Microbiologie BIOL 3253 La croissance Croissance - la scissiparité Croissance Augmentation des constituants cellulaires qui peut aboutir à: Accroissement du nombre de cellules. i.e., Quand les micro-organismes se multiplient par scissiparité ou par bourgeonnement. Accroissement de la taille de la cellule. i.e., Les micro-organismes coenocytiques (multinucléés) peuvent subir des divisions nucléaires sans divisions cellulaires concomitantes. Les microbiologistes étudient habituellement des variations numériques (croissance) sur la totalité de la population plutôt que chez des microorganismes pris individuellement. La courbe de croissance Lorsque des micro-organismes sont cultivés en milieu liquide, ils se développent habituellement dans un système fermé, culture en “batch” ou discontinue. Ils sont incubés dans un flacon contenant un seul lot de milieu de culture. Représenté graphiquement comme le logarithme du nombre de cellules en fonction du temps d’incubation. La courbe résultante est constituée de quatre phases distinctes. La courbe de croissance microbienne dans un système fermé Arrêt de la croissance Divisions à un Taux maximal Pas d’augmentation Diminution du nombre de cellules 1- La phase de latence Synthèse de nouveaux composants cellulaires. i.e., Synthèse de substances utilisées ou épuisées. i.e., Adaptation à un nouveau milieu ou de nouvelles conditions. La durée varie selon les micro-organismes et la nature du milieu. Dans certains cas, cette phase peut être très courte ou absente. 2- La phase exponentielle Aussi appelée logarithmique. Chaque organisme se divise à un moment légèrement différent. Vitesse de coissance constante. La population est presque uniforme en termes de propriétés chimiques et physiologiques. Croissance en équlibre et équilibre instable Durant la phase exponentielle, les cellules sont en croissance à l’équilibre. Tous les constituants cellulaires sont synthétisés à des vitesses constantes par rapport aux autres. Un changement des concentrations en nutriment ou des conditions de culture provoque une croissance en équilibre instable. La vitesse de synthèse des composants cellulaires varie. Changements dans le milieu de culture “shift-up” (Changement d’un milieu pauvre à riche) “shift-down” (Changement d’un milieu riche à pauvre) Concentration des nutriments et croissance 3- La phase stationnaire Le nombre total de micro-organismes viables demeure constant. Peut résulter d’un arrêt de reproduction chez des cullules métaboliquement actives. Peut résulter d’un équilibre entre division et mort cellulaire. Principales raisons pour entrer en phase stationnaire: Limitation en éléments nutritifs. Disponibilité limitée en oxygène. Accumulation de déchets toxiques. La population atteint une densité critique. Réponses au manque de nourriture Changements morphologiques i.e., Formation d’endospores. Diminution de taille, rétrécissement du protoplasme, et condensation du nucléoïde. Production de protéines de manque. Survie à long terme. Augmentation de la virulence. 4- La phase de mortalité Les cellules meurent à un rythme exponentiel. Perte irréversible de la capacité à se reproduire. Dans certains cas, le taux de mortalité diminue dû à une accumulation de cellules résistantes. Différentes hypothèses existent pour expliquer la cinétique de la mortalité: Les mathématiques de la croissance Temps de génération ou de doublement (g) Temps nécessaire pour qu’une population microbienne double sa taille. Constante de vitesse de croissance moyenne (k) Nombre de génération par unité de temps. Généralement exprimé par le nombre de génération par heure. Temps de génération et vitesse de croissance Mesure de la croissance microbienne On peut mesurer un changement du nombre de cellules d’une population. On peut mesurer un changement de la masse cellulaire. Mesure du nombre de cellules Comptage direct Chambre de comptage. Compteurs électroniques. Décompte direct sur des membranes filtrantes. Décomptes de cellules viables Étalement sur un milieu solide. Décompte sur membranes filtrantes déposées sur milieu gélosé. Chambres de comptage Faciles à utiliser, peu coûteuses, et rapides. Pratique pour dénombrer des eucaryotes ou des procaryotes. Ne peut pas distinguer entre des cellules vivantes ou mortes. Compteurs électroniques Une suspension bactérienne doit passer au travers d’un orifice, où un courant électrique est appliqué. Le mouvement de cellules au travers de