BIOCHIMIE I (CHMI 2227 F) Problèmes et solutions
publicité
BIOCHIMIE I (CHMI 2227 F) Problèmes et solutions Eric R. Gauthier, Ph.D. Département de chimie et de biochimie Université Laurentienne Janvier 2007 1 Note: Ce cahier d'exercice est destiné avant tout aux étudiants qui sont inscrits au cours Biochimie I (CHMI 2227F) tel qu'offert à l'Université Laurentienne. Il comporte de nombreux exercices et problèmes tirées soit de manuels de référence, soit de l'imagination de l'auteur. Quoique la majorité des problèmes retrouvés dans ce manuel peuvent être résolus assez aisément à l'aide des notes de cours, certains problèmes d'un niveau de difficulté plus avancé furent aussi inclus. Ainsi, les problèmes marqués d'une astérisque (*) nécessiteront davantage de recherche de la part de l'étudiant(e). Quand aux problèmes marqués d'une double astérisque (**), qui sont peu nombreux, ils devraient constituer un excellent défi pour l'étudiant intéressé à les résoudre. L'étudiant(e) trouvera après la section "Problèmes" la solution détaillée de tous ces exercices. Pour des raison pédagogiques évidentes, nous suggérons à l'étudiant(e) de n'y avoir recours qu'après avoir pris le temps de réfléchir sur le problème. La liste des pKas et pI des 20 acides aminés naturels, ainsi que le tableau du code génétique, sont inclus en annexe à la fin de la section "Problèmes". Les manuels de référence suivants furent consultés lors de l'élaboration de cet ouvrage: 1) Kuchel, P. W. et Ralston, G. B. Biochimie 1. Cours et problèmes. Série Schaum. McGrawHill. 1989. 2) Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Principles of Biochemistry. 2ième édition. Worth Publishers. 1993. 3) Mathews, C. K. et van Holde, K. E. Biochemistry. 2ième édition. Benjamin/Cummings Publishing Company, INC. 1996. 4) Rawns, J. D. Traité de biochimie. Editions du renouveau pédagogique. 1990. (disponible à la réserve de la bibliothèque). 5) Wood, W. B., Wilson, J. H., Benbow, R. M., Hood, L. E. Biochemistry. A Problems Approach. Benjamin/Cummings Publishing Company, INC. 1981. (disponible à la réserve de la bibliothèque). 6) Zubay, G. L., Parson, W. W., Vance, D. E. Principles of Biochemistry. Wm. C. Brown Publishers. 1995. Des exercices et problèmes supplémentaires peuvent être trouvés dans ces références. 1 Problèmes 2 Chapitre 1 : Équilibre acide-base et spectrophotométrie 1.1 Équilibre acide-base : Quel est le pH de chacune de ces solutions? a) Acide chlorhydrique 0.35M b) Acide acétique 0.35M (pKa=4.76) c) Acide acétique 0.035M 1.2 Équilibre acide-base : Un acide faible HA d’une concentration totale de 0.20M est ionisé (dissocié) à 2%. a) Quel est le Ka de cet acide? b) Quel est le pH de cette solution? 1.3 Équilibre acide-base : Quel est le pH des mélanges suivants : a) 1M d’acide acétique avec 0.5M d’acétate de sodium b) 0.3M d’acide phosphorique avec 0.8M de KH2PO4 (pKa=2.14) 1.4 Équilibre acide-base : Vous désirez préparer une solution tampon de pH = 7.00 en utilisant du KH2PO4 et Na2HPO4 (pKa=7.21). Si vous disposez d’une solution de 0.1M de KH2PO4, quelle devra-être la concentration de Na2HPO4 que vous devrez utiliser? 1.5 Équilibre acide-base : Vous désirez préparer une solution tampon de pH=7.00 en utilisant du KH2PO4 et du Na2HPO4. Quelles devront-être les concentrations respectives de ces substances si vous désirez obtenir une concentration finale en phosphate ([HPO4-2] + [H2PO4-1]) de 0.3M? 1.6 Spectrophotométrie : Quelle sera la concentration de l’acide aminé tyrosine (ε=1 420 L mol-1 cm-1) si on obtient une absorbance de 0.71 à l’aide d’une cuvette de 1cm? Avec une cuvette de 0.1 cm? 1.7 Spectrophotométrie : Quelle sera l’absorbance d’une solution de 37 mM de tyrosine? 1.8 Spectrophotométrie : Vous désirez déterminer la concentration d’hémoglobine dans un échantillon sanguin par spectrophotométrie. Pour cela, vous établissez une courbe standard de l’absorbance à 412 nm de solutions d’hémoglobine de concentration connues. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous. Quelle est la concentration (en µg/mL) en hémoglobine dans votre échantillon, si vous obtenez une valeur d’absorbance à 412 nm de 0.303? 3 Absorbance (412nm) 0.069 0.113 0.201 0.377 0.730 Concentration du standard (µg/mL) 1 2 4 8 16 Chapitre 2: Acides aminés * 2.1. Masse moléculaire d'un acide aminé. 1.812 g d'un acide α-aminé cristallisé (pKa1: 2.4; pKa2; 9.7) donne une solution de pH 10.4 quand il est dissout dans 100 mL de NaOH 0,1M. Calculez la masse moléculaire de cet acide aminé. 2.2. Courbe de titrage. Calculez le pI de l'histidine et tracez sa courbe de titrage. Indiquez la position du pI, des pKas, ainsi que le pourcentage des formes ioniques à chacun des pKas ainsi qu'au début et à la fin du titrage. La liste des pKas des 20 acides aminés est disponible à la fin de la section « Problèmes » du cahier d’exercices. 2.3. Charge nette des acides aminés. Quelle est la charge nette (+, 0, -) de chacun des acides aminés suivants: glycine, sérine, acide aspartique, glutamine et arginine, à : a) pH 2.01 b) pH 3.96 c) pH 5.68 d) pH 10.76 2.4. Chromatographie échangeuse d'ions. On sépare un mélange de lysine, glycine, alanine, isoleucine et d'acide glutamique par chromatographie échangeuse d'ions. Quel sera l'ordre d'élution des acides aminés si on utilise un tampon allant progressivement de pH 10 à pH 2, et si on utilise: a) une résine échangeuse de cations b) une résine échangeuse d'anions Quelle est selon vous la colonne donnant la meilleure séparation? 2.5. Acides aminés Quels acides aminés peuvent être convertis en d'autres acides aminés par hydrolyse douce, avec libération d'ammoniaque? 4 2.7. Acides aminés La phosphosérine se retrouve dans les hydrolysats enzymatiques de la caséine, une protéine du lait. Cependant, elle ne fait pas partie des 20 acides aminés codés lors de la synthèse protéique. Fournissez une explication plausible. CH2-CH2-CH-COOH O NH2 -2 PO3 Phosphosérine *2.8. Chromatographie échangeuse d'ions. La glycine, l'alanine, la valine et la leucine peuvent être séparés efficacement par chromatographie échangeuse d'ions. Pourtant les pKas de ces acides aminés sont presque identiques. Expliquez ce comportement des acides aminés. 2.9. Peptides. Un petit peptide a été hydrolysé et on a effectué l'analyse de ses acides aminés. En outre, comme l'hydrolyse acide détruit le tryptophane, on a estimé le contenu en tryptophane par une mesure au spectrophotomètre. D'après les données fournies ci-dessous, établissez la formule empirique du peptide: Acide aminé mmol Ala 2.74 Glu 1.41 Leu 0.69 Lys 2.81 Arg 0.72 Trp 0.65 2.10. Peptides. Dessinez la structure du peptide GWYQR. Indiquez la forme ionisée de ce peptide aux pH suivants: a) pH 2.0 b) pH 7.0 c) pH 10.5 5 Chapitre 3. Propriétés générales et purification des protéines 3.1. Purification des protéines. Pourquoi utilise-t-on souvent la procédure de précipitation au sulfate d'ammonium comme étape initiale de purification d'une protéine? 3.2. Purification des protéines. Une colonne de DEAE cellulose est rarement utilisée à un pH supérieur à 8.5. Pourquoi? 3.3. Purification des protéines. La 6-phosphogluconate déshydrogénase possède un pI de 6. Expliquez pourquoi le tampon utilisé lors d'une chromatographie sur DEAE-cellulose devra avoir un pH supérieur à 6 mais inférieur à 9 pour que l'enzyme puisse lier efficacement la colonne. 3.4. Purification des protéines. Est-ce-que la 6-phosphogluconate déshydrogénase pourra se lier à une résine de CM-cellulose si on utilise les mêmes conditions de tampon qu'au problème précédent? Pourquoi? 3.5. Purification des protéines. Référant au problème précédent, quel pH approximatif le tampon devra-t-il posséder afin de permettre à la déshydrogénase de lier efficacement la colonne de CM-cellulose? 3.6. Purification des protéines. On charge une colonne de DEAE-cellulose à pH 6.5 avec un mélange de protéines: ovalbumine (pI 4.6), uréase (pI 5.0), et myoblobine (pI 7.0). La colonne est éluée avec un tampon de faible force ionique à pH 6.5, puis avec le même tampon contenant des concentrations croissantes de chlorure de sodium. Dans quel ordre les protéines apparaîtront-elles dans l'éluant? 3.7. Purification des protéines. Une enzyme (Mr 24 kDa, pI 5.5) est contaminée par deux autres protéines, l'une de masse moléculaire analogue et de pI 7.0, et l'autre de Mr 100 kDa et de pI 5.4. Suggérez un protocole général de purification de l'enzyme. 3.8. Purification des protéines. Une procédure servant à purifier la 6-gluconate déshydrogénase d’E. coli est présentée cidessous. a) Pour chaque étape, calculez (1) l'activité spécifique, (2) le pourcentage de rendement par rapport à la quantité initiale d'enzyme, et (3) le degré de purification (p.ex. 5 fois plus pur). b) Indiquez quelle étape permet la plus grande purification de la protéine. c) Assumant que la protéine est pure après le tamisage moléculaire (Bio-Gel A), quel pourcentage de l'extrait initial était constitué de 6-gluconate déshydrogénase? 6 Volume (mL) Protéines totales (mg) Activité enzymatique (µg/min) 1- Extrait cellulaire 2 800 70 000 2 700 2- Sulfate d'ammonium 3 000 25 400 2 300 3- Dénaturation chaleur 3 000 16 500 1 980 4- Chromato. DEAE 80.00 390.00 1 680 5- CM-cellulose 50.00 47.00 1 350 6- Bio-Gel A 7.00 35.00 1 120 Étape de purification 3.9. Purification des protéines. Pourquoi n'ajoute-t-on jamais de SDS à des protéines devant subir une focalisation isoélectrique? 3.10. Purification des protéines. Une série de protéines de masse moléculaire connue et une enzyme inconnue ont été étudiées par chromatographie sur gel de séphadex G-200. Le volume d'élution (Vel) pour chaque protéine est donné dans le tableau ci-dessous. Estimez la masse moléculaire de la protéine inconnue. Protéine Mr dextran bleu 1 000 kDa lysozyme 14 kDa chymotrypsinogène 25 kDa ovalbumine 45 kDa sérum albumine 65 kDa aldolase 150 kDa uréase 500 kDa ferritine 700 kDa ovomucoide 28 kDa inconnu ? Vel (mL) 85.00 200.00 190.00 170.00 150.00 125.00 90.00 92.00 160.00 130.00 *3.11. Purification des protéines. Référant au problème précédent, fournissez une explication plausible quant au comportement bizarre de la ferritine lors de sa chromatographie sur gel de séphadex. 3.12. Purification des protéines. Une étudiante isole une protéine à partir d'une bactérie anaérobique et soumet son échantillon à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (PAGE-SDS). Après coloration, une seule bande est visualisée, ce qui enthousiasme beaucoup le superviseur de l'étudiante. Cependant, ce dernier suggère à l'étudiante d'effectuer une seconde électrophorèse de son échantillon, mais cette fois sous des conditions natives (i.e. non-dénaturantes, i.e. sans SDS). 7 Elle observe alors deux bandes après coloration du gel. Assumant que l'étudiante n'a pas fait de gaffes au cours de ses expériences, expliquez ces observations. 3.13. Purification des protéines. Un étudiant du cours CHMI 2227 F effectue l'analyse de la sérum albumine bovine (bovine serum albumin-BSA) en électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE-SDS). Au cours de son expérience, il omet d'ajouter du β-mercaptoéthanol à son échantillon. En comparant ses résultats à ceux de ses collègues, il s'aperçoit que la masse moléculaire apparent de son échantillon de BSA déterminé par PAGE-SDS est de 57 kDa, alors que la valeur obtenue par tous les autres étudiants (qui eux n'ont pas oublié d'ajouter le β-mercaptoéthanol) est de 68 kDa. Expliquez l'origine de cette différence. 