Spectrométrie de masse
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Spectrométrie de masse Analyseurs – Généralités Type Temps d’envol Acronyme TOF Principe de séparation Dispersion temporelle d’un fasceau ionique pulsé; séparation selon le temps d’envol Secteur magnétique B Dispersion d’un faisceau ionique continu; séparation selon le momentum des ions dans un champ magnétique (Forces de Lorentz) Quadrupole linéaire Q Faisceau ionique continu dans un champ quadrupolaire linéaire de radio-fréquence; séparation selon la stabilité des trajectoires. Trappe ionique quadrupolaire linéaire LIT Faisceau ionique continu et ions piègés; accumulation et séparation dans un champ linéaire de radio-fréquence quadrupolaire Trappe ionique quadrupolaire QIT Ions piègés; separation selon la trajectoire stables d’ions dans un champ quadrupolaire tridimensionelle de radio-frequence Résonance ionique cyclotronique ICR Ions piègés; séparation selon la fréquence cyclotronique (Force de Lorentz) dans un champ magnétique. CHM 3102 1 Spectrométrie de masse Analyseur – Temps d’envol La séparation temporelle des ions dans un tube de temps d’envol de longueur D est définie par: t = m •D 2eV De facon plus génerale nous devons considérer l’espace spatiotemporelle des ions au moment de leur accélération, ceux-ci étant dispersés sur une distance s entre la grille d’extraction et la plaque arrière de la source. Ce temps de résidence contribue également au temps d’envol et peut etre calculé en considérant la vélocité à chaque position s de la source. CHM 3102 2 Spectrométrie de masse Analyseur – Temps d’envol Plaque arrière Focalisation spatiale Grille Détecteur Tube d’envol so 2eVs m Si v = ∫ dt = ∫ D = 2so où v = ds/dt, par intégration nous obtenons: m ds • 1/2 2eV s et ts = m •2 s 2eV = m • 2s 2eVs De plus, le temps d’envol dans la region avant la grille (tD) est: Et le temps total est donne par: t = tD + ts = CHM 3102 tD = m •D 2eV m • [2s + D] 2eV 3 Spectrométrie de masse Analyseur – Temps d’envol Detecteur Temps d’envol linéaire (MCP) Cible + echan. Temps Laser Detecteur (MCP) Temps d’envol avec Reflectron Temps CHM 3102 4 Spectrométrie de masse Analyseur – Temps d’envol Reflectron à champ uniforme. Un reseau de resistance entre l’entrée de la grille et la fin du reflectron forme un champ électrique de croissance linéaire. Reflectron à deux étapes. Deux champ de retardement à croissance linéaire séparés par une grille. Le champ dans la premiere section (d1) est significativement plus élevé (↑∆V sur petit d) que dans la deuxieme section (d2). Les ions perdent 2/3 de leur énergie cinétique sur 1/10 de la longueur du reflectron. L1 ou L2 sera environ 8 fois la longueur du reflectron. Cet instrument permet une focalisation d’énergie de 2e ordre sur une plus grande gamme d’énergie cinétique. R.J. Cotter, Time of flight mass spectrometry, ACS, 1997 CHM 3102 5 Spectrométrie de masse Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice Longueur du tube d’envol Lineaire/reflectron 1.3/2.0 m 2.0/3.0 m 4.2/6.6 m CHM 3102 6 Spectrométrie de masse Analyseur – Quadrupole Caractéristiques Gamme de masse: m/z 10-4000 Résolution: ~ 1000 (unitaire) mais peut etre de 6000 dans certains cas Précision: ~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: Jusqu’à 5000 m/z par s Le temps de vie d’un ion de sa formation a sa detection est d’environ 40-100 µs. CHM 3102 7 Spectrométrie de masse Analyseur – Quadrupole y z x +(VDC + VRFcosωt) -(VDC + VRFcosωt) Deux paires d’électrodes métalliques. Application d’un voltage + à une paire et – à l’autre. Une combinaison de voltage direct (VDC) et alternatif (VRF) de frequence ω est appliqué à chaque paires. Les ions oscillent entre les électrodes dû aux forces électriques alternatives (attractives et repulsives). Les électrodes maintenues a voltage + filtrent les ions de haute masse alors que celles de voltage – filtrent les ions de basse masse. Pour une amplitude donnée des voltages DC et RF, seuls les ions ayant d’un m/z spécifique auront une trajectoire stable et seront transmis par le quadrupole alors que les autres seront destabilisés et n’auront pas de