Les secrets de la méthode des 4 quadrants
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LABORATOIRE DE DIAGNOSTIQUE DE L’INSTITUT DE MICROBIOLOGIE DU CHUV Les secrets de la méthode des 4 quadrants Jérémy Pittet & Valentin Loup Mme Maria Senra Ortiz, Dr. Antony Croxatto & Dr. Guy Prod’hom 12/03/2014 Ecole Supérieure de la Santé, Lausanne Figure 1 : Staphylococcus aureus Sommaire La méthode d’ensemencement en quatre quadrants est la méthode de référence pour la plupart des prélèvements en microbiologie. Elle permet à la fois une estimation semi-quantitative du nombre de germes contenus dans un prélèvement et l’obtention de colonies isolées. Le principe est un épuisement séquentiel du matériel de départ. L’automatisation des ensemencements au moyen du WASPI (Walk Away Specimen Processor) permet d’obtenir une reproductibilité des mises en culture et représente ainsi une opportunité pour l’investigation de cette méthode d’ensemencement. Lors de notre stage de six mois au sein de l’institut de Microbiologie du CHUV, notre travail de diplôme a permis de tester les limites de cette méthode. Lors de ce travail nous avons souhaité : Visualiser la répartition des germes sur un milieu solide ensemencé avec la méthode des 4 quadrants Comparer 2 méthodes d’ensemencements en 4 quadrants disponibles sur le WASP. Etablir une corrélation entre la méthode semi-quantitative des 4 quadrants et l’ensemencement quantitatif. Mots clés : WASP I Technique Quatre Quadrants Pour tous les mots en rouge, se rapporter au « Lexique » 2 Quantitative Abstract The four quadrant streak pattern is one of the reference methods for samples inoculation on agar plate in microbiology. It allows both a semi-quantitative estimation of the number of colony-forming unit of a microbe in a sample and the obtention of individual colonies. The automated streaking using the WASP, allows a reproductibility of the inoculation and represent an opportunity for the investigation of this streaking methods. During our six month training in the Institute of Microbiology of the Lausanne University Hospital (CHUV), the goal of our diploma works was to test the limits of this method. During this work we wished: To monitor the distribution of bacteria plated with the four quadrant streak. To compare two four quadrant streaking methods available in the WASP. To investigate the correlation between the semi-quantitative four quadrant streaking method and the quantitative seeding method. Keys words: WASP Streaking Four Quadrant 3 Quantitative TABLES DES MATIERES 1. INTRODUCTION : ............................................................................................................. 6 1.1 Historique de l’isolement .............................................................................................. 6 1.2 La méthode en 4 quadrants : ........................................................................................ 7 1.3 Autres méthodes d’ensemencement : ........................................................................... 8 1.4 L’ensemencement automatisé en microbiologie ........................................................... 9 1.4.1 Les ensemenceurs : ................................................................................................ 9 1.4.2 L’InoqulA : .............................................................................................................. 9 1.4.3 Le Previ-isola ........................................................................................................ 10 1.4.4 Le WASP : ............................................................................................................. 11 2. BUT : ............................................................................................................................. 12 3. MATÉRIEL ET MÉTHODE : .............................................................................................. 12 3.1 Matériel : .................................................................................................................... 12 3.1.1 Les souches ATCC:................................................................................................ 12 3.1.2 Les milieux de culture : ........................................................................................ 12 3.1.3 Module d’acquisition d’images : .......................................................................... 14 3.2 Les mises en culture du WASP:.................................................................................... 14 3.2.1 La méthode des 4 quadrants Q3 : ........................................................................ 14 3.2.2 La méthode des 4 quadrants Q4 : ........................................................................ 14 3.2.3 La méthode quantitative2 H1: .............................................................................. 15 3.2.4 Le McFarland 0.5, les dilutions et les contrôles : ................................................. 15 3.2.1 La préparation des inoculum polymicrobiens ...................................................... 17 3.3 Déroulement de l’étude .............................................................................................. 18 4. RÉSULTATS : .................................................................................................................. 19 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 Test 1 : avec stérilisation ............................................................................................ 19 Test 1 : sans stérilisation ............................................................................................. 23 Test 2 : mélange de germe.......................................................................................... 28 Test 3 : limite supérieure de la méthode ..................................................................... 32 Test 4 : échantillons cliniques ..................................................................................... 36 5. DISCUSSION : ................................................................................................................ 40 5.1 1ère partie : comparaison des 4 quadrants .................................................................. 40 5.2 2ème partie mixes à différentes concentration ............................................................. 41 4 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 3ème partie limite de la méthode ................................................................................. 42 4ème Echantillons cliniques .......................................................................................... 42 Variations ................................................................................................................... 42 Observations ......................................................................... Erreur ! Signet non défini. Proposition d’améliorations : ...................................................................................... 46 6. CONCLUSION ................................................................................................................ 47 7. COÛTS ........................................................................................................................... 48 8. REMERCIEMENTS .......................................................................................................... 49 9. BIBLIOGRAPHIE ................................................................... ERREUR ! SIGNET NON DEFINI. 10. TABLE DES ILLUSTRATIONS............................................................................................ 51 11. REFERENCES ICONOGRAPHIQUES.................................................................................. 54 13. LEXIQUE : ...................................................................................................................... 55 14. GLOSSAIRE : .................................................................................................................. 56 15. ANNEXES : ..................................................................................................................... 