7 sont impliquées dans la prolifération et la transformation cellulaire. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 11 Figure 2: Organisation structurale et génomique des HPV A : particules virales en microscopie électronique ; inature.canalblog.com/images/ 20051213_01.gif ; B : modèle atomique de la capside virale, Monsenego., 2006 ; C: Représentation schématique du génome, D'Abramo et Archambault, 2011 1.2.3. Classification La classification des papillomavirus peut se faire selon le génotype, l’analyse phylogénétique et le pouvoir cancérigène. Celle basée sur le génotype et l’analyse phylogénétique est la plus informative et de ce fait, fera l’objet de ce point. De nos jours, on dénombre plus de 200 types de papillomavirus humains (HPV) et de papillomavirus animaux (Alain, 2010) découverts au fil des années. Jusqu’au début de l’année 2000 les types de papillomavirus connus étaient Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 12 regroupés dans le genre papillomavirus et formaient avec le genre polyomavirus la famille dite des Papovaviridae. Cette classification se justifiait par l’absence d’enveloppe sur la capside et la présence d’ADN circulaire, commun aux deux groupes. Avec le renforcement des connaissances par le séquençage et la PCR, chaque groupe devient une famille sur la base de leurs caractéristiques génétiques et moléculaires particulières et des analyses phylogénétiques portant sur leur génome entier ou sur le gène L1 qui serait le mieux conservé. En 2004, de Villiers et son équipe, après une étude sur le gène complet L1 ORF de 96 types de HPV et 22 types de papillomavirus animaux ont fait plusieurs observations. En intégrant à ces observations les normes de classification établies par ICTV. de Villiers et al. ont abouti à une interprétation officielle des groupes phylogénétiques en indiquant plusieurs niveaux taxonomiques : '' genres '', '' espèces '', '' Types '' et '' variants ''. A l’issue de cette étude, de Villiers et son équipe ont obtenu un cladogramme en utilisant les critères suivants : Le niveau qui, antérieurement, était appelé supers-groupe (HPV génitaux) correspond maintenant au niveau '' genres ''. Sont considérés appartenant au même genre, tous les Papillomavirus qui ont moins de 60% d’identité des séquences nucléotidiques du L1 et plus de 23% de similitude sur tout génome entier. Cela a donné lieu à 12 genres parmi lesquels cinq correspondent aux Papillomavirus humain α, β, γ, μ et ν, et sept aux papillomavirus animaux (de Villiers et al., 2004). Les taxons autrefois nommés '' groupes '' et '' sous-groupes'' sont remplacés par la dénomination « espèce », lorsque des Papillomavirus du même genre ont un degré de similitude du L1 compris entre 60-70%. Au sein des espèces, se trouvent les types lorsque le degré d’homologie est compris entre 71 à 89 % (soit au moins 10 % de divergence). Au sein des types existent des variants qui ne diffèrent des autres virus du même type que par une ou quelques paires de bases (moins de 2 % de divergence) (de Villiers et al., 2004). Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 13 Figure 3: Arbre phylogénétique de 118 types de papillomavirus construit par l’analyse de séquences partielles du gène L1 (de Villiers et al., 2004). Légende : Les papillomavirus de types humains sont représentés ici par seulement un chiffre arabe à la fin de chaque branche (ex: 39 = HPV39). Les types viraux sont regroupés en espèces et les espèces sont regroupées en différents genres viraux. Les papillomavirus humains (HPV) de notre étude appartiennent au genre Alpha Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 14 1.2.4. Maladies causées par les papillomavirus humains La famille des papillomavirus comporte plus de 200 types dont environ 150 sont spécifiques à l’humain (Kovanda et al., 2011). Les maladies causées par les HPV sont classifiées soit selon leur tropisme (cutané ou muqueux) ou soit selon la manifestation clinique. Cependant, la classification selon le tropisme est moins réelle, car les types cutanés peuvent se retrouver dans des épithéliums cutanés et inversement pour les types muqueux. Sans tenir compte d’aucune de ces classifications, nous aborderons très sommairement les principales pathologies causées par les HPV. Verrues cutanées : Elles sont dues à plusieurs types de HPV à différents sites anatomiques. Les verrues communes (verrucae vulgaris), causées majoritairement par HPV1, HPV2 et HPV4, sont le plus souvent rencontrées au niveau des mains, sur les doigts, et sur les pieds. Les verrues plantaires sont causées majoritairement par le HPV1 et les verrues planes, dues principalement aux HPV3 et HPV10, situées au niveau du visage, des mains et des avant-bras. Papillomatose respiratoire récurrente : elle est causée par les HPV6 et HPV11(Handisurya et al., 2009). L’infection produit des papillomes au niveau du larynx, qui peuvent obstruer les voies respiratoires si elles sont nombreuses. Elles sont observées chez les enfants et les adultes. Conjonctivites à papillomavirus : ils peuvent être causés par des LR-HPV (HPV à bas risque) comme HPV6 ou HPV11, ou encore par des HPV à haut risque comme HPV16 ou HPV33 (Trottier et Burchell, 2009). Ces papillomes sont majoritairement bénins et régressent spontanément. Epidermodysplasia verruciformis(EV) : L’EV est une maladie héréditaire récessive très rare due à une mutation des gènes TMC6 ou TMC8 situés sur le chromosome 17. Elle entraîne une susceptibilité accrue aux β-HPV (HPV5 et HPV8). L’EV entraine apparition de lésions cutanées polymorphes et présentant un risque élevé de cancer de la peau. Verrues génitales : elles sont causées par les LR-HPV et peuvent être planes, en forme de dôme, être lisses ou raboteuses. Les HPV6 et HPV11 sont responsables à eux seuls d’environ 90% des verrues génitales, appelées condylomata acuminata. Ils ont une fréquence élevée chez les jeunes (15 à 24 ans) avec 74% des infections incidentes (Handisurya et al., 2009). Les cancers : environ 20% des cancers humains seraient causés par des agents infectieux dont 20 à 30% seraient dus à des HPV (Zur Hausen, 2009) . Les HPV-HR sont en partie Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 15 responsables du développement de nombreux autres cancers au niveau de la région anogénitale (pénis, vagin, vulve, anus, région périanale) et du système oropharyngé (bouche, larynx, pharynx). 1.2.5. Mode de transmission du HPV La transmission des HPV se fait essentiellement par contact direct (peau-peau, muqueusemuqueuse ou peau-muqueuse) car celles par les mains, le linge ou les surfaces contaminées et mère-enfant sont possibles, mais mineures (Alain et al, 2010). Parmi les voies de contamination par contact direct, celle par la voie sexuelle est la plus fréquente à cause de la forte charge virale au niveau des voies ano-génitales à la phase productive de l’infection, ce qui fait de l’infection par les HPV muqueux génitaux la plus fréquente des infections sexuellement transmises. Chez les hommes, on trouve les HPV surtout au niveau pénien ou anal et ce sont de ce fait des vecteurs majeurs des papillomavirus génitaux (Palefsky, 2010). En 2007, Nielson et al., trouvaient que le pénis était le site le plus susceptible de multiples infections HPV avec une prévalence de 38.5%. Les HPV génitaux sont également retrouvés dans les poils pubiens et les sécrétions génitales. Ces infections externes peuvent migrer secondairement au niveau du col, et causer une possible infection, même en l’absence d’acte sexuel et de pénétration. Les HPV ont presque le même mécanisme de transmission, de sorte que plusieurs espèces de HPV peuvent être simultanément ou successivement transmises. Ce phénomène de coïnfections est une réalité aussi bien chez les femmes que chez les hommes avec respectivement des fréquences de 20 à 30 % et 51 % dans la population générale (Dunne et al., 2006). 