trajectoires stables. CHM 3102 8 Spectrométrie de masse Analyseur – Quadrupole Diagramme de stabilité ax = − ay = 8eVDC mr 2ω 2 qx = −qy = 4eVRF mr 2ω 2 xy a instable 0.3 Plus de résolution m1 < m 2 < m 3 a 2VDC = = cst q VRF 0.2 y stable 0.1 m2 m3 Moins de résolution x stable m1 0.2 xy stable 0.4 0.6 ∆q où: m: masse de l’ion e: charge r: rayon entre les électrodes 0.8 Détermine la résolution q Les voltage VDC et VRF sont balayés simultanément mais en maintenant leur rapport constant La gamme passante d’ion est définie par l’intersection de la pente a/q a l’intérieur de la région de stabilité CHM 3102 9 Spectrométrie de masse Analyseur – Quadrupole a Résolution a 2VDC = = cst q VRF 0.3 0.2 y stable x stable 0.1 xy stable 0.4 0.6 0.8 q Intensité 0.2 La résolution est determinee par la gamme ∆q. La résolution n’est pas nécessairement uniforme avec m/z et nécessite un ajustement de la pente a/q. L’augmentation de résolution se manifeste également par une diminution de sensibilité. Un compromis est nécessaire pour transmettre les ions d’intérêt avec une sensibilité et une résolution adéquate. m/z CHM 3102 10 Spectrométrie de masse Analyseur – Quadrupole Que se passe t’il lorsque VDC = 0 et que l’on varie VRF? a 0.3 q 0.2 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 q Lorsqu’on fixe VDC a 0, le quadrupole transmet une large bande d’ions et pert son avantage de filtre de masse. On peut tirer avantage de situation lors de l’activation par collision pour la caractérisation structurale ou un ion est soumis a une dissociation produisant des fragments caractéristiques pouvant tous etre transmis et détectés simultanément. CHM 3102 11 Spectrométrie de masse Analyseur – Quadrupole Q1 q Q2 Types de balayage Balayage complet (spectre conventionnel) Gaz de collision, Ar ou N2 Balayage sélectif (transmission d’ion avec m/z pré-définis, SIR) Spectre d’ions fragments (product ion scan) Multiples fragmentation sélectives (Multiple reaction monitoring) Spectres de precurseurs (precursor ion scan) Perte de neutre spécifique (Constant neutral loss) CHM 3102 12 Spectrométrie de masse Analyseur – Hybride quadrupole/temps d’envol Reflectron Q1 en mode selectif (MS-MS) Q1 en mode RF (Acquisition TOF) Orifice d’échantillonnage MCP Nébuliseur électrostatique Pulseur et lentilles d’extraction CHM 3102 q mode RF seul. (cellule à collision) q0 mode RF seul. 13 Spectrométrie de masse Analyseur – Hybride quadrupole/temps d’envol Duty cycle 615.4 (1+) 1s survey 2s MSMS2 2s MSMS1 5.00 6.00 7.00 Survey scan 421.7 (2+) T 583.3 (2+) 537.8 (2+) 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 889.4 (1+) 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 Time (min) MS-MS scan m/z 583.3 K S F N N N E E 9813 157 185.1 86.0 234.1 100 200 m/z 537.8 K 381.2 495.6 609.3 300 400 Q 201.1 I 388.2 yMax 1094.5 500 600 700 800 E A 852.3 723.4 L 900 1000 1100 1200 S LD 846.4 229.1 173.1 E I Human Stathmin yMax 646.3 517.3 759.4 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 CHM 3102 m/z 14 Spectrométrie de masse Analyseur – Trappe ionique Ion injectés Electrode terminale +Vrescos(ωrest + φres) z Voltage RF Vcos (ωt+φ) r r0 Electrode centrale Voltage de résonance AC -Vrescos(ωrest + φres) Détecteur Les ions sont accumulés à l’intérieur de la trappe ionique comportant deux électrodes terminales et une électrode centrale. Les ions ont une trajectoire stable en appliquant un voltage RF sur l’électrode centrale. Pour un maximum d’efficacité, les ions doivent etre concentrés vers le centre de la trappe où le champ électrique est optimal et moins distortionné. Ceci est accomplit en utilisant un gaz tampon tel l’helium favorisant un refroidissement collisionel. CHM 3102 15 Spectrométrie de masse Analyseur – Trappe ionique En augmentant le voltage RF ou en applicant un voltage auxilliaire aux electrodes terminales(ou les deux) il est possible de: Déstabiliser les ions et les éjecter de la trappe progressivement. Accumuler un ion spécifique Accumuler un ion et enregistrer ses fragments suite à l’application d’une longueur d’onde d’excitation aux électrodes terminales (MS-MS in time). Cette dernière etape