Les récepteurs

Physiologie du SN et GE
M. Pichon
Semestre 6
Mode d’action des hormones
I.
Caractéristique du récepteur
1234-
Interaction rapide avec le ligand spécifique
Spécificité de l’interaction avec le ligan
Réversibilité de l’interaction
Saturabilité
Ces expériences sont faites avec un ligand radioactif, incubées avec un ligand non radioactif, en
quantité très supérieure. Par soustraction, on peut obtenir la fixation spécifique. Quand on a 50% de
la fixation totale, avec la concentration de fixation totale, on a le KD, qui s’exprime en M, alors que KA
s’exprime en M-1
II.
Les différents types de récepteurs
2 grandes catégories de récepteurs :
-
Les récepteurs membranaires
Les récepteurs cytosoliques et/ou nucléaires
A.
Les récepteurs membranaires
Il y en a de plusieurs types :
-
Les canaux ioniques régulés par la fixation d’un ligand
Les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque : tyrosine kinase, sérine kinase,
phosphatase, guanylyl cyclase
Les récepteurs couplés aux protéines G trimériques
Les récepteurs associés à des transducteurs intracellulaires : récepteurs des cytokines (II, INF,
TNF…)
1
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B.
M. Pichon
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Les récepteurs cytosoliques et/ou nucléaires
Les ligands sont :
-
-
Des structures stéroïdes : hormone thyroïdienne, acide rétinoïque (proche de la vitamine A,
en ajoutant un alcool, le rétinol, que peut être transformé en aldéhyde, le rétinal, qui peut
être oxydé et donner l’acide rétinoïque, le ligand actif)
La vitamine D3, prohormone pour le calcitriol, aussi appelé 1,25-dihydroxycholécalciférol. La
vitamine D3 est aussi appelée le cholécalciférol.
On va surtout utiliser les récepteurs stéroïdes. Comment a-t-on mis en évidence ces récepteur ? Au
début des années 50, il a été montré que de l’œstradiol tritié était séquestré dans des organes
spécifiques. De plus, l’interaction de l’œstradiol avec le tissu cible était réversible. La concentration
en hormone décroit jusqu’à des concentrations négligeables en quelques heures. On a alors pu
montrer par autoradiographie que l’hormone se trouvait pratiquement exclusivement dans le noyau
des cellules cibles. C’était le cas pour toutes les hormones stéroïdiennes. Cette localisation de
l’hormone et du récepteur de l’hormone est quelque chose qui a été très longuement débattu. La
localisation du récepteur est différente suivant si l’hormone est présente ou absente. En absent
d’hormone, la majorité des récepteurs peut être extraite des cellules par des tampons de faible force
ionique, ce qui a suggéré que les récepteurs étaient intracytoplasmiques. En présence d’hormone, le
récepteur n’est plus présent dans la partie soluble, mais lié fortement au noyau. On a alors postulé le
phénomène de translocation du récepteur dans le noyau en présence d’hormone.
Les récepteurs (en particulier de l’œstradiol et de la progestérone) étaient particulièrement localisés
dans le noyau, que l’hormone soit présente ou absente. Ce qui prévaut maintenant, c’est que la plus
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grande partie des récepteurs des hormones stéroïdiennes, sont initialement localisées dans le noyau
où ils sont faiblement associés avec les constituants cellulaires. On peut alors les extraire facilement
avec des tampons de faible force ionique. Ces récepteurs ont été appelés récepteurs cytosoliques.
L’affinité des récepteurs pour les composants nucléaires augmente considérablement en présence
d’hormone, il faut une plus forte force ionique, on les a appelé récepteurs nucléaires. Dans tous les
cas, le complexe hormone stéroïdienne-récepteur
est présente dans le noyau et il interagit
fortement avec l’ADN nucléaire. Dans le cas des
hormones thyroïdiennes et du calcitriol, les
récepteurs
sont
apparemment
toujours
nucléaires. Dans toutes les espèces de vertébrés,
et dans tous les organes cibles, les récepteurs dits
cytosoliques de l’œstrogène, de la progestérone,
de l’androstérone, des glucocorticoïdes, des
minéralocorticoïdes, tous ont une masse
moléculaire de l’ordre de 300 000 Da, avec un
coefficient de sédimentation de l’ordre de 8 à 10
S, ceci lorsqu’ils sont isolés en absence de ligand.
Ce sont les formes lourdes. Cette forme est un
complexe protéique qui contient une ou 2
molécules de récepteurs associés avec 2
molécules d’une protéine de 90 000 Da, appelée
HSP90, avec en plus des protéines chaperonnes
associées dans ce complexe.
Quand l’hormone se fixe sur le récepteur, il entraine un changement de conformation qui démasque
un site de fixation à l’ADN. C’est la forme légère avec une conformation de 4 S. Ceci va interagir avec
les HRE (Hormone Response Element).
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La forme lourde cytosolique, quand l’hormone déplace HSP90, devient légère, et on a dimérisation
du complexe, et l’homodimère permet alors l’association avec le HRE et l’ADN en se transloquant.
Quelle est la structure plus précise de ce dimère, et celle qui permet la reconnaissance spécifique du
HRE ?
III.
Structure des récepteurs
A.
Région de fixation à l’ADN
La purification et l’étude structurale des récepteurs et molécules hydrophobes, et le clonage des
récepteurs a permis de mettre en évidence des structurales importantes, et on a pu caractériser
plusieurs domaines fonctionnels, avec une région responsable de la fixation à l’ADN. Tous les
récepteurs sont caractérisés par une région riche en cystéine et en arginine-lysine. Elle définit le
domaine de fixation à l’ADN, le DBD (DNA binding domain) qui contient environ 70 acides aminés, et
approximativement placé au milieu du peptide. Cette région a une séquence particulièrement bien
conservée, qui est dite en doigts à zinc. On a 2 atomes de zinc chélatés avec deux cystéines.
