L1-09-10-Molecule-TD3 Ionisation AA correction

LV1 Module-Molécules de la vie
Travaux Dirigés n°3
Ionisation des Acides Aminés.
CORRECTION
Par commodité, les valeurs de pKa des différentes fonctions ionisables sont les suivantes
pour l'ensemble des exercices:
 COOH :
2,3 (tous)
 NH3+ :
8,9 (tous)
Phénol (noyau-OH):
 COOH :
3,9 (Asp)
NH3+ :
10,5 (Lys)
Imidazole (à dessiner) : 6,5
 COOH
4,2 (Glu)
Thiol (SH):
8,0 (Cys)
Guanidinium (à dessiner): 12
:
10,0
EXERCICE 1
Combien de polypeptide différent de 61 résidus peut on former en utilisant les 20
acides aminés naturels. 2061(soit environ le nombre d’atome dans l’univers étant estimé à
1080)
EXERCICE 2
Un mélange des acides aminés suivant est soumis à une électrophorèse sur papier à pH 3.9
et à pH 10.
Ala, Arg, Glu, Ser, Phe, Asp, Leu et His.
1) Quels acides aminés migreront vers la cathode (-), vers l’anode (+) ?
A pH 3.9.
Ne migrent pas – Ala, Ser, Phe, Leu,
Vers la cathode – Arg, His (migre aussi loin car loin du pKa)
Vers l’Anode – Asp (chargé à 50%) Glu (chargé à moins de 50% donc migre moins loin)
A pH 10.
Ne migrent pas – Arg
Vers la cathode –-aucun
Vers l’Anode –Ala ser Phe Leu, His ,Asp (2x+loin) et Glu(2xplus loin)
2) Avec cette fois ci un mélange Ala, Glu, Val, Lys et Thr à pH = 6. Faire le profil de
séparation sur papier après coloration à la ninhydrine. Indiquer l’anode, la cathode,
l’origine et la position de tous les acides aminés
( la ninhydrine colore les acides aminé en réagissant avec la fonction -amine libre)
Lys
Cathod
e
Ala,Val
Thr
Glu
Anod
e
EXERCICE 3
Les acides aminés peuvent occasionnellement servir de tampon. Un tampon est
une solution qui résiste aux changements de pH lorsqu’un acide ou une base sont ajouté. La
zone de pH pour laquelle un tampon est actif se défini habituellement comme pKa +1 à
pKa-1.
1) Indiquer les zones tampon de Gly, Asp et Lys.
Ils sont tous tampon entre 1.3-3.3 et 7.9-9.9 (chaînes n et c term) auxquelles il faut rajouter
2.9-4.9 pour Asp (donc 1.3-4.9 zone tampon basse) et 9.5-11.5 pour Lys (donc 7.9-11.5
zone tampon haute)
2) Choisir un acide aminé pour tamponner une solution à pH = 4, pH = 6, pH = 9 et
pH = 11
pH=4 c’est Asp, pH=6 aucun (ou His si on a le choix), pH=9 tous, pH 11 c’est Lys
3) Vous attendez vous à ce qu’un protéine contenant 100 acides aminés sont un aussi
bon tampon que le mélange de ses constituants a une concentration molaire
équivalente ? Expliquez pourquoi.
Non le mélange des constituants est plus efficace car 100 fois plus de chaînes n et c libres
donc susceptible d’échanger des protons et de tamponner le milieu
EXERCICE 4
Chaque groupement ionisable d'un acide aminé a deux états d'ionisation possibles : chargé
et non chargé.
1. Ecrire les différents états d'ionisation des amino-acides suivants: Gly, Glu, His, Pro, Tyr,
Cys, Lys.
2. Déterminer leur charge nette pour chaque forme d'ionisation.
3. Calculer la valeur du point isoélectrique (PI) de ces acides aminés en rappelant la
formule utilisée.
4. Calculer la fraction qui est neutre, anionique et cationique pour ces acides aminés à pH
7,0 (seulement si celle çi est présente à plus de 1% soit un pH+/- 2 par rapport au pKa).