l’orifice modifie (augmente) la résistance électrique. Ne peut pas distinguer entre des cellules vivantes ou mortes. Facile et rapide à utiliser. Utile pour des micro-organismes de grande taille ou des cellules sanguines, mais pas pour des procaryotes. Décompte direct sur des membranes filtrantes Les cellules sont filtrées sur une membrane spéciale (polycarbonate) qui possède un fond foncé. Les cellules sont ensuite colorées avec des colorants fluorescents. Pratique pour dénombrer des bactéries. En utilisant certains colorants, il est possible de distinguer entre des cellules vivantes et mortes. Étalement sur milieu solide Mesure le nombre de cellules viables. La taille de la population est exprimée en termes d’unités formatrices de colonies (UFC) (ang. colony forming units ou CFU) Des dilutions d’une population sont étalées sur un milieu solide adéquat Le nombre de colonies est compté Le nombre de cellules dans la population est déterminé Étalement sur milieu solide Simple et précis. Largement utilisé pour effectuer des décomptes viables de micro-organismes présents dans des aliments, dans l’eau ou le sol. Les résultats peuvent être imprécis si des agrégats de cellules sont mal distribués. Décompte sur membranes filtrantes déposées sur milieu gélosé Particulièrement utile pour étudier des échantillons auqatiques Mesure de la masse cellulaire Poids sec Quantité de certains constituants cellulaires Technique peu sensible et longue à effectuer. i.e., protéines, ADN, ATP, ou chlorophylle. Utile si la quantité d’une substance est constante dans chaque cellule d’une population. Mesure de la turbidité (dispersion de la lumière incidente) Rapide, facile et précis. Turbidité et mesure de la masse cellulaire Plus de cellules Plus de dispersion de la lumière Moins de lumière détectée (↑absorbance) Dénombrement de procaryotes végétatifs viables mais non cultivables Les micro-organismes en situation de stress peuvent temporairement perdre leur habilité à croître et être non détectables si on utilise des méthodes dépendantes de la culture. Plusieurs techniques moléculaires permettent maintenant de détecter et dénombrer des cellules viables mais non cultivables. La culture continue des micro-organismes Culture dans un système ouvert Approvisionnement constant en nutriments. Les déchets sont également retirés à un rhythme constant. Maintient la croissance des cellule dans la phase exponentielle et à une concentration constante de la biomasse. Ces conditions sont réalisées en laboratoire dans des systèmes de culture continue. Le chémostat Rythme d’introduction du milieu stérile = rythme d’élimination du milieu. Un élément nutritif essentiel est fournit en quantités limitées (i.e. un acide aminé). Vitesse de dilution et croissance microbienne Vitesse de dilution Vitesse à laquelle le milieu passe au travers de la chambre de culture par rapport au volume de la cuve. La densité cellulaire reste inchangée pour une large gamme de vitesse de dilution. Le chémostat fonctionne de façon optimale à une vitesse de diltion faible. Le turbidostat La vitesse d’écoulement du milieu au travers de la cuve est automatiquement réglée pour maintenir une turbidité ou densité cellulaire prédeterminée. La vitesse de dilution varie. Pas d’élément nutritif limitant. Les turbidostats fonctionnent mieux à des vitesses de dilution élevées. Importance des méthodes de culture continue Utiles car elles produisent une quantité constante de cellules en phase exponentielle tout en se multipliant à une vitesse connue. Permet d’étudier la croissance microbienne en présence de concentrations de nutriments faibles, ce qui est similaire aux conditions rencontrées en milieux naturels. Permet l’étude d’interactions microbiennes sous des conditions similaires à celles rencontrées dans des milieux aquatiques. Très utilisées en microbiologie alimentaire et industrielle. L’influence de l’environnement sur la croissance La croissance des micro-organismes est considérablement influencée par la nature chimique et physique de l’environnement. Extrêmophiles Se développent sous des conditions difficiles qui empêchent la croissance de la plupart des autres organismes. Les solutés et l’activité de l’eau Activité de l’eau (aw) Disponibilité de l’eau exprimée de façon quantitative. Réduite par des interactions avec des molécules de solutés (effet osmotique). [soluté] élevée faible aw Réduite par l’absorption sur des surfaces (effet