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Du coté C-ter de chaque doigt à zinc, on a une hélice α. Ces deux hélices α, dans l’espace, sont dans
une position en croix l’une par rapport à l’autre.
Certains acides aminés de la première hélice α sont responsables de la fixation à HRE (ceux qui sont
numérotés sur les schémas). Par exemple, en prenant un récepteur des hormones œstrogènes, aux
acides aminés 25, 26 et 29, on a respectivement Glu, Gly et Ala. Si on substitue au même endroit ces
acides aminés par les acides aminés Gly, Ser et Val, correspondant au récepteur des glucocorticoïdes
(GRE), il ne reconnait plus l’ERE, mais le GRE. Ces 3 acides aminés suffisent pour reconnaitre
l’élément spécifique au niveau de l’ADN.
Qu’est-ce qui est reconnu au niveau de l’ADN ?
ERE :
AGGTCAXXXTGACCT
GRE :
AGAACAXXXTGTTCT
Ce sont ces domaines qui vont permettre la reconnaissance du récepteur :
Il va aussi régler l’espacement des deux récepteurs, et donc la reconnaissance des demi-séquences
au niveau de l’ADN. On peut montrer l’importance de ce domaine D dans la dimérisation et le réglage
de l’écartement de l’hélice α de ce monomère. En changeant de domaine D de récepteur aux
œstrogènes par un domaine D de l’hormone thyroïdienne T3, sous l’action d’œstrogènes, ce
récepteur ER + DT3R va reconnaitre les séquences HRE de T3.
ERE :
AGGTCAXXXTGACCT
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T3RE : AGGTCATGACCT
Les séquences inversées sont des palindromes dans la plupart des cas. On peut également avoir des
palindromes inversés.
B.
Région de fixation à l’hormone
Elle se fait dans la région C-ter du récepteur, fait environ 250 acides
aminés et se trouve environ 50 acides aminés après le DBD. Il y a
beaucoup de résidus hydrophobes qui feront des interactions
hydrophobes avec l’hormone. On a deux types de structure présents.
L’ensemble forme une poche hydrophobe. Pour une même hormone
dans différentes espèces, l’homologie de séquence est de 90 à 95% dans
cette séquence, mais beaucoup plus faible (de 10 à 20%) pour des
hormones différentes.
C.
L’extrémité N-ter
Cette région présente peu d’homologie entre les différents
récepteurs, peut avoir des tailles très variables, on ne sait pas
vraiment à quoi elle sert, mais elle aiderait à la fixation du
récepteur sur les séquences HRE. Elle peut aussi participer à
l’activation de co-activateurs.
Tout ça fait que tous ces récepteurs ont la même structure globale, consensus de ces récepteurs :
6
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N-ter
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Hinge
Hinge
DBD
A
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B
C
C-ter
LBD
D
70 acides
aminés
E
F
250 acides
aminés
Hinge : région charnière
Pour une même hormone dans différentes espèces :
A/B : 50-90%
C : 100%
D/E : 90-99%
Pour 2 hormones différentes :
A/B : 0-50%
C : 40-90%
D/E : 5-30%
On fabrique des récepteurs chimériques :
GRN
DBD
LBD
C
GRE
G
RAR
C
RARE
RA
C
GRE
RA
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Au début des années 90 on a mis en évidence les récepteurs PPAR (Peroxysome proliferatioractivated receptor). Il s’associe avec les récepteurs de l’acide rétinoique. C’est le ligand des dirivés
des acides gras, notamment l’acide arachdonique, métabolisé en leucotriène ou prostaglandine. La
transcription de gène est sous la dépendance de lignands.
Le fonctionnement diffère dans α et dans β/γ. Les ligands viennent de l’acide arachidonique C20 : 4.
Del’acide arachidonique dérive le HETE (hydroxyeicosatetranoic acid). A partir de l’acide linoléique
C28 : 2, on forme les hydroxyoctadécadénoic acide HODE.
A partir de β-γ et en absence de ligand, le PPAR sont capables de se lier à PPRE, et répriment les
gènes sous la dépendance de PPRE. En présence de ligand, tous les récepteurs PPAR, le co-répresseur
est dissocié et remplacé par un co-activateur, qui activ les gènes sous la dépendance de PPRE.
IV.
Les récepteurs membranaires
A.
Récepteurs à activité enzymatique – Exemple : le récepteur à
insuline
Ils sont présents chez tous les types cellulaires, mais leur nombre peut être extrêmement variable. Il
peut y avoir 40 récepteurs sur les érythrocytes, et 200 000 sur les adipocytes.
Ce récepteur sous forme tétramérique est synthétisé sous
forme d’un seul polypeptide. On a donc un pro-récepteur
formé d’une seule chaine polypeptidique qui correspond à
1355 acides aminés. Il est ensuite clivé au niveau de résidus
basiques, pour donner d’un coté la sous-unité α (côté N-ter),
et de l’autre la sous-unité β (côté C-ter). Si bien que quand on
parle des acides aminés, aussi bien côté α que côté β, on
prend l’ordre du pro-récepteur. Donc α commence à 1 et fini
à 735, et la β commence à 735 et fini à 1355.
La masse globale du récepteur est de 300 à 400 kDa, la sousunité α comprend 735 acides aminés, ce qui fait 130 kDa, la
sous-unité β contient 620 acides aminés, ce qui fait 95 kDa.
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Le récepteur lui-même peut être phosphorylé
B.
Phosphorylation du récepteur
Il peut être phosphorylé sur des tyrosines. L’activité catalytique
des sous-unités β est normalement inhibée quand la sous-unité α
n’est pas occupée par l’insuline. On peut, dans certains cas,
couper α par des protéolyses, et on lève alors l’inhibition de la
tyrosine-kinase de la sous-unité β. On obtient le même résultat
en faisant des délétions du coté α. L’activité kinase portée par β
est probablement activée de façon similaire à l’activité TK du
récepteur EGF. On peut construire des récepteurs chimériques,
en prenant un domaine extracellulaire correspondant au
récepteur EGF, et qui va être couplé à la sous-unité β d’un
récepteur à insuline. L’activité kinase peut alors être mise en
route par la fixation d’EGF.