57 5 1. Introduction : 1.1 Historique de l’isolement La mise en culture par la méthode des 4 quadrants est appliquée dans la plupart des laboratoires de microbiologie mais son origine est difficile à identifier. En effet dans un article rédigé par le microbiologiste Robert Koch1 en 1881 il est déjà mentionné que pour étudier les bactéries il faut auparavant obtenir des cultures pures. Ces cultures pures doivent être obtenues à partir de l’ensemencement d’une colonie isolée représentant une souche bactérienne, sur un nouveau milieu solide. Afin d’obtenir des colonies isolées, les microbiologistes se sont aperçus qu’il était nécessaire de diluer la concentration bactérienne par épuisement en étalant le matériel sur le milieu solide afin d’obtenir un gradient décroissant de germes. La première version illustrée de la méthode en 4 quadrants que nous avons retrouvée est celle décrite par les scientifiques Pelczar et Reid1 en 1958. Ils y décrivent l’ensemencement du 1er quadrant par quatre stries unidirectionnelles à l’aide d’une anse. Ensuite, ils stérilisent celle-ci avant d’effectuer les trois autres quadrants toujours en effectuant quatre à cinq stries unidirectionnelles, sans effectuer d’aller-retour. Ils illustrent par cette méthode l’importance de la stérilisation après l’ensemencement du 1er quadrant car la plupart du temps celui-ci est recouvert de colonies confluentes et la stérilisation de l’anse permet de répartir le matériel sur les trois autres quadrants et d’obtenir des colonies isolées même lors de prélèvements avec une forte concentration de bactéries. La méthode en 4 quadrants n’a pas vraiment évolué depuis cette date, si ce n’est par le fait que l’on effectue des stries en zigzags plutôt qu’unidirectionnelles et en plus grand nombre sur chaque quadrant. En effet, cette méthode reste encore à l’heure actuelle celle de référence afin d’obtenir des colonies isolées même à forte concentration bactérienne. 6 1.2 La méthode en 4 quadrants : Cette méthode est utilisée pour la plupart des prélèvements car elle va permettre d’obtenir des colonies isolées des différents germes. Elle permet d’avoir une estimation semi-quantitative de la quantité des germes contenus dans les divers prélèvements. Le premier quadrant est réalisé en effectuant des zigzags sur le quart de la gélose avec une quantité variable de prélèvement, puis l’anse est stérilisée avant l’ensemencement des 3 autres quadrants2. 1er quadrant 2ème quadrant 4ème quadrant 3ème quadrant La répartition des germes sur le milieu de culture est ensuite évaluée en « + » suivant leur répartition sur les différents quadrants : Nombre de colonies dans les quadrants 1 quadrant 2ème quadrant 3ème quadrant 4ème quadrant Quelques Tapis >5 Tapis >5 >5 Tapis >5 >5 >5 Grade er Figure 2 : Répartition sur le er 1 quadrant quantité faible Figure 3 : Répartition sur le er ème 1 et 2 quadrants (minimum 5 colonies) quantité modérée 7 + ++ +++ ++++ Figure 4 : Répartition sur 3 quadrants forte Estimation semiquantitative Faible Modérée Forte Forte Figure 5 :Répartition sur 4 quadrants forte quantité 1.3 Autres méthodes d’ensemencement : Il existe d’autres types d’ensemencements adaptés à des prélèvements spécifiques comme le LCR (liquide céphalo-rachidien), l’ensemencement du liquide de sonicationII des prothèses et la méthode quantitative. Ensemencement du LCR : la méthode consiste à déposer 4 gouttes sur une gélose à l’aide d’une pipette pasteur stérile. Cette méthode présente les avantages suivants : i) ensemencement d’un volume plus important (4x ~50 microlitres) ce qui permet de concentrer les germes ii) visualisation d’éventuelles contaminations par la croissance de colonies en dehors des gouttes. Ensemencement de liquide de sonication de prothèse : la mise en culture du biofilm lors d’infection de prothèse est précédée par une étape de sonication. La prothèse est plongée dans une solution de PBS contenue dans un récipient plastique. L’ensemble est soumis à une sonication pour détacher le biofilm bactérien de la prothèse. On prélève ensuite 100 µl du PBS contenant désormais les germes, que l’on étale sur un milieu de culture solide à l’aide d’un râteau. Une fois la plaque incubée on compte le nombre de colonies par géloses, afin d’exprimer le résultat final en nombre de germes par millilitre ce qui en fait une méthode quantitative. II Figure 6 : Culture du LCR Figure 7 : Sonication Ensemencement quantitatif2 : C’est la méthode utilisée en routine pour les prélèvements urinaires, les lavages broncho-alvéolaires et les biopsies des patients brûlés. La quantification bactérienne pour ces prélèvements est essentielle à l’interprétation du résultat. Dans les urines une concentration égale ou supérieure à 105 est généralement considérée comme pathologique3. L’ensemencement par le WASP se fait par le dépôt de 10µl de matériel sur la gélose qui est ensuite tiré jusqu’au tiers de la gélose puis des stries sont effectuées du haut jusqu’en bas du milieu. Les Figure 8 : Méthode résultats sont ensuite interprétés en comparaison avec des chablons (cf. quantitative annexes) correspondant à une série de concentrations connues. A noter que lors de l'ensemencement manuel conventionnel, le matériel est tiré sur la totalité de la gélose avant d'effectuer des stries de haut en bas. Pour tous les mots en rouge, se rapporter au « Glossaire » 8 1.4 L’ensemencement automatisé en microbiologie Contrairement à la plupart des laboratoires d’analyses médicales, l’automatisation des activités de bactériologie est encore limitée. Seules des activités spécifiques comme la détection des hémocultures positives et la lecture d’antibiogrammes sont automatisées depuis plusieurs années. Récemment, un nouveau type d’automate destiné à la mise en culture des échantillons cliniques a été commercialisé. L’automatisation doit permettre de répondre à une demande accrue d’analyses sans ressource en personnel supplémentaire. 1.4.1 Les ensemenceurs : Les ensemenceurs automatiques sont devenus indispensables dans un laboratoire de routine en microbiologie, car ils vont permettre d’assumer une activité répétitive sans valeur ajoutée pour le personnel tout en maintenant la qualité du service. Ces automates ont comme points forts : i) ii) une haute cadence d’ensemencement une bonne reproductibilité de l’activité (indispensable pour les méthodes quantitatives). Il existe différents modèles d’ensemenceurs sur le marché dont voici quelques exemples. 1.4.2 L’InoqulA : Cet automate est produit par la maison BD Kiestra . La spécificité de celui-ci provient du fait qu’il ensemence les prélèvements par l’intermédiaire d’une bille magnétique qui va se déplacer et repartir les germes sur l’ensemble de la gélose en suivant une trajectoire bien précise en zigzag. Figure 10 : Automate InoqulA de BD Kiestra Figure 9 : Isolement par l’InoquIA de BD Kiestra 9 1.4.3 Le Previ-isola Le Previ-isola est un automate commercialisé par la maison BioMerieux®. Sa technique d’ensemencement utilise un peigne tournant à 360°C, répartissant les germes sur toute la gélose. Cette technique permet d’obtenir plus facilement un plus grand nombre de colonies isolées à partir d’un prélèvement ainsi qu’une quantification depuis des chablons de référence. Figure 11 : L’isolement du Previ-Isola Figure 12 : Le peigne du Previ-Isola 10 1.4.4 Le WASP : Le WASP produit par la maison COPAN® est actuellement l’automate utilisé à l’Institut de Microbiologie du CHUV. C’est un automate permettant l’ensemencement sur plusieurs milieux de cultures et le dépôt de matériel sur des lamesa qui seront ensuite colorées au Gram. Le WASP reproduit à l’identique le travail que ferait un technicien manuellement, c’est-à-dire à l’aide d’une anse stérile avec laquelle il dépose 10µl de matériel et effectue des stries sur la totalité de la gélose. L’avantage du WASP est la possibilité de programmer plusieurs méthodes (pattern) d’ensemencements depuis un ordinateur relié à celui-ci. Il s’agit donc d’un automate flexible et personnalisable. Cet automate possède un carrousel comprenant 9 compartiments séparésb où l’on peut placer des milieux solides différents et ainsi ensemencer plusieurs géloses pour un même prélèvement. Pour pouvoir ensemencer les prélèvements avec le WASP, il faut qu’ils soient contenus dans un tube COPAN car les bras automatiquesc de l’appareil sont calibrés pour ceux-ci. En effet, on charge les tubes COPAN sur un tapis roulantd et un bras mécanique va prendre un à un chaque tube pour l’ensemencement. Les milieux solides ressortent ensuite sur le tapis de distributione. d c c a b e Figure 13 : Le Wasp 11 2. But : Cette étude a pour but de répondre à 3 objectifs distincts : 1. La méthode automatisée des 4 quadrants est-elle quantitative? 2. Comparer les deux différentes méthodes des 4 quadrants disponibles sur le WASP, en termes de quantification et d’obtention de colonies isolées. 3. Quels sont les avantages de la méthode en 4 quadrants en comparaison avec la méthode quantitative. 3. Matériel et méthode : 3.1 Matériel : 3.1.1 Les souches bactériennes: Pour le déroulement de notre travail, nous avons testé nos méthodes avec 4 souches bactériennes différentes. Des souches de référence ATCC (American type culture collection) et une souche clinique : Escherichia coli (Esccol) ATCC 25922 Staphylococcus aureus (Staaur) ATCC 29213 Enterococcus faecalis (Etcfec) ATCC 29212 Klebsiella pneumoniae (Klepne) souche clinique Ces souches ont été choisies car elles ont une croissance rapide (moins de 24 heures) à 37°C et sont fréquemment isolées des échantillons cliniques. 