Régulation hormonale à court terme de la glycémie chez le

Régulation hormonale à
court terme de la
glycémie chez le Rat,
mise en évidence par
l’action de l’insuline
Compte rendu de TP
En injectant de l’insuline, hormone pancréatique naturelle,
à un rat vivant anesthésié par un cathéter, on induit
rapidement une
hypoglycémie, qui est suivi d’une
augmentation de la glycémie jusqu’à sa valeur initiale. On
met ici en évidence l’action antagoniste des deux hormones
pancréatiques que sont l’insuline et le glucagon sur la
régulation de la glycémie (l’effet hypoglycémiant de
l’insuline et l’effet hyperglycémiant du glucagon). On peut
alors apprécier l’implication de ces deux hormones selon
des conditions physiologiques particulières que sont la
période postprandiale ou une période de jeûne.
Jean SIMONNET
Aurélien CHATEIGNER
1 Introduction
La glycémie est la concentration de glucose sanguin. Elle varie en fonction de différents paramètres
que sont notamment l’alimentation ou l’effort physique. On constate que, chez l’homme, la glycémie
normale se situe autour de 1 g/L, et que cette valeur fluctue relativement peu lors d’une journée,
alors que les apports glucidiques ne sont pas les mêmes. Après un repas, le glucose est absorbé au
niveau du tractus digestif et passe alors dans le sang. A distance des repas, il n’y a plus d’apport
glucidique par l’alimentation. Une régulation du taux de glucose sanguin s’effectue et permet un
maintient autour d’une valeur fixe.
On sait que cette régulation met en jeu des hormones, et particulièrement l’insuline, dont le rôle va
être de diminuer la glycémie lorsque celle-ci est trop élevée.
Après injection de cette hormone à un rat, on va observer les fluctuations de la glycémie et alors
déduire les mécanismes physiologiques qui entrent en jeu. Comment et pourquoi l’insuline
engendre-t-elle une diminution du taux de glucose sanguin ? Quels sont les mécanismes cellulaires et
moléculaires qui entrent en jeu ? On déduira alors l’importance biologique d’une telle hormone.
2 Matériel et méthode
On utilise des rats adultes, mâles ou femelles. Ils sont anesthésiés par injection intra-péritonéale
d’uréthane, un anesthésique couramment utilisé, du fait de son coût peu élevé. C’est un bon
anesthésique qui permet une narcose longue (12 heures en théorie), ce qui est très bien pour les
manipulations qui ne vont pas durer plus de 3 heures. En fin de manipulation, une dose forte de ce
même anesthésique est utilisée pour l’euthanasie de l’animal, étant donné que le réveil de l’animal
n’est pas souhaité pour l’expérience. Cependant, il peut occasionner des détresses respiratoires, il
faut donc être vigilant pour pourvoir agir vite en cas de problème. Il cause aussi une légère
hypothermie, on veille à ce que le rat soit placé assez près de la lampe, ce qui permet de la
réchauffer légèrement et de compenser cette perte thermique.
On utilise des techniques chirurgicales : le cathétérisme de la jugulaire et celui de la carotide.
Le cathéter de la jugulaire permet différentes injections. C’est en effet par là que l’on injecte, pour
des raisons anatomiques : la jugulaire est la veine qui apporte le sang directement au cœur. En
injectant ici, on est sûr que le produit sera rapidement diffusé au travers de tout l’organisme. Dans
un premier temps, l’héparine sera injectée. C’est un anticoagulant puissant, elle inhibe un des
facteurs de coagulation. Ceci défavorise la formation de caillots dans les cathéters et empêche le
sang, que l’on prélèvera par la suite, de coaguler, et donc facilite les manipulations, pas toujours
évidentes. On injectera ensuite l’insuline par ce même cathéter, à raison de 0,2 UI pour 100g de
poids d’animal. Notre rat pesant 520g, et la solution étant à 1 UI / mL, on injecte 1,1 mL de solution
par la jugulaire. On défini le temps t0 à partir de cet instant.