On peut avoir une activité TK permanente, et donc un récepteur
actif en permanence, il suffit pour cela de remplacer la valine en position 664 par un glutamate. Ce
récepteur constitutivement actif correspond à un oncogène, ou un proto-oncogène C-erb-2.
Le récepteur peut s’auto-phosphoryler, et il y a au moins 8 résidus tyrosine qui peuvent le faire, ils
sont répartis dans l’extrémité C-ter de la sous-unité β. Cette autophosphorylation de la sous-unité β
est un phénomène que l’on appelle trans-actif. La fixation de l’insuline sur l’une des sous-unités α
entraine l’activation de la β de gauche, qui va alors phosphoryler les résidus Tyr du β de droite. On a
pu montrer que l’autophosphorylation de 3 Tyr de la région régulatrice de β stimule l’activité kinase
et l’augmente de 10 à 20 fois. Inversement, si on mute successivement ces 3 tyrosines, on réduit
progressivement l’activité kinase, et parallèlement à cette baisse d’activité, on entraine une perte
progressive de l’activité tyrosine kinase. Ces trois Tyr sont en position 1146, 1150 et 1151.
--- YXXXYY---Il existe aussi dans la région juxta-membranaire une tyrosine 960, qui est dans une séquence
spécifique Asn-Pro-X-Y960. Si on la remplace par une Phe ou une Ala, on annihile complètement l’effet
de l’insuline. Pourtant, l’activité TK est conservée. Lorsqu’elle est remplacée, le récepteur à activité
TK ne peut plus phosphoryler des substrats endogènes, du coté cytosolique. Cette séquence
spécifique est importante pour la sélection du substrat endogène, et on peut montrer ça avec des
récepteurs EGF ou PDGF, qui n’ont pas cette séquence, et donc ne phosphorylent pas les mêmes
substrats endogènes que le récepteur à insuline.
La région cytosolique de β peut aussi être phosphorylée par des résidus Ser/Thr, la phosphorylation
des sous-unités β sur les résidus Ser et Thr va modifier l’activité TK du récepteur. Dans certains cas,
cette phosphorylation va entrainer une baisse de la TK, ce qui va entrainer un phénomène de
résistance à l’insuline. Ca intervient donc dans le traitement de certains diabètes.
1.
Substrats endogènes du récepteur
Une protéine cytosolique de 185 kDa a été détectée dans les cellules d’hépatome, stimulée par
l’insuline, à l’aide d’un anticorps anti-phosphotyrosine. Cette protéine est fondamentale dans la
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cascade d’évènements déclenchée par l’insuline. Cette protéine est IRS, insuline receptor substrate.
Comme c’était la première, on l’a appelée IRS-1.
Sur cette protéine endogène, il y a 21 sites potentiels de phosphorylation sur une tyrosine. En plus,
on a pu mettre en évidence une trentaine de sites qui sont potentiellement phosphorylables par des
kinases. La fonction de cette protéine peut être régulée de façon très variée. Parmis les 21 sites Tyr
phosphorylables, il y a au moins 8 Tyr phosphorylés par le récepteur à insuline.
Une des particularités de ces phosphotyrosines est d’être reconnue par d’autres protéines qui ont
des domaines SH2. Ils ont été mis en évidence sur une autre protéine, appelée pp60Src. C’était une
protéine qui était activée dans le cas de Sarcome, en particulier dans le Sarcome de Rous. SH2 = Src
Homology domain 2.
Les sites d’homologie reconnaissent les phosphotyrosines et peuvent s’y associer. D’autres domaines
sont également impliqués, souvent avec les domaines SH2, ce sont les domaines SH3, qui ne
reconnaissent pas des phosphotyrosines, mais de la proline. Ceci forme alors des conformations
particulières.
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Sur IRS, se fixent plusieurs protéines à domaine SH2.
On trouve aussi les protéines LCK, SHPTP-2…
// Voir structure
Notons le γ de la PLCγ-1.
On retrouve des protéines à activité, et des protéines d’adaptation, sans activité.
Toutes ces protéines à domaine SH2, sont théoriquement capables de s’associer à des protéines à
domaine phosphorylé. Sur IRS1, on aura association à différentes protéines, notamment la PI3’K.
Chaque domaine SH2 s’associe avec une tyrosine différente. En général, il faut 2 domaines SH2 pour
que l’on ait une stabilisation.
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Les SH3 stabilisent l’interaction entre ces 2 protéines.
// image « Activation of a Src-like protein kinase… », « three dimensional structure of an SH2
domain… ».
Quand on a eu phosphorylation d’IRS-1, plusieurs domaines seront activés. Que se passe-t-il
ensuite ?
2.
Transduction du signal en aval de IRS-1
a)
PI3-K
C’est une kinase capable de phosphoryler le phosphatidylinositol sur l’inositol en position 3’.
L’important est le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, qui va être reconnue par des protéines
qui sont des protéines à domaine PH (Plecstrin Homology). Elle était connue et mise en évidence
dans les plaquettes (Platelet), dans les leucocytes (leukocyte), à séquence particulière, les KSTR (LysSer-Thr-Arg). Cette protéine a un domaine PH, et on retrouve par exemple la PKB, protéine kinase B.
Il existe une autre protéine à domaines plecstrine, qui est une PDK (Phosphatidylinositol Dependant
Kinase).
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Ces deux protéines reconnaissent le PtdInst-3,4,5-PPP et vont le phosphoryler PKB sur 2 résidus Thr
et Ser, et on a alors régulation de la transcription, de la synthèse de glycogène, de la survie et du
cycle de la cellule.
La PI3’K a été divisée en 3 classes. Les domaines SH2 ne sont présents que dans la classe 1. On y
trouve 2 cas, 2 sous-unités, l’une régulatrice, la p85α et l’autre p110α, effectrice.