3.14. Séquençage de polypeptides Considérant le peptide suivant: A-L-K-M-P-E-Y-I-S-T-D-Q-S-N-W-H-H-R Indiquez quels fragments seront générés suite à la digestion avec: a) la trypsine b) la pepsine c) la protéase V8 d) le bromure de cyanogène 3.15. Séquençage de polypeptides Déduisez la séquence du polypeptide pour lequel on a obtenu les résultats suivants: a) hydrolyse acide: (Ala2 , Arg , Lys2 , Met, Phe, Ser2); b) digestion à la carboxypeptidase A: Ala; c) digestion à la trypsine: (Ala, Arg) (Lys, Phe, Ser) (Lys) (Ala, Met, Ser) d) traitement au bromure de cyanogène: (Ala, Arg, Lys2 , Met, Phe, Ser) (Ala, Ser) e) digestion à la thermolysine: (Ala) (Ala, Arg, Ser) (Lys2 , Met, Phe, Ser) 3.16. Séquençage de polypeptides Un polypeptide est réduit avec le β-mercaptoéthanol et donne deux fragments peptidiques de la séquence suivante: 8 chaîne 1: A-C-F-P-K-R-W-C-R-R-V-C chaîne 2: C-Y-C-F-C Le polypeptide sous sa forme non-réduite est digéré avec la thermolysine et donne les fragments suivants: (A,C,C,V) (R,K,F,P) (R,R,C,C,W,Y) (C,C,F) Indiquez la position des ponts disulfure dans le polypeptide. 3.17. Séquençage de polypeptides On procède à l'analyse du polypeptide Shawi isolé de la bactérie Chrétientus négativii, et on obtient les résultats suivants: a) hydrolyse acide: (Ala4 , Val, Lys2 , Arg, Gly, Asp, Met, Pro, Trp) b) digestion à la carboxypeptidase: Lys c) traitement au dinitrofluorobenzène: Val d) traitement au bromure de cyanogène: génération de deux peptides: peptide A: (Gly, Arg, Trp, Asp, Lys, Ala) Le traitement de ce peptide au DNBF et carboxypeptidase donne: DNFB: Gly Carboxypeptidase: Lys peptide B: (Ala3 , Lys, Val, Met, Pro) Le traitement de ce peptide au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB: Val Carboxypeptidase: Met e) digestion à la trypsine: génère trois peptides: peptide C: (Lys, Trp, Ala) Le traitement de ce peptide au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB: Trp 9 peptide D: (Ala3 , Val, Lys, Pro) peptide E: (Met, Asp, Gly, Arg) Le traitement de ce peptide au DNFB et carboxypeptidase donne: DNFB: Met Finalement, le traitement du peptide D avec la thermolysine donne : Val Ala Ala (Ala, Lys, Pro) Quelle est la structure primaire de ce peptide? Chapitre 4. Structure tridimensionnelle des protéines 4.1. Structure 3-D des protéines Quels acides aminés parmi les suivants vous attendriez-vous à retrouver a) à l'intérieur, et b) à la surface d'une protéine globulaire typique, en solution aqueuse et à pH 7? Glu Arg Val Phe Ileu Asn Lys Ser Thr 4.2. Structure 3-D des protéines D'après la structure de l'urée, déduisez comment ce composé provoque la dénaturation des protéines. 4.3. Structure 3-D des protéines Quoique la phénylalanine est un acide aminé hydrophobe, on la rencontre fréquemment à la surface de protéines natives et fonctionnelles. Donnez le rôle le plus probable de la phénylalanine dans cette situation. *4.4. Structure 3-D des protéines Quoique l'aspartate est un acide aminé chargé, on le rencontre fréquemment à l'intérieur de protéines natives et fonctionnelles. Expliquez comment cela peut être possible. 4.5. Structure 3-D des protéines 10 Le tableau suivant décrit la composition en acides aminés de trois protéines. acide aminé Résidus polaires Arg Asn Asp Cys Gln Glu His Lys Ser Thr Trp Tyr Résidus apolaires Ala Gly Ileu Leu Met Phe Pro Val nombre de résidus par molécule protéine 1 protéine 2 protéine 3 12.00 9.00 14.00 7.00 8.00 11.00 4.00 22.00 20.00 15.00 2.00 7.00 4.00 6.00 5.00 2.00 7.00 4.00 2.00 6.00 5.00 3.00 3.00 7.00 7.00 5.00 9.00 6.00 6.00 6.00 4.00 15.00 11.00 11.00 3.00 6.00 14.00 9.00 5.00 3.00 7.00 9.00 8.00 16.00 28.00 9.00 16.00 19.00 11.00 13.00 13.00 29.00 25.00 8.00 9.00 7.00 9.00 11.00 10.00 21.00 Sachant que la protéine A possède une forme de bâtonnet, la protéine B est une protéine globulaire monomérique, et que la protéine C est une protéine globulaire formée de quatre sousunités identiques, déduisez à quelle composition en acides aminés correspondent ces protéines. 4.6. Structure 3-D des protéines Indiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hélice α, feuillet β, pelote statistique) adoptera le peptide suivant en solution aqueuse à pH 7: Ileu-Glu-Asn-Glu-Gln-Asn-Met-Ala-His-Phe-Trp-Tyr 4.7. Structure 3-D des protéines Indiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hélice α, feuillet β, pelote statistique) adoptera le peptide suivant en solution aqueuse à pH 7: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala 4.8. Structure 3-D des protéines Indiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hélice α, feuillet β, pelote statistique) adoptera le 11 peptide suivant en solution aqueuse à pH 7: Lys-Gly-Arg-Arg-Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-Pro 4.9. Structure 3-D des protéines Indiquez quelle(s) structure(s) secondaire (hélice α, feuillet β, pelote statistique) adoptera le peptide suivant en solution aqueuse à pH 7: 1 10 20 Gly-Pro-Glu-Ser-Ala-Tyr-Lys-Thr-Leu-Phe-Asp-Val-Pro-Asp-Asp-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala26 Gly-Ser-Ser-Gly-Ala 4.10. Structure 3-D des protéines Le tableau suivant décrit la composition en acides aminés de trois protéines. Déterminez si ces protéines adopteront une structure en hélice α, en feuillet β ou en triple hélice de collagène. Protéine Ala Arg Asp Cys Glu Gly His Hypro Ileu A 29.40 0.50 1.30 1.00 44.60 0.20 0.70 B 5.00 7.20 6.00 11.20 12.10 8.10 0.70 2.80 C 10.70 5.00 4.50 7.10 33.00 0.40 9.40 0.90 Protéine Leu Lys Met Phe Pro Ser Trp Tyr Val A 0.50 0.30 0.50 0.30 12.20 0.20 5.20 2.20 B 6.90 2.30 0.50 2.50 7.50 10.20 1.20 4.20 5.10 C 2.40 3.40 0.80 1.20 12.20 4.30 0.40 2.30 Chapitre 5. Enzymologie 5.1. Cinétique enzymatique Soient les résultats suivants obtenus lors de l'analyse de l'activité d'une enzyme. Déterminez: a) le Vmax b) pourquoi la vitesse v est-elle constante à [S] supérieure à 2 x 10-3 M? c) quelle est la [E] libre à une [S] de 2 x 10-2 M? [S] (mol/L) 2 x 10-1 2 x 10-2 2 x 10-3 2 x 10-4 1,5 x 10-4 1,3 x 10-5 v (μmol/min) 60,00 60,00 60,00 48,00 45,00 12,00 12 5.2. Cinétique enzymatique Vous trouverez ci-dessous les résultats de l'analyse de l'activité d'une enzyme. Sans faire de graphique, déterminez: a) le Vmax; b) le Km; c) la vitesse initiale à [S] de 1 x 10-1 M; d) la quantité de produit formé au cours des 5 premières minutes à une [S] de 2 x 10-3 M. À une [S] de 2 x 10-6 M? e) quel est le Km et le Vmax si on augmente la [E] d'un facteur 4? [S] (mol/L) 5 x 10-2 5 x 10-3 5x 10-4 5x 10-5 5 x 10-6 5 x 10-7 v (μmol/min) 0.25 0.25 0.25 0.20 0.07 0.01 5.3. Cinétique enzymatique Le tableau suivant décrit les résultats d'une expérience d'enzymologie. Trouvez grâce au graphe de Lineweaver-Burke: a) le Km; b) le Vmax; [S] (mol/L) 1 x 10-3 5 x 10-4 1x 10-4 5x 10-5 3 x 10-5 2 x 10-5 1 x 10-5 5 x 10-6 1 x 10-6 5 x 10-7 v (μmol/min) 65.00 63.00 51.00 42.00 33.00 27.00 17.00 9.50 2.20 1.10 5.4. Cinétique enzymatique On étudie l'influence du pH sur l'activité enzymatique de la 6-phosphogluconate déshydrogénase. Cette enzyme catalyse la réaction: 6-phosphogluconate + NADP acide 6- phosphogluconique + NADPH2 13 Le NADPH2 absorbe à 340 nm. L'activité de la déshydrogénase a été mesurée spectrophotométriquement en mesurant la densité optique à 340 nm, qui est proportionnelle à la concentration de NADPH2. [S] x 104 M Accroissement de l’absorbance à pH 7.6 Accroissement de l’absorbance à pH 9.0 0.174 0.074 0.034 0.267 0.085 0.047 0.526 0.098 0.075 1.666 0.114 0.128 4.000 - 0.167 À quel pH l'enzyme a-t-il le plus d'affinité pour le substrat? 5.5. Cinétique enzymatique Les résultats suivants décrivent l'effet d'un inhibiteur sur l'activité enzymatique d'une enzyme. Déterminez: a) le Vmax en présence et en absence de l'inhibiteur b) le Km en présence et en absence de l'inhibiteur c) le Ki d) de quel type d'inhibition s'agit-il? [S] (mol/L) Sans inhibiteur v (μmol/min) 1 x 10-4 1,5 x 10-4 2x 10-4 5x 10-4 7,5 x 10-4 28.00 36.00 43.00 65.00 74.00 Avec inhibiteur [I] = 2,2 x 10-4 M v (μmol/min) 17.00 23.00 29.00 50.00 61.00 5.6. Cinétique enzymatique Une biochimiste étudie les propriétés d'une enzyme métabolique qu'elle vient tout juste d'isoler. Elle obtient les résultats d'analyse cinétique suivants en absence et en présence de deux inhibiteurs différents (A et B). L'identité des inhibiteurs est inconnue, mais on sait que l'un d'eux est un analogue du substrat et l'autre est un agent alkylant. 14 Déterminez: a) le Km et le Vmax de cette enzyme; b) quel inhibiteur est l'analogue du substrat. Lequel est l'agent alkylant? c) quelles sont les constantes d'inhibition (Ki) respectives des inhibiteurs A et B? d) quel sera le Vo de cette réaction enzymatique à une concentration de substrat de 3 x 10-4 M et en présence de 2 x 10-5 M de l'inhibiteur A? [S] (mol/L) Sans inhibiteur v (µmol/min) 5 x 10-4 2,5 x 10-4 1,7 x 10-4 1,2 x 10-4 1 x 10-4 1.25 0.87 0.67 0.54 0.45 Avec inhibiteur A [I] = 5 x 10-4 M v (µmol/min) 0.82 0.49 0.36 0.26 0.23 Avec inhibiteur B [I] = 3,2 x 10-6 M v (µmol/min) 0.48 0.33 0.25 0.20 0.17 5.7. Catalyse enzymatique Activité enzymatique (%) L'effet du pH sur l'activité d'une enzyme est démontré dans le graphique ci-dessous: pH Comment expliquez-vous l'effet du pH sur l'activité de l'enzyme? 5.8. Catalyse enzymatique Plusieurs enzymes montrent une dépendance vis-à-vis le pH qui est similaire à celle schématisée dans le graphique du problème précédent. Cependant, le pH optimal varie beaucoup d'une enzyme à l'autre. Quelles chaînes latérales retrouverait-on au site actif d'enzymes dont le pH optimal est de: a) pH 4 15 b) pH 11 5.9. Allostérie On étudie la cinétique de deux enzymes (A et B). À partir des données suivantes, distinguez le type d'enzyme (c'est-à-dire si il s'agit d'un enzyme ordinaire ou allostérique) et expliquez l'allure des courbes représentant la vitesse en fonction de la concentration du substrat. [S] (x 103 M) 0.00 0.50 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 8.00 v (enzyme A) (μmol/min) 0.00 8.80 14.00 19.00 21.50 22.80 22.30 23.50 23.60 v (enzyme B) (μmol/min) 0.00 0.30 1.00 4.70 12.40 19.00 21.80 22.80 23.30 Chapitre 6. Structure et propriétés des acides nucléiques. 6.1. Structure des acides nucléiques. Soit le polynucléotide suivant: AUUACGUGGUGCACUCGGGAACAUCCCGAGUGCACCACGUAAUGGA Dessinez les deux structures secondaires intramoléculaires les plus stables que ce polymère peut adopter. *6.2. Structure des acides nucléiques. Une solution d'ADN double-brin est chauffée puis refroidie à la température de la pièce pendant deux minutes. Prédisez qualitativement la variation dans l'absorbance à 260 nm dans les conditions suivantes: a) la solution est chauffée jusqu'à ce que la température soit juste sous le Tm avant d'être refroidie; b) la solution est chauffée jusqu'à ce que la température dépasse largement le Tm, puis est refroidie; c) suggérez la structure de deux polynucléotides (synthétiques ou naturels) qui résulteront dans un profil d'absorbance suite au refroidissement qui sera l'inverse parfait du patron obtenu suite au chauffage de la molécule au-dessus du Tm. 6.3. Structure des acides nucléiques. 16 Expliquez pourquoi l'ARN, mais non l'ADN, est hydrolysé sous des conditions de pH basique. 