peut être répetée successivement de façon a obtenir des spectres MSn. CHM 3102 16 Spectrométrie de masse Analyseur – Trappe ionique Diagramme de stabilité a q q= où: 4eVRF mr 2ω 2 m: masse de l’ion e: charge r: rayon de électrode centrale VRF: Voltage RF Pour que les ions aient une trajectoire stable q doit se situer entre 0.3 et 0.9. Ce paramètre est important particulièrement lors de la fragmentation; les ions fragments < 1/3 de m/z du précurseur auront une valeur q > 0.9 est ne seront pas accumulés. En augmentant VRF il est possible d’extraire un ion (m/z spécifique). Il est également possible d’ajuster le voltage aux électrodes terminales affectant le paramètre a. En combinant ces deux actions il est possibles d’éliminer les m/z (hauts et bas) nondésirés (modulation axiale). Ceci est par contre difficile a accomplir lorsque l’ion d’intérêt est en présence d’un excès d’ion ayant un m/z rapproché. CHM 3102 17 Spectrométrie de masse Analyseur – Trappe ionique Cycle des fonctions de la trappe ionique pour l’analyse MS-MS Voltage RF A Longueur d’onde multifrequence Ionization B Ejection > m/z Longueur d’onde multifrequence C Longueur d’onde activation par collision CHM 3102 Activation par collision et application de longueur d’onde d’excitation Accumulation des ions fragments VDC Modulation axiale Act. Coll. (cible) Balayage de m/z Ejection < m/z (cible) 18 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique Un ion (rouge) de vitesse perpendiculaire a la direction du champ magnétique (B en vert) subira l’action d’une force (bleu) telle que celui-ci sera déflechit sur une orbite circulaire. Cette force est décrit par: F = q (v × B) CHM 3102 où F: Force exercée sur l’ion q = charge de l’ion v = vitesse de l’ ion B = champ magnétique en Tesla 19 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique Lorsqu’on est face au champ magnetique, un ion soumis a celuici sera deflechit sur une trajectoire circulaire et la force magnetique (F2) sera égale et opposée à la force centrifuge (F1). F1 = F2 q v B = m v2/r m v2/r = q v B On obtient que la fréquence angulaire cyclotronique (ω en radian) d’un ion de masse m (en kg) et de charge q (en C) est: v/r = ω = q B/m CHM 3102 20 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique Si la fréquence cyclotronique est donnée par ω = q B/m Quelle est celle-ci pour un ion m/z 1000 soumis à un champ magnétique de 7 Tesla? q = 1.6022 x 10-19 coulombs (charge d’un électron) B = 7.0 T (champ magnétique) m = 1000 u x 1.6605 x 10-27 kg/u (pour obtenir la masse en kg) ω = 1.6022 x 10-19 C x 7.0 T x 1000 x 1.6605 x 10-27 kg = 6.7542 x 105 radians/s Fréquence en Hertz est donnée par: ω/2π f = ω/2π = 6.7542 x 105/2π f = 107.45 kHz CHM 3102 21 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique La détection des ions est basée sur une image de courant que l’ion laisse lors de son passage entre deux électrodes. Le va et vient de migration d’electrons au passage des ions se traduit par une image de courant et un signal sinusoidal de l’ordre de ~µA. Ce signal doit etre amplifié environ 1000 x (~ mA) avant d’être envoyé a l’ordinateur. Plusieurs milliers d’ions peuvent être détectés simultanément. Chaque m/z sera definit par une fréquence specifique. Une transformation de Fourier est nécessaire pour analyser les differentes fréquences et les convertir en m/z CHM 3102 22 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique Balayage RF pour accélérer les ions Ions oscillant sont détectés comme image-courant Transformation Fourier pour extraire fréquence et amplitude et conversion en spectre de masse CHM 3102 23 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique FTMS Ionspec de 7T CHM 3102 24 Spectrométrie de masse Analyseur – Résonance ionique cyclotronique Ubiquitin (~8500 Da) Caractéristiques analytiques: Precision sur la mesure de masse ~ 1ppm Résolution: > 200,000 (diminue avec vitesse de balayage) Sensibilité: ~ 10 fmoles (MALDI) MS-MS nécessite mode d’isolation et dissociation par capture électronique Coûteux (> 1M $) et volumineux Fichiers LC-MS requiert espace mémoire de plusieurs TB en mode continu. CHM 3102 25