On a pu montrer de façon précise l’interaction de p85α et β avec IRS-1. L’association entre p85 et
IRS-1 est inhibée par des peptides qui vont contenir différentes tyrosines phosphorylés. Ces peptides
doivent contenir la séquence YMXM, du coté C-ter. Il faut pour cela que la tyrosine soit
phosphorylée. On a pu montrer qu’il y avait 4 tyrosines impliquées ici, Y608MPM, Y939MNM, Y987MTM,
Y460ICM. D’un autre coté, toujours en faisant des peptides synthétiques et p85α + p110, on a une
activation de la sous-unité catalytique p110. Cette PI3’K peut être activée par un grand nombre de
stimuli extracellulaires, et on peut alors avoir différents types de réponses de la cellule. Ce qui est
intéressant de noter, c’est que dans cette voie de signalisation, on a action sur le métabolisme du
glucose, de différentes façon, et en particulier l’action de l’insuline par l’intermédiaire de la
transduction du signal va aller agir sur le recrutement de transporteurs du glucose, localisés dans des
vésicules intracytosoliques. Quand on a le signal approprié, ces vésicules qui contiennent des
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transporteurs glucoses, ils sont inclus, si bien que l’insuline favorise l’entrée dans la cellule du
glucose.
b)
Grb2
C’est une protéine de 217 acides aminés chez l’homme, qui contient un domaine SH2 et 2 domaines
SH3, et qui se fixe sur la tyrosine 895 au niveau de IRS-1. Grb2 = Growth factor receptor bound 2. Elle
va servir d’adaptateur entre IRS-1 et une autre protéine qui est appelée mSOS (mamalian SOS, Son Of
Sevenless, mis en évidence chez la drosophile, d’où le m).
GDP
IRS-1
P
Grb2
Ras
mSOS
GTP
Ras-GTP va aller activer une autre kinase, raf, qui est une Ser-Thr kinase. De raf, on a une cascade de
phosphorylations, qui va aboutir à l’activation soit de facteurs de transcription (noyau), soit de
phosphoprotéine-phosphatase qui vont pouvoir déphosphoryler leurs substrats spécifiques.
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α
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α
β
IRS-1
IRS-1
A finir
Elle va activer la glycogène phosphorylase, la phosphorylase kinase, et la glycogène synthase.
// Manque un bout
Au final, on a donc synthèse de glycogène, à partir du glucose sanguin. Donc l’insuline est bien une
hormone hypoglycémiante.
Pour passer de l’insuline à ISPK, on a attendu 40 ans, pour savoir comment l’insuline stimulait ISPK.
La MAPK phosphorylée, va pouvoir agir sur ISPK, et sur le noyaux, pour réguler l’expression des
gènes. Il n’y a pas que l’insuline qui peut les activer. MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase. On
peut les regrouper sous un terme plus général, on trouve les MEK et les ERK. Les MEK correspondent
aux MAPKK et les ERK aux MAPK. MEK = Mitogen Extracellular activated Kinase. ERK = Extracellular
Regulated Kinase.
// Schéma avec les 2 voies de signalisation
C.
Autres récepteurs
1.
Voie des ommatidies de drosophile
2.
Voie de différenciation vulvaire de C. elegans
3.
Action de EGF ou de NGF/FGF sur des cellules d’origine nerveuse : les
phéochromocytomes (PC12)
Les phéochromocytomes sont des tumeurs de la médulla de la glande surrénale. C’est la partie de la
glande qui synthétise et sécrète les catécholamines en général.
Quand on traite ces cellules avec NGF ou FGF, on a une différenciation des cellules PC12 qui se
produit, avec différenciation des neurites, et un arrêt de la prolifération cellulaire. Par contre, si on
traite ces mêmes cellules avec EGF, on a prolifération, mais pas de différenciation. Les 3 facteurs
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aboutissent dans les deux cas à l’activation de Ras. Dans le cas de la stimulation par NGF, on a une
activation persistante de Ras-GTP. Avec EGF, on a une activation transitoire de Ras-GTP. D’autre part,
les interactions dans la cascade de transduction du signal sont différentes, dans le cas d’EGF :
Dans le cas de NGF :
16
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Pour FGF :
V.
GPCR
G protein Coupled Receptor. Ils lient les GTP et GDP, qui sont trimériques. C’est un récepteur
membranaire. La protéine G trimérique de couplage, et en aval une molécule effectrice, par exemple
l’adényl cyclase, les phospholipases Cβ, la phosphodiestérase, les canaux ioniques.
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A.
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Les récepteurs
C’est une catégorie qui est probablement la plus répandue dans le règne vivant, aussi bien chez les
animaux que chez les plantes. En ce qui concerne les animaux, on a une diversité extrêmement
importante de ces récepteurs. Chez l’homme, on a mis en évidence plus de 1000 gènes capables de
coder des récepteurs couplés aux protéines trimériques. Ces récepteurs ont des ligands très variés,
ça peut être des photons, mais aussi des molécules impliquées dans l’olfaction ou encore dans la
sensation gustative. Des petites molécules peuvent aussi être ligands, les acides aminés, les amines,
les polyamines, les nucléosides, les leucotryènes… Dans cette catégorie de petites molécules, on
trouve les catécholamines (adrénaline, noradrénaline, épinéphrine). Comme dans d’autres ligands,
on trouve des peptides et polypeptides. Il y a donc une grande diversité, aussi bien en nature qu’en
taille.
On estime actuellement que 80% des messages primaires actuellement connus exercent leur action
par l’intermédiaire de ces récepteurs. Dans ce système, l’information apportée par le messager
primaire va transiter par les molécules trimériques, et les molécules effectrices.