3.1.2 Les milieux de culture : Pour notre étude nous avons ensemencé les germes sur deux géloses différentes : Gélose Columbia4 : Le milieu de Columbia est un milieu riche où la plupart des germes exigeants vont pousser. Ce milieu est composé de sang de mouton (5%), de NaCl, d’agar, d’amidon et de peptones. Les peptones vont faciliter la croissance des germes, tandis que l’amidon va apporter une source d’énergie. Le sang de mouton va permettre la mise en évidence des différentes hémolyses et apporter également l’hémine (facteur X) qui est indispensable pour la croissance de certaines bactéries. 12 Gélose USB (Urine Screening of Bacteria): Ces géloses chromogènes sont utilisées en routine pour tous les prélèvements urinaires. Elles permettent la mise en évidence de trois activités enzymatiques que sont la β-galactosidase (rose), la tryptophane déaminase (brune) et la β-glucosidase (bleu). Nous avons utilisé ce milieu pour mieux visualiser les différents germes lors de nos ensemencements polymicrobiens. En effet les différents germes vont ressortir avec des couleurs bien distinctes sur la gélose : Escherichia coli : colonies rose (1) Staphylococcus aureus : colonies jaunes/blanches (2) Enterococcus faecalis : colonies turquoise (3) Klebsiella pneumoniae : colonies bleues foncées (4) 4 1 2 3 Figure 14 : Isolement quantitatif mix sur USB avec méthode H1 13 3.1.3 Acquisition d’images : Afin de comparer les cultures, les boîtes de Pétri ont été photographiées. 3.2 Les mises en culture du WASP: 3.2.1 La méthode des 4 quadrants Q3 : Figure 15 : Pattern de la méthode Q3 Figure 16 : Méthode en 4 quadrants Q3 avec Etc fec Cette méthode est celle utilisée actuellement en routine à l’Institut de Microbiologie du CHUV pour la plupart des prélèvements. L’automate dépose 10µl d’échantillon sur la largeur du 1er quadrant (va et vient) puis ensemence latéralement le premier quadrant (correspondant à 1/5ème de la surface de la gélose) en repassant 4 fois dans le 1er quadrant. L’anse est stérilisée après l'ensemencement du 1er quadrant avant l’ensemencement des 3 quadrants suivants où elle repasse latéralement 4 fois dans le quadrant précédent. Le fait de déposer à chaque fois la même quantité de matériel avant d’ensemencer le 1 er quadrant permet d’avoir une méthode reproductible et peut-être quantitative. 3.2.2 La méthode des 4 quadrants Q4 : Figure 18 : Méthode en 4 quadrants Q4 avec Etc fec Figure 17 : Pattern de la méthode Q4 14 Cette méthode se distingue de la méthode Q3 par le fait que : i) Le premier quadrant couvre une surface plus large (un tiers de la gélose) ii) le dépôt initial du matériel ne se fait pas sur la largeur complète du 1 er quadrant, iii) Un plus grand nombre de stries sont effectuées pour chacun des quatre quadrants (7 stries). Le but est d’ensemencer une surface plus importante de la gélose. 3.2.3 La méthode quantitative2 H1: Figure 20 : Méthode Quantitative avec Etc fec Figure 19 : Pattern de la méthode H1 Dans la méthode quantitative effectuée par le WASP, le dépôt initial se fait sur 1/3 (20 mm) de la gélose avant de répartir le matériel par épuisement par des stries sur l’ensemble de la gélose selon le schéma indiqué ci-dessus. Dans cette méthode aucune stérilisation n’est effectuée par l’automate. Grâce à la reproductibilité du WASP, des chablons de référence on été mis en place afin de quantifier les germes correctement. Cette méthode permet une estimation quantitative au log de 10 près entre 103 et 108 avec la présence de colonies isolées. Au-delà de 108 cfu (colony forming unite)/ml, l'obtention de colonies isolées est impossible. 3.2.4 Le McFarland 0.5, les dilutions et les contrôles : Pour pouvoir quantifier de manière précise nos méthodes, nous partons à chaque fois d’une suspension avec une concentration bactérienne connue, le McFarland 0.5 correspond à 1.5*108 germes/ml d’Escherichia coli. La préparation de l’inoculum est une étape importante. Il faut que la suspension soit parfaitement homogène afin d’obtenir des résultats reproductibles. En effet, la qualité de la suspension va influencer la précision des dilutions et modifiera considérablement le nombre de colonies sur les plaques. Nous allons utiliser cette méthode pour tous les inocula de notre étude. 15 Nous avons effectué des dilutions à partir de nos McFarland 0.5 pour obtenir un gradient de concentration de 108 à 102 germes par millilitre. 200 µl Mc Farland 108 107 106 105 104 103 102 Contrôle : 100µl + 1800 µl NaCl Mc Farland 0.5 Afin de vérifier si l’inoculum initial et les dilutions étaient corrects, nous avons étalé sur deux plaques Columbia 100 µl au râteau des dilutions 103 et 104. Nous comptons ensuite le nombre de colonies sur les plaques. Une dilution précise à 104 germes devrait donner une croissance d’environs 1000 colonies et une dilution correcte pour 103 devrait donner logiquement une croissance dix fois moins élevée d'environ 100 colonies. 16 3.2.1 La préparation des inocula polymicrobiens Nous avons préparé plusieurs McFarland 0.5 avec 4 différentes souches bactériennes : Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli et Enterococcus faecalis. Nous avons effectué des dilutions et des mélanges avec les différentes concentrations en utilisant toujours le même volume (400µl) pour chaque germe. Le mélange des inocula peut faire varier la concentration de l’échantillon d’environ un log. Par exemple, la concentration du mélange Etcfec 107, Staaur 106, Klepne 105 possède une concentration de 3.6x106. La concentration diminue dans les mélanges avec des concentrations différentes car les échantillons se diluent entre eux. Exemple du calcul d’une concentration : Exemple de la préparation d’un inoculum avec différentes concentrations de germes : Etcfec 107 Staaur 106 Klepne 105 + 400µl Concentration final 3.6x106 cfu/ml 17 3.3 Déroulement de l’étude Nous avons sélectionné trois types d’ensemencements pour la réalisation de cette étude qui sont les 2 méthodes en quatre quadrants Q3 et Q4 et la méthode quantitative H1. La stratégie optée pour ce travail est divisée en quatre parties : 1. Nous avons ensemencé trois souches ATCC sur des plaques Columbia avec les méthodes Q3, Q4 et H1 avec et sans stérilisation après le 1er quadrant afin d’avoir une première idée des résultats. Ces résultats nous permettront de dire si la méthode en 4 quadrants est quantifiable et de définir laquelle des deux méthodes en quatre quadrants est la plus performante. 2. Nous procédons à un mélange de germes (de 2 à 4) à différentes concentrations (allant de 108 à 105 germes/ml) dans le but d’observer : i) Si la quantification est influencée par une flore polymicrobienne. ii) D’observer si l’on obtient des colonies isolées de chaque germe malgré une forte concentration. 3. Afin de tester la limite supérieure des trois méthodes d’ensemencement, nous avons effectué une culture en overnight pour les souches d’Escherichia coli et de Staphylococcus aureus dans des bouillons BHI (Brain Heart Infusion). Ceci nous permet d’obtenir une concentration bactérienne entre 109 et 1010. 4. Nous avons testé divers prélèvements cliniques très fortement positifs à l’examen direct. Le but étant de confronter nos dilutions avec des échantillons cliniques. 18 4. Résultats : Première partie : Déterminer laquelle de deux méthodes d’ensemencement en quatre quadrants est la plus performante. Comparer l’ensemencement en quatre quadrants avec la méthode quantitative. 4.1 Test 1 : avec stérilisation Résultats des méthodes Q3, Q4 avec stérilisation et de la méthode quantitative H1 avec Escherichia coli. Pour la méthode Q3, nous avons observé qu’à la concentration la plus élevée (108), les colonies atteignent le 3ème quadrant (figure 21). Nous avons pu relever également que dès la concentration 107, la répartition des germes ne se retrouvent plus qu’au 2 ème quadrant (figure 22). 8 7 Figure 21 : Esccol 10 Q3 Figure 22 : Esccol 10 Q3 Pour la méthode Q4, les colonies ne se répartissent pas plus loin que le 2ème quadrant avec une concentration de 108 (figure 23). A partir de 107 les colonies se répartissent uniquement sur le 1er quadrant pour Esccol (figure 24) et Staaur, mais sur deux quadrants pour EEtcfec. 8 7 Figure 23 : Esccol 10 Q4 Figure 24 : Esccol 10 Q4 Les contrôles internes nous indiquent que nous sommes légèrement en-dessous des concentrations (concentration la plus élevée égale environ à 5x107 plutôt que 108. Voir figure 21 ci-dessous). L’étalement du contrôle à 104 nous avons compté environs 400 colonies alors que nous aurions dû 19 arriver autour des 1000 colonies (Figure 25). La situation est la même pour le contrôle à 10 3 où nous comptons environs 40 colonies plutôt que 100 (Figure 26). Cela peut s’expliquer par le fait que la préparation d'un McFarland 0.5 ne permet pas d'atteindre une concentration de 108 avec une précision de 100% (variation biologique et analytique). 