6.4. Structure des acides nucléiques. Les résultats suivants sont obtenus lors d'une expérience de dénaturation/renaturation d'un acide nucléique simple (polyA:polyU). Comment interprétez-vous ces données? Absorbance (260 nm) Solution refroidie rapidement Solution refroidie lentement Température (oC) Tm 6.5. Structure des acides nucléiques. L'IMP (inosine monophosphate) est présent chez E. coli en tant qu'intermédiaire de la biosynthèse des nucléotides puriques, et il est possible d'incorporer de l'IMP à l'ADN si le dITP (inosine triphosphate) est présent dans le milieu réactionnel. Pourtant, le dIMP n'est jamais présent dans l'ADN dans la nature. Proposez une explication. 6.6. Structure des acides nucléiques Quels sont les produits de la digestion de l'oligoribonucléotide: 5'pACGAUGCUAUC 3' par chacun des enzymes suivants: a) ribonucléase pancréatique; b) ribonucléase T2; c) ribonucléase T1; 6.7. Structure des acides nucléiques On veut procéder à l'analyse d'un ARN. Sa composition globale en bases est 2A, 2C, 1U, 1G. Le traitement par la phosphodiestérase de venin de serpent libère pC. 17 L'hydrolyse par la ribonucléase pancréatique libère 1C, un dinucléotide qui comprend A et C, et un trinucléotide qui contient A, G et U. L'action de la ARNase T2 donne pAp, un dinucléotide qui contient U et C, et un trinucléotide ayant A, G et C. Quelle est la structure primaire de cet ARN? 6.8. Structure des acides nucléiques On procède à l'analyse d'un ARN dont la composition brute en bases est 2A, 4C, 2G, 1U. La ribonucléase pancréatique libère 2Cp, deux dinucléotides dont un contient G et C et l'autre A et U, et un trinucléotide fait de A, C et G. Un mélange de ARNase T1 et T2 produit C, Ap, pGp, et deux trinucléotides, le premier contenant A et C et le deuxième CG et U. La phosphodiestérase du venin de serpent libère pC. Quelle est la formule de cet ARN? 6.9. Structure des acides nucléiques Quelle est la charge globale portée par le trinucléotide ApGpUpC à pH neutre? 6.10. Structure des acides nucléiques Pourquoi d'un duplex circulaire d'ADN se renature-t-il plus rapidement qu'un duplex linéaire? 6.11. Structure des acides nucléiques Pourquoi l'ADN se dénature-t-il dans l'eau pure, c'est-à-dire à force ionique voisine de zéro? 6.12. Structure des acides nucléiques La taille du chromosome de E. coli est de 4000 kpb. Quelle longueur d'ADN contient-il? 6.13. Synthèse des acides nucléiques. Au cours d'une expérience du type de celle effectuée par Meselson et Stahl, vous laissez les bactéries pousser pour 3 générations (au lieu de 2 dans l'expérience classique) dans un milieu ne contenant que du 14N. Suite à l'isolation de l'ADN et son analyse par centrifugation analytique, quelle proportion de molécule d'ADN lourdes, hybrides ou légères obtiendrez-vous? 6.14. Synthèse des acides nucléiques. Un brin isolé (+) d'ADN (composition en bases: 10% de A, 20% de G, 30% de C et 40% de T) est répliqué par la ADN polymérase de E. coli en un brin complémentaire (-). L'ADN bicaténaire sert ensuite de modèle à la ARN polymérase de E. coli qui transcrit le brin (-). 18 Indiquez la composition en bases (en % de A, C, G et T/U) du brin formé. *6.15. Synthèse des acides nucléiques. Le temps requis pour synthétiser complètement le génome d’E. coli est de 40 minutes. Pourtant, le temps de génération de cette bactérie est de seulement 20 minutes. Trouvez une explication à ce paradoxe. **6.16. Synthèse des acides nucléiques. Vous avez l'insigne honneur d'être le premier scientifique à analyser un micro-organisme provenant de la planète Mars. Cette bactérie contenant de l'ADN double-brin comme matériel génétique, vous décidez d'effectuer une analyse de type Meselson-Stahl. et vous obtenez les résultats décrits à la page suivante. a) comment interprétez-vous ces résultats? b) afin de mieux comprendre ce phénomène, vous isolez tous les composants impliqués dans la réplication de l'ADN chez cet organisme. Vous identifiez: - une activité d'ARN polymérase; - une ADN polymérase qui fonctionne seulement sur de l'ADN monocaténaire (simple brin); - une nouvelle enzyme qui peut générer un produit sensible à la ADNase en présence de NADH et d'un produit insensible à la ADNase et résistant à la chaleur. D'après ces informations, déduisez le mécanisme selon lequel ce micro-organisme réplique son ADN. LL HL HH Générations après transfert dans 14N 0 1 2 6.17. ARNm et transcription À la différence de l’ADN polymérase, l’ARN polymérase n’effectue pas de relecture avec correction éventuelle de son produit. a) Pourquoi cette absence d’autocorrection de la synthèse d’ARN ne menace-t-elle pas la viabilité cellulaire? 19 b) En quoi le fait, pour un organisme, de posséder une enzyme utilisant l’ARN comme matrice pour synthétiser l’ADN modifierait-il le taux de mutation de cet organisme? *6.18. ARNm et transcription La très grande majorité des ARNm ont une demi-vie très courte – de l’ordre de 3 minutes chez les bactéries. Quelle raison a poussé l’évolution à façonner les ARNm en molécules aussi instables? 6.19. ARNm et transcription Si l’ARN polymérase allonge l’ARN à la vitesse de 35 à 70 nucléotides par seconde et si chaque molécule de polymérase s’accole à 70 paires de bases d’ADN : a) Quelle est la vitesse maximale de transcription par minute à laquelle un gène de 6000 paires de bases est transcrit en molécules d’ARN? b) Quel est le nombre maximal de molécules de polymérases qui pourraient se retrouver attachées à ce gène à un moment donné? 6.20. Codage des protéines. Soit l'ARNm suivant: AGU CUC UGU CUC CAU UUG AAG AAG GGG AAG GGG a) indiquez la séquence d'acides aminés qui sont codés (lecture de 5' vers 3'). Le tableau contenant le code génétique est inclus en annexe. b) on obtient des mutations qui consistent en l'addition ou la délétion d'un seul nucléotide. Si on insère G entre le troisième et le quatrième nucléotide de la séquence précédente, et que l'on élimine le dixième nucléotide à partir de la droite (c’est un G), quelle sera la séquence peptidique obtenue? 6.21. Codage des protéines. La séquence d'acides aminés d'une partie du lysozyme provenant d'un bactériophage T4 de type sauvage et d'un mutant sont: type sauvage: -Tyr-Lys-Ser-Pro-Ser-Leu-Asn-Ala-Ala-Lys- mutant: -Tyr-Lys-Val-His-His-Leu-Met-Ala-Ala-Lys- a) ce mutant peut-il être le résultat du changement d'une seule paire de bases dans l'ADN du phage T4? Si non comment ce mutant peut-il avoir été produit? b) quelle est la séquence en bases de l'ARNm qui code pour les cinq acides aminés du type sauvage qui sont différents dans le mutant? 6.22. Codage des protéines. 20 Un brin d'ADN comporte la séquence indiquée ci-dessous: 5' TCGTTTACGATCCCCATTTCGTACTCGA 3' a) quelle est la séquence des bases de l'autre brin d'ADN? b) quelle est la séquence des bases de l'ARNm transcrit à partir du premier brin? c) quelle est la séquence en acides aminés codés? d) quelle est la séquence en acides aminés codés si le second T de l'extrémité 3' de l'ADN fait l'objet d'une délétion? 6.23. Génie génétique. Donnez les fragments de restriction obtenus suite à la digestion du fragment suivant avec l’enzyme EcoR I : 5’ATGCTCGATCGATCGAATTCTATAGCCCGGGGCTGGATCCAGGTACCAAGTTAAGCTTG3’ 3’TACGAGCTAGCTAGCTTAAGATATCGGGCCCCGACCTAGGTCCATGGTTCAATTCGAAC5’ 6.24. Génie génétique. Donnez les fragments de restriction obtenus suite à la digestion du fragment présenté au problème 6.23 avec l’enzyme BamH I. 6.25. Génie génétique. Donnez les fragments de restriction obtenus suite à la digestion du fragment présenté au problème 6.23 avec l’enzyme Sma I. 6.26. Génie génétique. Donnez les fragments de restriction obtenus suite à la digestion du fragment présenté au problème 6.23 avec à la fois les enzymes Kpn I et Hind III. 6.27. Génie génétique. Vous désirez cartographier le génome du bactériophage λ (ADN double brin linéaire). Pour cela, vous marquez le génome de λ (longueur totale de 48,500 pb) à une seule de ses extrémités 5’ avec du phosphore radioactif (32P). Vous le digérez ensuite avec différentes enzymes de restriction sous des conditions permettant une digestion partielle de l’ADN. Vous analysez les fragments obtenus par électrophorèse sur gel d’agarose, suivie d’une autoradiographie afin de visualiser l’ADN radioactif. Vous obtenez alors les résultats décrits dans le tableau ci-dessous. a) Calculez la longueur des fragments de restriction obtenus. b) Établissez une carte de restriction du phage λ. 21 ADN standard Longueur (pb) Distance migrée (cm) 23 130 3.5 9 416 4.1 6 557 4.5 4 361 4.9 2 320 5.25 2 027 6.15 560 6.7 Apa I Distance migrée (cm) 2.76 4.12 22 Pvu I Distance migrée (cm) 2.76 3.02 3.29 3.98 BamH I Distance migrée (cm) 2.76 2.89 3.06 3.24 3.43 4.65 Annexes 23 Annexe 1 pKas et pI des acides aminés pKa1 pKa2 pKr pI G A V L I P 2,34 2,34 2,32 2,36 2,36 1,99 9,60 9,69 9,62 9,60 9,68 10,6 F Y W 1,83 2,20 2,83 9,13 9,11 9,39 S T C M N Q 2,21 2,63 1,71 2,28 2,02 2,17 9,15 10.43 10.78 9,21 8,80 9,13 13,60 13,60 8.33 5,68 5,87 5,07 5,74 5,41 5,65 D E 2.09 2,19 9,82 9,67 3,86 4,25 2,77 3,22 K R H 2,18 2,17 1,82 8,95 9,04 9,17 10,79 12,48 6,00 9,74 10,76 7,59 24 5,97 6,01 5,97 5,98 6,02 6,48 10,07 5,48 5,66 5,89 Annexe 2 Le code génétique Base en 5' ↓ U C A G Base centrale Base en 3' U C A G ↓ Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Tyr Tyr Stop Stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Cys Cys Stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly U C A G U C A G U C A G U C A G 25 Solutions 26 Chapitre 1: Equilibre acide-base et spectrophotométrie 1.1 Équilibre acide-base : a) Comme le HCl est un acide fort, il se dissociera complètement lorsque mis en solution : HCl Æ H+ + ClAinsi, comme la concentration de HCl de départ est de 0.35M, la stoechiométrie nous indique que la concentration finale de H+ dans la solution sera aussi de 0.35M. Nous aurons donc : pH = - log[H+] = -log 0.35 = 0.46 b) L’acide acétique en solution se dissociera lui aussi : CH3-COO- + H+ CH3-COOH Par contre, comme il s’agit d’un acide faible, il ne se dissociera pas complètement. Nous devrons donc tenir compte de la constante d’association (Ka) dans nos calculs. Cette constante est définie de la manière suivante : pKa = - log Ka Donc Ka = 1/10pKa = 1.74 x 10-5M On peut alors facilement calculer la concentration en H+ : Ka = [H+] [CH3COO-] [CH3COOH] 1.74 x 10-5M = [H+] [CH3COO-] 0.35 M 1.74 x 10-5M x 0.35M = [H+] [CH3COO-] = [H+]2 [H+] = (6.09 x 10-6 M2)1/2 = 2.47 x 10-3M Enfin: pH = - log [H+] = - log 2,47 x 10-3 = 2.61 c) Suivant la même procédure qu’en (b), nous obtenons un pH de 3.11. 