Extracellulaire
Intracellulaire/
cytosolique
membranaire
Message
primaire
Récepteur
Protéine G
trimérique
E
Messager 2nd
40
80
20
61
2
cAMP, DAG, Ips3, Ca2+,
cGMP, aa
On trouve des récepteurs adrénergiques (Isoproterenal) β (β1, 2 et 3) et α (α1 et 2), muscariniques
M1 à M5, et sérotonine 5-HT (5-hydroxytryptamine).
C’est le cas des récepteurs de la vasopressine, des opiacés (enképhaline, endorphine, dynorphine).
Les protéines G trimériques sont regroupées en 4 familles. Ce sont les protéines effectrices, il y en a 6
à 12. Quelle est la structure des récepteurs couplés aux protéines trimériques ? Ils ont tous la même
structure globale, à 7 domaines transmembranaires :
Du coté intracellulaire on a des sites de
phosphorylation. Certains de ces récepteurs, du coté
intracellulaire, sont encrés dans la membrane, par
encrage palmitoyle, grâce à un acide palmitique C16. Ce
n’est pas le cas de tous les récepteurs.
Il y a aussi des ponts S-S entre la boucle 2 et la 4.
La βARK est une enzyme qui permet de former des sites
de phosphorylation.
C’est suite à l’étude de nombreux récepteurs qui ont été
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clonés, purifiés, séquencés, qui venaient de différentes origines et de différents ligands, et on a
comparé en particulier la séquence de différents récepteurs avec la séquence de différentes
protéines qui étaient la bactériorhodopsine. Elle se trouve dans une bactérie photosynthétique
(Halobacterium halobium), qui est chez elle une pompe à protons membranaires. Elle est
extrêmement bien représentée chez cette bactérie. On a pu la purifier en masse, la cristalliser, et
avoir sa structure tridimentionelle. Cette bactérie est formée d’un seul polypeptide
transmembranaire, et elle présente 7 domaines transmembranaires. La structure tridimentionnelle
de cette bactérie était parfaitement bien connue.
En comparant la séquence des récepteurs avec la séquence de cette bactérie, on en a déduit que les
récepteurs avaient cette structure.
Jusqu’à maintenant, on n’a jamais montré formellement que les récepteurs avaient cette structure.
B.
Les familles de GPCR
D’après les séquences et leurs homologies, on peut différencier 6 familles, dont trois principales :
1.
Famille 1
Chez ces récepteurs, on trouve les ligands des molécules olfactives, gustatives, des catécholamines,
des amines (petits ligands), mais aussi des plus gros ligands, des peptides avec des hormones
glycoprotéiques, ce que fait que dans cette famille, on a fait 3 sous familles.
a)
1a
Ce sont les récepteurs de petits ligands. Le site d’interaction est situé entre les hélices au sein de la
membrane.
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b)
1b
Ce sont les récepteurs des neuropeptides, des hormones peptidiques, de cytokines, de PAF, de la
thrombine. Ces ligands interagissent avec l’extrémité N-terminale, les boucles extracellulaires 1 et 2
et la partie supérieure des hélices 2 à 5.
Thrombine
N
Ext
Int
C
PAR
C
N
Ext
Int
C
c)
1c
20
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2.
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Famille 2
// Manque un bout
Il n’y a pas de séquence DM. Les ligands sont des hhormones peptidiques comme le glucagon, la PTH,
la calcitonine, le GnRH, le CRF.
3.
Famille 3
Elle est à part, le domaine extracellulaire est très important, très structuré. Le domaine C-ter est
aussi très important. La troisième boucle intracellulaire est très courte, il n’y a pas d’encrage par les
palmitoyles. C’est vraiment la structure extracellulaire qui est caractéristique, comparée à la feuille
modifiée de la plante carnivore appelée Dionée, Venus Fly Trap.
Les ligands sont le calcium extracellulaire, le
GABA-B, les métabotrophiques du glutamate.
Ces récepteurs n’agissent que sous forme
dimérique. Il nous semble aujourd’hui que les
autres familles font la même chose.
C.
Oligomérisation des GPCR
Tous ces récepteurs peuvent s’associer avec d’autres récepteurs, former des oligomères. Quand ce
sont 2 fois les mêmes, ce sont des homo-oligomères. Il y a d’autres récepteurs qui peuvent former
des hétéro-oligomères, quand les 2 sont différents.
Si on a une coopération négative entre les récepteurs, ceci peut avoir un rôle dans la
désensibilisation du récepteur. Au contraire, avec un seul agoniste, on peut avoir une activation des
récepteurs adjacents, et dès le récepteur, on aura amplification du signal.
Si on utilise deux récepteurs de la somatostatine (SST1B), qui ont comme ligand soit la somatostatine
14, soit la somatostatine 28 (SST14 ou SST28), on peut muter un des deux récepteurs pour qu’il ne lie
21
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Semestre 6
plus. On peut prendre un autre récepteur somatostatine, muté également, qui n’est plus couplé à
l’adényl-cyclase. En présence de somatostatine, on aura production d’AMPc.
Autre exemple :
(GABA)B(1) qui n’a pas de couplage à la protéine G. (GABA)B(2) qui n’a pas de ligand. Quand les deux
sont présents, on a une réponse cellulaire par transactivation, la liaison du ligand sur le 1 permet au 2
de donner la réponse cellulaire.
Une autre fonction de cette oligomérisation est le transport. Les protéines membranaires destinées à
être exportées sont, depuis le RE, co-transportées avec d’autres protéines membranaires, ce qui
permet aux protéines membranaires d’arriver à la membrane, même en cas de problème pour l’une
d’elles.
Dans le cas de la mucoviscidose, le canal chlore, CFTR, est un canal adressé à la membrane
intestinale. Des récepteurs mutés ne sont plus adressés à la membrane, bien qu’ils soient
synthétisés. Par contre, si on fait surexprimer une protéine associée à ce CFTR, on permet d’accorder
le transport, et donc aux cellules de fonctionner plus normalement. Ce co-transport semble être un
phénomène général.