Démontrer la formule utilisée.
5. Indiquer quel est l'état d'ionisation majoritaire pour chaque acide aminé à pH 1, pH 4,
pH=pI, et pH 10.
Leur monter sur le premier ce qu’on attend d’eux .Je leur fait représenter que les fonctions
protonables. Puis je leur dis de partir d’un pH le plus acide possible, de faire l’état
d’ionisation puis d’imaginer que le pH monte et qu’ils fassent à chaque passage de pKa la
transition et le nouvel état d’ionisation. Soit
Gly
NH3+---------COOH
Charge + 1
2.9
NH3+ -------- COO0
8.9
NH2-------COO-1
pI = (2.9+8.9 )/2 = 5.9
Leur faire comprendre grâce à la formule d’Henderson Hasselbach que lorsque le pH est
éloigné de plus de 2 unités pH du pKa la forme qui est de l’autre côté devient présente à
moins de 1% et que pour simplifier les calculs on peut donc la négliger…
A pH 7 il faudra donc ici tenir contre d’un seul équilibre, celui à 8.9; deux formes seront
présente de manière significative (+ de 1%) forme 0 et forme -1,
pH = pKa + log (forme-1/forme0) 10^(7-8.9) = forme-1 / forme 0 =0.0129 si l’on met
forme -1 + forme 0 = 100% donc forme -1 = 1.3% et forme 0 = 98.7%
forme majoritaire pH 1 = forme +1, pH 4= forme 0, pH=pI=5.9= forme 0, pH 10 =
forme -1
Pour un acide aminé qui possède une chaîne latérale protonable c’est plus complexe
Glu
NH3+--------COOH 2.3 NH3+--------COO- 4.2 NH3+---------COO- 8.9 NH2-----COOCOOH
COOH
COOCOO+1
0
-1
-2
pI =(2.3+4.2)/2=3.25
calcul idem forme -2 = 1.3% forme -1 = 98.7% etc
His
C’est plus compliqué de calculer le pourcentage des formes car à pH 7 il y a 3 formes qui
sont présente a plus de 1%,
+2
2.3
+1
6.5
0
8.9
-1
Ici +1,0 et -1
Pour faire les calculs il faut faire une équation par équilibre soit
7 = 6.5 + log (forme 0 / forme +1) et 7 = 8.9 + log (forme -1/forme 0)
Avec forme 0+forme +1 + forme -1 = 100% on a 3 équations 3 inconnus on peut donc
résoudre et on trouve +1 = 24% 0=75% et -1 = 1%
EXERCICE 5
1)
2- pI = 3,1
3- Les équilibres de dissociation sont : P+ <=> Po <=> P- <=> P2Au départ, le peptide 0.1 M est en solution à pH 1 : il est sous un mélange de forme Po et de
formeP+ . Pour calculer la concentration de chacune des 2 formes à pH 1, on applique la
formule de Henderson-Hasselbach : pH = pKa + log [base] /[acide].
1 = 2,3 + log [Po] / [P+]
[Po] / [P+] = 0.05
[Po] + [P+] = 0.1
[Po] = 0.005 M
[P+] = 0.095 M
5- Au point isoélectrique, on a un mélange de forme P-, P+ et P0 selon la relation :
3,1 = 2,3 + log [P0] / [P+]
3,1 = 3,9 + log [P-] / [P0]
[0] + [P+] + [P-] = 100%
100,8 = [Po] / [P+]
10-0,8 = [P-] / [Po]
[Po] ( 1 + 1 / 100,8 + 10-0,8 ) = 100%
[Po] = 75%
[P-] = 12,5%
[P+] = 12,5%
Donc pour une concentration de 0,1 M totale, on a :
[P+] = 0,0125 M
[Po] = 0,075 M
[P-] = 0,0125 M
Il faut donc passer de :
[P+] = 0,088 M
[Po] = 0,012 M
[-] = 0 M
A une concentration finale de :
[P+] = 0,0125 M
[Po] = 0,075 M
[P-] = 0,0125 M
En ajoutant de la soude NaOH, qui va transformer P+ en P0 et P0 en P-.