27 1.2 Équilibre acide-base : a) On a un acide faible. L’équilibre acide-base sera donc le suivant : H+ + A- HA On peut déterminer le Ka de la manière suivante : Ka = [H+] [A-] [HA] L’énoncé du problème indique que cet acide n’est ionisé qu’à 2% (ou 0.20, c’est pareil). Ceci nous permet de déterminer les concentrations respectives de HA, H+ et A- : [H+] = [A-] = 0.20M x 0.02 = 0.004M [HA] = 0.2M – [H+] = 0.196 M Ainsi : Ka = [H+] [A-] [HA] Ka = 0.004M x 0.004M 0.196 M Ka = 8.16 x 10-5 M b) Le pH de cette solution sera donc de : pH = - log [H+] = - log 0.004M = 2.39 1.3 Équilibre acide-base : a) Ce mélange constitue une solution tampon fabriquée avec l’acide acétique et sa base conjuguée, l’acétate de sodium : H+ + CH3COO- Na+ CH3COOH Le pH de ce type de solution peut facilement être déterminé grâce à l’équation d’HendersonHasselbach : pH = pKa + log [Base conjuguée] [Acide] 28 pH = 4.76 + log 0.5M = 4.46 1M b) On a l’équilibre suivant : H+ + H2PO4- K+ H3PO4 Utilisant la même procédure qu’en (a), on obtient : pH = pKa + log [H2PO4-] [H3PO4] pH = 2.14 + log 0.8 M 0.3 M pH = 2.57 1.4 Équilibre acide-base : Nous avons ici l’équilibre suivant : H2PO4- H+ + HPO4-2 Et le pKa donné est de 7.21. L’équation d’Henderson-Hasselbach nous donne: pH = pKa + log [HPO4-2] [H2PO4-] 7,00 = 7.21 + log [x] 0.1 M -0.21 = log x – log 0.1 M -0.21 + log 0.1 M = log x = -1,21 x = 10logx = 0.062 M 1.5 Équilibre acide-base : On a toujours l’équilibre acide base suivant : H+ + HPO4-2 H2PO4- 29 D’après l’énoncé du problème, on a : [H2PO4-] + [HPO4-2] = 0.3M Ainsi : [H2PO4-] = 0.3 M - [HPO4-2] À partir de l’équation d’Henderson-Hasselbach, on aura donc : pH = pKa + log [HPO4-2] [H2PO4-] 7,00 = 7.21 + log [HPO4-2] [H2PO4-] 7,00 = 7.21 + log [HPO4-2] [H2PO4-] -0.21 = log [HPO4-2] [H2PO4-] 10-0.21 = [HPO4-2] [H2PO4-] 0.616 = [HPO4-2] [H2PO4-] 0.616 x [H2PO4-] = [HPO4-2] Ceci est identique à : 0.616 x (0.3M - [HPO4-2]) = [HPO4-2] 0.185 – 0.616 x [HPO4-2] = [HPO4-2] 0.185 = 1.616 x [HPO4-2] 0.114 M = [HPO4-2] Et la concentration de [H2PO4-] sera : [H2PO4-] = 0.3M - [HPO4-2] = 0.186 M 1.6 Spectrophotométrie La relation entre l’absorbance d’une solution et sa concentration est donnée par l’équation de Beer-Lambert : A = εcl 30 Où : A = absorbance ε = coefficient d’extinction molaire (unités : litres x mol-1 x cm-1) c = concentration (unités : mol/l = M) l = trajet optique (épaisseur de la cuvette; unités : cm) On aura alors : 0.71 = 1.420 l mol-1 cm-1 x c x 1 cm c = 0.71 mol cm 1420 l x 1 cm c = 5 x 10-4 M Si on utilise une cuvette de 0.1 cm, on aura: 0.71 = 1.420 l mol-1 cm-1 x c x 0.1 cm c = 0.71 mol cm 1420 l x 0.1 cm c = 0.005 M 1.7 Spectrophotométrie Grâce à l’équation de Beer-Lambert, on a : A = εcl Ainsi : A = 1420 l mol-1 cm-1 x (37 x 10-3M) x 1cm A = 52.54 1.8 Spectrophotométrie Nous devons tout d’abords tracer la courbe standard de l’absorbance en fonction de la concentration en hémoglobine. Ce graphique est représenté à la page suivante. Comme l’inconnu a une absorbance de 0.303, nous pouvons reporter cette valeur sur la courbe standard afin de trouver la concentration en hémoglobine correspondante, qui est de 6.31µg/mL. Cette valeur peut aussi être obtenue avec beaucoup plus de précision en utilisant l’équation d’une droite : y = mx + b où y = valeur sur l’axes des y x = valeur sur l’axe des x 31 m = pente de la droite b = intersection sur l’axe des y Les valeurs de m et b sont obtenues soit directement sur le graphique, soit en les calculant par régression linéaire (de loin la meilleure méthode). Donc, on aura : y = 0.0441x + 0.0246 x = (y-b)/m x = (0.303-0.0246)/0.0441mLµg-1 = 6.31 µg/mL. 0.8 0.7 Absorbance 0.6 0.5 A = 0.303 0.4 0.3 0.2 6.31 µg 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentration hémoglobine (µg/mL) 32 14 16 18 Chapitre 2: Acides aminés * 2.1. Poids moléculaire d'un acide aminé. Suite à l'ajout du NaOH, on assiste à un déplacement de l'équilibre acide-base de l'acide aminé vers la forme basique: NH3+-CH(R)-COO- NH2-CH(R)-COO- À l'aide de l'équation d'Henderson-Hasselbach, il est possible d'obtenir la proportion d'acide aminé sous forme de base et d'acide suite à l'ajout du NaOH: pH = pKa + Log [base] / [acide] 10,4 = 9,7 + Log [base] / [acide] 0,7 = Log [base] / [acide] 5,011 = [base] / [acide] Comme 0,01 mol de NaOH (100 ml de 0,1M) a été utilisée afin d'atteindre pH 10,4, ceci nous indique que 0,01 mol de l'acide aminé a été convertie en base. Nous aurons donc: 5,011 = [base] / [acide] 5,011 = 0,01 mol /[acide] [acide] = 0,002 mol La somme de la quantité d'acide aminé sous forme basique et acide nous donne la quantité totale d'acide aminé, soit 0,012 mol. Il ne reste plus qu'à utiliser ces données afin d'obtenir le poids moléculaire: 1,812 g = 0,012 mol Donc, poids moléculaire: g / mol = 1,812 g /0,012 mol = 151 g / mol 2.2. Courbe de titrage. Le titrage de l'histidine implique les équilibres acide/base suivants: H+N H+N CH2 – CH – COO CH2 – CH – COOH HN + HN NH3 pKa1 N N + NH3 pKaR 33 CH2 – CH – COO CH2 – CH – COO HN NH3 HN + pKa2 NH2 Afin de dessiner la courbe de titrage, nous avons besoin des valeurs des pKas et des points d'inflexions. Pour l'histidine, les pKas sont les suivants: pKa1: 1,82 pKaR: 6,00 pKa2: 9,17 Par définition toujours, le pKa est le point où la moitié de l'acide aminé dans la solution a perdu un proton, alors que l'autre moitié possède encore ce proton. Les points d'inflexion sont déterminés par la moyenne arithmétique de deux pKa consécutifs: point d'inflexion no. 1: (1,82 + 6,00) / 2 = 3,91 point d'inflexion no. 2: ( 6,00 + 9,17) / 2 = 7,59 Le pI est défini comme étant le pH où la charge nette de l'acide aminé est neutre, et il est déterminé par la moyenne arithmétique des pKas précédant et suivant l'espèce neutre de l'acide aminé. Pour l'histidine, le pI sera donc de 7,59 (soit le point d'inflexion no. 2). On peut ainsi dessiner la courbe de titrage de l'histidine (voir page suivante). 2.3. Charge nette des acides aminés. Pour déterminer la charge nette d'acides aminés à différents pH, on doit d'abord déterminer le pI de ces différents acides aminés. Avec cette information, la charge de l'acide aminé peut être déduite à différents pH: en effet, par définition, la charge de l'acide aminé à un pH égal à son pI est nulle. À un pH inférieur à son pI, l'acide aminé est chargé positivement, alors qu'il est chargé négativement à un pH supérieur à son pI. Ainsi, pour ce qui est de ce problème, nous obtenons les résultats suivants: pH glycine (pI: 5.97) sérine (pI: 5.68) 2.01 3.96 5.68 10.76 + + + - + + 0 - acide aspartique (pI: 2.77) + - 34 glutamine (pI: 5.68) arginine (pI: 10.76) + + 0 - + + + 0 Graphe du problème 2.2. pKa2=9.17 9.0 N pI = 7.59 7.5 100% CH2 – CH – COO NH3+ HN pH pKaR=6.0 6.0 H+N 3.91 100% CH2 – CH – COO HN NH3+ pKa1=1.82 1.82 0.5 1.5 1.0 2.0 2.5 3.0 Équivalents d’ions OHH+N 50% HN H+N pKa1 H+N CH2 – CH – COOH 50% + NH3 50% HN HN N pKaR CH2 – CH – COO NH3+ CH2 – CH – COO 50% CH2 – CH – COO HN N 50% pKa2 50% CH2 – CH – COO HN N NH3+ CH2 – CH – COO HN NH2 35 NH3+ NH3+ 2.4. Chromatographie échangeuse d'ions. On débute la chromatographie à pH 10. À ce pH, tous les acides aminés dans le mélange seront chargés négativement (pH est supérieur au pI). a) sur une résine échangeuse de cations, aucun des acides aminés ne s'accrochera à la résine et ils seront donc tous retrouvés dans l'éluant. b) sur une résine échangeuse d'anions, tous les acides aminés s'accrocheront à la résine. Au fur et à mesure que l'on diminue le pH, les acides aminés élueront dès que le pH du tampon deviendra inférieur à leur pI. Ainsi, dans l'ordre, on recueillera: 1- lysine 2- isoleucine, alanine, glycine (tous trois à peu près en même temps à cause de leur pI rapprochés) 3- acide glutamique. Évidemment, c'est la résine échangeuse d'anions qui donnera la meilleure séparation. 2.5. Acides aminés Seulement deux acides aminés peuvent générer d'autres acides aminés en libérant de l'ammoniac: l'asparagine et la glutamine: H2O O NH3 O C-CH2-CH-COOH H2N C-CH2-CH-COOH HO H2N H2N ASN ASP H2O O NH3 O C-CH2-CH2-CH-COOH H2N C-CH2-CH2-CH-COOH HO H2N GLN H2N GLU *2.6. Acides aminés Cette observation ne peut être expliquée que si l'on assume que la sérine est d'abord insérée dans la caséine lors de la traduction, et que le groupe phosphate lui est attaché une fois la synthèse protéique terminée. Les résultats expérimentaux confirment cette hypothèse. 36 *2.7. Chromatographie échangeuse d'ions. Comme ces quatre acides aminés peuvent être séparés sur une résine échangeuse d'ions, mais que leurs pKa est presque qu'identique, une différence structurale quelconque doit logiquement être responsable de la différence de comportement de ces acides aminés lors de la chromatographie. L'examen de la structure de la glycine, l'alanine, la valine et la leucine révèle une augmentation croissante du caractère hydrophobe de la chaîne latérale. On peut donc conclure que ces acides aminés forment des interactions hydrophobes d'intensité différente avec la résine échangeuse d'ions, ce qui permet leur séparation. 2.8. Peptides. Comme les rendements en leucine, arginine et tryptophane sont similaires, on peu conclure qu'ils devraient être en proportion égale. De plus, comparativement à la leucine, l'arginine et le tryptophane, on a recueilli approximativement deux fois plus de glutamate et quatre fois plus d'alanine et de lysine. La formule empirique de ce petit peptide devrait donc être: (Arg, Leu, Trp, Glu2, Ala4, Lys4)n Cette expérience ne nous permet pas cependant de connaître la séquence de ce peptide. 2.9. Peptides. La structure du peptide GWYQR (Glycyl-Tryptophanyl-Tyrosyl-Glutaminyl-Arginine) est: O O O O H2N-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH CH2 (CH2)3 CH2 CH2 CH2 NH C C NH O NH NH2 NH2 OH Afin de déterminer quelle sera la forme ionisée de ce peptide aux différents pH, il suffit de prendre note du pKa des différents groupes chargés (y compris les chaînes latérales), et de déduire l'état d'ionisation de chacun de ces groupes ( pH<pKa: forme protonée; pH>pKa: forme non-protonée): À pH 2: Tous les groupes sont protonés: O O O O H3N-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH CH2 (CH2)3 CH2 CH2 CH2 NH C C NH2+ O NH NH2 NH2 OH + 37 À pH 7: Le groupe carboxyl de l'arginine est ionisé (pH>pKa). Par contre, la chaîne latérales de l’arginine et le groupe amino de la glycine sont toujours protonés (pH<pKa): O O O O H3N-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-COO CH2 (CH2)3 CH2 CH2 CH2 NH C C NH2+ O NH NH2 NH2 OH + À pH 10,5: Ici, le groupe amino de la glycine et la chaîne latérale de la tyrosine sont déprotonés (pH>pKa). Par contre, le groupe amino de la chaîne latérale de l'arginine demeure protoné (pH<pKa): O O O O H2N-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-COO CH2 (CH2)3 CH2 CH2 CH2 NH C C NH2+ O NH NH2 NH2 O- Chapitre 3. Propriétés générales et purification des protéines 3.1. Purification des protéines. La précipitation au sulfate d'ammonium permet de concentrer la protéine d'intérêt en précipitant de manière non-spécifique une proportion généralement importante des protéines contenues dans l'extrait brut. On obtient donc très aisément une purification partielle de la protéine, qui peut ensuite subir d'autres étapes de purification. 3.2. Purification des protéines. Le groupe diéthylamino (-CH2-CH2-NH+-CH2-CH3) du DEAE-cellulose porte une charge positive qui est à la base du fonctionnement de cette colonne. En effet, les acides aminés/protéines chargées négativement vont lier (via des liaisons électrostatiques) le groupe diéthylamino, alors que les acides aminés/protéines chargés positivement se retrouveront dans l'éluant. Comme le groupe diéthylamino possède un pKa voisin de 8,5, ce groupe sera déprotoné à un pH supérieur à 8,5, ce qui lui enlève toute sa capacité à lier des substances chargées 38 négativement. 3.3. Purification des protéines. À un pI supérieur à 6, la 6-phosphogluconate déshydrogénase possède une charge globale négative (pH>pI): elle peut donc lier la colonne. À un pH supérieur à 9, le groupe diéthylamino de la colonne perd son proton, empêchant du même coup toute séparation de l'enzyme selon sa charge. 3.4. Purification des protéines. Non, car la CM-cellulose (CM = carboxyméthyl = -CH2-COOH) est une résine échangeuse de cations: à un pH supérieur à 6, la 6-phosphogluconate déshydrogénase est chargée négativement (voir problème 3.3) et ne peut donc pas lier la colonne. 