LC-MS/MS

RÉSULTATS
CONCLUSION
Malgré la bonne corrélation apparente entre la méthode ECLIA de Roche et la méthode de référence LC-MS/MS, un biais considérable semble exister, surtout en
présence de D2.
Des résultats préliminaires démontrent que la méthode Roche semble sous-estimer le dosage de la 25-OH vitamine D totale de 65% chez les patients
supplémentés avec D2.
Cette étude permettra :
de proposer la meilleure méthode pour dépister et surveiller le traitement du déficit en vitamine D chez la population bariatrique;
la mise à jour des recommandations du suivi post-chirurgie bariatrique et le changement des pratiques en optimisant le choix de
suppléments en vitamine D (D2 vs D3) en fonction de la méthode de dosage disponible.;
d’orienter les laboratoires pour le choix de méthodes de dosage dépendamment de la clientèle servie.
Le dosage de la 25-OH vitamine D par la méthode ECLIA de Roche répond-il au besoin de
suivi des patients post-chirurgie bariatrique type dérivation bilio-pancréatique (DBP) ?
Ahlem Chouiali¹, Simon Biron², Guy Fink¹, Marie-France Langlois3
¹Département de biochimie, Faculté de médicine & sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Qc, Canada
²Département de chirurgie, Faculté de médecine & sciences de la santé, Université de Laval, Québec, Qc, Canada
3Département de médecine, Faculté de médicine & sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Qc, Canada
RÉSUMÉ
Introduction: la prévalence de l'hypovitaminose D peut atteindre 90% chez les patients après DBP malgré la supplémentation avec des
méga-doses de vitamine D. Notre hypothèse est que la méthode ECLIA de Roche pourrait ne pas reconnaître de façon équimolaire les
deux formes de la 25-OH vitamine D, surestimant ainsi la prévalence du déficit en vitamine D et exposant les patients post-DBP, et plus
particulièrement ceux supplémentés en D2, à un risque de toxicité à la vitamine D.
Objectif: comparer deux méthodes de dosage de la 25-OH vitamine D totale : la méthode ECLIA de Roche et la méthode LC-MS/MS chez
trois populations.
Méthode: c’est une étude transversale et corrélationnelle avec une mesure quantitative sur trois groupes : un groupe de 50 individus
choisis par convenance au laboratoire de biochimie clinique et deux groupes de patients post-DBP : 50 supplémentés en D3 et 50
supplémentés en D2.
Résultats préliminaires: malgré la bonne corrélation apparente entre la méthode Roche et la méthode LC-MS/MS chez le groupe contrôle,
un biais considérable semble exister, en particulier en présence de D2. La méthode Roche semble sous-estimer le dosage de la 25-OH
vitamine D totale de 65% chez les patients supplémentés avec D2.
Conclusion: les résultats de cette étude pourraient nous permettre de proposer la meilleure méthode pour dépister et surveiller le
traitement du déficit en vitamine D chez la population bariatrique ainsi que la mise à jour des recommandations du suivi post-chirurgie
bariatrique.
INTRODUCTION
La chirurgie est le seul traitement efficace à long terme de l'obésité morbide; pour ces raisons, le gouvernement a mis de l'avant un
programme de chirurgie bariatrique avec des objectifs de 25 à 150 patients opérés par an en Estrie entre 2007-2012.
La prévalence de l’hypovitaminose D peut atteindre 90% chez les patients après une chirurgie bariatrique malabsorptive (DBP) malgré
une supplémentation par des méga-doses de vitamine D.
La posologie préventive du déficit en vitamine D en post-DBP recommandée actuellement par lignes directrices est de 50 000 UI de
vitamine D2 ou D3 avec augmentation progressive des doses pouvant atteindre les 800 000 UI/j voire plus, avec des concentrations
sériques en 25-OH vitamine D souvent non satisfaisantes.
Le médecin a le choix de prescrire la vitamine D sous forme de vitamine D2 ou vitamine D3, en sachant qu’au Canada les comprimés
de la vitamine D2 sont concentrés à 50 000 UI et les comprimés de vitamine D3 le sont à 10 000 UI, les médecins à l’IUCPQ ont plus
tendance à prescrire de la D2 en post-DBP.
La méthode ECLIA de Roche pourrait ne pas reconnaître de façon équimolaire les deux formes de la 25-OH vitamine D, surestimant
ainsi la prévalence du déficit en vitamine D et exposant les patients post-DBP, et plus particulièrement ceux supplémentés en D2, à un
risque de toxicité à la vitamine D.
La prise d’une trop grande quantité de suppléments en vitamine D peut entraîner des effets toxiques néfastes (la formation de
lithiases rénales, calcification des tissus mous, notamment ceux du cœur, des poumons et des vaisseaux sanguins).
Peu d'études ont comparé la méthode Roche avec la méthode LC-MS/MS :
Malgré la bonne corrélation apparente entre les deux méthodes, un biais considérable semble exister, surtout
en présence de D2, pouvant varier de – 64% à + 62%.