On aura préalablement effectué un prélèvement sanguin par le cathéter carotidien, qui constitue
alors le prélèvement t0. On utilise ce cathéter pour le prélèvement car la carotide est l’artère qui fait
sortir le sang directement du cœur, et donc la pression y est importante, ce qui permet un bon débit
sanguin pour le prélèvement. On réalise en tout 6 prélèvements : à t = 0, 10, 25, 40, 60 et 75 min. Le
prélèvement à t0 sert à définir la valeur normale de référence de la glycémie chez le rat.
2
Directement après avoir prélevé, on dilue au 10ème l’échantillon sanguin, pour éviter toute
coagulation ou hémolyse. Pour ce faire, on prélève 100µL de sang que l’on place dans 900µl de
sérum physiologique. On centrifuge ensuite (3000 t/min à 15°C pendant 5min) pour récupérer un
surnageant de plasma sanguin (ici c’est du plasma et non du sérum car c’est du sang non coagulé)
dilué 10 fois. C’est dans ce surnageant que le glucose sanguin est présent. On va l’utiliser pour doser
le glucose par la méthode de Trinder. On réalise également ce dosage pour une solution de liquide
physiologique ainsi que pour une solution de glucose à 1g/L dilué 10 fois (pour que la valeur
d’absorbance soit située dans un intervalle lisible). On lit ensuite les absorbances au
spectrophotomètre à 505nm. On pourra déduire la concentration en glucose de chaque échantillon
par comparaison avec l’absorbance de la solution de glucose à 1 g/L. Les dilutions étant identiques, la
valeur de la glycémie est donnée par le simple rapport DOéchantillon/ DOstandard.
3 Résultats
Temps (min)
0
10
15
40
60
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Rat 4
Rat 5
Rat 6
Rat 7
Rat 8
Rat 9
Rat 10
Moyenne
Ecart type
2,07
2,46
2,41
1,2
1,53
2,78
2,76
0,87
1,09
0,82
1,80
0,78
1,82
2,77
2,44
0,56
1,27
2,19
2,4
1,43
2,38
2,34
0,67
1,24
1,8
2,46
1,27
0,36
1,21
1,52
0,72
1,02
2,09
1,84
1,003
1,14
1,84
1,07
0,7
0,34
1,06
1,21
0,55
1,39
2,47
2,26
1,24
1,34
1,63
0,64
0,78
0,36
0,72
1,28
0,69
1,15
1,83
0,77
75
3,1
2,51
0,95
1,83
0,42
0,51
0,36
1,38
1,11
Tableau 1 : Résultats de la glycémie pour chaque rat en fonction du temps. Les valeurs sont données en g/L. Les résultats
personnels sont en italique
Globalement la glycémie chute jusqu’à 40 min, puis remonte ensuite vers la valeur de la glycémie
normale (celle mesuré à t0).
On constate des résultats étranges dont les valeurs seront exclues de l’étude :




Rat 7 : la valeur de glycémie ne fait que chuter.
Rat 8 : les valeurs ne varient pas logiquement (courbe en dents de scies).
Rat 9 : La glycémie chute et reste constante.
Rat 10 : Les résultats oscillent autour d’une valeur moyenne de 0,99 g. A noter qu’une légère
hémolyse s’est produite, ce qui a causé une erreur dans la mesure d’absorbance.
Chaque résultat sera expliqué dans la discussion
3
Temps (min)
0
10
15
40
60
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Rat 4
Rat 5
Rat 6
Rat 7
Rat 8
Rat 9
Rat 10
Moyenne
Ecart type
2,07
2,46
2,41
1,2
1,53
2,78
1,82
1,43
2,38
2,34
0,67
1,24
1,8
1,02
2,09
1,84
1,003
1,14
1,84
1,39
2,47
2,26
1,24
1,34
1,63
2,44
0,56
1,27
2,19
75
3,1
2,51
0,95
1,83
Valeurs exclues
2,17
0,61
1,92
0,77
1,76
0,68
1,43
0,47
1,57
0,63
1,76
1,10
Tableau 2 : Tableau des résultats, dans lequel ne sont pas présentes les valeurs exclues.