3.5. Purification des protéines. Afin de séparer la 6-phosphogluconate déshydrogénase sur une colonne de CM-cellulose, on doit s'assurer que la protéine possède une charge globale positive. Le pH du tampon devra donc être inférieur au pI de la protéine, soit inférieur à 6. 3.6. Purification des protéines. Afin d'éluer des protéines liées sur une résine échangeuse d'ions, deux possibilités s'offrent au biochimiste: utiliser soit un gradient de pH, soit de sel (généralement du NaCl). Dans la cas où l'on a choisi d'utiliser un gradient de NaCl, on débute généralement avec un tampon de faible force ionique, pour par la suite utiliser une série de tampons dont la concentration en NaCl augmente graduellement. Les ions Na+ ou Cl- décrocheront les protéines de la colonne en neutralisant les charges négatives ou positives qui permettent aux protéines d'interagir avec la résine. Le résultat est l'élution des protéines selon leur densité de charge: en effet, afin d'être décrochées d'une colonne échangeuse de cations, les protéines possédant moins de charges positive nécessiteront moins d'ions Cl- (donc une concentration de NaCl moins élevée) pour neutraliser leurs charges que des protéines possédant plus de charges positives. La même logique s'applique aux ions Na+ lors de l'élution de protéines fixées à une résine échangeuse d'anions (e.g. CM-cellulose). Dans le cas qui nous concerne, on peut donc conclure que : - la myoglobine éluera la première car elle ne se fixera pas à la colonne (pH<pI: donc charge nette positive); - le pI de l'uréase (5,4) est plus rapproché du pH du tampon que le pI de l'ovalbumine (4,6): l'uréase possédera donc une charge globale nette moins négative que l'ovalbumine. On peut donc prédire que l'uréase éluera à une concentration de NaCl inférieure à celle requise pour éluer l'ovalbumine. L'ordre d'élution sera donc: myoglobine, uréase, ovalbumine. 3.7. Purification des protéines. Une manière simple et rapide de séparer ces protéines est d'effectuer d'abord une chromatographie sur résine échangeuse d'ions: il est alors possible de se débarrasser de la 39 protéine dont le pI est différent de notre enzyme. En seconde étape, on peut effectuer un tamisage moléculaire afin de séparer notre enzyme (Mr 24 kDa) de l'autre protéine contaminante (Mr 100 kDa). Note: Des résultats similaires seraient obtenus si l'on effectue d'abord le tamisage, suivi de la chromatographie sur résine échangeuse d'ions. 3.8. Purification des protéines. a) L'activité spécifique étant définie comme étant le nombre d'unité enzymatique par mg de protéine, nous n'avons qu'à diviser le nombre d'unités enzymatiques déterminées expérimentalement par la quantité de protéine dans l'extrait. Ainsi, pour l'étape du traitement à la chaleur, on aura: activité spécifique = activité enzymatique / mg protéine activité spécifique = 1 980 U/16 500 mg = 0,12 U/mg Le pourcentage de rendement est défini comme la quantité d'enzyme (ou de protéine) recueilli après x étapes par rapport à la quantité présente initialement dans l'extrait brut. Il est obtenu en divisant l'activité enzymatique à l'étape x par l'activité enzymatique initiale. Toujours pour l'étape de dénaturation à la chaleur, on aura: Pourcentage de rendement = act. enzym. étape x / act. enzym. initiale Pourcentage de rendement = (1 980 U/2 700U) x 100 = 73,3 % Quant au degré de purification, il est obtenu en divisant l'activité spécifique après l'étape x par l'activité spécifique initiale. On obtient alors le nombre de fois que notre enzyme fut concentrée (donc purifiée) après les traitements effectués. Pour l'étape de dénaturation à la chaleur, on aura: Degré de purification = act. spécif. étape x / act. spécif. initiale Degré de purification = 0,12/0,039 = 3,07 fois. Les résultats pour chacune des étapes de purification sont indiqués dans le tableau ci-dessous: Étape de purification Extrait cellulaire Sulfate d'ammonium Activité spécifique (U/mg) 0,039 Pourcentage de rendement 100% Degré de purification (n fois) --- 0,09 85,2% 2,30 40 Étape de purification Dénaturation chaleur Chromato. DEAE CM-cellulose Bio-Gel A Activité spécifique (U/mg) 0,12 Pourcentage de rendement 73,3% Degré de purification (n fois) 3,07 4,31 28,72 32,00 62,2% 50% 41,5% 110,50 736,40 820,50 b) Afin de déterminer quelle étape fut la plus efficace dans la purification de notre enzyme, il s'agit de diviser le degré de purification après une étape x par le degré de purification de l'étape précédente. Ainsi, l'étape de chromatographie sur DEAE a permis la plus grande purification de l'enzyme, soit 36 fois. c) Considérant que la protéine est pure après tamisage moléculaire, on aura donc recueilli 35 mg de 6-gluconate déshydrogénase. Ceci correspond à 41,5 % de la quantité d'enzyme présente initialement dans l'extrait (c.f. pourcentage de rendement). Ainsi, dans notre extrait initial, on avait: 35 mg / 41,5% = 75,9 mg Et cette quantité d'enzyme était initialement présente dans 70 000 mg de protéine. On avait donc dans l'extrait brut: (75,9 mg / 70 000 mg) x 100 = 0,108 % de 6-gluconate déshydrogénase 3.9. Purification des protéines. Le but de la focalisation électrique consiste à séparer des protéines selon leur point isoélectrique, donc selon leur différence de charge à différents pH. Le fait d'ajouter du SDS ferait en sorte que toutes les protéines auraient la même densité de charge et, donc, ne pourraient pas être séparées selon ce type d'électrophorèse. 3.10. Purification des protéines. Afin de déterminer le poids moléculaire de la protéine inconnue, il suffit de tracer le graphe du volume d'élution en fonction du log du poids moléculaire (voir graphe à la page suivante). Protéine Log Mr Vel (ml) dextran bleu 6,000 85,00 lysozyme 4,146 200,00 chymotrypsinogène 4,398 190,00 ovalbumine 4,653 170,00 41 Protéine Log Mr Vel (ml) sérum albumine 4,813 150,00 aldolase 5,176 125,00 uréase 5,699 90,00 ferritine 5,845 92,00 ovomucoide 4,447 160,00 En déterminant sur le graphe le poids moléculaire correspondant au volume d'élution obtenu pour l'inconnu, on obtient une valeur de 139 kDa. Note: la valeur de volume d'élution obtenue pour la ferritine et l'ovomucoide furent exclus de la courbe car ces protéines semblent se comporter différemment aux autres standards lors de la chromatographie sur gel de séphadex. Graphique, problème 3.10 Lysozyme 200 Chymotrypsinogène 180 Ovalbumine Volume d'élution 160 Ovomucoide Albumine 140 Aldolase 120 Ferritine 100 Uréase Log Mr =5.14 Mr = 139 kDa 80 Dextran 60 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 Log masse moléculaire 42 5.4 5.6 5.8 6 *3.11. Purification des protéines. La ferritine possède un noyau d'hydroxyde ferrique, lui conférant une densité supérieure aux protéines de même poids moléculaire, ce qui influence son comportement en chromatographie sur gel de séphadex. 3.12. Purification des protéines. En présence de SDS, toutes les protéines possèdent une densité de charge identique: c'est ce qui permet de d'utiliser le système PAGE-SDS afin d'évaluer la masse moléculaire des protéines. Ainsi, deux protéines de pI différent mais de masse moléculaire identique formeront une seule bande en gel PAGE-SDS. Par contre, en absence de SDS (donc dans des conditions dites natives ou non-dénaturantes), la migration des protéines vers les bornes négatives ou positives se fera en fonction de leur charge globale, donc de leur pI. Dans ce cas, deux protéines de masse moléculaire identique mais de pI différents donneront deux bandes distinctes suite à la coloration du gel. 3.13. Purification des protéines. En absence de β-mercaptoéthanol, les ponts disulfure au sein de la protéine demeurent intacts. Ainsi la protéine adoptera une conformation plus compacte, et migrera plus rapidement en gel de PAGE-SDS qu'un échantillon de la même protéine dont les ponts disulfure ont été réduits et qui, par le fait même, possède une structure plus allongée. 3.14. Séquençage de polypeptides a) La trypsine hydrolyse le lien peptidique du côté carboxy de acides aminés basiques arginine et lysine. Les fragments de digestion avec la trypsine posséderont tous des résidus Arg ou Lys en C-terminal, sauf bien entendu le fragment correspondant à l'extrémité C-terminal du peptide. Ainsi, avec le peptide décrit ici, nous obtiendrons les deux fragments suivants: A-L-K M-P-E-Y-I-S-T-D-Q-S-N-W-H-H-R b) la pepsine hydrolyse le lien peptidique du côté N-terminal des acides aminés aromatiques Phe, Trp, et Tyr. Les fragments de digestion à la pepsine posséderont donc tous un résidu Tyr, Trp ou Phe à leur extrémité N-terminale, sauf bien sûr le fragment possédant le résidu N-terminal du peptide initial. On obtiendra donc les trois produits de digestion suivants: A-L-K-M-P-E Y-I-S-T-D-Q-S-N W-H-H-R c) la protéase V8 hydrolyse le lien peptidique du côté C-terminal des acides aminés acides Asp et Glu. Les fragments de digestion obtenus posséderont donc tous un résidu Asp ou Glu à leur Cterminal, sauf bien sûr le fragment possédant le résidu C-terminal du peptide initial. On obtiendra alors les trois fragments suivants: A-L-K-M-P-E Y-I-S-T-D Q-S-N-W-H-H-R 43 d) le bromure de cyanogène hydrolyse le lien peptidique au niveau du C-terminal des résidus méthionine. Les fragments de digestion obtenus auront donc tous un résidu Met à leur Cterminal, sauf bien entendu le fragment correspondant au C-terminal du peptide. On aura alors les deux fragments suivants: A-L-K-M P-E-Y-I-S-T-D-Q-S-N-W-H-H-R 3.15. Séquençage de polypeptides La digestion à la carboxypeptidase A nous indique que le résidu C-terminal du peptide est Ala. La digestion à la trypsine nous permet d'ordonner partiellement deux des quatre fragments obtenus (rappel: la trypsine génère des fragments dont le C-terminal est Arg ou Lys): Ala-Arg (Phe, Ser)-Lys De plus, la digestion à la trypsine indique qu’une Lys est situé du côté C-terminal de Lys ou Arg (libération d'une lysine avec la trypsine). La digestion à la trypsine indique aussi que le tripeptide (Ala, Met, Ser) correspond au Cterminal du peptide (il n'y a pas de Arg ou Lys dans ce fragment). De plus, la digestion au CNBr nous permet de déduire la position de la méthionine dans ce tripeptide comme étant: Met-(Ala, Ser) L'alanine étant le résidu C-terminal du peptide (voir digestion à la carboxypeptidase A), la séquence des trois résidus du C-terminal du peptide sera: Met-Ser-Ala La thermolysine coupe du côté N-terminal de résidus hydrophobes: on peut donc déduire la position des résidus hydrophobes des deux fragments obtenus: Ala-(Arg, Ser) Phe-(Lys, Lys,)-Met-Ser Avec cette dernière information et considérant le patron de digestion à la trypsine, on peut conclure que la séquence du peptide est: Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala 3.16. Séquençage de polypeptides La thermolysine coupe le lien peptidique du côté N-terminal de résidus hydrophobes. La digestion des deux fragments du peptide suite à la réduction des ponts S-S nous donne: chaîne 1: A-C F-P-R-K chaîne 2: C Y-C W-C-R-R V-C F-C 44 Comme les liens disulfures du peptide sont intacts lors de la digestion à la thermolysine, certains des fragments décrits ci-dessus seront liés via des ponts S-S impliquant des Cys. Selon les fragments de digestion alors obtenus, on peut déduire la position des ponts S-S comme étant: S-S A-C-F-P-K-R-W-C-R-R-V-C S-S C-Y-C-F-C -S SNote: n'oublions pas qu'à la fois des ponts S-S- intrachaîne et interchaînes peuvent être présents dans la molécule. 