Les ligands peuvent pour certains être des ligands bivalents. Par exemple : l’endothéline (ET-1) peut
agir sur les récepteurs ETA et ETB. Les cellules de l’hypophyse antérieure expriment les deux
molécules à la fois. ET-1 se fixe simultanément sur ETA et ETB. Il peut donc induire la différenciation
du dimère ou le stabiliser s’il est déjà formé. On a deux récepteurs différents. C’est intéressant du
point de vue pharmacologique, car on va pouvoir créer des ligands dimériques, homo ou hétéro.
La création de médicaments dimériques avait déjà été réalisée, et on avait montré que leur action
était plus efficace que celle des monomériques. On a des exemples de cette action accrue : c’est le
cas d’un ligand de 5-HT1. Un ligand dimérique a 700 fois plus d’affinité pour le récepteur 5-HT1B. On
peut donc diminuer la dose. D’autre part, on augmente la sélectivité du ligand. Il est sélectif pour les
5-HT1B et les 5-HT1D, alors que le monomérique reconnait tous les 5-HT1. On a utilisé cela pour le
Sumatripan®, médicament qui permet de soigner les migraines chroniques, en se fixant aux 5-HT1B.
En en faisant un dimère, l’affinité a été multipliée par 100.
Par dimérisation, on peut aussi changer la sélectivité du ligand. C’est le cas d’un antagoniste opioïde,
le monomère n’est pas sélectif. Le dimère avec une distance courte entre les deux monomères, ce
ligand devient exclusivement sélectif pour les opioïdes κ, et si on augmente la distance, on perd la
sélectivité.
VI.
Les protéines G trimériques
A.
Fonctionnement des protéines G trimériques
Il y a 3 sous-unités : α, β et γ.
La sous-unité α sert à fixer le X de GXP. Quand le récepteur sera activer, on aura une association
étroite entre le récepteur et la protéine G trimérique. On change ainsi la conformation de la protéine
G trimérique, notamment α, qui libère le GDP. Le GTP prend alors la place du GDP. On a alors une
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protéine G-GTP, ce qui entraine une dissociation α-GTP et β-γ. α-GTP est la forme active, qui a une
action sur une protéine effectrice. La liaison β-γ est très forte et s’associe sur d’autres protéines
effectrices.
Il faut que le retour à l’état basal se fasse. La sous-unité α a une activité GTPase, dégrade le GTP,
dissocie α et la protéine effectrice, qui se retrouve seule, et α se retrouve de nouveau liée à GDP. αGDP va alors se lier à β-γ, qui s’est séparé de la protéine effectrice, et on revient au stade du départ.
Le temps d’hydrolyse du GTP en GDP est très important. Si l’activité GTPase est très importante, la
demi-vie de GTP sera courte. Donc par cette activité, on régule aussi bien l’activité du GTP que celle
de β-γ lié. Le régulateur de cette activité est RGS (Regulator of G Signaling).
B.
Les familles des protéines G trimériques.
On a 4 grands groupes, suivant la sous-unité α. On a de ce fait 4 types de sous-unité α :
-
αS : activation (anticorps I à IX, canaux Ca2+, Na+, Cl-)
αi/0 : effet inhibiteur (anticorps II, III, V et VI). Il active des canaux potassiques mais inhibe les
canaux Ca2+, Na+, Clαq/11 : augmente les PLC β1, 2 et 3
α12/13 : augmente l’activité des petites protéines G
Le couple β-γ est un inhibiteur de l’ACI, activateur de l’ACII et IV, des PLC β1, 2 et 3, des canaux…
Le complexe Gβγ libre peut agir comme une molécule signal elle-même, en activant d'autres
messagers secondaires ou en commandant directement des canaux ioniques. Par exemple, le
complexe Gβγ, quand il est lié à un récepteur histaminique, peut activer la phospholipase A2. Les
complexes Gβγ liés à des récepteurs muscariniques - acetylcholine, d'un autre côté, ouvrent
directement les canaux GIRK (canaux à courant potassique rectifiant activé par les protéines G).
On connait 16 gènes différents qui codent les sous-unités α, et la diversité est augmentée par des
coupures alternatives. On a donc de grandes quantités d’isotopes. La masse des ces sous-unités va de
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40000 à 45000 Daltons. La plupart de ces sous-unités α est exprimé dans des tissus. Il y a quelques
exceptions où une sous-unité α est spécifique d’un tissu. αt n’est exprimé que dans les cellules
rétiniennes. αolf et αgust ne se retrouvent que dans les cellules olfactives et gustatives. α16 ne se
retrouve que dans le système hématopoïétique, et α0 ne se retrouve que dans le SNC.
Il y a 2 grands domaines dans la sous-unité α :
-
un domaine à GTPase
un site d’interaction avec le récepteur
Le domaine GTPase a aussi une interaction avec le domaine β. La sous-unité α est par là en
interaction avec la molécule effectrice. Le domaine hα est lié au domaine GTPase par un linker, elle
permet un changement de conformation.
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Sous l’action d’un récepteur, les deux domaines modifient leur position relative de façon à faire sortir
le GDP et entrer le GTP.
L’interaction avec βγ se fait par l’intermédiaire d’une hélice qui correspond à l’extrémité N-ter de α
et de β, mais aussi par l’hélice α2. Une cistéine peut être pontée avec β, si la sous-unité α est proche.
L’interaction de la sous-unité α avec la cellule effectrice (E) se fait aussi avec α2, ceci recouvre
partiellement la zone d’interaction avec βγ, donc il est possible que α ne puisse fixer les deux en
même temps.
L’interaction avec le récepteur se fait à l’extrémité C-ter, on peut le montrer en modifiant l’extrémité
C-ter, en remplaçant les 3 acides aminés terminaux qui correspondent à αQ, et qu’on les remplace
par αi, on obtient une αQ modifiée, qui va se lier à des récepteurs à αi. Il n’y a pas que cette extrémité
qui est spécifique de cette interaction, des sous-unités α différentes à αQ identique interagissent avec
des récepteurs différents, et donc il y a un autre site de liaison.