On déduit une valeur moyenne de la glycémie : 2,17 ± 0,61 g / L.
Evolution de la glycémie en fonction du temps écoulé
après l'injection d'insuline
3.5
3
Rat 1
Glycémie (g/L)
2.5
Rat 2
2
Rat 3
Rat 4
1.5
Rat 5
1
Rat 6
0.5
Rat 7
Moyenne
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Temps après injection (min)
Pour résumer, on constate une diminution de la glycémie après injection de l’insuline, puis une
augmentation par la suite.
4
4 Discussion
L’insuline étant une hormone hypoglycémiante, l’effet observé au début, c'est-à-dire la diminution
du taux de glucose dans le sang, est probablement liée à son action. On constate cependant que la
concentration de glucose augmente pour revenir autour de la valeur initiale par la suite, l’organisme
répond à l’hypoglycémie engendrée par l’insuline et évite ainsi l’atteinte d’une valeur trop basse de
la glycémie.
Figure 1 : Molécule d'insuline :
composé de 2 chaines peptidiques
liées par des ponts disulfures
Lors de l’injection, l’insuline, qui est une hormone peptidique, normalement synthétisée par le
pancréas, va induire une diminution de la concentration de glucose sanguin, en influençant d’une
part l’entrée du glucose dans les cellules de l’organisme, et d’autre part sa prise en charge cellulaire
après son entrée dans la cellule, c'est-à-dire en influençant la voie dans laquelle le glucose est utilisé.
L’insuline influence alors différents métabolismes, en fonction du tissu impliqué, chaque tissu tirant
son énergie ou la stockant de différentes manières. Elle peut alors influencer le métabolisme
glucidique de base notamment dans les cellules qui comportent les enzymes permettant le
métabolisme du glycogène ou encore l’équilibre entre glycolyse et néoglucogenèse (hépatocytes,
myocytes…). L’insuline joue également un rôle dans le métabolisme lipidique, notamment en
influençant et en permettant la synthèse de triglycérides et de cholestérol (foie, tissu adipeux).
Dans un contexte normal, ceci se produit juste après un repas riche en glucides où les sucres passent
du tractus digestif vers le sang, ce qui provoque une hyperglycémie, et où le corps à donc la nécessité
de faire baisser cette valeur.
5
Figure 2 : Récepteur à l'insuline
Cette hormone agit par l’intermédiaire de son récepteur, appelé « récepteur à l’insuline ». C’est un
récepteur comportant 4 sous-unités : deux chaines α extracellulaires comportant le site de fixation à
l’insuline et deux chaines β transmembranaires qui comportent une activité enzymatique « tyrosine
kinase du coté cytosolique. L’activation de ce récepteur va conduire à une cascade de transduction
cellulaire qui va permettre l’entrée du glucose dans les cellules, ainsi que son stockage : c’est une
hormone anabolisante.
L’activation du récepteur à l’insuline passe par son autophosphorylation : des résidus tyrosines de la
chaine β sont phosphorylés, ce qui stimule de 10 à 20 fois son activité tyrosine kinase. A noter que ce
récepteur peut subir une modulation par phosphorylation de certains résidus thréonine ou sérine, ce
qui peut conduire à son inactivation.
Le substrat endogène de ce récepteur est une famille de protéines appelée IRS (Insuline Receptor
substrat). Les protéines IRS (1, 2, 3 ou 4) contiennent des séquences particulières, potentiellement
phosphorylables : 8 des 21 résidus tyrosines phosphorylables peuvent être phosphorylés par le
récepteur à l’insuline. Ces phospho-tyrosines sont ensuite reconnues par des protéines possédant
des régions particulières appelées SH (src Homology : des structures découvertes en premier sur des
protéines responsables de sarcome (src)). Il faut en général 2 SH qui s’associent chacun avec une
phospho-tyrosine pour une stabilisation du complexe et donc une activation de la protéine, qui est
soit une protéine d’adaptation, soit une enzyme.
