Objectifs :
L’objectif du stage de M2R s’inscrira dans l’une de ces 2 thématiques :
- clarifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des gènes codant le SST1
(en particulier via l’expression de ARNnc) et du gène rtxA lors du cycle cellulaire en
conditions de laboratoire et lors du cycle d’infection d’un hôte. A cette fin, le stage
comprendra une première partie de constructions génétiques : des fusions d’opérons avec des
gènes rapporteurs (GFP…), des mutants d’expression de l’ARNnc (déficience ou
surexpression). Ce matériel biologique permettra ensuite de suivre l’expression du SST1 « in
vivo » (vis-à-vis de l’amibe ou des macrophages) lors du cycle infectieux afin d’identifier
précisément l’impact sur la virulence de Legionella pneumophila.
- comprendre comment les voies de signalisation à di-GMP cyclique interviennent dans la
coordination de la sécrétion des effecteurs bactériens au cours de l’infection. Des données de
RNA-seq différentiel attendues avant le démarrage du stage de M2R (séquençage en cours des
ARN totaux des souches mutantes et parentale) devraient permettre d’identifier des pistes à
explorer en priorité, via la construction de matériel génétique (délétions de gènes, fusions
avec des gènes rapporteurs,…). Par ailleurs, les 3 enzymes du métabolisme du di-GMP
cyclique impliquées ont été purifiées, ce qui permettra également la recherche des partenaires
de cette signalisation, et/ou des acteurs participant à l’organisation de la sortie des centaines
d’effecteurs via le système Dot/Icm (recherche d’interactants par approches biochimiques de
de type pulldown, cross-linking,…).
Techniques :
Les techniques sont communes au 2 axes présentés (manipulation en laboratoire de niveau 2,
tests d’infection sur différentes cellules cibles (amibes environnementales, macrophages
humains), tests d’efficacité d’entrée, suivi de la multiplication intracellulaire de bactéries
exprimant des protéines fluorescentes (GFP, m-cherry) par mesure d’augmentation de la
fuorescence dans un lecteur de plaque (Tecan), test de translocation des effecteurs bactériens
dans les cellules par système rapporteur, suivi de marqueurs cellulaires par microscopie
confocale, techniques de biologie moléculaire (mutagénèse, clonage), biochimiques
(purification de protéines, pull-down), ….
Références récentes:
1. Allombert, J., Fuche, F., Michard, C. and Doublet, P. (2013) Molecular mimicry and
original biochemical strategies for the biogenesis of a Legionella pneumophila replicative
niche in phagocytic cells.. Microbes Infect. Oct 24.
2. Fuche, F., Vianney, A., Andrea, C., Doublet, P. and Gilbert, C. Functional type I secretion
system involved in Legionella pneumophila virulence . Soumis à Infect. Immun.
3. Allombert, J., Lazzaroni, J.C., Baïlo, N., Gilbert, C., Charpentier, X., Doublet, P. and
Vianney, A. (2014) Three antagonistic c-di-GMP-catabolizing enzymes promote differential
Dot/Icm effectors delivery and intracellular survival at the early steps of Legionella
pneumophila infection. Infect Immun. 82(3) : 1222-1233.