La structure βγ : On connait 6 gènes codant pour β, elle a une masse relativement homogène. Il y a
12 gènes codant la sous-unité γ, d’une masse beaucoup plus petite, en dessous de 10 kDa. On a
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logiquement 72 couples possibles, mais on est très loin du compte, toutes les paires ne sont pas
possibles, la sous-unité β1 peut s’associer à γ1 et γ2, alors que β2 ne peut s’associer qu’à γ2. On a
normalement 1152 trimères avec α, mais on n’en a identifié qu’une vingtaine.
La structure de β : on a une hélice α du coté N-ter, puis une région qui comprend 7 domaines WD : ils
sont composés de 43 résidus d’acides aminés :
Tyr – 7…11 – [Gly – His – X23…41 – WD] – N4-8
Boucle variable
Région constante
La sous-unité γ : On trouve une hélice α.
Les sous-unités β et γ sont étroitement associées en N-ter, et la partie C-ter de γ est en interaction
avec WD, mais en opposition de α.
Les sous-unités α et γ subissent une modification post-traductionnelle, c’est une méristoylation par
l’acide miristique C14 avec l’extrémité N-ter de α, sur une glycine. C’est une liaison stable, irréversible.
Il y a aussi une palmitoylation, par l’acide palmitoique. Toutes les sous-unités α sont palmitoylées au
moins une fois. C’est un thioester instable qui en est responsable, c’est réversible, régulé.
Les sous-unités γ sont isoprénilées par un polymère de l’isoprényl.
Isoprène
3 isoprènes = farnésyl (C15)
4 isoprènes = géranyl-géranyl (C20)
Ils se fixent sur :
Ce sont des thioester stables.
-------CAAX
Si X = Ser, Met, Gln ou Ala
 Farnésyl
Si X = Leu
 Géranyl-géranyl
sur le C
VII. Désensibilisation et internalisation
Quand un agoniste agit sur son récepteur spécifique, on a immédiatement l’initiation de 2 processus
opposés. On a l’activation de la voie de signalisation propre au récepteur, et quasiment en même
temps une désensibilisation du système de transduction. Celle-ci entraine une diminution de la
réponse cellulaire à l’agoniste. Elle peut aller jusqu’à l’annulation de la réponse. Dans le cas de cette
désensibilisation, l’effet physiologique est aboli, la cellule est incapable de poursuivre cette réponse.
Elle peut résulter d’un effet au niveau du récepteur lui-même avec des couplages entre le récepteur
et la protéine G, une internalisation des récepteurs dans des endosomes précoces (séquestration),
ou encore une dégradation des récepteurs dans les lysosomes. On peut également avoir
désensibilisation par effet sur la protéine G trimérique, et enfin par action sur la voie de signalisation
en aval du système de récepteurs de la protéine G trimérique.
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A.
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Désensibilisation rapide
De l’ordre de la seconde ou la minute. Elle est contrôlée par phosphorylation qui peut être contrôlée
par des protéines kinases qui peuvent être activées par des protéines secondaires (AMPc pour PKA),
ou par le calcium par exemple pour PKC. D’autres protéines kinases, comme GRK, le sont par GPCR.
La phosphorylation des récepteurs par PKA ou PKC va entrainer un découplage entre le récepteur et
la protéine G trimérique. Cette phosphorylation va entrainer une désensibilisation homologue, on a
activation par exemple d’une PKA qui va phosphoryler son propre récepteur, ce qui entraine le
découplage.
PKA et PKC sont également responsables de la désensibilisation hétérologue, les protéines vont aller
phosphoryler les sites d’un autre type de récepteur.
La phosphorylation par PKA dans le cas des récepteur β2 adrénergiques, on a découplage du
récepteur β2AR d’avec GS mais aussi couplage du β2AR avec Gi. Ceci permet de mettre en route une
autre voie de signalisation qui va passer par ERK/MAPK. Pour les récepteur à prostacycline, on a des
Switch entre Gs, Gi et Gq.
Les protéines qui sont spécifiques de GPCR (les GRK) ont un mécanisme très général, il implique un
couple GRK/arrestine (protéine d’adaptation). Ce système concerne uniquement la désensibilisation
homologue. En effet, la protéine kinase GRK ne peut phosphoryler que le complexe agonisterécepteur (contrairement à la désensibilisation hétérologue). Une fois que la phosphorylation est
faite, le récepteur est reconnu par l’arrestine, ce qui conduit à un empêchement stérique qui inhibe
toute interaction du récepteur avec la protéine G. Ces kinases GRK sont en fait une famille de
protéines codées par 7 gènes, on a :
-
Les GRK 1 et 7 que l’on trouve uniquement au niveau des bâtonnets et des cônes
(respectivement)
Les GRK 4 que l’on trouve dans le cervelet, les reins et les testicules
GRK 2, 3, 5 et 6 se retrouve quasiment partout
On les a divisés en 3 sous-familles du point de vue structural :
-
La première regroupe GRK 1 et 7
La deuxième regroupe GRK 2 (β-ARK) et 3 qui ont un domaine PH (plecstrin homology)
La troisième regroupe GRK 4, 5 et 6, ils sont associés à la membrane de façon constitutive
Plusieurs facteurs vont influencer la PK, la conformation du récepteur avec une activation
allostérique, l’association de GRK avec la membrane. Par exemple, GRK 2 et GRK 3 s’associent avec
βγ qui a une isoprénilation. GRK 1 s’associe avec γ qui possède un farnésyl. GRK 4 et 6 sont
palmitoylés, et donc associés de façon permanente à la membrane. L’activité des GRK peut aussi être
modifiée par phosphorylation, soit par PKA, soit par PKC.
L’arrestine (aussi appelé β-arrestine) est codée par 4 gènes, deux arrestines sont spécifiques des
bâtonnets (arrestine 1 et 4) et 2 autres (β-arrestine 1 = arrestine 2 et β-arrestine 2 = arrestine 3) sont
ubiquitaires.