6
Notons l’implication de la PI(3)K (Phosphatidyl inositol kinase) qui, une fois activée par liaison avec
IRS, va notamment phosphoryler le phosphatidyl inositol (glycérophospholipide membranaire). Celuici sera ensuite reconnu par différentes protéines (comportant un domaine de reconnaissance
particulier), telles que la PKB (protein kinase B) et la PDK (phosphatidyl inositol Dependant Kinase),
qui vont alors être phosphorylées et activées. Celles-ci vont alors jouer un rôle indirect (nécessite
l’activation d’autres facteurs cellulaires intermédiaires) sur le métabolisme du glucose en permettant
la translocation vers la membrane plasmique de vésicules contenant dans leur membrane les
récepteurs GluT4, protéines membranaires permettant l’entrée du glucose dans la cellule. On
permet alors le recrutement du glucose par les cellules, ce qui permet de baisser le taux de glucose
sanguin. Une fois dans la cellule le glucose sera utilisé par différentes voies métaboliques activées
également par la transduction cellulaire induite par l’activation du récepteur à l’insuline. On note
notamment, la protéine Grb2 (Growth factor Recepteur Bound 2) qui sert d’adaptateur entre IRS et
le système mSOS (mammal Son Of Sevenless). L’activation de cette voie de transduction aboutit
entre autre à l’activation d’une phosphoprotéine phosphatase qui va jouer un rôle dans le
métabolisme glucidique, notamment en favorisant la synthèse du glycogène, phénomène appelé
glycogénogenèse. Cette enzyme déphosphoryle la glycogène-synthétase, ce qui permet son
7
activation et la production du glycogène à partir du glucose ; elle déphosphoryle également la
phosphorylase kinase, ce qui l’inactive et celle-ci ne peut donc pas activer la Phosphorylase, enzyme
qui dégrade le glycogène. Le glucose qui rentre dans la cellule est alors stocké sous forme de
glycogène, ce qui permet de constituer des réserves dans le cas ou le glucose viendrait à manquer.
Ceci est un exemple de l’effet de l’insuline, contribuant à l’utilisation cellulaire du glucose, après son
entrée dans la cellule. Il existe d’autres voies métaboliques permettant d’utiliser plus ou moins
directement du glucose, pour éviter son accumulation cellulaire, également activées par l’insuline,
mais pas forcément par la même voie de transduction que celle décrite précédemment (activation
phosphoprotéine phosphatase). On note par exemple l’activation des voies de synthèse des acides
gras et du cholestérol, qui sont aussi facilitées par l’augmentation de glucose intracellulaire. En fait le
glucose va être utilisé par la cellule pour synthétiser des précurseurs (glycérol, Acétylcoenzyme A) de
ces voies métaboliques, ce qui permet donc son utilisation et évite son accumulation.
Dans notre cas, l’insuline injectée provoque une entrée de glucose dans les cellules alors que la
glycémie était à un taux normal : une hypoglycémie est ainsi engendrée. L’organisme va donc réagir
pour contrecarrer cette baisse de glucose sanguin en dessous du taux normal. Ceci provoque, au
niveau du pancréas endocrine deux effets synergiques : un arrêt de la sécrétion d’insuline et une
sécrétion de glucagon. L’insuline est en effet une hormone naturellement produite par le pancréas,
comme son antagoniste, le glucagon. Ce dernier est également une hormone peptidique, qui est
synthétisée dans le cas d’une diminution de la glycémie au dessous de son taux normal. Son rôle va
être notamment de remonter le taux de glucose sanguin, de par son rôle cellulaire (métabolique)
inverse de celui de l’insuline. Ici, on constate que l’effet est assez long à mettre en place : ceci est dû
au fait que l’on a injecté une quantité relativement importante d’insuline, et qu’il faut que la quantité
de glucagon synthétisée contrecarre l’effet de la quantité d’insuline encore présente (celle-ci est
dégradée progressivement, comme le glucagon d’ailleurs).