4 3 Figure 25 : contrôle interne 10 Figure 26 : contrôle interne 10 Test Germes Méthodes Géloses Stérilisation Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Sta aur Esc col Etc fec Sta aur Etc fec Esc col Sta aur Etc fec Esc col H1 H1 H1 Q3 Q3 Q3 Q4 Q4 Q4 Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Non Non Non oui oui oui oui oui oui g10 - g9 - g8 10^8 10^8 10^8 3+ 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ Concentration des dil. g7 g6 g5 g4 10^7 10^7 10^5 10^4 10^8 10^6 10^5 10^4 10^7 10^6 10^5 10^4 2+ 2+ 1+ 1+ 2+ 1+ 1+ 1+ 2+ 2+ 1+ 1+ 2+ 1+ 1+ 1+ 2+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ Tableau 1 : Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4 avec stérilisation 20 g3 16 col 4 col 1 col qq qq qq qq qq qq g2 6 col Ø Ø Ø Ø Ø Ø 2 col 1 col 108 107 106 105 Q3 Q4 H1 H1 Réf. 8 5 Tableau 2 : Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec Escherichia coli de 10 à 10 Tous les ensemencements ont été réalisés sur gélose Columbia. Les chablons de référence sont sur USB. 21 104 103 102 Q3 Q4 H1 H1 Réf. 4 2 Tableau 3 : Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec l’Escherichia coli de 10 à 10 22 4.2 Test 1 : sans stérilisation Résultats du test 1 avec les méthodes Q3, Q4 sans stérilisation après le 1er quadrant. Tous les ensemencements ont été également réalisés sur gélose Columbia. Contrairement à la méthode avec stérilisation, on remarque cette fois qu'une quantification est possible (gradient de répartition proportionnel de 108 à 102) pour les deux méthodes mais que très peu de colonies sont isolées pour les concentrations de 10 8 et 107. Pour Etcfec et Staaur on remarque qu’entre 107 et 106 il n’y a pas une grande différence au niveau des 3ème et 4ème quadrants mais que dans le tapis la quantité diminue (figures 27 à 28). Cette observation peut être due au fait qu'une différence d'un log (10x) se distingue difficilement dans les 3ème et 4 ème quadrants lorsque la concentration de germes est très élevée. Il devient impossible d'estimer une quantité lorsque la gélose est saturée (colonies confluentes). Ainsi, des prélèvements contenant 108, 109 ou 1010 bacteries/ml auront une croissance confluente identique sur la gélose. (Figure 29 et 30) 6 Figure 28 : Staaur à 10 avec Q3 7 Figure 27 : Staaur à 10 avec Q3 8 7 Figure 29 : Esccol à 10 avec Q3 Figure 30 : Esccol à 10 avec Q3 23 La différence importante observée entre 107 (figure 31) et 106 (figure 32) de Esccol est logique. Entre 50 et 100 colonies sont comptées du 2ème au 4 ème quadrant avec les dilution 106, ce qui signifie qu'environ 1000 colonies sont présententes dans ces mêmes quadrants à 107. 6 7 Figure 32 : Esccol à 10 Méthode Q3 Figure 31 : Esccol à 10 Méthode Q3 Concernant la méthode Q4 on peut s’apercevoir que malgré la largeur plus grande du 1er cadran, il n’y a pas de différence significative avec la méthode Q3. On retrouve les mêmes points mis en évidence avec la méthode Q3. Test Germes Méthodes Géloses Stérilisation Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Test 1 Sta aur Esc col Etc fec Sta aur Etc fec Esc col Sta aur Etc fec Esc col H1 H1 H1 Q3 Q3 Q3 Q4 Q4 Q4 Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Non Non Non Non Non Non Non Non Non g10 - g9 - Concentration des dil. g8 g7 g6 g5 g4 10^8 10^7 10^6 10^5 10^4 10^8 10^8 10^6 10^5 10^4 10^8 10^7 10^6 10^5 10^4 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ g3 1 col 3 col 7 col 1+/qq Ø qq qq qq qq g2 1 col 1 col 1 col 3 col Ø Ø 5 col Ø Ø Tableau 4 : Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation En regardant ce tableau, on peut affirmer que les méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation donnent des résultats similaires et que ces résultats sont équivalents à la méthode H1. 24 108 107 106 Q3 Q4 H1 H1 Réf. Tableau 5 : Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 25 108 à 105 105 104 103 102 Q3 Q4 H1 H1 Réf 4 2 Tableau 6 : Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 10 à 10 26 Résumé des résultats du test 1 : a) Le premier point important pour la méthode Q3, réalisé avec stérilisation, est le fait qu’à la concentration 107, les colonies ne se répartissent pas plus loin que le 2ème quadrant. En routine cela correspond à une quantité modérée. De plus, le fait qu’à une concentration de 108, la répartition des colonies ne dépasse pas le 3ème quadrant nous indique que lorsque nous sommes confrontés à des colonies allant jusqu’au 4ème quadrant, les concentrations bactériennes se situent entre 109 et 1010. b) Pour la partie du test sans stérilisation, nous avons pu nous apercevoir que la méthode choisie n’influence en rien les résultats. Effectivement, quelque soit la concentration, les résultats seront identiques pour les deux méthodes. 27 4.3 Test 2 : Inocula polymicrobiens Cette étape va nous permettre de vérifier laquelle des méthodes (Q3 ou Q4) est la plus performante au niveau de la quantification et de l’isolement lors de prélèvements polymicrobiens. Nous avons utilisé 4 germes différents pour réaliser ce test qui sont : Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. Les différents ensemencements sont réalisés avec et sans stérilisation à partir de flores mixtes de concentrations variables. Tous les tests ont été réalisés sur gélose USB. Pour la méthode Q3, nous avons pu constater qu’avec des concentrations bactériennes à 10 8, la stérilisation est indispensable afin d’obtenir des colonies isolées (figure 33 et 34). Entre 107 et 106, nous sommes confrontés au même problème que dans le test n°1, les colonies sont réparties sur deux quadrants. A cette concentration, la méthode Q3 sans stérilisation permet d’obtenir plus de colonies isolées car elles sont mieux réparties sur la gélose (figure 35 et 36). 8 8 8 Figure 33 : Etc 10 , Sta 10 , Esc 10 Q3 avec stérilisation 7 6 8 8 7 6 8 Figure 34 : Etc 10 , Sta 10 , Esc 10 Q3 sans stérilisation 5 Figure 35 : Etc 10 , Sta 10 , Kle 10 avec stérilisation 5 Figure 36 : Etc 10 , Sta 10 , Kle 10 sans stérilisation 28 Pour la méthode Q4, à une concentration de 108, la stérilisation n’améliore pas l’isolement (cf. figure 37 et 38). 8 8 8 Figure 37 : Etc 10 , Sta 10 , Esc 8 10 Q4 avec stérilisation 8 Figure 38 : Etc 10 , Sta 10 , Esc 8 10 Q4 sans stérilisation Lorsque nous sommes en présence d’une concentration inférieure ou égale à 10 7, le fait de stériliser donne de moins bons résultats (cf. figure 36 et 37), comme déjà souligné avec la méthode Q3. 7 6 5 7 Figure 39 : Etc 10 , Sta 10 , Kle 10 Q4 avec stérilisation 6 5 Figure 40 : Etc 10 , Sta 10 , Kle 10 Q4 sans stérilisation 29 (a) : Escherichia coli à 108, Staphylococcus aureus à 108, Enterococcus faecalis à 108 (b) : Escherichia coli à 108 et Klebsiella pneumoniae à 108 (a) Avec stérilisation (a) Sans stérilisation Q3 Q4 H1 Tableau 7 Résultats de deux différents mix sur géloses USB 30 (b) Avec stérilisation (b) Sans stérilisation (c) : Enterococcus à 107, Staphylococcus aureus à 106 et Klebsiella pneumoniae à 105 (d) : Enterococcus à 108, Escherichia coli à 107 et Klebsiella pneumoniae à 105 (c) Avec stérilisation (c) Sans stérilisation Q3 Q4 H1 Tableau 8 : Résultats de deux différents mix sur géloses USB 31 (d) Avec stérilisation (d) Sans stérilisation Résumé du test 2 : a) Pour les méthodes avec stérilisation : Avec Q3, les résultats diffèrent de ceux obtenus au test 1. En effet, avec une concentration bactérienne à 108, nous retrouvons des colonies jusqu’au 4ème quadrant alors que lors de la première expérience elles atteignaient seulement le 3ème. Sans stérilisation les résultats sont équivalents au test n°1. Pour la méthode Q4 , les résultats quantitatifs sont les mêmes que ceux observés dans le test n°1. b) Pour les méthodes sans stérilisation : Pour des concentrations supérieures ou égales à 108, la stérilisation est indispensable pour éviter une confluence des colonies avec les deux méthodes. A partir d’une concentration de 107, les méthodes sont équivalentes et donnent de meilleurs résultats sans stérilisation. 4.4 Test 3 : limite supérieure de la méthode Après le test N°1, nous avons constaté que la concentration à 10 8 n’arrivait qu’au troisième quadrant. Nous avons réalisé ce test pour évaluer la quantité des germes sur quatre quadrants et tester la limite de deux méthodes d’isolement. Nous avons pour cela cultivé deux souches bactérienne, Escherichia coli et Staphylococcus aureus, jusqu’à atteindre une concentration situé entre 109 et 1010 germes/ml que nous avons ensuite dilué jusqu’à 107 germes/ml. Avec une concentration à 1010 nous atteignons cette fois le 4ème quadrant par les deux méthodes avec stérilisation (Figure 41 et 42) tandis que la méthode H1 est complètement saturée (Figure 43). 