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Semestre 6
Manque début de paragraphe. La déphosphorylation nécessite l’internalisation du récepteur. Il est
alors soit sécrété dans les endosomes, soit dégradé par les lysosomes. Pour ce routage, la β-arrestine
est impliquée, elle va choisir la cible du routage.
Cette internalisation/séquestration se passe suivant plusieurs possibilités, l’internalisation du
récepteur phosphorylé avec l’arrestine a deux choix :
-
Dans l’endosome, il y a déphosphorylation et peut être rapidement recyclé
Dans l’endosome tardif, soit :
o Déphosphorylé et recyclé lentement
o Dans le lysosome, dégradé, c’est une rétro-régulation
B.
Désensibilisation lente
On peut également avoir une régulation au niveau de la transcription ou de la traduction des
récepteurs. C’est un processus de désensibilisation qui va être prolongé, qui peut prendre plusieurs
heures. Elle comprend la désensibilisation qui passe par les lysosomes.
On peut aussi avoir une désensibilisation qui se fait au niveau de la voie du signal, c’est le cas de
l’implication d’une famille de protéines appelée RGS (Regulator of G protein Signal). C’est une famille
de protéine qui a une activité GAP (GTPase Activating Protein) spécifique pour les protéines G
trimériques. Il existe une famille d’au moins 25 membres de ces RGS, toutes contiennent un domaine
particulier appelé domaine GRS, qui comprend environ 130 résidus d’acides aminés. Ces protéines
RGS ont une spécificité plus ou moins stricte pour G et pour R.
Si on accélère la vitesse d’hydrolyse du GTP et ainsi la désactivation de α, une fois que la stimulation
du récepteur a cessé. Si la stimulation continue, on a une diminution de la réponse physiologique.
La régulation par le RGS est relativement complexe et on a un degré de compléxité du fait de la
redondance de ces RGS dans un même tissu. Dans le cœur on connait 10 RGS différentes. Il est
difficile de leur attribuer chacune une fonction.
Dans ce système, le récepteur et l’agoniste vont fonctionner comme une protéine d’échange, un GEF,
on aura le GDP qui sera remplacé par le GTP. Puis RGS et GAP vont désactiver par augmentation de
l’hydrolyse du GTP en GDP.
L’internalisation du récepteur est un point important dans la régulation de son activité.
C.
Internalisation du récepteur GPCR
Quand l’agoniste se fixe sur le récepteur, on a stimulation, désensibilisation, et redistribution des
récepteurs. Comme on l’a vu, cette internalisation permet dans certains cas la re-sensibilisation du
récepteur grâce à une re-phosphorylation. En plus, cette internalisation permet l’activation d’autres
voies de signalisation. Cette internalisation peut se faire grâce à des domaines comportant des
cavéolines et du cholestérol, les domaines cavéolés, ils font partie des radeaux lipidiques. Ce sont des
invaginations membranaires et des agents qui détruisent ces zones membranaires empêchent
l’internalisation du récepteur. On a un exemple avec l’endoténine et le récepteur VIP. Plusieurs
protéines G et différentes adényl-cyclases sont localisés dans ces domaines. On a donc les
récepteurs, les protéines G, les adényl-cyclases, tous les acteurs nécessaires pour contrôler une voie
de signalisation.
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Semestre 6
L’internalisation peut aussi se faire par des vésicules à clathrines, les CCV, dépendants de l’arrestine.
Après la fixation agoniste-récepteur, les GRK vont phosphoryler le récepteur, permettre le
recrutement de l’arrestine, qui permet à son tour le recrutement de protéines impliquées dans la
régulation, notamment la chaine lourde de la clathrine, et la sous-unité β-2 adaptine, sous-unité de la
protéine d’adaptation AP2.
Ensuite, le bourgeonnement, l’agrandissement de ce puits permet l’activation de la dynamine, à
activité GTPase, on ferme le puits et on forme la vésicule. Le manteau est alors démantelé, on aura
une vésicule non mantelée, et envoyée dans les endosomes et ribosomes.
C’est l’arrestine qui permet le routage différenciel, elle va servir d’adaptateur pour d’autres
protéines cytosoliques, et en particulier pour ses c-Src, qui vont phosphoryler les dynamines et
réguler la formation de la CCV par phosphorylation.
La β-arrestine va également contrôler l’internalisation du récepteur et son intégration par un
mécanisme qui comprend une ubiquitination. L’ubiquitine est ici impliquée dans le routage des
récepteurs, et la β-arrestine 2 interagit avec une protéine appelée l’ubiquitine ligase et l’arrestine va
permettre l’ubiquitilation des récepteurs β-2 adrénergiques, en agissant sur l’ubiquitine ligase, qui
sera ubiquitinilée.
La β-arrestine agit aussi avec d’autres acteurs du routage vésiculaire, et en particulier avec NSF et
avec la protéine ARF (petite protéine G). Ces 2 facteurs permettent le recrutement des protéines
COPs, impliquées dans le trafic intracellulaire.
L’arrestine va jouer le rôle de plate-forme, de protéine d’adaptation pour d’autres systèmes, d’autres
protéines qui permettent de mettre en route d’autres voies de signalisation, qui vont passer par un
chemin qui n’implique pas les protéines G trimériques. Donc sous certaines conditions, des
récepteurs aux protéines G trimériques peuvent mettre en route des voies de signalisation qui
n’impliquent pas ces protéines G trimériques.
Cette voie d’internalisation dépend des récepteurs, par exemple par protéolyse, par récepteur de
chémo-attractant, ou des récepteurs de β-2 adrénergiques…
D.
Un exemple de protéine effectrice : l’adényl-cyclase
C’est une protéine transmembranaire à 2 grands domaines transmembranaires comprenant 6
domaines transmembranaires. C’est une famille de protéines.
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βγ a une activité sur les adényl-cyclases.
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