3.17. Séquençage de polypeptides La digestion à la carboxypeptidase indique que le C-terminal est Lys Le traitement au DNFB indique que le N-terminal est Val La digestion à la trypsine nous permet d'ordonner partiellement les peptides obtenus comme suit: peptide C: Try-Ala-Lys terminal) peptide D: Val-(Ala, Ala, Ala, Pro)-Lys (rappel: Val est N- peptide E: Met-(Asp, Gly)-Arg On peut ordonner le peptide E grâce aux résultats du traitement au CNBr: Met-Gly-Asp-Arg Finalement, le traitement avec la thermolysine permet d’ordonner les Ala par rapport à Pro : Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys La séquence du peptide est donc: Val-Ala-Ala-Ala-Pro-Lys-Met-Gly-Asp-Arg-Try-Ala-Lys Chapitre 4. Structure tridimensionnelle des protéines 4.1. Structure 3-D des protéines Règle générale, les acides aminés hydrophobes sont retrouvés à l'intérieur des protéines (donc à 45 l'abri du solvant aqueux), et les résidus polaires ou chargés sont retrouvés à la surface des protéines. On aura donc la distribution suivante: Intérieur: Val, Phe, Ileu Surface: Glu, Arg, Asn, Lys, Ser, Thr *4.2. Structure 3-D des protéines La structure de l'urée suggère que celle-ci dénature les protéines en brisant les ponts H stabilisant la structure tridimensionnelle de la macromolécule (interaction des groupes amino et cétone de l'urée avec les groupes amino et cétone du lien peptidique et avec les chaînes latérales). 4.3. Structure 3-D des protéines Même si elle est située à la surface d'une protéine, la phénylalanine doit éviter le contact avec le solvant aqueux. Ceci peut être accompli si deux ou plusieurs sous-unités d'une protéine globulaire établissent des contacts entre-elles via des régions hydrophobes (pouvant inclure la Phe), protégeant ainsi ces résidus non-polaires du solvant aqueux. *4.4. Structure 3-D des protéines La présence de l’Asp à l'intérieur des protéines est possible si ce dernier peut établir des interactions intermoléculaires impliquant ses groupements polaires et chargés. Ceci est entreautre possible via l'inclusion de l'Asp dans une structure secondaire de type hélice α. 4.5. Structure 3-D des protéines La protéine 1 possède un contenu élevé en acides aminés hydrophiles, et relativement peu de résidus hydrophobes (65% hydrophiles/35% hydrophobes). Ceci suggère que de nombreux résidus de cette protéine sont en contact avec le solvant, ce qui est le cas pour les protéines en forme de bâtonnets (qui sont allongées). Il s'agirait donc de la protéine A. La protéine 3 possède un rapport acides aminés hydrophiles/hydrophobe de 50%/50%, alors que celui de la protéine 2 est de 30%/70%. Ceci tend à suggérer que la protéine 3 serait de forme globulaire, avec de nombreux résidus hydrophobes enfouis à l'intérieur, et plusieurs acides aminés hydrophobes à la surface. La protéine 3 serait donc la protéine B. Quand à la protéine 2, son contenu élevé en acides aminés hydrophobes et le petit nombre d'acides aminés hydrophiles présents suggère qu'elle pourrait être la protéine C, où l'association des différentes sous-unités monomériques s'effectuerait au niveau d'acides aminés hydrophobes localisés à la surface de la protéine. 4.6. Structure 3-D des protéines La structure primaire de ce peptide ne montre aucune caractéristique des structures en feuillet β, et il y a absence de résidus (Gly et Pro) qui normalement détruisent les structures secondaires. On peut donc en déduire que ce peptide pourrait adopter une structure secondaire en hélice α. 4.7. Structure 3-D des protéines La structure primaire de ce peptide est caractéristique des protéines adoptant un structure 46 secondaire en segment β. 4.8. Structure 3-D des protéines La présence de plusieurs résidus chargés positivement (Arg et Lys) ainsi que de la glycine indique que ce peptide n'adoptera aucune structure secondaire précise (donc pelote statistique). 4.9. Structure 3-D des protéines Grâce aux mêmes critères établis au cours des trois problèmes précédents, on peut déduire que: acides aminés 2-12: hélice α; acides aminés 13-17: pelote statistique (random coil); acides aminés 18-26: segment en structure β. 4.10. Structure 3-D des protéines La composition élevée en Pro et Hypro indique que la protéine C adopte un structure en triple hélice de collagène. La protéine A est riche en acides aminés à chaîne latérale petite (Gly, Ser, Ala): elle adoptera donc une structure en feuillet β. La protéine B possède une composition en acides aminés qui pourrait mener à la formation d'une hélice α. Cependant, cette hélice α pourrait être déstructurée par la présence occasionnelle de résidus Gly et Pro, et par la présence d'acides aminés basiques ou acides consécutifs. Chapitre 5. Enzymologie 5.1. Cinétique enzymatique a) D'après les données disponibles, on remarque que la vitesse de la réaction enzymatique n'augmente pas lorsque la concentration de substrat dépasse 2 x 10-3 M. Ceci constitue donc la vitesse maximale (Vmax) de l'enzyme, soit 60 μmol/min. b) v est constant à une [S] supérieure à 2 x 10-3 M car l'enzyme est alors saturée par le substrat. c) Comme à une concentration de 2 x 10-2 M on a atteint la vitesse maximale de catalyse par l'enzyme, presque tout l'enzyme existe sous la forme d'un complexe enzyme/substrat. La quantité d'enzyme libre dans le milieu réactionnel est alors négligeable. 5.2. Cinétique enzymatique a) Vmax = 0,25 μmol/min; b) Le Km peut être déterminé en utilisant l'équation de Michaelis-Menten: 47 v = [S] Vmax [S] + Km v[S] + vKm = [S]Vmax vKm = [S]Vmax - v[S] vKm = [S] (Vmax - v) Km = [S] (Vmax - v) v Prenant les données pour une [S] de 5 x 10-6: Km = 5 x 10-6 M x (0,25 μmol/min - 0,071 μmol/min) 0,071 μmol/min Km = 1,26 X 10-5 M Note: le même résultat sera obtenu si l'on utilise une concentration de substrat différente, en autant que v < Vmax. c) La vitesse initiale sera directement obtenue à l'aide de l'équation de Michaelis-Menten: - pour [S] = 1 x 10-6 M: v = [S] Vmax [S] + Km v = 1 x 10-6 M x 0,25 μmol/min 1 x 10-6M + 1,26 x 10-5 M v = 0,0184 μmol/min - pour [S] = 1 x 10-1M: v = 0,25 μmol/min (concentration saturante de substrat: v = Vmax). d) Pour une concentration de substrat de 2 x 10-3 M, la vitesse initiale sera égale au Vmax. On aura alors: v = Vmax = 0,25 μmol/min Après 5 minutes, on aura alors: 0,25 μmol/min x 5 min. = 1,25 μmol de produit formé. 48 - Pour une concentration de substrat de 2 x 10-6 M, il nous faut d'abord trouver la vitesse de la réaction, ce qui est possible grâce à l'équation de Michaelis-Menten: v = [S] Vmax [S] + Km v = 2 x 10-6 M x 0,25 μmol/min 2 x 10-6 M + 1,25 x 10-5 M v = 0,035 μmol/min Donc, après 5 minutes de réaction, on aura: v = 0,035 μmol/min x 5 min. = 0,175 μmol de produit formé. e) Comme le Km est indépendant de la concentration d'enzyme, il ne sera pas affecté par l'augmentation de [E] de demeurera égal à 1,25 x 10-5 M. Par contre, le Vmax sera altéré car: Vmax = kcat x [Et]. Ainsi, comme kcat est une constante, l'augmentation de la concentration d'enzyme par un facteur 4 multipliera aussi le Vmax d'un facteur 4. On aura alors Vmax = 1 μmol/min. 5.3. Cinétique enzymatique Le graphe de Lineweaver-Burke représente la réciproque de la vitesse initiale (1/v) en fonction de la réciproque de la concentration du substrat (1/[S]). D'après les données du problème, on aura alors les valeurs suivantes: 1/[S] M-1 1000,00 2000,00 10 000 20 000 33 333 50 000 100 000 200 000 1 000 000 2 000 000 1/v (mmol-1 x min.) 0,0154 0,0158 0,0196 0,0238 0,0303 0,0370 0,0588 0,1050 0,4550 0,9090 49 Le graphique de Lineweaver-Burke est représenté ci-dessous. Le Km est facilement obtenu par la réciproque de l'intersection sur l'axe des x. Dans ce cas-ci, Km = 2.7 x 10-5 M. Quant à lui, le Vmax est obtenu par la réciproque de l'intersection sur l'axe des y. Ici, Vmax = 67 μmol/min. 1 0.9 0.8 0.7 -1/Vmax = 0.0149 Vmax = 67 µmol/min 1/v 0.6 0.5 y = 4E-07x + 0.0149 0.4 0.3 -1/Km = 36,750 Km = 2.7 x 10-5M 0.2 0.1 0 -500000 0 500000 1000000 1500000 2000000 1/[S] 5.4. Cinétique enzymatique Pour déterminer l'affinité de l'enzyme pour son substrat, on doit trouver la valeur de la constante de Michaelis-Menten. Ceci est facilement réalisé grâce au graphe de Lineweaver-Burke: 1/ [S] (M-1 x 10-4) 5,74 3,75 1,90 0,60 0,25 1/v (μmol-1 x min.) (pH 7,6) 13,51 11,76 10,20 8,77 - 1/v (μmol-1 x min.) (pH 9,0) 29,41 21,28 13,33 7,81 5,99 50 Le graphe de Lineweaver-Burke est représenté ci-dessous. L'intersection des droites avec l'axe des x donne la valeur de -1/Km. Sur le graphique, plus la valeur de -1/Km est petite, plus Km sera grand. Km est une constante d'affinité de l'enzyme pour le substrat et est équivalent à la concentration de substrat nécessaire afin d'atteindre 1/2 Vmax. Ainsi lorsque Km est élevé, l'enzyme a peu d'affinité pour le substrat: il faut beaucoup de substrat à l'enzyme afin d'atteindre 1/2 Vmax. D'après le graphique, on peut donc constater, sans déterminer exactement leur valeur, que le Km de l'enzyme est supérieur à pH 9 par rapport à pH 7,6. Ainsi, se sera donc à pH 7,6 que l'enzyme aura la plus forte affinité pour son substrat. 35 30 pH = 9 25 1/V 20 15 pH = 7.6 10 5 0 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 1/[S] 5.5. Cinétique enzymatique Afin de résoudre ce problème, nous devons d'abord dessiner le graphe de Lineweaver-Burke. La transformation des données donne les résultats suivants: 1/[S] (M-1) 10 000 6 666,67 5 000 1/v (mmol-1 x min.) 1/v (mmol-1 x min.) sans inhibiteur avec inhibiteur 0,0357 0,0588 0,0277 0,0435 0,0233 0,0345 51 2 000 1 333,33 0,0154 0,0200 0,0135 0,0164 Et le graphe de Lineweaver-Burke est donné ci-dessous. a) le Vmax nous est donné par la réciproque de l'intersection sur l'axe des y. Dans ce cas-ci: 1/Vmax = 0,0101 μmol-1 x min. Vmax = 99 μmol/min Comme l'intersection sur l'axe des y est la même en absence qu'en présence de l'inhibiteur, on peut conclure qu'il s'agit d'une inhibition compétitive. b) le Km nous est donné par le négatif de la réciproque de l'intersection sur l'axe des x. Dans ce cas-ci, les Km seront les suivants: - en absence d'inhibiteur: -1/Km = 3 800 M-1 Km = 2,63 x 10-4 M - en présence de l'inhibiteur: -1/Kmapp = 2000 M-1 Kmapp = 5 x 10-4 M c) le Ki peut être déterminé à l'aide des données précédentes grâce à l'équation: Kmapp = Km + Km [I] Ki Ki = Km [I] (Kmapp-Km) Ki = 2,63 x 10-4 M x 2,2 x 10-4M (5 x 10-4 M - 2,63 x 10-4 M) Ki = 2,44 x 10-4 M 52 0.07 0.06 Avec inhibiteur y = 5E-06x + 0.01 1/Vmax = 0.0101 µmol-1min Vmax = 99 µmol/min Sans inhibiteur 0.04 1/V 1/V 0.05 -1/Kmapp =2000 M-1 Kmapp= 5 x 10-4 M 0.03 y = 3E-06x + 0.0097 0.02 -1 -1/Km = 3800 M Km= 2.63 x 10-4 M 0.01 0 -6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1/[S] 5.6. Cinétique enzymatique a) afin de trouver le Km et le Vmax, nous devons tracer le graphe Lineweaver-Burke (représenté ci-dessous): 1/[S] (M-1) 1/v (μmol-1x min.) 2000,00 4000,00 5882,00 8333,00 10 000 0,80 1,15 1,49 1,85 2,22 1/v (μmol-1x min.) inhibiteur A 1,22 2,02 2.78 3.76 4,42 53 1/v (μmol-1x min.) inhibiteur B 2,08 3,03 4,00 5,00 5,88 7 6 Sans inhibiteur Inhibiteur A Inhibiteur B 5 1/v 4 3 2 1 0 -4000 -2000 0 -1 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1/[S] La valeur du Vmax de l'enzyme nous est donnée par la réciproque de l'intersection de la droite sur l'axe des y. Ainsi, Vmax = 2,36 μmol/min. De même, le Km de l'enzyme nous est donné par le négatif de la réciproque de l'intersection sur