10 Figure 41 : Q3 à 10 stérilisation avec 10 Figure 42 : Q4 à 10 stérilisation 32 avec 10 Figure 43 : H1 à 10 Pour la méthode Q3 avec stérilisation à 109, le 4ème quadrant est toujours atteint (Figure 44). 9 Figure 44 : Q3 à 10 avec stérilisation Pour la méthode Q4 avec stérilisation à 109 et 108 , les colonies n’arrivent qu’au 2ème quadrant (Figure 45 et 46). En regardant la plaque attentivement on remarque que l’automate ne touche pas le 1er cadran dans la dilution 109 ce qui explique le nombre de colonies restreintes dans cet échantillon (voir chapitre 5.5 variation point 3). 8 8 Figure 45 : Q4 à 10 avec stérilisation Figure 46 : Q4 à 10 avec stérilisation On remarque que nos concentrations sont effectivement supérieures à 10 8 cfu/ml grâce aux chablons de référence. La quantité de colonies est plus élevée par rapport à tous nos autres tests. 33 1010 109 108 Q3 Q4 H1 H1 Ref Tableau 9 : Résultats de la limite de la méthode d’Escherichia coli avec stérilisation 34 107 1010 109 108 Q3 Q4 H1 H1 Ref Tableau 10 : limite de la méthode d’Escherichia coli sur Columbia sans stérilisation 35 107 Test Germes Méthodes Géloses Stérilisation Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Test 3 Sta aur Esc col Sta aur Esc col Sta aur Esc col Sta aur Esc col Sta aur Esc col H1 H1 Q3 Q3 Q3 Q3 Q4 Q4 Q4 Q4 Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Columbia Non Non oui oui non non oui oui non non Concentration des dil. g10 g9 g8 g7 g6 g5 g4 > 10^8 10^8 10^7 10^6 10^5 10^4 >10^8 >10^8 >10^8 10^7 10^6 10^5 4+ 4+ 2+ 2+ 1+ 1+ 4+ 4+ 2+ 2+ 1+ 1+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 1+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 4+ 2+ 1+ 1+ 1+ 1+ 4+ 2+ 2+ 1+ 1+ 1+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - g3 Ø 2 col 2 col Ø 2 col - g2 Ø Ø Ø Ø Ø - Tableau 11 : Résultats récapitulatif du test sur la limite de la méthode avec Escherichia coli et Staphylococcus aureus 4.5 Test 4 : échantillons cliniques Ce test va nous permettre de tester la limite des deux méthodes sur des échantillons cliniques. Nous avons donc choisi des prélèvements contenant une flore polymicrobienne en forte quantité à l’examen direct. Nous avons sélectionné des prélèvements tels que des expectorations et un pus, à cause de leur viscosité, afin d’observer s’il y a une différence en fonction de la nature de l’échantillon. Expectorations : Figure 47 : Expectorations N°14-02190933 Q3 sans stérilisation Figure 48 : Expectorations N°14-02190933 Q4 sans stérilisation 36 Figure 49 : N°14-0219-0933 Q3 avec stérilisation Figure 50 : Expectorations N°14-02190933 Q4 avec stérilisation Figure 51 : Expectorations N°14-02190933 H1 37 Figure 52 : Expectoration N°14-02190999 Q3 avec stérilisation Figure 53 : Expectoration N°14-02190999 Q4 avec stérilisation Figure 54 : Expectoration N°14-02190999 Q3 sans stérilisation Figure 55 : Expectoration N°14-02190999 Q4 sans stérilisation Figure 56 : Expectoration N°14-02190999 H1 38 Dans ces échantillons, qui sont généralement polymicrobiens, l’absence de stérilisation nous amène jusqu’au 4ème quadrant avec des colonies isolées facilement identifiables. Avec la stérilisation, les colonies poussent uniquement dans le 1er quadrant ce qui gêne la distinction de certaines bactéries. Plaie opératoire superficielle : Figure 57 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 avec stérilisation Figure 58 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 avec stérilisation Figure 59 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 sans stérilisation Figure 60 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 sans stérilisation 39 Figure 61 : plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 H1 Cette plaie opératoire superficielle possède une plus grande concentration des germes que les deux expectorations ci-dessus. Sans stérilisation l’ensemencement est saturé, par contre la stérilisation permet d’identifier tous les germes et l’on observe de nombreuses colonies isolées. 5. Discussion : 5.1 1ère partie : comparaison des 4 quadrants Test 1 avec stérilisation : Dans ce test la méthode Q3 est meilleure que la méthode Q4. Cela peut être expliqué par la largeur du premier quadrant où le matériel sera plus dilué avant d’être réparti sur les autres quadrants. Une quantification de ces deux méthodes (Q3 ou Q4) reste très difficile à réaliser en raison de la répartition des germes uniquement dans le 1er quadrant pour les concentrations les plus basses (g5 à g2). Les résultats présenté dans les tableaux ci-dessus, nous permette de déduire qu’avec la méthode Q3 lorsque nous observons en routine un prélèvement contenant une quantité forte de germes (4+) nous sommes donc bien au-delà d’une concentration bactérienne correspondant à 108. A l’inverse pour les concentrations à 105, elles seront évaluées en quantité faible (1+) au poste de routine. Dans un prélèvement contaminé (expectoration) cette quantité de germes peut se révéler pathogénique bien qu’elle soit considérée comme faible. On peut également relever le fait qu’avec la méthode Q4, on retrouve un nombre de colonies isolées réduit par rapport à Q3, contrairement à ce que nous aurions attendu avec l’élargissement du 1er quadrant. Cette différence est expliquée dans le chapitre 5.5 variations. 40 Grâce à nos contrôles internes et à la méthode quantitative qui correspond aux chablons de référence nous pouvons affirmer la fiabilité de nos résultats. Test 1 sans stérilisation : Sans la stérilisation les méthodes Q3 et Q4 sont équivalentes, car en les comparants avec la méthode quantitative on remarque une similitude qui nous permettrait de quantifier les 4 quadrants. La quantification est donc envisageable si l’on supprimait la stérilisation dans les méthodes d’ensemencements Avec la suppression de la stérilisation nous obtenons des étalements à 4+ malgré une concentration à 108 seulement. Avec les dilutions plus basses (105) on retrouve des colonies uniquement dans le 1er quadrant. On n’obtient pas de colonies isolées en supprimant la stérilisation. La fiabilité de ce test est correct car les contrôles correspondent aux nombres de germes attendus et que la méthode quantitative est identique aux chablons de référence. La stérilisation est donc une méthode plus sensible à la variation de l’ensemencement donc moins reproductible. C’est une méthode optimale pour l’isolement de colonies dans des échantillons contenants une forte concentration de germes et pour la semi-quantification, mais pour avoir une méthode quantitative la suppression de la stérilisation est idéale. 5.2 2ème partie mixes à différentes concentration Pour les prélèvements polymicrobiens, la largeur du 1er quadrant de la méthode Q4 n’amène pas de plus-value car l’isolement est médiocre. La méthode Q3 est donc plus intéressante dans les prélèvements polymicrobiens car sa répartition est plus homogène et permet un meilleur isolement des colonies. Concernant la quantification, nous observons des différences par rapport aux résultats obtenus sur Columbia (test n°1). Sur USB, à une concentration de 108, le 4ème quadrant est cette fois atteint. Cette variation pourrait venir de la gélose en elle-même, l’USB étant plus épaisse et plus rugueuse qu’une gélose Columbia ou de l’inclinaison de l’anse (cf. chapitre 5.5). A partir d’une dilution de 106, on ne retrouve des colonies que dans le 1er quadrant, ce qui rend la quantification toujours aussi compliquée. 41 5.3 3ème partie limite de la méthode Pour la méthode Q3 nous pouvons observer qu’aux concentrations de 1010 et 109, les colonies atteignent le 4ème quadrant. Ce qui signifie que lorsque nous rencontrons des prélèvements décrits à 4+ au poste de routine, cela correspond à une concentration bactérienne supérieure à 108 cfu/ml. La méthode Q4 se révèle moins performante que la méthode Q3 lors de concentrations élevées. En effet les colonies sont moins bien isolées, et nous passons de 4 quadrants à 1010 à 2 quadrants pour une concentration de 109. Un 1er cadran plus large n’apporte pas de plus-value à la mise en culture. 5.4 4ème Echantillons cliniques Les résultats nous permettent d’observer qu’en supprimant la stérilisation dans des prélèvements contenant une faible concentration de germes, le matériel est beaucoup mieux réparti. Cela confirme les résultats obtenus dans la 2ème partie de l’étude. Avec des prélèvements contenant une forte concentration de germes la stérilisation est indispensable si l’on veut obtenir des colonies isolées. On remarque que la méthode Q3 est plus adaptée car le 1 er quadrant plus petit permet un meilleur étalement de l’échantillon. On remarque également que la méthode quantitative est inutilisable pour des prélèvements polymicrobiens au-delà de 108, on ne retrouve pas de colonies isolées. L’isolement par la méthode des 4 quadrants est donc la plus utile dans ce genre de prélèvements. 