Trois études ont utilisé un standard enrichi en vitamine D2 en sachant que celui-ci ne réagit pas de la même
façon qu’un spécimen humain contenant de la vitamine D2.
Le choix du type de population et du type de substitution vitaminique D n’a pas été précisé par ces études.
De plus, aucune de ces études n’a fait la corrélation de ces deux méthodes de dosage chez la population
bariatrique qui est la plus exposée à de fortes supplémentations en vitamine D pouvant atteindre la posologie
de 800 000 UI par jour.
HYPOTHÈSE ET OBJECTIF
Notre Hypothèse est que la méthode ECLIA de Roche pourrait ne pas reconnaître de façon équimolaire les deux formes de la 25-OH
vitamine D, surestimant ainsi la prévalence du déficit en vitamine D et exposant les patients post-DBP, plus particulièrement ceux
supplémentés en D2, à un risque de toxicité à la vitamine D.
L’objectif de cette étude est de comparer deux méthodes de mesure de la 25-OH vitamine D totale sérique : la méthode ECLIA de
Roche et la méthode de référence LC-MS/MS chez trois populations : deux populations post-chirurgie bariatrique type DBP : groupe
supplémenté en vitamine D2 et groupe supplémenté en vitamine D3 et un groupe contrôle supposément normal.
Patient
Posologie
D2 (UI Die)
ECLIA Roche
25-OH D totale
(nmol/l)
LC-MS/MS
25-OH D totale
(nmol/l)
LC-MS/MS
25-OH D2
(nmol/l)
LC-MS/MS
25-OH D3
(nmol/l)
1
600 000 35 219.99 214.52 5.47
2
150 000 64 150,97 144,03 6,94
3
50 000 23 80,85 71,17 9,68
Critères d’inclusion
Être âgé ≥ 18 ans
Avoir eu une chirurgie bariatrique type DBP (dérivation bilio-pancréatique)
Ne pas être supplémenté en vitamine D2 (pour le groupe sous vitamine D3)
Ne pas être supplémenté en vitamine D3 sauf en multivitamines (pour le groupe sous
vitamine D2)
Critères d’exclusion
Patient connu pour une mauvaise observance de la substitution en vitamine D
Inapte à consentir à l’étude
Patient ayant eu une révision de sa dérivation (2e intervention)
Patient ayant eu une DBP non standard (modifiée au niveau des longueurs d’anses)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
050 100 150
ROCHE (nmol/l)
LC-MS/MS (nmol/l)
Scatter Plot with Deming Fit
Identity
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
050 100
Standardized Residual
Estimated "True" Value
Residual Plot
0
20
40
60
80
100
120
140
160
050 100 150
ROCHE (nmol/l)
LC-MS/MS (nmol/l)
Scatter Plot with Deming Fit
Identity
Deming fit
(-22.66 + 1.26x)
A
-3
-2
-1
0
1
2
3
050 100
Standardized Residual
Estimated "True" Value
Residual Plot
B
DESIGN DE L’ETUDE ET MÉTHODE
Il s'agit d'une étude corrélationnelle transversale avec mesure quantitative sur trois groupes: un groupe de 50 spécimens de sang choisis
par convenance au laboratoire de biochimie clinique du CHUS et deux groupes de patients post-DBP : 50 patients supplémentés en D3 et
50 patients en D2.
Les patients seront recrutés au cours de leur visite de suivi à la clinique de l'obésité au CHUS et à l’IUCPQ.
Pour calculer la taille de l'échantillon, nous avons utilisé les recommandations du CLSI (clinical and laboratory standards institute). Le
nombre minimal requis dans chaque groupe est de 40 individus.
Pour la comparaison de méthodes, nous avons appliqué la régression de Deming, la régression linéaire et le graphique des différences à
l'aide du logiciel Analyse-it en considérant p <0,05 comme statistiquement significatif.
Les critères d'inclusion et d'exclusion pour 2 groupes de post-DBP :
RÉFÉRENCES
1. Khodja, H., et al. Le traitement ajustable chirurgical de l’obésité morbide, Rapport, Agence d’évaluation des technologies et des modes d’intervention en santé, Québec, octobre 2005.
2. Clinical practice guidelines for the perioperative, nutritional & metabolic support of bariatric patient: American society for metabolic and bariatric surgery, Endocrine Society and the obesity society, 2013.
3. Chen, Y., et al. Performance evaluation of Siemens ADVIA Centaur and Roche MODULAR Analytics Total 25-OH Vitamin D assays. Clinical Biochemistry, 2012.
4. Shu, I., et al. Influence of Vitamin D2 percentage on Accuracy of 1 commercial Total 25-OH vitamin D assay. Clinical Chemistry, 2012.
5. Method comparison and bias estimation using patient samples. Approved guideline. Clinical and laboratory standards institute, 2010.