1.2.6. Propriétés biologiques des protéines de HPV Plus de la moitié du génome des HPV est occupé par la région précoce (Zheng et Baker, 2006). Cette région code sept protéines fonctionnelles nécessaires à la réplication virale, mais aussi à l’immortalisation et la transformation des cellules infectées (Tungteakkhun et Duerksen-Hughes, 2008). Les deux autres protéines de structures formant la capside virale, sont codées par la région tardive. Dans cette section, nous décrirons quelques principales fonctions de chacune de ces protéines. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 16 1.2.6.1. La protéine E1 Elle présente plusieurs fonctions qui sont essentielles à la réplication de l’ADN viral. En effet, E1 reconnait et se lie à l’OR (origine de réplication), provoquant ainsi le relâchement de la condensation de l’ADN (McBride, 2008). Par la suite, E1 se réarrange en double trimère permettant l’ouverture de l’ADN viral (Schuck et al, 2005) et aussi en double hexamère autour d’un brin à l’OR permettant le recrutement des protéines cellulaires (protéine de réplication A (RPA), topo-isomérase I, complexe de la polymérase α primase) nécessaires pour initier la réplication (Liu et al., 1998). 1.2.6.2. La protéine E2 La protéine E2 intervient essentiellement dans le processus d’initiation de la réplication, le contrôle de l’expression des autres gènes viraux (E6, E7), la ségrégation du génome viral lors de la division cellulaire, l’arrêt du cycle cellulaire en G2. En effet, E2 permet de recruter E1 (E1 recrutant la machinerie réplicative) grâce à 3 de ses 4 sites de liaison sur le LCR qui encadrent le site de liaison de E1 à l’OR (Kajitani et al., 2012). A faible quantité, E2 se lie seulement aux sites de haute affinité du LCR permettant la transcription des gènes, par contre à forte quantité, elle se lie en plus aux sites de basse affinité d’où une saturation (Steger et al., 1997). Ces sites de faibles affinités sont superposés aux sites de liaisons des facteurs de transcriptions, empêchant ainsi la transcription des gènes viraux précoces (Demeret et al., 1997). E2 se lie au génome viral (4 sites sur LCR) par son DBD (DNA binding domain) et à la protéine brd4 (bromodomain-containing protein 4) fixée sur les chromosomes cellulaires à travers les histones H3 et H4 (McBride, 2006). Ainsi, les génomes viraux nouvellement synthétisés seront distribués entre les cellules filles avant la formation de la membrane nucléaire (McBride, 2006). Ce mécanisme est possible même en absence de brd4 (McPhillips et al., 2006). 1.2.6.3. La protéine E4 Elle est présente lors des phases précoce et tardive (expression maximale) de l’infection au HPV. Son rôle principal, dans la phase tardive, est de permettre la libération des virions (maturation des virions) et l’arrêt du cycle cellulaire en G2. La protéine E4 a une expression maximale dans les couches supérieures de l’épithélium en s’accumulant dans le cytoplasme (Doorbar et al., 1991). Dans le cytoplasme, E4 se lie aux Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 17 kératines, les obligeant à s’accumuler près du noyau (Wang et al., 2004). Cette réorganisation du réseau des kératines fragilise la membrane cellulaire facilitant la libération des virions (Doorbar et al., 1991). La protéine E7 stimulant le cycle cellulaire, perd cette capacité du fait de la forte concentration de E4 dans la phase tardive, bloquant ainsi le cycle cellulaire en G2 (Davy et al., 2002). 1.2.6.4. La protéine E5 La protéine E5, hydrophobe, est localisée au niveau des membranes des cellules, des endosomes et de l’appareil de Golgi (Ashrafi et al., 2005). Faiblement oncogénique, E5 stimule la prolifération cellulaire dans la couche basale en augmentant l’expression des récepteurs des facteurs de croissance (McBride, 2008). Elle permet aussi l’évasion des HPV du système immunitaire en réduisant le nombre de molécules de CMH à la surface cellulaire (Venuti et al., 2011). 1.2.6.5. La protéine E6 La protéine E6 est l’une des principales oncoprotéines des HPV dont l’action consiste essentiellement à créer un environnement favorable aux activités biologiques virales. En effet, E6 empêche l’arrêt de croissance et l’apoptose en se liant à la protéine cellulaire p53 (Doorbar et al., 2005). En plus, E6 favorise l’immortalisation cellulaire en agissant sur les télomérases (hTert) (Veldman et al., 2001). Les télomérases, absentes chez les cellules épithéliales, ont la capacité d’ajouter des séquences répétitives aux télomères empêchant ainsi la mort cellulaire du fait de télomères courts (Frias et al., 2012). 1.2.6.6. La protéine E7 Elle est la deuxième oncoprotéine principale des HPV et son action est complémentaire avec E6. Sa fonction majeure est de stimuler le cycle cellulaire afin de maintenir l’expression de la machinerie réplicative de l’ADN cellulaire (Doorbar et al, 2005). La protéine cellulaire pRb (protéine du rétinoblastome) se lie aux facteurs de transcriptions E2F et empêche l’entrée de la cellule en phase S (Doorbar et al, 2005). La protéine E7 a la capacité de se fixer et d’inactiver pRb, un régulateur négatif du cycle cellulaire (McBride, 2008). L’inactivation va augmenter l’expression des gènes de la phase S et donc de la machinerie réplicative cellulaire. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 18 1.2.6.7. La protéine L1 C’est la composante principale de la capside des HPV. Au nombre de 360 par virus, les protéines L1 sont regroupées d’abord en capsomères de 5 protéines donnant 72 capsomères qui constituent avec L2 la capside virale. L’interaction initiale des virions avec leur hôte est majoritairement attribuée à L1 (Buck et al., 2013). La protéine L1 reconnaît les glycoprotéines membranaires contenant du sulfate d’héparine (Buck et al., 2013). 1.2.6.8. La protéine L2 La protéine L2 est essentielle à l’infection au HPV et présente plusieurs fonctions. La protéine L2, après être clivée à son extrémité N-terminal, intervient dans l’internalisation des HPV en aidant la protéine L1 à se fixer sur son second récepteur. Elle permet par la suite, l’échappement de l’endosome. En effet, le virus est internalisé dans un endosome duquel il s’échappera en utilisant l’extrémité c-terminale de L2 pour le déstabiliser. La protéine L2 est très impliquée dans l’encapsidation des génomes nouvellement synthétisés (Doorbar et al, 2005). Une fois dans le noyau, cette protéine se dirige vers les ND10 d’où il assemblera avec lui la protéine L1 et E2. Le génome viral nouvellement synthétisé se trouve du même coup entraîné dans la capside car lié à L2 et E2. 