Il faut donc rajouter une quantité de NaOH de : (0,075 – 0,012) + (0,0125 x 2) = 0,088 mol.
4- Si le peptide est au pI, il est sous forme Po. Titrer complètement les fonctions acide consiste
donc à le faire passer sous la forme P2- en ajoutant NaOH. Il faut pour cela ajouter 0.2 mol +
0,088 mol de NaOH = 0.288 mol de NaOH.
6-7- La fonction acide C-terminale est transformée en ester méthylique par addition de
méthanol. Le pI de l'aspartame est égal à 6.62.
EXERCICE 6
A partir d’une solution contenant 0.1 mole d’Alanine ajustée à pH = 0.5 avec de
l’acide hydrochlorique (HCl), vous rajouter progressivement une forte base, la soude
(NaOH).
Dessiner la courbe de titration (abscisse = moles de NaOH, ordonnée = pH)
montrant toute les inflexions. Pour vous aider à la tracer calculer précisément plusieurs
point remarquable de cette courbe (pH= pKa-1, pH = pKa et pH = pKa+1).
Ala : pKa 2.3 et 8.9 Donc à pH=
1.3 = 2.3 + log (A-/AH) avec AH+A-=0.1 mole donc
A- = 0.01 mole (soit H+ liberé = 0.01 mole) donc il
a fallu ajouter OH- = 0.01mole donc pour pH 2.3
=> 0.05 3.3 => 0.09 7.9 => 0.11 8.9 => 0.15
9.9 => 0.19
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0.05
0.1
0.15
EXERCICE 7
Un analyseur d'amino-acides est un appareil qui permet de séparer les acides
aminés par chromatographie d'échange d'ions et de déterminer leur rapport molaire. La
résine échangeuse de cations utilisée comporte des billes de polystyrène contenant des
groupements sulfonates (SO3- ) covalement liés aux noyaux phényls. Deux types majeurs
d'effets sont utilisés pour séparer les arnino-acides : interactions électrostatiques avec le
groupement SO3- et interactions hydrophobes avec le noyau phényl apolaire.
Sachant que le pH de la colonne est maintenu à pH 7,0 à l'aide d'un tampon approprié, quel
sera l'ordre d'élution pour les couples d'acides aminés suivants: Asp/Lys, Arg/Met,
Gly/Leu, Tyr/Phe, et Lys/His ?
A pH 7
Asp -1 et Lys +1 donc Lys s’accroche et Asp sort un premier
Arg +1 et Met non chargé donc Arg s’accroche et Met sort en premier
Gly et Leu non chargé aucun s’accroche mais leucine plus hydrophobe donc sort après Gly
Tyr et Phe non chargé mais Phe plus hydrophobe (pas groupement polaire comme Tyr) donc Tyr
sort en premier
Lys et His ;; Lys entierement chargé his partiellement chargé Lys s’accroche beaucoup mieux que
His
EXERCICE 8
1-2)
3- Calculer le pI :
pI est le pH où existe la forme P(0). C'est la 1/2 somme des pKa qui entourent la forme P(0) dans les
équilibres de dissociation.
pI = 1/2 (10.5 + 12) = 11.25
4- La charge nette du peptide à pH =7 :
A pH =7, il y a co-existence des formes P(2+) et P(+) avec prédominance de la forme P(2+).
La charge électrique sera comprise entre +2 et +3/2.
5- Coupure par la trypsine et la chymotrypsine.
La trypsine est une protéase (endopeptidase) qui coupe au niveau du -CO de Arg ou Lys (après Arg
ou Lys dans la séquence). Dans ce tetrapeptide, il y a 2 sites de coupure pour la trypsine.
Il n'y a pas de site de coupure pour la chymotrypsine, endopeptidase qui coupe les chaînes après les
acides aminés aromatiques.
6- Les histones sont associées à l'ADN par des interactions ioniques. L'ADN est une macromolécule
chargée négativement à pH 7 (pH intracellulaire). Les histones sont des protéines chargées
positivement à pH 7 (question précédente).