5.5 Variations Nous avons été confrontés à plusieurs facteurs pouvant influencer la reproductibilité, la qualité et la quantification de nos ensemencements. En effet, de nombreuses variations sont présentes dans les méthodes Q3 et Q4.Nous n’obtenons jamais exactement les mêmes résultats pour un même protocole de mise en culture. Nous avons pu noter plusieurs raisons pouvant expliquer ces variations : 1) L’inclinaison de l’anse : L’anse pourrait expliquer une grande partie de ces variations. En effet nous avons remarqué que celle-ci était parfois tordue ce qui pourrait dire que l’anse ne touchait pas assez la gélose lors de nos ensemencements. Le WASP ne possède aucun capteur pouvant optimiser le contact avec le milieu solide. Nous pouvons néanmoins affirmer que l’anse touchait la gélose lors de nos tests car on peut nettement voir les stries dessinées sur nos géloses. Cependant, ce que l’on ne peut pas garantir est une différence de pression exécutée par l’anse sur la gélose due à son inclinaison, ce qui pourrait provoquer un moins bon dépôt du matériel sur le milieu solide. 2) Gélose USB vs Columbia : Nous avons pu nous apercevoir à travers nos résultats qu’une différence sur la répartition des colonies existe entre les milieux Columbia et USB. Cela peut être expliqué par la consistance du milieu USB qui est plus dense que la Columbia (éventuellement plus d’agar). Cette différence de consistance pourrait permettre à l’anse de mieux déposer le matériel sur la surface de la gélose car 42 celle-ci présente une plus forte résistance au mouvement de l'anse. De plus nous avons pu remarquer que la surface de la gélose Columbia est beaucoup plus irrégulière. 3) Exécution incorrecte de Pattern : Nous avons comparé nos ensemencements avec les patterns officiels fournis par COPAN et avons pu constater de grandes différences entre la théorie et la réalité. Pour la méthode Q3, nous avons remarqué qu’il y a une variation lorsque l’anse retourne dans le 1 er quadrant afin d’exécuter le 2ème. En effet, le WASP va retourner pour certains cas jusqu’à la 3ème strie du 1er quadrant alors que dans d’autres seulement jusqu’à la 2ème strie. Cette différence pourrait modifier la répartition sur les autres quadrants car on reprend plus ou moins de matériel. De plus dans certains cas, lors de la conception des quadrants 3 et 4, l’automate ne retourne pas assez loin, ou pas du tout, dans le quadrant antécédent. Ces variations par rapport aux patterns pourraient être expliquées par l’inclinaison de l’anse ou par un mauvais paramétrage de l'automate. Néanmoins si le problème ne vient pas de l’anse, le problème viendrait des Patterns qui ne correspondent pas à la réalité de l’automate et il faudrait donc rapporter cette constatation à COPAN. 8 7 Figure 62 : StaAur à 10 cfu/ml Figure 63 : StaAur à 10 cfu/ml 43 Pour la méthode Q4 la différence entre les patterns et nos ensemencements est beaucoup plus marquée. En effet, pour effectuer le 2ème quadrant, l’automate est censé retourner jusqu’à la 3ème strie du 1er quadrant, alors que dans nos résultats, l’anse touche tout juste la dernière strief. Ce point pourrait expliquer pourquoi lors de nos résultats nous obtenons des répartitions ne dépassant jamais le 1er quadrant. Le fait que peu de matériel soit reprit du 1er quadrant couplé à la stérilisation a pour conséquence une immense perte de matériel qui se reflète sur la répartition. Il serait souhaitable de reprogrammer le WASP afin qu’il retourne plus loin dans le 1er quadrant avec l’anse. Nous pouvons voir une différence entre le pattern et nos ensemencements sur les quadrants 3 et 4, où l’on peut voir dans certains cas l’anse ne retournant pas dans le quadrant précédentg. f f g g g Figure 64 : Pattern Q4 g 8 8 8 Figure 65 : Mix Etcfec 10 , Staaur 10 , Esccol 10 44 5.6 Réponses au but de l’étude : 1. Peut-on quantifier la méthode des 4 quadrants ? A travers nos diverses expériences, nous avons pu constater que les différents facteurs de variation lors de l’ensemencement des méthodes Q3 et Q4 avec stérilisation, rend la quantification difficile. Effectivement, nous avons pu mettre en évidence le fait que le WASP n’est pas totalement reproductible, ce qui empêche une quantification précise. Hormis le fait que l’automate n’est pas totalement reproductible, nos différentes tentatives de quantification ne sont pas concluantes. En effet, lorsque nous stérilisons après le 1 er quadrant, nous nous trouvons avec une mauvaise répartition des germes sur la gélose, ce qui rend compliqué le fait de voir la différence entre chaque log. Au contraire, lorsque nous ne stérilisons pas l’anse après le 1er quadrant, nous nous retrouvons confrontés au problème des bactéries trop confluentes à partir d’une concentration de 107 cfu/ml (saturation) mais une quantification reste envisageable jusqu'à 107. 2. Comparaison des deux différentes méthodes d’ensemencement en 4 quadrants disponibles sur le WASP, en termes de quantification et d’obtention de colonies isolées. i) La quantification serait plus adaptée à la méthode Q3, ceci peut être dû à la trop forte variation (voir point 5.5. variations) lors de l’ensemencement de la méthode Q4. ii) La méthode Q3 avec stérilisation utilisée actuellement dans le laboratoire de microbiologie du CHUV est la plus performante pour l’isolement des colonies lors des prélèvements à forte concentration bactérienne. En effet, dans la méthode Q4, un premier quadrant plus large n’apporte pas d’amélioration, l’isolement est insuffisant. 3. Comparaison de la méthode en 4 quadrants avec la méthode quantitative. i) Avantage : La possibilité d’obtenir des colonies isolées lors des fortes concentrations de bactériennes (>108), ainsi que l’isolement des différentes morphologies. ii) Inconvénients : La quantification pourrait s’avérer utile pour d’autres types de prélèvements que les urines ou les biopsies des brûlés. Si le seuil de pathogénicité se situe, en général à 105, la quantification serait importante pour des prélèvements normalement contaminés par la flore commensale, comme par exemple les expectorations. Pour les prélèvements normalement stériles, cela permettrait, entre autre, de faire un suivi plus précis sur l’efficacité du traitement. 45 5.7 Proposition d’améliorations : a) Modification des patterns. Pour Q3 et Q4, envisager d’effectuer 1 strie remontant plus haut dans le 1er quadrant tout en maintenant une stérilisation. Le fait de réaliser une strie plus grande dans le 1er tapis va permettre de récupérer plus de matériel pour former les autres quadrants, ce qui pourrait donner des résultats moins sous-évalués. b) Vérifier l’état de l’anse du WASP minimum 2 fois par jour, une fois en début de journée et une autre en début d’après-midi. En effet l’inclinaison de l’anse (droite ou au contraire fortement inclinée) pourrait jouer un rôle dans l’exécution correcte des patterns. c) L’épaisseur et la consistance des milieux solides pourraient jouer un rôle dans les variations de l’ensemencement. Augmenter le pourcentage d’agar ou avoir la même épaisseur de gélose améliorerait la qualité de l’ensemencement. d) On pourrait également associer automatiquement des types d’ensemencements différents avec des prélèvements stériles/non stériles. Il y a également la possibilité d’inclure des milieux sélectifs afin de séparer les germes et augmenter notre résolution. Voici différentes propositions de méthodes d’ensemencement pour les prélèvements de routine : Prélèvements Frottis oro-phayryngés LBA Urines Liquide péritonéal Expectoration Plaie opératoire superficielle Isolement de colonies Q3 avec stérilisation H1 (Q3 sans stérilisation) H1 Q3 sans stérilisation (H1) Q3 sans stérilisation Q3 avec stérilisation 46 Quantification H1 (Q3 sans stérilisation) H1 (Q3 sans stérilisation) H1 H1 Pas quantifiable H1 6. Conclusion Le but de ce travail était de pouvoir quantifier la méthode des 4 quadrants (Q3 et Q4), de comparer 2 méthodes des 4 quadrants différentes et d’évaluer les avantages et les inconvénients de la méthode des 4 quadrants par rapport à la méthode quantitative. Cette étude était basée sur l’ensemencement automatique du WASP qui nous aurait permis d’obtenir des résultats reproductibles. Pour la comparaison entre les méthodes Q3 et Q4 la grandeur des 1er quadrants et l’augmentation du nombre de stries étaient les différences majeures. D’après nos observations, nous pouvons conclure que la méthode des 4 quadrants n’est pas quantifiable, sans une modification du protocole. La suppression de la stérilisation et un ajustement des protocoles du WASP pourrait permettre une quantification. En effet, trop de variations dans l’ensemencement du WASP nous empêchent de quantifier. La méthode Q3 est la meilleure car elle donne plus de