1.2.7. Histoire naturelle des infections par le HPV L’infection par le HPV est très courante dans la population générale et est considérée comme l’infection sexuellement transmise la plus fréquente (Schiffman et al., 2005). Plus d’une femme sur deux a été exposé aux HPV durant sa vie et 10 % environ feront une infection chronique (Monsonego, 2007) et la majorité de ces infections vont se résorber spontanément. Une minorité des cas persiste au-delà d’une année qui représente le délai moyen de la clairance virale. Cette persistance favorise l’intégration du génome viral au sein des cellules épithéliales, à l’origine d’une possible transformation tumorale. Les anomalies issues de cette intégration ne progressent pas toutes, l’évolution potentielle vers le cancer pouvant prendre de nombreuses années en passant par des stades différents d’anomalies histologiques intraépithéliales pré-invasives. 1.2.8. Cellules cibles et mécanisme d’infection du HPV Les différents types de HPV se caractérisent par leur tropisme tissulaire et on distingue des types de HPV à tropisme cutané ou à tropisme muqueux. L’infection utilise des mécanismes Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 19 moléculaires différents selon le type viral (cutané ou muqueux). Les HPV à tropisme muqueux infectent les cellules souches de l’épithélium malpighien, suite à une transmission par contact sexuel. Ils pénètrent dans l’épithélium par la zone de jonction pavimenteuse et aussi à la faveur d’une microlésion sur le col utérin. L’infection primaire a lieu au niveau des cellules basales de l’épithélium car ce sont les moins différenciées et mitotiquement les plus actives (Kajitani et al., 2012). Les virus ont aisément accès à ces cellules cibles (cellules basales) à travers la zone de jonction entre l’épithélium malpighien de l’exocol et l’épithélium glandulaire de l’endocol, expliquant la localisation préférentielle des lésions. La réplication du génome viral a lieu dans les cellules basales après décapsidation et migration de l’ADN viral vers le noyau. Cette réplication est contrôlée par les protéines E1 et E2 qui maintiennent le génome sous la forme épisomale de 50 à 100 copies de génomes dans les cellules basales et supra-basales (Kajitani et al., 2012). Les cellules basales et supra-basales seront maintenues en phase de synthèse d’ADN (phase S) par les protéines E6 et E7, exprimées à faible taux. Les cellules de la couche supérieure de l’épithélium chargées de virions desquament et se lysent à la surface de l’épithélium (Doorbar et al, 2005). Les squames contenant des virions de HPV sont diffusés et transmis au partenaire non-infecté lors des relations sexuelles. 1.2.9. Mécanisme de la carcinogenèse Les infections par les HR-HPV, dans leur majorité, régressent naturellement. Cependant, lorsqu’une infection persiste, cela augmente les risques d’un cancer qui passe par les lésions précancéreuses. Les lésions précancéreuses sont divisées en lésions de bas-grade et hautgrade. Les lésions de bas-grades régressent fréquemment par contre celles de haut-grade régressent rarement. Les lésions de haut-grade évoluent vers un cancer lorsque le génome viral est intégré au génome cellulaire et avec une expression significative des oncoprotéines E6 et E7. Cette intégration se fait généralement au niveau du gène E2 qui est un répresseur transcriptionel de E6 et E7 lors de l’infection productive. Ainsi, la quantité des oncoprotéines E6 et E7 va augmenter suite à l’inhibition de E2 par l’intégration du génome viral à son niveau. Aussi, les protéines E1 et E2, associées à l’infection productive, peuvent être inhibées par suite de l’intégration du génome viral augmentant les quantités de E6 et E7. L’intégration du génome virale aura pour effet l’inhibition et/ou la diminution de la production de plusieurs protéines virales. La perte du gène E2 lors de l’intégration du génome permet au HPV d’éviter la mort cellulaire. Sans la protéine E4, seule la protéine E7 régule le cycle cellulaire, ce qui permet la prolifération. La protéine E7 se fixe sur la protéine cellulaire pRb, une protéine Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 20 suppressive de tumeur, et l’inactive entrainant ainsi un dérèglement du contrôle du cycle cellulaire (McBride, 2008). L’action de la protéine virale E6 consiste à la dégradation de la protéine p53. La cellule perd ainsi son point de contrôle au niveau de la transition de la phase G1 à la phase S et de la phase G2 à la phase M, ce qui entraîne l’instabilité génétique de la cellule épithéliale. C’est l’ensemble de ces évènements qui entretient le cancer. 1.2.10. Facteurs influençant la progression des infections génitales au HPV Afin de déterminer les individus ou groupes d’individus sur qui orienter les programmes de dépistage du cancer, il est important de connaitre les facteurs qui mènent à la progression de l’infection vers un cancer. Plusieurs facteurs, tels les facteurs de l'hôte (génétiques ou acquises : l'âge, l'immunodépression, la contraception orale, le tabagisme) et les facteurs viraux (génotype, variantes, charge virale, intégration ...), augmentant la persistance, ont été identifié. La plus part des infections au HPV sont passagères et sont éradiquées sur une période d’environ 12 mois (Handisurya et al., 2009). La persistance d’une infection avec un HR-HPV est de ce fait un facteur de risque important pour la progression de l’infection vers le cancer. Suite à la persistance, le génome viral sera intégré dans le génome humain. L’intégration constitue un facteur de risque, car elle entraîne un avantage de croissance des cellules infectées par un HR-HPV et aussi parce que les niveaux d’expression d’ARNm précoces produits par une seule copie de HPV intégrée correspondent aux niveaux que peuvent produire plusieurs milliers de HPV sous forme épisomale (Peitsaro et al., 2002). Aussi, les infections par un HR-HPV avec une charge virale élevée augmentent les probabilités d’intégration du génome viral dans les chromosomes de l’hôte (Peitsaro et al., 2002). Tous les types et variants oncogéniques de HPV ne sont pas associés au développement du cancer de la même façon. En effet, HPV16 est le plus fréquent suivi de HPV18 qui est plus agressive. Outre les différences entre les différents types de HPV, le degré d’oncogénicité des HPV peut différer en fonction des variantes. Les risques de développer des lésions de hautgrade et un cancer sont de deux à neuf fois plus élevés lors d’une infection par une variante non-européenne de HPV16 que chez les variantes européennes (Lichtig et al., 2006). La coinfection est un facteur associé à la persistance de l’infection à HPV. La co-infection par plus d’un type de HPV est associée à la persistance de l’infection (Perrons et al., 2005). L’infection au HPV16 est davantage persistante lorsqu’elle est associée avec d’autres types (Woodman et al., 2001). La co-infection se fait également par des agents autres que les HPV. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 21 Il y a entre autres Chlamydia trachomatis (CT), herpès Virus de type II (HSV II), Virus de l’immuno-déficience humaine (VIH), etc. En effet, le risque de développer un cancer utérin est doublé en cas de co-infection de CT et HPV-HR (Smith et al., 2004) et HSV II et HPVHR (Smith et al., 2002). En terrain immunodéprimé, certains types de cancers sont majoritairement retrouvés. Il y a par exemple le sarcome de Kaposi et le cancer du col utérin. La persistance des infections au HR-HPV est plus fréquente (Stanley, 2009) et le risque de développer un cancer du col de l’utérus est élevé chez les femmes VIH positives (Strickler et al., 2005). Le nombre de grossesses menées à terme et l’intervalle entre celles-ci sont associés à un risque élevé de cancer du col de l’utérus, surtout pour les femmes déjà infectées par un HRHPV (Munoz et al., 2002). Cette augmentation du risque de cancer pourrait être expliquée par des traumatismes du col de l’utérus et du vagin au moment de l’accouchement. La prise de contraceptifs oraux à long terme est aussi associée au risque élevé de cancer cervical. Ces contraceptifs contiennent de la progestérone impliquée dans le cycle menstruel et dans la grossesse. Les hormones stéroïdiennes (progestérone) peuvent interagir avec des régions précises du LCR augmentant ainsi la réplication du génome viral et par voie de conséquence un risque élevé de la persistance (Piccini et al., 1997). De plus, ces hormones augmentent la transcription des oncoprotéines E6 (Shi et al., 2012). L’avenir d’une infection au HPV est en partie tributaire du système immunitaire. La réponse immunitaire contre les HPV est assurée par des molécules telles les HLA (Human Leucocyte Antigen), TAP (Transporteur associated with antigen processing) et KIR (killer-cell immunoglobulin-like receptor). Cependant, des polymorphismes au niveau de ces gènes peuvent induire une progression des infections au HPV (Denis et al., 2008). 1.2.11. Réponse immunitaire de l’hôte face à l’infection du HPV Généralement l’infection aux HPV régresse spontanément au bout de 12 mois. La prévalence de ces infections semble diminuer avec l’âge. En effet, elle est moins forte chez les adultes d’au moins 30 ans que chez les adolescentes et les jeunes adultes. Cela n’est pas lié au changement de comportement mais plutôt au fait d’une réponse immunitaire. Ce sont l’immunité innée et l’immunité adaptative qui sont impliquées dans la résolution des infections par les HPV. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 22 L’immunité innée assurée par des molécules (Complément, Interférons β, TNF) et des cellules (NK, macrophages, neutrophiles) constitue la première barrière de défense de l’organisme. Cependant, en cas d’infection au HPV, la quantité de ces molécules est réduite au point de permettre leur évasion au système immunitaire. En plus, pour échapper au SI (système immunitaire) , le HPV se réplique à très faible taux afin d’éviter la reconnaissance par le SI (Doorbar et al., 2005). L’immunité adaptative contre les HPV est aussi une combinaison de mécanismes humoraux (anticorps) et cellulaires (CTL, Th1/2). La réponse à médiation cellulaire est essentielle à la résolution de l’infection par les HPV. Les lymphocytes T CD4 auxiliaires, après être activés par les CPA, stimulent les CTL via une réponse Th1. L’action des CTL dirigée contre les protéines virales E2 et E6 (Stanley, 2009) et aussi contre certains épitopes de E7 est fortement associée à la régression de l’infection (Kadish et al., 2002). Mais les HPV, peuvent se soustraire du SI, en utilisant E7 pour induire la tolérance du système immunitaire. En effet, les HPV (E7), détourne la réponse immunitaire en stimulant la réponse Th2 au lieu de Th1 qui normalement active les CTL. La réponse humorale est assurée principalement par des anticorps contre la protéine L1, les anticorps anti-L2 n’existant pas par l’infection naturelle. Cette réponse humorale est lente et faible et ses anticorps (anti-L1) sont incapables face à une infection déjà acquise (Carter et al., 2000) et une réinfection (Viscidi et al., 2005). En outre la réponse humorale est fonction du type de HPV. En effet, le temps mis et la persistance de la réponse humorale est selon le type de HPV. La séroconversion est tôt chez VPH6 que chez HPV16 et HPV18 et moins persistante chez HPV6 que chez HPV16 et HPV18 (Carter et al., 2000). 1.2.12. Prévention et traitement La réduction de la transmission des HPV utilise presque les mêmes méthodes traditionnelles que les autres IST. En effet, le préservatif, la circoncision et les règles d’hygiène ont un impact réductif sur la transmission des HPV. La recherche de moyens efficaces de prévention a conduit à une approche vaccinale dont deux ont été développées: prophylactique et thérapeutique. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 23 La vaccination prophylactique Les vaccins prophylactiques ont pour objectif d’induire la production des anticorps neutralisants contre la capside virale. Les vaccins antiviraux sont classiquement basés sur une atténuation ou une inactivation virale. Pour les HPV, cette stratégie n’est pas applicable dû au fait que ce virus n’est pas cultivable et aussi, parce que son génome contient des oncogènes (E6, E7). Pour ce faire la stratégie a consisté à cibler les protéines de la capside virale grâce à la propriété d’auto-assemblage de la protéine majeure L1 de la capside virale. En effet, cette protéine permet la formation de pseudo-particules virales VLP (virus-like-particules). Ces VLP ont la même morphologie que celle des virions ; elles sont sans génome, sans caractère pathogène et elles sont hautement immunogéniques. La production des VLP se fait par l’insertion du gène L1 dans des cellules d’insectes (infectés par des baculovirus) ou dans des levures (Saccharomyces cerevisiae). Les VLP injectées chez l’homme induisent la production de titres élevés d’anticorps neutralisants dirigés contre la protéine L1 (Stanley et al., 2009). Ces anticorps vont transsudés à travers les muqueuses génitales et être présents dans les sécrétions cervico-vaginales pour neutraliser le virus au moment de la première exposition. Deux vaccins basés sur les VLP sont de nos jours utilisés : Gardasil® (Sanofi Pasteur MSD, West Point Pennsylvanie) dirigé contre les papillomavirus type 6, 11, 16 et 18 et Cervarix® (GlaxoSmithkline, Rixensart, Belgique/Medimmune, Maryland) qui est dirigé contre les HPV oncogènes à haut risque 16 et 18. Le titre des anticorps post-vaccinaux est 50 à 80 fois plus élevé que celui induit par l’infection naturelle (Villa et al., 2005). Ces vaccins concernent les adolescentes avant les premiers rapports sexuels mais peut aussi présenté un intérêt pour les femmes d’un âge plus avancé, si celles-ci n'ont jamais été infectées par au moins un des types viraux contenus dans le vaccin. Vaccin thérapeutique Cette approche vaccinale vise la sensibilisation des cellules immunocompétentes afin de neutraliser l’infection déjà installée et faire régresser les lésions précancéreuses, voire les cancers du col utérin. Ces vaccins sont constitués de peptides libres, de protéines recombinant de virus ou bactérie recombinant. Associées à des gènes codant pour certains types de HPV, ces formulations vaccinales induisent l’immunité T cellulaire (lymphocytes T CD8+ et CD4+) en présentant les antigènes vaccinaux à la surface des cellules qui les ont intégrées en association avec les molécules HLA de classe I ou II (Brun et al., 2008). Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 24 1.2.13. Prévalence des infections au papillomavirus dans la population Le cancer du col de l’utérus est le deuxième cancer le plus fréquent chez la femme avec une incidence mondiale d’environ 493 000 nouveaux cas estimés chaque année (Ly et al., 2009). Plus de 270.000 femmes en meurent chaque année dont plus de 85% sont issues des pays à revenu faible ou intermédiaire (OMS, 2013). La fréquence des HPV est très variée selon la présence du VIH et les régions géographiques. Au Rwanda et en Afrique du Sud, on a trouvé respectivement 69% (Singh et al., 2009) et 90% (Adler et al., 2008) de HPV chez les femmes VIH séropositives. Au Chili et en France la fréquence des HPV est respectivement 10,7 (Ferreccio et al., 2013) et 10,1 à 16,1% (Monsonego et al., 2012). Au Burkina Faso la fréquence des HPV est de 30,20% (Zohoncon et al., 2013) et environ 60% chez les femmes co-infectées par VIH (Djigma et al., 2011). Les HPV à faible risque oncogène les plus fréquents sont les HPV 6 et 11, à l’origine de 90% des lésions génitales à types de « condylomes acuminés » ou verrues génitales (Burk et al., 2009). Les HPV à haut risque oncogènes les plus fréquents sont les HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58 et 59, responsables de 90% des cancers de col utérin (70% pour les HPV 16 et 18) (Burk et al., 2009). 1.2.14. Diagnostic des infections à HPV Les méthodes diagnostiques sont principalement moléculaires : La PCR (Polymerase Chain Reaction) ou réaction de polymérisation en chaine est une méthode permettant l’amplification, l’identification des séquences d’ADN présentes dans un échantillon. Elle est très sensible et correspond à la technique de référence pour le diagnostic de l’infection. La PCR peut permettre deux types de diagnostics : Un diagnostic d’infection à HPV sans précision du type ou du groupe. Dans ce cas, les amorces utilisées portent un matériel génétique commun aux différents HPV Un diagnostic du type de HPV ou génotypage du HPV. La capture d’hybrides est une méthode consistant à capturer sur les parois d’un micro-puits des hybrides d’ADN de virus HPV présents dans le milieu étudié et d’ARN complémentaires. L’hybridation in situ se fait sur des cellules isolées déposées sur des lames ou sur des coupes tissulaires à partir de prélèvements obtenus par la méthode conventionnelle ou en milieu liquide. Méthode par détection des ARNm des protéines E6 et E7. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 25 Objectifs de l’étude Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 26 2. Objectifs de l’étude 2.1. Objectif principal L’objectif principal de cette étude est de déterminer les génotypes de HPV à haut risque et leur prévalence dans des cas de cancer du col de l’utérus chez les femmes au Centre hospitalo-universitaire-Yalgado OUEDRAOGO (Ouagadougou). 2.2. Objectifs spécifiques Caractériser les génotypes HPV à haut risque par PCR en temps réel à partir des tissus archivés fixés et inclus en paraffine ayant un diagnostic histologique de cancer du col de l’utérus au service d’anatomie pathologie du CHU-YO. Déterminer la fréquence des génotypes HPV à haut risque dans les cas de cancers du col de l’utérus au service d’anatomie pathologie du CHU-YO (Ouagadougou). Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 27 Matériel et méthodes Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 28 3. Matériel et Méthodes 3.1. Le cadre de l’étude Les analyses biologiques ont été faites à l’Hopital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO) et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE), situés à Ouagadougou (Burkina Faso). Les échantillons ont été collectés au laboratoire d’anatomie et de cytologie pathologiques (CHU-YO) et par la suite acheminés au CERBA/LABIOGENE et à l’HOSCO pour les analyses. 3.2. Matériel 3.2.1. Réactifs Pour la détermination des génotypes des HPV à haut risque par PCR à temps réel nous avons utilisés les réactifs suivants : FFPE DNA Purification Kit, pour l’extraction de l’ADN du HPV PCR-RT kit: « HPV génotypes 14 Real-TM Quant » de Sacace Biotechnologies S.r.l, Italie, pour l’amplification de l’ADN. Ce kit permet la détection de 14 génotypes HPV à haut risque (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58, 59, 66 et 68). 3.2.2. Appareillage Les coupes histologiques ont été faites par le microtome LEICA-RM-2135 L’appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie” a été utilisé pour l’amplification de l’ADN. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 29 Figure 4: Réalisation des coupes des tissus contenus dans les blocs de paraffines et appareils pour la PCR en temps réel 3.3. Méthode 3.3.1. Type et période de l’étude L’étude réalisée est descriptive rétrospective sur une série de 169 cas de cancers du col de l’utérus. L’étude s’est déroulée sur une période de sept (7) mois, allant du 03 Octobre 2014 au 05 Mai 2015. 3.3.2. Population d’étude et échantillonage Cent soixante-neuf (169) cas de cancers révélés par l’analyse hystologique pendant la période 2009-2014 ont été inclus dans cette étude. Les registres (2009-2014) du laboratoire d’anatomie et de cytologie pathologiques du CHU-YO nous ont servi pour la recherche des numéros (codes) pour lesquels le cancer du col utérin a été confirmé mais aussi les informations sociodémographiques. Les numéros relevés ont été utilisés pour rechercher les blocs correspondant. Ces blocs solides de paraffine contenant soit une pièce de biopsie, soit une pièce de conisation ou d’hystérectomie, ont été coupés à l’aide d’un microtome pour obtenir 5 sections d’au plus 20 µm d’épaisseur. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 30 3.3.3. Détection des génotypes du HPV 3.3.3.1. Extraction de l’ADN viral du HPV L’extraction a été faite à l’aide du kit «FFPE DNA Purification Kit» de Norgen Biotek Corporation en suivant le protocole fourni par le fabricant (cf Annexe). 3.3.3.2. PCR en temps reel Principe de la PCR en temps réel Le principe de la PCR en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule reporter fluorescente capable d’émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l’intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR. Nous avons réalisé une PCR en temps réel faite d’amplification multiplex de 4 tubes pour chaque échantillon. Chaque tube contient des amorces dirigées contre des régions de trois ou quatre (4) types de HPV et du gène de la bêta-globine utilisé comme contrôle interne. Nous avons quatre types de fluorescences à savoir : Fam pour une fluorescence de couleur bleu, Hex pour une fluorescence de couleur verte, Rox pour une fluorescence de couleur jaune et Cy5 pour une fluorescence de couleur orange. Protocole de la PCR en temps réel Préparation des échantillons pour l’amplification Un mix constitué de 60 μl de Hot Start DNA Polymerase et 0,6 ml de PCR-buffer-FRT mélangé au vortex a été préparé. Cette préparation est valable pour 132 réactions et est stable durant 3 mois lorsqu’elle est conservée à 4°C. Ce mix (DNA polymérase+ PCR-buffer-FRT) est équitablement ajouté dans quatre tubes PCR auquel on ajoute les PCR-mix-1 conténant les amorces des 14 génotypes recherchés et on obtient ainsi la réaction Mix. Pour préparer cette réaction Mix nous avons suivi le protocole du kit « HPV Genotypes 14 Real-TM Quant » qui comprend quatre PCR-mix-1 à savoir : PCR-mix-1 « 16-18-31-IC » couvercle bleue ; PCRmix-1 « 39-45-59-IC » couvercle incolore ; PCR-mix-1 « 33-35-56-68 » couvercle verte ; PCR-mix-1 « 51-52-58-66 » couvercle orange. Le volume de PCR-mix-1 et le volume de la préparation mix composée de PCR-buffet-FRT et de Polymerase ont été déterminés, selon le nombre d’échantillons, en suivant la figure 3 du protocole (SACACE, 2014) . Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 31 La préparation finale pour la PCR est obtenue en ajoutant 15μl de Mix « 16, 18, 31, CI » dans le premier tube PCR, 15μl de Mix « 39, 45, 59, CI » dans le deuxième tube PCR, 15μl de Mix « 33, 35, 56, 68 » dans le troisième tube PCR et 15μl de Mix « 51, 52, 58, 66 » dans le quatrième tube PCR. Dans les quatre tubes PCR de chaque échantillon, nous y avons ajouté 10μl d’ADN de l’échantillon correspondant. Nous avons préparé 1 contrôles négatifs et deux standards K1 et K2 qui représentent les contrôles positifs, en ajoutant 10μl de DNA-buffer dans les 4 tubes PCR correspondant au contrôle négatif et 10μl de Positive K1 et K2 dans les 4 tubes PCR correspondant à chaque contrôle positif (K1 et K2). Le volume réactionnel total est de 25 μl. L’amplification a été faite en utilisant le programme suivant (Tableau III) Tableau III: Programme d’amplification sur SaCycler-96 pour la PCR-RT du HPV Etapes Température en 0C 1 2 3 Temps Répétitions 95 °C 15 min 1 cycle 95 °C 5s 60 °C 20s 72 °C 15 s 95 °C 5s 60 °C 30s : détection du signal fluorescent 72 °C 5 cycles 40 cycles 15s 3.3.3.3. Interprétation des résultats de la PCR L’interprétation des résultats a été faite à l’aide du Programme Microsoft Excel ‘‘HPV Typing Real-Time Results Matrix.xls’’ fourni par le fabricant. Le résultat de l'échantillon est invalide en cas d'absence de tout signal de fluorescence pour les controles positifs. Le résultat est valide si « negative amplification controls » n'a pas de signal de fluorescence et dans chacun des contrôles positifs, sont déterminés tous les signaux de fluorescence. Le résultat de l'échantillon est négatif si le signal du contrôle interne β-globine est détecté dans les deux premiers tubes de l’échantillon et positif si un signal des 4 fluorescences est détecté, excepté celui de Cy5 dans la première et deuxième rangée, qui est réservé pour le gène de détection βglobine humain. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 32 3.3.4. Analyse des données Les données ont été traitées et analysées sur micro-ordinateur à l’aide des logiciels SPSS 20 .0 et Epi Info 6.04. Le test de Chi carré à été utilisé pour les comparaisons. La différence a été considerée comme significative pour p <0,05. 3.3.5. Considérations éthiques Cette étude a été réalisée avec l’approbation du Comité d’éthique pour la recherche en Santé du Burkina Faso. Nous avons eu l’autorisation des responsables du service d’anatomie et de cytologie pathologiques du CHU-YO. Les informations recueillies resteront strictement confidentielles et anonymes. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 33 Résultats Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 34 4. Résultats 4.1. La répartition du cancer de col de l’utérus selon le type et le stade La présente étude a permis de recenser 169 cas de cancers du col utérin de 2009 à 2014 dont l’âge des femmes concernées variait de 21 à 84 ans avec une moyenne de 46,72 ± 11,68 ans. La répartion de l’ensemble des cancers récencés selon le stade, est illustée par le tableau IV. Tableau IV: Répartition du cancer du col de l’utérus selon le stade Stade du carcinome Proportion n (%) In-situ 15(8,88%) Invasif 154(91,12%) La répartition des cancers suivant les tranches d’âges est donnée par la figure 6. Des 169 cas de cancers, 95.26% (161/169) avaient un âge supérieur ou égal à 25 ans, 4 (2,37%) en avaient moins et chez les quatre (2,37%) restant l’âge n’avait pas été rapporté. La répartition par âge des carcinomes du col de l’utérus indique une fréquence croissante à partir de 25 ans avec un pic chez les femmes dont l’âge est compris entre 35 et 44 ans suivie d’une faible diminution chez les femmes de 45 à 54 ans pour se stabiliser à partir de 55ans. Répartition des cancers selon la tranche d’âge 30 fréquence du cancer 25 20 15 10 5 Figure 5: Répartition des cancers selon la tranche d’âge Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 35 Les carcinomes épidermoïdes représentaient 86,6% (148/169) et les adénocarcinomes 13,4% (21/169) de l’ensemble. La majorité des adénocarcinomes (80% soit 16/21) et des carcinomes épidermoïdes (79,73%) sont survenus respectivement quand les femmes avaient plus de 45 ans et 34 ans. Tableau V: Répartition des types histologiques du cancer du col selon la tranche d’âge Tranche Adénocarcinome Carcinome P value d’âge en % épidermoïde en % <25 0 (0,0%) 4 (2,7%) - 25 à 34 2 (9,52%) 22 (14,86%) 0,663 35 à 44 2 (9,52%) 44 (29,73%) 0,008 45 à 54 9 (42,8%) 39 (26,35%) 0,088 ≥55 8 (38,0%) 35 (23,65%) 0,159 Non rapporté 0 (0,0%) 4 (2,7%) - Total 21 148 4.2. Génotypage et prévalence des 14 génotypes HPV à haut risque (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) par PCR en temps réel La caractérisation des 14 génotypes HPV (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58, 59, 66 et 68) à haut risque a concerné 106 échantillons des 169 cancers du col de l’utérus. A l’issue de la caractérisation moléculaire des 106 échantillons, nous avons obtenus 44,34% (47/106) de résultats inadéquats et 55,64% (59/106) résultats adéquats. Parmi les résultats adéquats, c’est-à-dire l’ensemble des négatifs et des positifs, 69,50% (41/59) des carcinomes étaient dû aux HPV à haut risque. Tableau VI: Proportion des issues des tests moléculaires Issue du test PCR Proportion n (%) Inadéquat 47 (44,34%) Adéquat 59 (55,64%) Total 106 (100%) Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO Positifs 41 (69,50%) Négatif 18 (30,50%) 36 Le génotypage a révélé la présence de 11 génotypes HPV à haut risques des 14 recherchés ; les 3 génotypes absents étaient les HPV33, 66, 68. Nous avons trouvé un nombre total de 63 génotypes. Parmi ces génotypes retrouvés, les plus fréquents étaient HPV18 (27%), HPV31 (15,9%), HPV39 (14,3%), HPV16 (11,1%), et HPV45 (11,1%), HPV58 (6,3%) et HPV35 (6,3%). Les génotypes les moins fréquents étaient HPV52 (3,2%) et les HPV51, 56, 59, tous avaient une fréquence de 1,6%. Tableau VII: Fréquence des 14 génotypes HPV à haut risque dans l’échantillon caractérisé Génotype Effectifs Pourcentage HPV N (%) HPV18 17 27,0 HPV31 10 15,9 HPV39 9 14,3 HPV45 7 11,1 HPV16 7 11,1 HPV35 4 6,3 HPV58 4 6,3 HPV52 2 3,2 HPV51 1 1,6 HPV56 1 1,6 HPV59 1 1,6 HPV33 0 0,0 HPV66 0 0,0 HPV68 0 0,0 Total 63 100 Les HPV16 et 18 étaient retrouvés chez 58,8% (24/41) des femmes et les HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 et 59 étaient présent chez 68,30% (28/41) des femmes. Aussi, 41,5% (17/41) des femmes étaient infectés uniquement par des HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,59 ; une seule infection multiple a été notée (HPV31, 39, 45, 52). Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 37 Tableau VIII: Infections uniques et infections multiples par des génotypes HPV à haut risque détectés Génotypes Effectifs Pourcentage HPV N % 16 4 9,8 16, 31 1 2,4 16, 31, 39 1 2,4 16, 31, 39, 58 1 2,4 18 9 22,0 18, 31, 45, 58 1 2,4 18, 35 1 2,4 18, 39 2 4,9 18, 45 2 4,9 18, 51 1 2,4 18, 58 1 2,4 31 2 4,9 31, 39 4 9,8 31, 39, 45, 52 1 2,4 35 3 7,3 45 3 7,3 52 1 2,4 56 1 2,4 58 1 2,4 59 1 2,4 Total 41 100,0 Le nombre de génotypes HPV à haut risque variait de 1 à 4 par individu avec un nombre moyen de génotypes de 1,56 ± 0,13 par femme infectée. Les infections à un seul génotype étaient majoritaires 61% (25/41). Les infections multiples représentent 39% (16/41). Parmi les femmes qui étaient infectées par un seul génotype, nous avions retrouvé le HPV16 ou 18 chez 52% et les HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,59 chez les 48% d’entre elles. Tableau IX: Nombre de génotypes HPV à haut risque par femme infectée Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 38 Nombre de génotypes Effectif Pourcentage par échantillons N % 1 25 60,97 2 12 29,27 3 1 2,44 4 3 7,32 Total 41 100,00 La répartition des 41 échantillons positifs au HPV en fonction du stade du carcinome a montré 9,80% (4/41) de carcinomes in situ et 90,20% (37/41) de carcinomes invasifs. Le niveau du cancer associé à la prévalence et au type de HPV à haut risque a montré une fréquence de 40,54% (15/37) d’infections multiples et de 59,46% (22/37) d’infections unique dans les cancers invasifs. Au stade invasif du cancer, les HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,59 occupaient 45,45% (10/22) des infections à un seul génotype contre 54,55% (12/22) pour les HPV16 et 18. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 39 Discussion Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 40 5. Discussion Notre étude a permis de mettre en évidence 11 génotypes à haut risque dans les cancers du col utérin. Plus de la moitié des patientes se trouvait dans la tranche d’âge de 35 à 54 ans. La moyenne d’âge des patientes atteintes du cancer du col de l’utérus était de 46,68 ± 11,68 ans. N’guessan et al, en Côte d’Ivoire avaient trouvé un âge moyen égal de 48,5 ans avec un pic situé entre 41 et 50 ans (N’guessan et al, 2009). Notre résultat est proche de celui de N’guessan et al qui indiquait une apparition du cancer à un âge relativement jeune en Afrique par rapport aux pays occidentaux (N’guessan et al, 2009). L’apparition du cancer du col de l’utérus à un âge plus précoce en Afrique semble être liée à la recrudescence des facteurs de risque comme les mauvaises conditions socio-économiques, la précocité des rapports sexuels, le multipartenariat sexuel, et les nombreuses maternités (Banza et al, 1999). La majorité des cancers (91,12%) avait atteint le stade invasif. Bien que nous n’ayons pas eu les informations sur le statu socio-économique des patientes, la prépondérance du stade invasif pourrait y être associée. Déjà en 2010, une étude avait montré que le cancer cervical invasif était le plus rencontré chez les femmes en Afrique subsaharienne avec une incidence de 75,141 nouveaux cas par an (Vuyst et al., 2013). La prévalence du cancer du col utérin en Afrique Sub-saharienne était de 10 à 20 fois plus élevé que dans la plus part des pays européens et ceux de l’Asie de l’Est (Singh et al., 2012). La même étude indiquait que cette forte prévalence du cancer du col utérin, dans ces pays africains, était fortement corrélé à la pauvreté, les dépenses de santé par habitant, l'urbanisation et le taux d'alphabétisation (Singh et al, 2012). Or l’UNICEF en 2012 indiquait une augmentation de la sévérité de la pauvreté des femmes âgées de 15 à 49 ans entre 2003 et 2010 au Burkina-Faso (UNICEF, 2012). Le nombre de carcinomes épidermoïdes était environ 6 fois plus élevé que les adénocarcinomes. Le plus grand nombre de carcinomes épidermoïdes a été retrouvé dans la tranche d’âge de 34 à 45 ans. Dans cette tranche d’âge, nous avons trouvé une différence significative entre les adénocarcinomes et les carcinomes épidermoïdes (p= 0,008). Le HPV à haut risque a été détecté dans 69,5% (41/59) des échantillons à résultat adéquat. Steinau et al. ont trouvé 77,6% (94/121) de HPV dans les échantillons à résultat valide (Steinau et al., 2011). Dans notre étude, cette faiblesse de prévalence pourrait s’expliquer principalement par la substance fixatrice (Bouin) utilisée et l’excès de paraffine qui influence négativement l’extraction de l’ADN. En effet, en comparant deux méthodes de déparaffinage, Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 41 Steinau et al ont obtenu des résultats meilleurs avec la technique de déparaffinage par chauffage, qui a consisté à fondre la paraffine sous la chaleur, que celle utilisant le xylène (Steinau et al., 2011). Nous avons trouvé 11 génotypes des HPV à haut risque sur les 14 recherchés, dans les blocs de paraffines. Ce nombre est inférieur à celui trouvé à l’issue d’un génotypage des HPV, dans les cancers, en Afrique sub-saharienne (Ntekim et al., 2012), qui en plus de ces 11 génotypes a connu la présence des HPV33 (6,4%), HPV51 (1,4%), HPV66 (0,6%), HPV68 (1,1%). L’absence des autres génotypes pourrait s’expliquer par la petite taille de notre échantillon et par la rareté de certains de ces génotypes. Ntekim et al. en 2012, en Afrique sub-saharienne avaient rapporté une fréquence de 1,1% de HPV68 et 0,6% de HPV66. Les génotypes les plus fréquents étaient, par ordre décroissant, HPV18 (27%), HPV31 (15,9%), HPV39 (14,3%), HPV16 (11,1%) et HPV45 (11,1%), HPV58 (6,3%) et HPV35 (6,3%). Antérieurement, au Burkina Faso, Djigma et al avait identifié chez 250 femmes HIV+ les HPV-18 (25.0%); HPV-50′S (25.5%); HPV-30′S (20.8%); HPV-16 (4.7%); HPV-45 (3.7%) (Djigma et al., 2011) et chez 73 femmes des fréquences cumulées de HPV-50′S (26/84 soit 31,0 %), HPV-18 (12/84 soit 14,3 %), HPV-16 (9/84 soit 10,7 %), HPV-30′S (5/84 soit 5,9 %), et HPV-45 (3/84 soit 3,6 %) (Ouedraogo et al., 2011). Au Benin, Piras et al en 2011, en cherchant la prévalence des HPV chez les femmes, avaient trouvé des résultats semblables : HPV-59 (24.65), HPV-35 (22.54), HPV-16 (17.6%), HPV-18 (14.8%), HPV58(13.4%), HPV-45 (9.9%), HPV-56 (8.4%). Ces résultats indiquent tous une prévalence élevée des HR-HPV autres que les HPV16 et 18. Par contre, une étude sur la prévalence des HR-HPV dans les tumeurs en France et au Mozambique avait noté une nette prédominance de HPV16 et 18 (Jacquard et al., 2010 ; Naucler et al., 2004) et une fréquence non moins importante de HPV33 (Naucler et al., 2004). Cependant, au Burkina Faso, une étude sur une population de femmes dont le statut pathologique du col utérin était inconnu et qui a porté sur des prélèvements cellulaires cervicaux, avait rapporté l’absence du HPV33 (Zohoncon et al., 2013). La proportion des infections isolées dues aux HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 était de 48% dans l’ensemble des infections isolées et de 41,50% de l’ensemble des échantillons (41) à résultat positifs. Cette fréquence signifie que pour 100 cancers du col de l’utérus confirmés par un test moléculaire (PCR), au moins 41 de ces cancers seraient dus à ces génotypes. C’est donc une fraction importante non prise en compte par les deux vaccins. En Guinée, au Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 42 Sénégal et à Kinshasa, les types 16 et 18 avaient respectivement une fréquence de 44,4%, 43,7% et 25% (Ali-Risasi et al., 2008 ; Karly et al., 2009) indiquant ainsi une fréquence élevée du reste des HPV à haut risque. Ces deux types de HPV, visés par les vaccins Gardasil et Cervarix, n’étaient portés que par 3/5 de nos patientes et donc les HPV portés par les 2/5 des patientes n’étaient pas visés par ces vaccins. De nos jours, il apparait que le profil de distribution et la fréquence des types HPV en Afrique paraient différents de ceux observés de par le monde et aussi qu’en Afrique cette situation est disparate selon les pays (De Vuyst et al., 2003 ; Karly et al., 2009). Sur le plan de la santé publique, une prévalence de 2/5 pourrait être significative si elle se confirmait par des études plus larges. Il est donc à craindre que celle-ci va avoir un retentissement négatif sur l’efficacité des deux