matrice). L’activité de l’eau est inversement proportionnelle à la pression osmotique. L’activité de l’eau et la croissance microbienne Les organismes osmotolérants Peuvent croître sous une très large gamme d’activités de l’eau ou de concentrations osmotiques. Peuvent utiliser des solutés compatibles afin d’augmenter leur concentration osmotique interne. Ces solutés sont compatibles avec le métabolisme et la croissance. Certains de ces organismes possèdent des protéines et membranes qui nécessitent des concentrations élevées en solutés pour maintenir leur stabilité et activité. Halophiles Nécessitent une concentration élevée en NaCl pour croître. Les effets du chlorure sodique sur la croissance microbienne Le pH Définit comme le logarithme négatif de la concentration en ions hydrogène. Le pH Acidophiles Croissance optimum entre pH 0 et pH 5.5. Neutrophiles Croissance optimum entre pH 5.5 et pH 8.5. Alcalophiles Croissance optimum entre pH 8.5 et pH 11.5. La plupart des acidophiles et des alcalophiles maintiennent un pH interne près de la neutralité. Certains utilisent des mécanismes d’échange de protons/ions. Certains synthétisent des protéines qui fournissent une protection. i.e., protéines du choc acide. Plusieurs micro-organismes peuvent altérer le pH de leur environnement en produisants des déchets acides ou alcalins. La plupart des milieux de culture possèdent des tampons pour prévenir l’inhibition de croissance. Température La croissance de chaque organisme dépend des températures dites cardinales minimale maximale optimale Température La concentration en oxygène Besoin d’oxygène Aérobie obligatoire Préfère l’oxygène Anaérobie facultatif Ignore l’oxygène Anaérobie aérotolérant L’oxygène est toxique Anaérobie strict Requiert 2 - 10% d’oxygène Microaérophile Les bases des différentes réponses à l’oxygène L’oxygène est facilement réduit en produits toxiques Radical superoxyde Peroxyde d’hydrogène Radical hydroxyle Les aérobies produisent des enzymes de protection Superoxide dismutase (SOD) Catalase L’oxygène et la croissance bactérienne La croissance des anérobies Approches possibles: Milieu anaérobie spécial contenant des agents réducteurs comme le thioglycolate ou la cystéine. On enlève l’air à l’aide d’une pompe à vide et on expulse l’O2 résiduel avec de l’azote. Système Gas Pak ou sacs de plastiques (systèmes scellés). De l’hydrogène et de l’anhydride carbonique sont produits par une enveloppe Gas Pak. Un catalyseur contenant du palladium catalyse la formation d’eau à partir d’hydrogène et d’oxygène, éliminant ainsi l’oxygène du contenant scellé. Le système Gas Pak La pression Organismes barotolérants Affectés de façon défavorable par une augmentation de pression, mais pas autant que les bactéries non tolérantes. Organismes barophiles Croissance plus rapide à des pressions élevées. Les radiations Dommages causés par des radiations Les radiations ionisantes Rayons X et gamma. Mutations mort. Modifient la structure chimique de différentes molécules, incluant l’ADN. Dommages causés par des radiations La lumière ultraviolette (UV) Mutations mort Engendre la formation de dimères de thymine au niveau de l’ADN. Les dommages au niveau de l’ADN peuvent parfois être réparés par des mécanismes: Photoréactivation – Les dimères sont clivés en présence de lumière. Réaction à l’obscurité – Les dimères sont excisés et remplacés en absence de lumière. La croissance microbienne dans des environnements naturels L’environnement des micro-organismes est complexe et en perpétuel changement. Dans un endroit particulier, les microorganismes sont exposés à de nombreux gradients chevauchants de nutriments et d’autres facteurs du milieu. Limitation de la croissance par des facteurs environnementaux Loi du minimum de Leibig La biomasse totale d’un organisme sera déterminée par l’élément nutritif présent en moindre quantité par rapport aux exigences de l’organisme. Loi de tolérance de Shelford Il y a des limites dans les facteurs environnementaux au-dessous et au-dessus desquelles un organisme ne peut survivre et se développer quelque soit l’apport en nutriment. Les biofilms Communautés complexes de micro-organismes enveloppés dans un mucus. Une fois fixés, les micro-organismes commencent à libérer des polysaccharides, des protéines et de l’ADN qui permettent aux cellules d’adhérer de manière plus stable à la surface. La communication intercellulaire dans les populations microbiennes