6. Moon, H.W., et al. Comparison of four current 25-OH vitamin D assays. Clinical Biochemistry, 2012.
7. Janssen, M., et al. Multicenter comparison study of current to measure 25-OH vitamin D in serum. Steroids, 2012.
Figure 3: Corrélation de la méthode ECLIA de Roche avec le LC-MS/MS pour
le dosage 25-OH-D totale chez 70 individus choisis par convenance au
laboratoire de biochimie clinique du CHUS.
Régression de Deming (A) et diagramme des différences (B).
La corrélation est acceptable avec un biais positif moyen inferieur à 1% (0,8%).
0
50
100
150
200
250
050 100 150 200 250
ROCHE (nmol/l)
LC-MS/MS (nmol/l)
Scatter Plot with Deming Fit
Identity
Deming fit
(-11.42 + 1.05x)
A
A
-3
-2
-1
0
1
2
3
050 100
Standardized Residual
Estimated "True" Value
Residual Plot
B
Figure 1: Dosage de 25-OH vitamine D totale par ECLIA Roche
La nouvelle trousse pour le dosage Roche est censée
reconnaître de façon équimolaire des deux formes circulantes
de 25-OH vitamine D (25-OH D2 et 25-OH D3). Cette
technique présente un CV de moins de 7% à 10%, la limite de
détection de 7,5 nmol/l et la limite de quantification est de
22,5 nmol/l pour une erreur totale < à 40%. La linéarité est
comprise entre 7,5 et 175 nmol / l.
Figure 4 : Corrélation de la méthode ECLIA de Roche avec le LC-MS/MS pour
le dosage 25-OH D3 chez 70 individus choisis par convenance au laboratoire
de biochimie clinique du CHUS.
Régression de Deming (A) et diagramme des différences (B)
La valeur de la 25-OH D totale obtenue avec Roche a été comparée avec la 25-OH D3
obtenue par LC-MS/MS.
La corrélation est acceptable avec un biais positif de 3%.
Figure 2: Dosage de la 25 OH D2 et D3 par LC-MS/MS
La séparation chromatographique a été obtenue après extraction
organique et ajout du standard interne 25 (OH) D3-d₆. Les ions ont
été séparés après leur ionisation (ESI) en fonction de leur rapport
masse (m) /charge(z) des transitions de 570> 297,9 [std D3-d₆], 564>
297,9 [25 (OH) D3] , et 558> 297,9 [25 (OH) D2]. Le CV est < 6% pour
la D3 et < 8% pour la D2. La limite de détection est de 6,06 nmol/l
pour la D3 et 1,07 nmol/l pour la D2. La linéarité est comprise entre
0 et 250 nm/l pour la D3 et entre 0 et 40 nmol/l pour la D2.
Tableau 1 : Résultats préliminaires chez trois patients post-DBP supplémentés
en D2
Depuis deux ans, j’ai pu reprendre le suivi de 78 patients ayant subi une DBP. Parmi ces
patients, trois m’ont inspirée à développer ce projet de recherche, et plus
particulièrement la patiente # 1. Il s’agit d’une patiente de 44 ans qui a réintégré la
clinique de suivi de l’obésité du CHUS après 20 ans d’absence pour un tableau clinique
compatible avec un déficit sévère en vitamine D (ostéomalacie, ostéoporose, fractures
multiples spontanées et une myopathie avec incapacité de marcher). Le dosage de sa
vitamine D par Roche confirmait ces données cliniques avec un résultat très bas de
10 nmol/L. On avait débuté la supplémentation vitaminique D2 par une dose de
100 000 UI par jour per os et en augmentant progressivement la dose jusqu’à 600 000 UI
par jour ainsi que 600 000 UI en sous-cutanée 2 fois/an. Toutes ces méga-doses de
vitamine D n’arrivaient pas à améliorer la concentration sérique de sa vitamine D qui
demeurait plus basse que 35 nmol/L. Ceci m’a amenée à vérifier le résultat avec la
méthode LC-MS/MS. Le résultat fut surprenant car la patiente était sur le point d’être
intoxiquée à la vitamine D; sa vraie valeur était de 220 nmol/L, alors que la méthode
Roche donnait une valeur de 35 nmol/L.
Figures 5 : Corrélation de la méthode ECLIA de Roche avec le LC-MS/MS
pour le dosage 25-OH-D totale chez 70 individus choisis par convenance au
laboratoire de biochimie clinique du CHUS, après ajout des résultats des
trois patients post-DBP supplémentés en D2.
Régression de Deming (A) et diagramme des différences (B)
La corrélation est jugée acceptable avec un biais négatif de 6%.
En réalité, si les résultats des trois patients supplémentés en D2 sont analysés
séparément , on arrive à un biais négatif considérable de 65%.
558 (D2)
564 (D3)
570 (D3 -d₆)
%
m/z
REMERCIEMENT
Denis Cyr, chimiste, CHUS
Patrick Behrer, chimiste, CHUS
Isabelle Fréchette, stagiaire postdoctorale en biochimie clinique, CHUS
A
B