PROPOSITION DE SUJET DE STAGE
MASTER!2 RECHERCHE INFECTIOLOGIE FONDAMENTALE
UNIVERSITE LYON!1
2014!2015
Titre du sujet de stage: Contrôle des étapes précoces du cycle infectieux de Legionella
pneumophila
Unité d’accueil : CIRI (INSERM U1111 / CNRS UMR5308 / ENS / UCB Lyon1) (Dr. F-L.
Cosset) http://ciri.inserm.fr
Laboratoire d’accueil : Equipe « Pathogénèse des légionelles » (PI : P. Doublet), Campus de
la Doua – Bât. Lwoff (R+3). 10, rue Dubois - Villeurbanne
Contact : Anne Vianney / Christophe Gilbert
Anne.vianney@univ-lyon1.fr christophe.gilbert.bio@univ-lyon1.fr
Sujet de stage:
Contexte :
Legionella pneumophila, est une bactérie pathogène intracellulaire, capable d’infecter
les amibes des environnements aquatiques, mais aussi les macrophages alvéolaires humains
après inhalation d’aérosols contaminés, causant alors une pneumopathie sévère, la
légionellose. Cette pathologie reste un problème de santé publique en raison de son taux de
mortalité relativement élevé (10 à 30 %, pour environ 1500 cas par an en France) et ceci en
dépit de la mise en place d’un traitement adapté.
L. pneumophila échappe à la dégradation par les cellules phagocytaires notamment grâce à
l’injection, via le système de sécrétion de type 4 Dot/Icm, de près de 300 effecteurs bactériens
directement dans les cellules cibles. Par ailleurs, ces dernières ne phagocytent pas L.
pneumophila avec une grande efficacité, aussi la bactérie semble avoir mis en place des
mécanismes stimulant son entrée dans les cellules (1).
cemment nous avons montré au laboratoire que l’étape d’entrée de L. pneumophila dans les
amibes fait intervenir un système de sécrétion de type I fonctionnel, en particulier via la
sécrétion d’un unique substrat, la protéine RtxA (2). Par ailleurs, un petit ARN non codant
(ARNnc) potentiellement impliqué dans la régulation de l’expression des gènes codants pour
ce SST1 a été identifié.
D’autre part, nous avons mis en évidence le rôle de 3 voies de signalisation à di-GMP
cyclique dans le contrôle des étapes précoces de l’infection par L. pneumophila (3). En effet,
des mutants dépourvus de certaines enzymes métabolisant ou dégradant le di-GMP cyclique
échappent plus difficilement à la dégradation intracellulaire. Nos derniers résultats suggèrent
que chez ces mutants, la cinétique de sécrétion des effecteurs par le système Dot/Icm serait
perturbée et ceci de façon spécifique à chacune des 3 voies identifiées, ce qui suggère un rôle
inédit des voies de signalisation à di-GMP cyclique dans le contrôle de l’ordre d’injection des
effecteurs du système de sécrétion Dot/Icm.
Objectifs :
L’objectif du stage de M2R s’inscrira dans l’une de ces 2 thématiques :
- clarifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des gènes codant le SST1
(en particulier via l’expression de ARNnc) et du gène rtxA lors du cycle cellulaire en
conditions de laboratoire et lors du cycle d’infection d’un hôte. A cette fin, le stage
comprendra une première partie de constructions génétiques : des fusions d’opérons avec des
gènes rapporteurs (GFP…), des mutants d’expression de l’ARNnc (déficience ou
surexpression). Ce matériel biologique permettra ensuite de suivre l’expression du SST1 « in
vivo » (vis-à-vis de l’amibe ou des macrophages) lors du cycle infectieux afin d’identifier
précisément l’impact sur la virulence de Legionella pneumophila.
- comprendre comment les voies de signalisation à di-GMP cyclique interviennent dans la
coordination de la sécrétion des effecteurs bactériens au cours de l’infection. Des données de
RNA-seq différentiel attendues avant le démarrage du stage de M2R (séquençage en cours des
ARN totaux des souches mutantes et parentale) devraient permettre d’identifier des pistes à
explorer en priorité, via la construction de matériel génétique (délétions de gènes, fusions
avec des gènes rapporteurs,…). Par ailleurs, les 3 enzymes du métabolisme du di-GMP
cyclique impliquées ont été purifiées, ce qui permettra également la recherche des partenaires
de cette signalisation, et/ou des acteurs participant à l’organisation de la sortie des centaines
d’effecteurs via le système Dot/Icm (recherche d’interactants par approches biochimiques de
de type pulldown, cross-linking,…).
Techniques :
Les techniques sont communes au 2 axes présentés (manipulation en laboratoire de niveau 2,
tests d’infection sur différentes cellules cibles (amibes environnementales, macrophages
humains), tests d’efficacité d’entrée, suivi de la multiplication intracellulaire de bactéries
exprimant des protéines fluorescentes (GFP, m-cherry) par mesure d’augmentation de la
fuorescence dans un lecteur de plaque (Tecan), test de translocation des effecteurs bactériens
dans les cellules par système rapporteur, suivi de marqueurs cellulaires par microscopie
confocale, techniques de biologie moléculaire (mutagénèse, clonage), biochimiques
(purification de protéines, pull-down), ….
Références récentes:
1. Allombert, J., Fuche, F., Michard, C. and Doublet, P. (2013) Molecular mimicry and
original biochemical strategies for the biogenesis of a Legionella pneumophila replicative
niche in phagocytic cells.. Microbes Infect. Oct 24.
2. Fuche, F., Vianney, A., Andrea, C., Doublet, P. and Gilbert, C. Functional type I secretion
system involved in Legionella pneumophila virulence . Soumis à Infect. Immun.
3. Allombert, J., Lazzaroni, J.C., Baïlo, N., Gilbert, C., Charpentier, X., Doublet, P. and
Vianney, A. (2014) Three antagonistic c-di-GMP-catabolizing enzymes promote differential
Dot/Icm effectors delivery and intracellular survival at the early steps of Legionella
pneumophila infection. Infect Immun. 82(3) : 1222-1233.
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