PROPOSITION DE SUJET DE STAGE MASTER-­‐2 RECHERCHE INFECTIOLOGIE FONDAMENTALE UNIVERSITE LYON-­‐1 2014-­‐2015 Titre du sujet de stage: Contrôle des étapes précoces du cycle infectieux de Legionella pneumophila Unité d’accueil : CIRI (INSERM U1111 / CNRS UMR5308 / ENS / UCB Lyon1) (Dr. F-L. Cosset) http://ciri.inserm.fr Laboratoire d’accueil : Equipe « Pathogénèse des légionelles » (PI : P. Doublet), Campus de la Doua – Bât. Lwoff (R+3). 10, rue Dubois - Villeurbanne Contact : Anne Vianney [email protected] / Christophe Gilbert [email protected] Sujet de stage: Contexte : Legionella pneumophila, est une bactérie pathogène intracellulaire, capable d’infecter les amibes des environnements aquatiques, mais aussi les macrophages alvéolaires humains après inhalation d’aérosols contaminés, causant alors une pneumopathie sévère, la légionellose. Cette pathologie reste un problème de santé publique en raison de son taux de mortalité relativement élevé (10 à 30 %, pour environ 1500 cas par an en France) et ceci en dépit de la mise en place d’un traitement adapté. L. pneumophila échappe à la dégradation par les cellules phagocytaires notamment grâce à l’injection, via le système de sécrétion de type 4 Dot/Icm, de près de 300 effecteurs bactériens directement dans les cellules cibles. Par ailleurs, ces dernières ne phagocytent pas L. pneumophila avec une grande efficacité, aussi la bactérie semble avoir mis en place des mécanismes stimulant son entrée dans les cellules (1). Récemment nous avons montré au laboratoire que l’étape d’entrée de L. pneumophila dans les amibes fait intervenir un système de sécrétion de type I fonctionnel, en particulier via la sécrétion d’un unique substrat, la protéine RtxA (2). Par ailleurs, un petit ARN non codant (ARNnc) potentiellement impliqué dans la régulation de l’expression des gènes codants pour ce SST1 a été identifié. D’autre part, nous avons mis en évidence le rôle de 3 voies de signalisation à di-GMP cyclique dans le contrôle des étapes précoces de l’infection par L. pneumophila (3). En effet, des mutants dépourvus de certaines enzymes métabolisant ou dégradant le di-GMP cyclique échappent plus difficilement à la dégradation intracellulaire. Nos derniers résultats suggèrent que chez ces mutants, la cinétique de sécrétion des effecteurs par le système Dot/Icm serait perturbée et ceci de façon spécifique à chacune des 3 voies identifiées, ce qui suggère un rôle inédit des voies de signalisation à di-GMP cyclique dans le contrôle de l’ordre d’injection des effecteurs du système de sécrétion Dot/Icm. Objectifs : L’objectif du stage de M2R s’inscrira dans l’une de ces 2 thématiques : - clarifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des gènes codant le SST1 (en particulier via l’expression de ARNnc) et du gène rtxA lors du cycle cellulaire en conditions de laboratoire et lors du cycle d’infection d’un hôte. A cette fin, le stage comprendra une première partie de constructions génétiques : des fusions d’opérons avec des gènes rapporteurs (GFP…), des mutants d’expression de l’ARNnc (déficience ou surexpression). Ce matériel biologique permettra ensuite de suivre l’expression du SST1 « in vivo » (vis-à-vis de l’amibe ou des macrophages) lors du cycle infectieux afin d’identifier précisément l’impact sur la virulence de Legionella pneumophila. - comprendre comment les voies de signalisation à di-GMP cyclique interviennent dans la coordination de la sécrétion des effecteurs bactériens au cours de l’infection. Des données de RNA-seq différentiel attendues avant le démarrage du stage de M2R (séquençage en cours des ARN totaux des souches mutantes et parentale) devraient permettre d’identifier des pistes à explorer en priorité, via la construction de matériel génétique (délétions de gènes, fusions avec des gènes rapporteurs,…). Par ailleurs, les 3 enzymes du métabolisme du di-GMP cyclique impliquées ont été purifiées, ce qui permettra également la recherche des partenaires de cette signalisation, et/ou des acteurs participant à l’organisation de la sortie des centaines d’effecteurs via le système Dot/Icm (recherche d’interactants par approches biochimiques de de type pulldown, cross-linking,…). Techniques : Les techniques sont communes au 2 axes présentés (manipulation en laboratoire de niveau 2, tests d’infection sur différentes cellules cibles (amibes environnementales, macrophages humains), tests d’efficacité d’entrée, suivi de la multiplication intracellulaire de bactéries exprimant des protéines fluorescentes (GFP, m-cherry) par mesure d’augmentation de la fuorescence dans un lecteur de plaque (Tecan), test de translocation des effecteurs bactériens dans les cellules par système rapporteur, suivi de marqueurs cellulaires par microscopie confocale, techniques de biologie moléculaire (mutagénèse, clonage), biochimiques (purification de protéines, pull-down), …. Références récentes: 1. Allombert, J., Fuche, F., Michard, C. and Doublet, P. (2013) Molecular mimicry and original biochemical strategies for the biogenesis of a Legionella pneumophila replicative niche in phagocytic cells.. Microbes Infect. Oct 24. 2. Fuche, F., Vianney, A., Andrea, C., Doublet, P. and Gilbert, C. Functional type I secretion system involved in Legionella pneumophila virulence . Soumis à Infect. Immun. 3. Allombert, J., Lazzaroni, J.C., Baïlo, N., Gilbert, C., Charpentier, X., Doublet, P. and Vianney, A. (2014) Three antagonistic c-di-GMP-catabolizing enzymes promote differential Dot/Icm effectors delivery and intracellular survival at the early steps of Legionella pneumophila infection. Infect Immun. 82(3) : 1222-1233.