l'axe des x. Ainsi, Km = 4,4 x 10-4 M. b) D'après le graphe de Lineweaver-Burke, l'inhibiteur A possède un Vmaxapp de 2,36 mmol/min et un Kmapp de 8.3 x 10-4 M. Ceci correspond à un inhibiteur de type compétitif, tel un analogue du substrat. Quand à l'inhibiteur B, son Vmaxapp est de 0,889 μmol/min et son Km est de 4,4 x 10-4 M. Le Km est identique à celui de l'enzyme sans inhibiteur: on a donc une inhibition non-compétitive. Ce type d'inhibition est observé lorsque l'inhibiteur n'interfère pas avec l'interaction enzymesubstrat. Ceci est le cas pour un agent alkylant, qui inhibe l'activité enzymatique en alkylant l'enzyme. L’alkylation des enzymes peut modifier la conformation de la protéine, modifiant légèrement la structure du site actif et, par le fait même, rendre l’enzyme moins efficace comme catalyseur de réactions. c) Constante d'inhibition de l'inhibiteur A: pour l'inhibition compétitive, on a: 54 Kmapp = Km + Km [I] Ki Ki = Km [I] (Kmapp-Km) Ki = 4,25 x 10-4 M x 5 x 10-4M (1,11 x 10-3 M - 4,25 x 10-4 M) Ki = 5.64 x 10-4 M Constante d'inhibition pour l'inhibiteur B: pour l'inhibition non-compétitive, on a: Vmaxapp = Vmax (1 + [I]/Ki) Ki = Vmaxapp [I] Vmax- Vmaxapp Ki = 0,889 μmol/min (3,2 x 10-6M) (2,36 μmol/min - 0,889 mmol/min) Ki = 1.93 x 10-6 M d) la vitesse initiale peut être déterminée par la modification de l'équation de Michaelis-Menten pour les inhibiteur compétitifs: v = Vmax x [S] [S] + Kmapp et Kmapp = Km + Km [I] Ki Kmapp = 4,4 x 10-4 M + 4,4 x 10-4 M x 2 x 10-5 M 5.64 x 10-4 M Kmapp = 4,56 x 10-4 M On aura alors: 55 v = Vmax x [S] [S] + Kmapp v = 2,36 μmol/min x 3 x 10-4 M 3 x 10-4 M + 4,56 x 10-4 M v = 0,936 μmol/min 5.7. Catalyse enzymatique Le fait que le pH optimal de l'enzyme soit à pH 8,0 suggère que l'état d'ionisation (ou de protonation) de résidus d'acide aminé du centre actif de l'enzyme est important pour l'activité de cette dernière. Par exemple, à pH inférieur à 8, la protonation de la chaîne latérale d'un résidu histidine (pKaR = 6) pourrait altérer le mécanisme de catalyse enzymatique soit directement au sein du site actif, soit indirectement en induisant un changement conformationnel de la protéine. À un pH supérieur à 8, la déprotonation de groupements précis (e.g chaîne latérale de Tyr ou Lys; groupe amino-terminal) pourrait avoir la même conséquence sur l'activité enzymatique. 5.8. Catalyse enzymatique a) Pour une enzyme dont le pH optimal est de 4, on peut supposer que la partie ascendante de la courbe pourrait être attribuable à l'ionisation du groupe carboxyl de la chaîne latérale d'un Asp, ou du groupe α-carboxyl de l'acide aminé C-terminal. Pour la partie descendante, elle pourrait être le résultat de la déprotonation de l'His ou de l'ionisation de la Glu. b) Pour une enzyme dont le pH optimal est de 11, la portion ascendante de la courbe pourrait être attribuable à la déprotonation du groupe amino de la chaîne latérale de Lys. Quant à la partie descendante de la courbe, elle pourrait être la conséquence de la déprotonation de Arg. 5.9. Catalyse enzymatique Afin de répondre à cette question, nous devons d'abord dessiner le graphe de la vitesse de la réaction en fonction de la concentration en substrat (voir page suivante). D'après l'allure du graphe, A est une enzyme ordinaire qui suit la cinétique de Michaelis-Menten. La vitesse initiale de la réaction catalysée par l'enzyme A ne dépend que de la concentration du substrat, la vitesse maximale étant atteinte en présence d'un excès de substrat. Grâce au graphique, on peut aussi conclure que l'enzyme B est une enzyme allostérique. En effet, à des concentrations peu élevées de substrat, l'enzyme (qui possède plusieurs sites de liaison du substrat) adopte une conformation telle que son affinité pour le substrat est faible. La vitesse de réaction est alors lente. Par contre, la liaison d'une molécule de substrat à l'enzyme induit un changement conformationnel chez cette protéine qui a pour conséquence d'augmenter l'affinité des autres sites envers le substrat. Plus la concentration en substrat augmente, plus le nombre de sites à haute affinité pour le substrat augmente, ce qui conduit à une plus grande vitesse de réaction. 56 25 V (mmol/min) 20 Enzyme A Enzyme B 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 [S] (x 103M) Chapitre 6. Structure et propriétés des acides nucléiques. 6.1. Structure des acides nucléiques. Le polynucléotide dont il est question ici est de l'ARN (remarquez la présence de l'uracile comme base azotée). Même si l'ARN n'existe pas, comme l'ADN, sous forme d'une double hélice, il peut tout de même adopter une structure secondaire hélicoïdale via l'appariement de régions complémentaires à l'intérieur même de la molécule. Les structures secondaires les plus stables seront évidemment celles impliquant le plus de pont H (donc, celles où l'on aura le plus grand nombre de paires de base). Dans le cas de la molécule qui nous intéresse, les deux structures les plus stables seront: A C C G C U A G C AUCCCGAGUGCACCACGUAAUGGA3’ AUCCCGA GUAAUGGA3’ C C AAGGGCUCACGUGGUGCAUUA5’ AAGGGCU CAUUA5’ C G A U C G G G U 57 A260nm *6.2. Structure des acides nucléiques. a) Comme le Tm n'a pas été atteint, les deux chaînes polynucléotidiques ne se sont pas complètement séparées, et sont donc encore alignées selon leur séquence complémentaire. On obtiendra alors une courbe du style suivant: Température juste sous le Tm Température (oC) Température augmente Température diminue b) Comme on a largement dépassé le Tm, les deux chaîne polynucléotidiques se sont séparées. Lors de la réhybridation, les deux molécules devront s'aligner selon leurs paires de bases complémentaires, ce qui est un processus relativement long (implique des collisions au hasard de nos deux molécules monocaténaires). Comme le temps alloué pour le refroidissement est assez court, la molécule d'ADN n'aura pas le temps de se réhybrider. L'absorbance ne diminuera donc que très peu suite au chauffage, et on aura une courbe du style: A260nm Température>>>Tm Température (oC) Température augmente Température diminue c) Une courbe parfaitement réversible peut être obtenue si l'alignement peut se faire très facilement. Ceci est le cas si l'on a affaire à des polynucléotides peu complexes du type poly(G):poly(C), ou poly (AT):poly(AT). 58 6.3. Structure des acides nucléiques. L'hydrolyse des acides nucléiques implique la cassure des liens phophodiesters liant chaque nucléotides dans l'orientation 5' vers 3'. La seule différence majeurs dans le squelette sucrephosphate entre l'ARN et l'ADN est la présence d'un groupe hydroxyl en position 2' du ribose chez l'ARN. Ainsi, en milieu alcalin, ce groupe peut être facilement ionisé, générant un O- qui peut facilement briser le lien phosphodiester en attaquant le groupe phosphoryl adjacent: B a s e O - O-P-O-CH2 O- O O - H+ O-P-O O CH2 - O-P-O-CH2 O- O- - O-P-O O O O B a s e O O B a s e O O-P O- O B a s e + OHCH2 O O O- - O-P-O O 6.4. Structure des acides nucléiques. Ces données peuvent être interprétée de la manière suivante: a) si l'on refroidi la solution d'acide nucléique rapidement, l'absorbance à 280nm ne varie que très peu, indiquant que les chaînes de polynucléotides restent à l'état monocaténaire (la molécule reste donc dénaturée). b) si l'on refroidi la solution d'acide nucléique lentement, on observe un diminution progressive de l'absorbance à 260 nm, indiquant que notre molécule est passée de l'état monocaténaire à bicaténaire (il y a donc eu réhybridation). 6.5. Structure des acides nucléiques. La structure de l'IMP est la suivante: O N H N N N Ribose L'IMP peut donc former des ponts H avec l'adénosine et avec la cytosine (compare la structure de l’IMP avec celle de l’AMP et de la CMP). Donc, l’incorporation dans l'ADN mettrait 59 O- évidemment en danger l'intégrité du code génétique en permettant une ambiguïté dans le pairage des bases, ce qui serait létal à court terme pour l'organisme. 6.6. Structure des acides nucléiques. a) la ribonucléase pancréatique coupe l'ARN du côté 3' des nucléotides pyrimidiques, générant une extrémité 3' phosphate. Dans le polynucléotide suggéré dans cet exemple, la ribonucléase pancréatique donnera donc les produits de digestion suivants: pACp3' GAUp3' 5' GCp3' 5' Up3' 5' AUp3' 5' 5' C3' 5' b) la ribonucléase T2 coupe du côté 3' des nucléotides adénosine, et générera une extrémité 3' phosphate. On aura alors: pAp3' 5' CGAp3' UGCUA3' 5' UC3' 5' 5' c) la ribonucléase T1 coupe du côté 3' des nucléotides guanosine, et générera une extrémité 3' phosphate. On aura alors: pACGp3' 5' AUGp3' CUAUC3' 5' 5' 6.7. Structure des acides nucléiques. La phosphodiestérase de venin de serpent ne coupe que le nucléotide situé en 3'-terminal de l'ARN, générant un nucléotide 5'phosphate. Cette information nous indique que Cp est situé en 3'-terminal de notre polynucléotide. La ribonucléase pancréatique coupe du côté 3' des nucléotides pyrimidiques, générant des produits de digestion se terminant par une pyrimidine 3' phosphate. D'après les résultats obtenus, on peut déduire les séquences suivantes: ACp3' (A,G)Up3' 5' 5' Finalement, la ribonucléase T2 coupe après l'adénosine, générant des fragments se terminant avec une adénosine 3'phosphate. On peut donc utiliser cette information afin d'ordonner les séquences du produit obtenu: (CG)Ap3' 5' De plus, la présence de pAp après digestion avec la ribonucléase T2 indique que A est le nucléotide 5'-terminal. En recoupant les informations obtenues par l'utilisation de ces trois enzymes, on obtient la séquence finale suivante: 60 pACGAUCp3' 5' 6.8. Structure des acides nucléiques. La phosphodiestérase de venin de serpent libère le nucléotide situé à l'extrémité 3' du fragment. Le résultat obtenu nous indique que pC est le nucléotide 3' terminal pour notre polynucléotide. La ribonucléase pancréatique coupe les molécules d'ARN du côté 3' des pyrimidines, générant des fragments se terminant avec une pyrimidine 3' phosphate. Grâce aux fragments obtenus, on peut déduire en partie leur séquence: GCp3' AUp3' 5' 5' (A,G)Cp3' 5' De plus, le fait que l'on a libéré 2 Cp indique ces nucléotides sont situés tout de suite après U ou C. L'ARNase T1 coupe du côté 3' de la guanosine, générant des fragments se terminant avec une guanosine 3'phosphate. Quant à la ARNase T2, elle coupe du côté 3' des adénosine, générant des adénosine 3'phosphate. L'utilisation combinée de ces deux enzymes donnera un mélange de fragments coupés par l'un ou l'autre de ces enzymes, ou même par les deux enzymes. On peut déduire la séquence des fragments obtenus: CCAp3' 5' (C,U)Gp3' 5' Note: on a déduit la présence de deux C dans le premier fragment car on mentionne qu'il s'agit d'un trinucléotide, et qu'il manque un C si l'on fait le décompte des nucléotides obtenus après digestion avec le mélange T1 + T2. D'après le résultat obtenu avec la ribonucléase pancréatique, l'uridine est précédée de l'adénosine. On aura alors le fragment suivant: AUCGp3' 5' De plus, toujours d'après le résultat avec T1 + T2, l'obtention de pGp indique que ce dernier est le nucléotide 5'-terminal. Le résultat obtenu avec la ribonucléase pancréatique indique aussi que ce G est suivi de C. Aussi, le fait d'avoir obtenu C et Ap indique que ces deux nucléotides sont situés tout de suite après A ou G. On a donc jusqu'ici la séquence suivante: pGC....AUCG....C3' 5' Il ne nous reste que A et C à placer. Comme avec la digestion avec T1 + T2 on a eu la séquence 5'CCAp3', ceci suggère que C est placé entre pGC...AUCG. Enfin, le dernier nucléotide, A, devrait logiquement être situé à l'avant-dernière place. 