vaccins employés du fait de leur sélectivité. Le nombre de génotypes par individu variait de 1 à 4 avec une moyenne de 1,5 ± 0,13 génotypes. Ce nombre est relativement inférieur à celui trouvé chez un groupe de femmes dépistées à Ouagadougou par Zohoncon et al., en 2013. Les infections multiples sont retrouvées plus fréquemment dans les lésions de bas-grade que dans les lésions de haut-grade et les cancers (Sasagawa et al., 2001). Cette différence pourrait s’expliquée par la diminution de la présence des HPV-LR et de certains HR-HPV (moins persistant) dans les infections multiples des lésions de haut-grade. Nous avons noté une infection multiple chez 39% des femmes contre 61% d’infection isolée. Au Mozambique Naucler et al., en 2004 ont trouvé 64,2%(45/70) d’infections isolées dans des cas de tumeurs du col de l’utérus. Les résultats de notre étude indiquent une distribution et prévalence différente avec ceux d’autres pays. Sanjosé et al. en 2007 et Bosch et al. en 2008 avaient déjà noté cette disparité à travers le monde. Ils remarquaient que chez les femmes à cytologie normale et chez celles à cytologie anormale ou ayant le cancer du col de l’utérus, HPV16 était le plus fréquent suivi du HPV18 en Europe, en Amérique centrale et du sud. En Afrique et en Amérique du nord HPV16 était respectivement suivi par HPV52-58 et HPV52-53 (Sanjosé et al., 2007 ; Bosch et al., 2008). Plus précisément au Nigeria HPV16 était suivi par les HPV31 et 35 (Thomas et al., 2004). Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 43 Conclusion Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 44 Conclusion et perspectives Nous avons caractérisé par PCR en temps réel, 14 génotypes HR-HPV dans un échantillon de 106 tissus cancéreux du col de l’utérus sur un total de 169 collecté, au CHU-YO. Les femmes constituant l’échantillon avait un âge moyen de 45,38 ans et la majorité se situait entre 35 et 55 ans. Le stade invasif du cancer constituait la majorité (91,12%) des cas de carcinomes collectés. L’étude rapporte que 67,8% des carcinomes étaient dus aux HPV à haut risque. Notre étude a montré la présence de 11 génotypes de HPV à haut risque sur les 14 recherchés, dans les cancers à Ouagadougou. Ainsi, HPV18, HPV31, HPV39, HPV45 et HPV16, HPV35 et HPV58 représentaient les génotypes les plus fréquents. Les HPV31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 étaient à eux seuls responsables de 41,5% des cancers. Le nombre moyen de génotypes par femme infectée et la fréquence d’infections multiples étaient respectivement 1,56 et 39%. Ces données méritent d’être confirmées en élargissant l’échantillon et en utilisant d’autres techniques d’extractions plus appropriées afin d’améliorer le diagnostic moléculaire des HPV à haut risque dans des blocs de paraffine. Au regard des limites de notre étude : 1. Nous envisageons l’élargir à un échantillon beaucoup plus représentatif de l’échelle nationale afin de rechercher tous les génotypes HR-HPV ; 2. Déterminer le profil de distribution et la prévalence des génotypes HR-HPV dans les échantillons de carcinomes co-infectés VIH+ ; 3. Faire le dépistage de l’infection au HPV chez les hommes ; Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 45 Suggestions Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 46 Suggestions Au ministère de la santé 1. Intensifier les campagnes d’information, d’éducation et de sensibilisation à l’infection par le HPV et le cancer du col de l’utérus à l’endroit des femmes mais aussi des hommes ; 2. Intensifier les campagnes de dépistage des lésions précancéreuses du col de l’utérus et instaurer des campagnes de dépistage du HPV par la PCR en temps réel ; Les femmes doivent faire le dépistage du HPV et du cancer du col de l’utérus périodiquement, et éviter au mieux les facteurs de risque de l’infection par le HPV. Il serait utile de réaliser une cartographie à l’échelle nationale, des génotypes HPV et de mettre à disposition, de nouveaux vaccins polyvalents anti- HPV couvrant tous les génotypes à haut risque. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 47 Références bibliographiques Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 48 Réferences bibliographiques ABULENCIA, A., ACOSTA, D., ADELMAN, J., AFFOLDER, T., AKIMOTO, T., ALBROW, M. G., AMBROSE, D., AMERIO, S., AMIDEI, D., ANASTASSOV, A., ANIKEEV, K., ANNOVI, A., ANTOS, J., AOKI, M., APOLLINARI, G., ARGUIN, J. 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Des tubes nucléase-free à centrifuger, y compris un tube pour le contrôle négatif de l'extraction, sont préparés à la taille de l’échantillon ; 3. Les sections obtenues sont transférées dans les tubes nucléase-free, sur lesquels on ajoute 1mL de xylène, puis on vortexe ; 4. Ce mélange est incubé à 500C pendant 5 minutes et centrifugé à 140000g pendant 2 min ; on verse le surnageant sans déranger le culot (Cette étape est répétée en cas d’excès de paraffine) ; 5. On ajoute au culot, 1 mL d’éthanol absolu (96-100 %) et on vortexe ; Puis une centrifugation à 14000g durant 2 min et le surnageant est versé (cette étape est répétée) ; 6. On ajoute du PBS au culot pour les échantillons fixés avec du bouin (cette étape n’est pas du protocole) ; 7. Le culot est séché à température ambiante pendant 10min (il est nécessaire de vaporiser tout l’éthanol ou le PBS) ; L’extraction : La lyse des cellules 8. Dans les tubes contenant les culots séchés, on ajoute respectivement 300μl de Digestion Buffer, 10μl de Protéinase K reconstituée et 1μl de Rnase et ensuite vortexer ; 9. Il va s’en suivre deux incubations successives à 550C et 900C pendant 1 heure chacune tout en vortexant occasionnellement (si à la fin des deux incubations des Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 57 débris demeurent, on centrifuge en 2 min à 14000g et on transvase le surnagent dans de nouveaux tubes et le culot est abandonné) 10. On ajoute au surnageant, 300μl de Binding Solution (vortexer) et 250μl d’éthanol absolu (96-100 %) puis vortexer. Rétention de l’ADN dans la colonne 11. Assembler des colonnes de purification à des tubes collecteurs ; 12. Dans la colonne installée dans le tube collecteur on ajoute 600μl du lysat et on centrifuge pendant une 1 min (étape à répéter après avoir jeté le lysat écoulé dans le tube collecteur) Lavage de la colonne 13. Ajouter 400μl de Wash Solution dans la colonne puis centrifuger à 14000g pendant 1 min, se rassurer que toute la Wash Solution est descendue dans le tube collecteur, au besoin centrifuger à nouveau 14. L’étape précédente est répété 2 fois de suite ; une centrifugation finale de 2 min afin de bien sécher la résine et jeter les tubes collecteurs ; Elution de l’ADN 15. Les colonnes sont cette fois-ci déposés dans des tubes d’élution de 1,7 mL fournis par le kit ; 16. On ajoute deux fois de suite 20 à 50μl de Elution Buffer dans la colonne suivit d’une incubation de 1 min à température ambiante (dans notre cas nous avons prélevé successivement 50 et 40μl) 17. On centrifuge en 1 min à 14000g après l’incubation de chaque volume mis ; pour une récupération maximale de l’ADN il est recommandé une dernière centrifugation à 14000g en 1 min ; Conservation de l’ADN 18. L'ADN purifié peut être conservé à -20 ° C pendant quelques jours. Pour une conservation à long terme, il est recommandé que l’ADN extrait soit placé à -70 ° C. Master II BioGéMA / 2014-2015 /Prosper BADO 58