colonies isolées à la plupart des concentrations. Au contraire de la méthode Q4 qui donne des résultats beaucoup plus variables, ceci peut être due au pattern non respecté (départ des stries trop basses) de cette méthode. Le gros avantage de la méthode quantitative est de pouvoir donner une concentration de germes dans les prélèvements tels que les urines, LBA, biopsies des brulés mais avec des échantillons comprenant une flore polymicrobienne et une grande quantité de germes il est très difficile de retrouver des colonies isolées. En conclusion, le WASP n’est pas totalement reproductible mais reste un outil indispensable dans un laboratoire de diagnostic bactériologique moderne grâce à sa vitesse d’ensemencement et à sa régularité. Changer la méthode des 4 quadrants n’apporte rien au laboratoire il faut donc garder la méthode actuelle (Q3). Par contre l’amélioration de la méthode en modifiant le pattern (matériel récupéré plus haut dans les quadrants) pourrait apporter des avantages (plus de colonies isolées avec de faibles concentrations de germes). Utilisé la méthode quantitative dans tous les prélèvements n’est pas une solution car il est plus important d’obtenir des colonies isolées pour pouvoir identifier chaque germe. Ce travail nous a permis de progresser d’une autre manière dans notre stage et a apporté plusieurs renseignements nouveaux et utiles pour le laboratoire: i) Avoir une estimation quantitative des méthodes semi-quantitatives (4+ = 1010-109). ii) La méthode Q3 avec stérilisation est la plus optimal pour les prélèvements riches en bactéries. iii) Une quantification ne peut se faire que sans stérilisation. Conclusion personnelle : A travers ce travail, nous avons appris à organiser une étude du début jusqu’à la fin. Nous avons également développé un œil critique sur les différents résultats obtenus. Ce travail nous a permis de jouer un rôle majeur dans un laboratoire en aidant dans le développement de celui-ci. Ainsi nous avons pu enrichir notre expérience d’une autre manière durant ce stage. 47 7. Coûts Ce travail a nécessité un certain budget, dont voici le tableau récapitulatif : Matériel Prix à l’unité en CHF Quantité utilisée Prix total en CHF Anses vertes (paquet) 5.8 3 17.40 Columbia 1.08 246 265.70 USB 1.00 95 95.00 Tube Copan vide 0.34 70 23.80 Bouillon BHI 1.5 2 3.00 Anses d’inoculation (paquet) 4.09 1 4.10 Embouts jaunes (boîtes) 0.855 5 4.30 Embouts bleus (boîtes) 0.855 3 2.60 Total 415.90 48 8. Remerciements Nous tenons à remercier chaleureusement Mme. Maria Senra Ortiz et le Dr. Antony Croxatto qui grâce à leurs connaissances et leur expérience ont pu nous diriger, nous conseiller et nous aider durant la réalisation de cette étude. Nous remercions également le Dr. Guy Prod’hom, responsable du laboratoire de bactériologie du CHUV pour les propositions et les corrections apportées pendant notre travail ainsi que le Dr. Onya Opota pour ces connaissances en anglais et la correction de notre travail Tous les membres de l’équipe du laboratoire de bactériologie du CHUV reçoivent également notre gratitude pour leur accueil durant nos 6 mois de stages. 49 9. Bibliographie 1. John, A. (1981). Laboratory Procedures in Clinical Microbiology. Washington 2. Bradley, J., & P., L. (10 août 1963). Quantitative urine cultures. British Medical Journal , 361 3. BIOKAR DIAGNOSTICS. (s.d.). Gélose Columbia. Consulté le 03.13.2014, sur Lycée Valin: http://lycee-valin.fr/bgb/ftech/C5K.pdf 4. Veron, B. (s.d.). gélose Columbia . Consulté le 03.13.2014, sur Microbiologie médicale: http://www.microbiologie-medicale.fr/milieuxnonselectifs.htm 5. Futura-sciences. (s.d.). la coloration de gram. Consulté le 03.21.2014, sur Futura-sciences: http://www.futura-sciences.com 50 10. Table des illustrations Tableaux Tableau 1 Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4 avec stérilisation ................................................................................................................................. 20 Tableau 2 Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec l’Escherichia coli de 108 à 105 ..... 21 Tableau 3 Résultats de Q3 et Q4 avec stérilisation et de H1 avec l’Escherichia coli de 104 à 102 ..... 22 Tableau 4 Tableau récapitulatif des résultats contenant la méthode H1 et les méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation ................................................................................................................................. 24 Tableau 5 Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 10 8 à 105 ... 25 Tableau 6 Résultats des méthodes Q3 et Q4 sans stérilisation et de la méthode H1 de 10 4 à 102 .... 26 Tableau 7 Résultats de deux différents mix sur géloses USB ............................................................ 30 Tableau 8 Résultats de deux différents mix sur géloses USB ............................................................ 31 Tableau 9 Résultats de la limite de la méthode d’Escherichia coli avec stérilisation .......................... 34 Tableau 10 imite de la méthode d’Escherichia coli sur Columbia sans stérilisation ............................ 35 Tableau 11 Résultats récapitulatif du test sur la limite de la méthode avec Escherichia coli et Staphylococcus aureus ....................................................................................................................... 36 Tableau 12 Résultats de la limite de la méthode d’Escherichia coli avec stérilisation ........................ 36 51 Figure Figure 1 Staphylococcus aureus ........................................................................................................... 1 Figure 2 Répartition sur le 1er quadrant quantité faible ...................................................................... 7 Figure 3 Répartition sur 4 quadrants forte quantité .......................................................................... 7 Figure 4 Répartition sur 3 quadrants forte quantité .......................................................................... 7 Figure 5 Répartition sur le 1er et 2ème quadrants (minimum 5 colonies) quantité modérée ................ 7 Figure 6 Culture du LCR ....................................................................................................................... 8 Figure 7 Sonication ............................................................................................................................... 8 Figure 8 Méthode quantitative............................................................................................................... 8 Figure 9 Isolement par l’InoquIA de BD Kiestra ................................................................................... 9 Figure 10 Automate InoqulA de BD Kiestra .......................................................................................... 9 Figure 11 Le peigne du Previ-Isola ..................................................................................................... 10 Figure 12 L’isolement du Previ-Isola ................................................................................................... 10 Figure 13 Le Wasp .............................................................................................................................. 11 Figure 14 Isolement quantitatif mix sur USB ....................................................................................... 13 Figure 15 Pattern de la méthode Q3 ................................................................................................... 14 Figure 16 Méthode en 4 quadrants Q3 avec Etc fec .......................................................................... 14 Figure 17 Pattern de la méthode Q4 ................................................................................................... 14 Figure 18 Méthode en 4 quadrants Q4 avec Etc fec ........................................................................... 14 Figure 19 Pattern de la méthode H1 ................................................................................................... 15 Figure 20 Méthode Quantitative avec Etc fec ..................................................................................... 15 Figure 21 Esccol 108 Q3 ..................................................................................................................... 19 Figure 22 Esccol 107 Q3 ..................................................................................................................... 19 Figure 23 Esccol 108 Q4 ..................................................................................................................... 19 Figure 24 Esccol 107 Q4 ..................................................................................................................... 