61 En tenant compte de ces différents résultats, on arrive à la séquence suivante: pGCCAUCGAC3' 5' 6.9. Structure des acides nucléiques. À pH neutre, les bases azotées sont non-ionisées. Les charges ne proviendront donc que des groupes phosphates. Comme on a dans l'exemple suggéré trois phosphate formant les liaisons phosphodiester, on aura 3 x (1-) = 3 charges négatives. 6.10. Structure des acides nucléiques. Une fois l'ADN circulaire dénaturé, les deux brins, quoique séparés, forment deux cercles qui s'enchevêtrent. Au cours de la renaturation, il se retrouvent donc beaucoup plus facilement que les brins complémentaires séparés d'un ADN linéaire dont la rencontre s'effectue au hasard des collisions. 6.11. Structure des acides nucléiques. La température de fusion dépend de la force ionique: en diminuant la force ionique, on abaisse la température de fusion. Dans le cas extrême d'une force ionique nulle, la répulsion électrostatique à l'intérieur de l'ADN, dont les groupements ne sont pas protégés par des contre-ions, est suffisante pour réduire la température de fusion à moins de 20oC. 6.12. Structure des acides nucléiques. L'ADN sous la forme B a une longueur de 3,4 nm (34 A) pour 10 paires de bases. Le chromosome de E. coli, avec 4 000 kb (donc 4 000 000 pb), possède ainsi une longueur de 1,36 x 106 nm, soit près de 1,4 mm. 6.13. Synthèse des acides nucléiques. Lors de l'expérience de Meselson et Stahl, on incube d'abord les bactéries dans un milieu de culture ne contenant que du 15N, et on transfère ensuite les cellules dans un milieu ne contenant que du 14N. Les résultats suivants sont alors obtenus: Après 0 génération: 100% ADN lourd : Après 1 génération: 100% hybride : Après 2 générations: 50% hybride, 50% léger Après 3 générations: 25% hybride, 75% léger. 62 6.14. Synthèse des acides nucléiques. Le brin de départ (+) est composé de: 10% A, 20%G, 30%C et 40%T. Suite à sa réplication, le brin (-) qui lui est complémentaire aura la composition: 40%A, 30%G, 20%C et 10%T (parce que A s'apparie uniquement avec T, et C uniquement avec G). Enfin, lors de la transcription du brin (-), l'ARN formé possédera une composition en base qui lui sera complémentaire, soit 10%A, 20%G, 30%C et 40% U. 6.15. Synthèse des acides nucléiques. Cette observation ne peut s'expliquer que si le génome de E. coli s'est répliqué 1 1/2 fois lors de la séparation physique des bactéries. **6.16. Synthèse des acides nucléiques. a) comme aucune molécule hybride n'est obtenue, nous devons conclure qu'un mécanisme de réplication conservatif a lieu, au cours duquel les brins servant de gabarit reforment le duplex initial après chaque ronde de réplication. b) La présence d'ARN polymérase suggère qu l'ADN bactérien est d'abord transcrit en une molécule d'ARN. Par la suite, cet ARN (résistant à la ADNase) est converti en ADN (sensible à la ADNase) via la réduction du carbone 2' par la nouvelle activité enzymatique et le NADH. Finalement, cet ADN sert de gabarit à l'ADN polymérase, formant une molécule d'ADN bicaténaire identique au duplex parental initial. 6.17. ARNm et transcription. a) L’introduction de mutations par absence d’activité d’édition est un phénomène aléatoire n’affectant qu’un petit nombre de copies d’un ARN donné. De plus, chaque ARNm a une demivie très courte et il ne dirige la synthèse que de quelques molécules de protéines avant d’être dégradé. L’introduction de mutations dans l’ARNm n’affectera donc qu’une infime minorité des molécules d’une protéine donnée, ce qui sera sans effet apparent pour la cellule. b) L’utilisation d’un intermédiaire ARN afin de synthétiser l’ADN résulterait dans l’apparition rapide de mutations dans le matériel génétique de l’organisme à cause de l’incapacité de l’ARN polymérase à corriger les erreurs survenues lors de la transcription. Ceci explique entre autre pourquoi certains virus à ARN (p.ex. HIV) possèdent un taux de mutation très élevé et peuvent ainsi échapper à plusieurs formes traditionnelles de thérapie anti-virale. 6.18.ARNm et transcription. La courte demi-vie des ARNm permet 1) de se débarrasser rapidement de transcrits ayant subi des mutations, et 2) de réguler rapidement l’expression des gènes. En effet, l’arrêt de la transcription d’un gène sera suivie rapidement de la dégradation complète des ARNm correspondants, assurant ainsi un arrêt rapide de la synthèse de la protéine encodée par ce gène. 6.19. ARNm et transcription. a) La vitesse maximale de transcription étant de 4,300 nucléotides par minute (70 nucléotides par seconde x 60 secondes), un gène de 6,000 pb sera alors transcrit en approximativement 1.4 minutes. 63 b) Étant donné que 70 pb sont couvertes par chaque molécule d’ARN polymérase, on aura qu’un maximum de 86 molécules de polymérase pourront se retrouver attaché à ce gène à un instant donné. 6.20.Codage des protéines. a) À l'aide du code génétique, on a la séquence en acides aminés suivante: AGU CUC UGU CUC CAU UUG AAG AAG GGG AAG GGG Ser - Leu - Cys - Leu - His - Leu - Lys - Lys - Gly - Lys - Gly b) Le résultat des mutations sera: G AGU GCU CUG UCU CCA UUU GAA GAA GGG AAG GGG Ser - Ala - Leu - Ser - Pro - Phe - Glu - Glu - Gly - Lys - Gly 6.21. Codage des protéines. a) Commençons par convertir la séquence en acides aminés du type sauvage en séquence en nucléotides: - Tyr - Lys - Ser - Pro - Ser - Leu - Asn - Ala - Ala - Lys A UAU - AAA - UCX - CCX - UCX - UUG - AAC - GCX - GCX - AAG C G - AGU - AGU - CUX U A C C Convertissons maintenant la séquence en acides aminés du mutant en séquence en nucléotides: - Val - His - His - Leu - Met - GUX - CAU - CAU - UUA - AUG C C G - CUX Le mutant n'a donc pas pu être formé par une seule mutation: on a besoin d'une mutation pour changer la séquence sauvage en séquence mutante, et d'une seconde mutation pour faire l'opération inverse (i.e. mutant à sauvage). Si l'on étudie attentivement les séquences sauvages et mutantes, on s'aperçoit que la séquence mutante peut être obtenue suite à la délétion de la septième base de la séquence sauvage (i.e. le A du codon AGU de Ser). On obtient effectivement: 64 Sauvage: Délétion: A UCX - CCX - UCX - UUG - AAC AGU - AGU - CUX U C C GU - CCX - UCX - UUX - AAU C La lecture du délétant nous donne donc les codons suivants: GUC - CXU- CXU - UAA - AU C G C En remplaçant les X par A, on constate que cette séquence correspond à celle du mutant: GUC - CAU - CAU - UUA - AUVal - His - His - Leu Enfin, l'insertion d'un G à la fin de cette séquence nous donne le dernier codon (AUG/Met) et replace le cadre de lecture à son état original. b) La séquence en bases de l'ARNm qui code pour les cinq acides aminés du type sauvage qui sont différents dans le mutant est: AGU - CCA - UCA - CUU – AAU-G délétion insertion 6.22. Codage des protéines. a) Commençons par écrire la séquence fournie sous la forme d'ADN double brin: 5' TCGTTTACGATCCCCATTTCGTACTCGA 3' 3' AGCAAATGCTAGGGGTAAAGCATGAGCT 5' La séquence du brin complémentaire est donc: 5' TCGAGTACGAAATGGGGATCGTAAACGA 3' b) la séquence en bases de l'ARN transcrit à partir du brin fourni sera identique à celle du brin complémentaire, à l'exception près de la présence d'uracile à la place de thymine: 5' UCGAGUACGAAAUGGGGAUCGUAAACGA 3' 65 c) La séquence en acides aminés est obtenue en séparant d'abord la séquence de l'ARNm en codons: 5' UCG AGU ACG AAA UGG GGA UCG UAA ACG A 3' Ser-Ser-Thr-Lys-Trp-Gly-Ser-Stop d) La délétion du second T de l'extrémité 3' du DNA nous donne la séquence en nucléotides suivante: T 5' TCG TTT ACG ATC CCC ATT TCG ACT CGA 3' La séquence en ARNm nous donne: 5' UCG AGU CGA AAU GGG GAU CGU AAA CGA 3' Et la traduction de cette séquence nous donne: Ser-Ser-Arg-Asn-Gly-Asp-Arg-Lys-Arg 6.23. Génie génétique. L’enzyme EcoR I coupe uniquement de la manière suivante : GAATTC CTTAAG G CTTAA + AATTC G Dans le fragment en question, il n’existe qu’un seul site de reconnaissance pour l’enzyme EcoR I, ce qui donnera, suite à la digestion avec cette enzyme, les fragments suivants : 5’ 3’ ATGCTCGATCGATCG3’ TACGAGCTAGCTAGCTTAA5’ 5’ + AATTCTATAGCCCGGGCTGGATCCAGGTACCAAGTTAAGCTTG3’ 3’ GATATCGGGCCCCGACCTAGGTCCATGGTTCAATTCGAAC5’ 6.24. Génie génétique. L’enzyme BamH I coupe uniquement de la manière suivante : GGATCC CCTAGG G CCTAG + GATCC G Dans le fragment en question, il n’existe qu’un seul site de reconnaissance pour l’enzyme BamH I, ce qui donnera, suite à la digestion avec cette enzyme, les fragments suivants : 66 5’ ATGCTCGATCGATCGAATTCTATAGCCCGGGGCTG3’ 3’ TACGAGCTAGCTAGCTTAAGATATCGGGCCCCGACCTAG5’ + 5’ 3’ GATCCAGGTACCAAGTTAAGCTTG3’ GTCCATGGTTCAATTCGAAC5’ 6.25. Génie génétique. L’enzyme Sma I coupe uniquement de la manière suivante : CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC + Dans le fragment en question, il n’existe qu’un seul site de reconnaissance pour l’enzyme Sma I, ce qui donnera, suite à la digestion avec cette enzyme, les fragments suivants : 5’ ATGCTCGATCGATCGAATTCTATAGCCC3’ 3’ TACGAGCTAGCTAGCTTAAGATATCGGG5’ + 5’ GGGGCTGGATCCAGGTACCAAGTTAAGCTTG3’ 3’ CCCCGACCTAGGTCCATGGTTCAATTCGAAC5’ 6.26. Génie génétique. L’enzyme Kpn I coupe uniquement de la manière suivante : GGTACC CCATGG GGTAC C + C CATGG Quant à l’enzyme Hind III, il ne coupe que de la façon suivante : AAGCTT TTCGAA A TTCGA + AGCTT A Dans le fragment en question, il n’existe qu’un seul site de reconnaissance pour chacun de ces enzymes, ce qui donnera les fragments suivants : 67 5’ ATGCTCGATCGATCGAATTCTATAGCCCGGGGCTGGATCCAGGTAC3’ 3’ TACGAGCTAGCTAGCTTAAGATATCGGGCCCCGACCTAGGTC5’ + 5’ CAAGTTA3’ 3’ CATGGTTCAATTCG5’ + 5’ 3’ 3’ AGCTTG AC5’ 6.27. Génie génétique. a) Afin de déterminer la longueur des fragments de restriction obtenus, nous devons tout d’abord dessiner le graphe du log de la longueur des molécules standard en fonction de la distance migrée. Ce graphe est donné ci-dessous. 4.5 4.3 4.1 Log longueur 3.9 3.7 3.5 3.3 y = -0.4529x + 5.8731 3.1 2.9 2.7 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 Distance migrée (cm) 6 6.5 7 Ensuite, grâce à ce graphe, il est facile de déterminer, par la distance migrée par les différents 68 fragments de restriction, quelle sera leur longueur. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau suivant : Fragment 1 2 3 4 5 6 Apa I (pb) 48,500 10,085 Pvu I (pb) 48,500 35,790 26,250 11,930 BamH I (pb) 48,500 41,730 34,500 27,920 22,345 5,505 b) Comme une seule des extrémités 5’ est marquée radioactivement, la longueur des fragments de restriction visualisés en autoradiographie nous donne la distance entre l’extrémité marquée et le site de restriction. De plus, comme les conditions expérimentales résultent en une digestion partielle de l’ADN, on obtiendra un mélange de fragments de longueur différente pour les enzymes coupant plus qu’une fois : la longueur de chaque fragment indiquera alors la position (toujours par rapport à l’extrémité 5’ marquée) d’un des sites de restriction de l’enzyme. Ainsi, pour l’enzyme Apa I, l’obtention de fragments de 10,085 pb et de 48,500 pb indique que Apa I ne coupe qu’une seule fois à une distance de 10,085 pb en 3’ de l’extrémité marquée. Grâce à ce raisonnement, on peut obtenir la carte de restriction suivante : BamHI ApaI PvuI BamHI PvuI BamHI BamHI PvuI 69 BamHI 48500 41730 35970 34500 26250 27920 22345 11930 10085 5505 Bout marqué radioactivement