19 Figure 25 contrôle interne 104 ............................................................................................................. 20 Figure 26 contrôle interne 103 ............................................................................................................. 20 Figure 27 Staaur à 107 avec Q3 .......................................................................................................... 23 Figure 28 Staaur à 106 avec Q3 .......................................................................................................... 23 Figure 29 Esccol à 108 avec Q3 .......................................................................................................... 23 Figure 30 Esccol à 107 avec Q3 .......................................................................................................... 23 Figure 31 Esccol à 107 Méthode Q3 ................................................................................................... 24 Figure 32 Esccol à 106 Méthode Q3 ................................................................................................... 24 Figure 33 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q3 avec stérilisation .................................................................. 28 Figure 34 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q3 sans stérilisation ................................................................... 28 Figure 35 Etc 107, Sta 106, Kle 105 avec stérilisation .......................................................................... 28 Figure 36 Etc 107, Sta 106, Kle 105 sans stérilisation .......................................................................... 28 Figure 37 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q4 avec stérilisation ................................................................... 29 Figure 38 Etc 108, Sta 108, Esc 108 Q4 sans stérilisation ................................................................... 29 Figure 39 Etc 107, Sta 106, Kle 105 Q4 avec stérilisation ....................................................... 29 7 6 5 Figure 40 Etc 10 , Sta 10 , Kle 10 Q4 sans stérilisation .................................................................... 29 Figure 41 H1 à 1010..................................................................................... Erreur ! Signet non défini. Figure 42 Q3 à 1010 avec stérilisation ......................................................... Erreur ! Signet non défini. 52 Figure 43 Q4 à 1010 avec stérilisation ................................................................................................. 32 Figure 44 Q3 à 109 avec stérilisation .......................................................... Erreur ! Signet non défini. Figure 45 Q4 à 108 avec stérilisation .......................................................... Erreur ! Signet non défini. Figure 46 Q4 à 108 avec stérilisation .......................................................... Erreur ! Signet non défini. Figure 47 Expectorations N°14-0219-0933 Q3 sans stérilisation ................ Erreur ! Signet non défini. Figure 48 Expectorations N°14-0219-0933 Q4 sans stérilisation ........................................................ 36 Figure 49 N°14-0219-0933 Q3 avec stérilisation ................................................................................ 37 Figure 50 Expectorations N°14-0219-0933 Q4 avec stérilisation ........................................................ 37 Figure 51 Expectorations N°14-0219-0933 H1 ................................................................................... 37 Figure 52 Expectoration N°14-0219-0999 Q3 avec stérilisation.......................................................... 38 Figure 53 Expectoration N°14-0219-0999 Q4 avec stérilisation.......................................................... 38 Figure 54 Expectoration N°14-0219-0999 Q3 sans stérilisation.......................................................... 38 Figure 55 Expectoration N°14-0219-0999 Q4 sans stérilisation.......................................................... 38 Figure 56 Expectoration N°14-0219-0999 H1 ..................................................................................... 38 Figure 57 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 avec stérilisation ....................................... 39 Figure 58 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 avec stérilisation ....................................... 39 Figure 59 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q3 sans stérilisation ....................................... 39 Figure 60 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 Q4 sans stérilisation ....................................... 39 Figure 61 plaie opératoire superficielle 14-0219-0923 H1 .................................................................. 40 Figure 62 StaAur à 108 cfu/ml ............................................................................................................. 43 Figure 63 StaAur à 107 cfu/ml ............................................................................................................. 43 Figure 64 Pattern Q4 .......................................................................................................................... 44 Figure 65 Mix Etcfec 108, Staaur 108, Esccol 108 ....................................... Erreur ! Signet non défini. 53 11. Références iconographiques Figure 10 : Copan. (2012). Copan WASP. Consulté le 13 03, 2014, sur Copan Innovating together: http://www.copanusa.com/products/wasp/general/ Figure 11 : Biomérieux. (2009). Previ-Isola. Consulté le 03 13, 2014, sur Biomérieux: http://www.biomerieux-usa.com Toutes les autres illustrations sont des photos personnelles. 54 13. Lexique : ATCC : American type culture collection BHI : Brain Heart Infusion ESCCOL : Escherichia coli ETCFEC : Enterococcus feacalis KLEPNE : Klebsiella pneumoniae LCR : Liquide céphalo-rachidien NaCl : Chlorure de sodium PBS : tampon phosphate salin (phosphate buffered saline) STAAUR : Staphylococcus aureus WASP : Walk Away Specimen Processor 55 Glossaire : Biofilm : Couche en 3 dimensions formées par les bactéries. Composées de polysaccharides et de canaux servant à faire passer les nutriments. Bouillon BHI (Brain-Heart Infusion) : Bouillon d’enrichissement pour culture de micro-organismes. Gram : La coloration de Gram est fondée sur l'action successive d'un colorant, le cristal violet, d'iode puis d'un mélange d'alcool et d'acétone. Dans un premier temps, le colorant pénètre dans la paroi et le cytoplasme. Dans un second temps, l'iode réagit avec le colorant et le rend insoluble. La perméabilité plus grande des bactéries à Gram négatif à l'alcool permet la décoloration. Les bactéries à Gram positif restent colorées en violet ou mauve. Une contre-coloration (par exemple en rose) permet de visualiser à nouveau, les corps cellulaires des bactéries à Gram négatif. McFarland 0.5 : Le McFarland 0.5 est un NaCl ensemencé avec des bactéries. L’inoculum contient environ 108 germes par millilitre, on détecte cette concentration grâce au trouble que les bactéries font dans le NaCl. Sa densité dépend donc du volume de la bactérie. Cet inoculum a été fait à la base avec une souche d’Escherichia coli, le McFarland est donc moins précis avec d’autre souches bactériennes. Overnight : Bouillon d’enrichissement incuber durant 22h. Sonication : La sonication est une étape nécessaire dans des prélèvements tels que les prothèses. En effet, les germes fixés sur la prothèse forment un biofilm. Un moyen simple pour récolter ce biofilm et pouvoir mettre les germes en cultures est la sonication. Cette technique consiste à immerger la prothèse dans du PBS et de soumettre le tout à des ultrasons afin de décoller le biofilm et de le récolter dans le PBS. L’ensemencement se fait ensuite à l’aide du PBS qui contient à présent les germes. 56 14. Annexe : Autres photos du test 1 sans stérilisation Staaur et Etcfec Q3 (108 à 104) : 57 Autres photos du test 1 sans stérilisation Staaur et Etcfec Q4 (108 à 104) : 58 Autres photos du test 1 sans stérilisation Staaur et Etcfec H1 (108 à 104) : 59 Autres photos du test 1 avec stérilisation Staaur et Etcfec Q3 (108 à 104) : 60 Autres photos du test 1 avec stérilisation Staaur et Etcfec Q4 (108 à 104) : 61 Autres photos du test 1 avec stérilisation Staaur et Etcfec H1 (10 8 à 104) : 62 Test 2 autres mix Etcfec 108, Staaur 107, Esccol 106, Klepne 105 Q3, Q4 avec et sans stérilisation et H1: Test 2 autres mix Esccol 108, Etcfec 106 Q3, Q4 avec et sans stérilisation et H1: 63 Test 3 autres photo avec Staaur de 109 à 105 Q3 avec et sans stérilisation: 64 Test 3 autres photo avec Staaur de 109 à 105 Q4 avec et sans stérilisation: 65 Test 3 autres photo avec Staaur de 109 à 105 H1 : 66 Test 4 plaie op sup N° 0225 0835 : 67