Figure 2 : molécule de Glucagon, composée d’une seule chaine, contrairement à l’insuline
Voyons plus en détail le mécanisme d’action du glucose sur les sécrétions pancréatiques d’insuline et
de glucagon. L’insuline est sécrétée par les cellules β des Îlots de Langerhans du Pancréas : Le glucose
entre dans ces cellules grâce au transporteur GluT2, un transporteur au glucose de la même famille
que GluT4 évoqué précédemment. Celui-ci est exprimé constitutivement dans la membrane des
cellules. Le glucose qui entre est pris en charge dans la glycolyse, dont le but est une production
d’ATP (adénosine tri phosphate) qui est une des sources principales d’énergie de la cellule. Dans ces
cellules, on trouve des protéines canaux potassiques, qui laissent naturellement sortir le potassium,
qui sont inactivées par une concentration augmentant en ATP. Quand ceux-ci sont activés, le
8
potassium ne sort plus de la cellule, ce qui dépolarise la membrane et active des canaux calciques
qui, eux, laissent entrer le calcium. L’augmentation de la concentration en calcium permet une
exocytose des vésicules contenant l’insuline, ce qui fait augmenter la concentration d’insuline dans le
sang, qui va alors engendrer l’effet hypoglycémiant décrit précédemment. Il est évident que c’est la
quantité de glucose qui module la cascade de réaction menant à la sécrétion d’insuline et que plus il
sera présent en grande quantité, plus la sécrétion d’insuline augmentera. Ici, la quantité de glucose
ayant diminué fortement à cause de l’injection préalable d’insuline, la sécrétion d’insuline est alors
fortement réduite voir stoppée, et donc tous les effets cellulaires induits par cette hormone sont
stoppés (entrée du glucose dans les cellules, fabrication de glycogène…).
Le glucagon est, lui, synthétisé par les cellules α des ilots de Langerhans, alors que la concentration
de glucose est en dessous de son taux normal. C’est une hormone catabolisante et
hyperglycémiante. Lorsqu’elle est libérée dans le sang, elle va ensuite se fixer au niveau des cellules
hépatiques, sur un récepteur à 7 domaines transmembranaires, couplé à une protéine Gs. La
protéine Gs va activer l’adénylate-cyclase, ce qui va stimuler la production d’AMPc (Adénosine
monophosphate cyclique). La concentration cellulaire en AMPc augmentant, la protéine kinase A
(AMPc dépendante) va être activée. Cette enzyme va alors phosphoryler un certain nombre
d’enzymes impliquées dans le métabolisme glucidique, et va notamment permettre la dégradation
du glycogène en glucose (la PKA a exactement l’effet inverse de la phosphoprotéine phosphatase
citée précédemment), appelée glycogénolyse, et va favoriser la néoglucogenèse (à plusieurs
niveaux), qui est la synthèse de glucose à partir de composés non glucidiques (protéines, glycérol, et
acides gras à nombre impair de carbones), notamment en activant la dégradation des triglycérides ce
qui produit du glycérol (et des acides gras). Notons cependant que cette réaction ne se produit que
dans le cas d’un jeûne prolongé. Ici, on se situe sur une période très courte, où cette réaction ne sera
alors que très minoritaire par rapport à la glycogénolyse.
Glucagon
Récepteur au
glucagon
AC active
Prot G
+
ATP
AMPc
+
PKA active
Action sur le métabolisme glucidique dans le but de produire du
glucose
Augmentation de la glycémie
Figure 3 : Action cellulaire du glucagon
9
Tous ces événements engendrés par l’augmentation du glucagon et la baisse de l’insuline vont faire
augmenter la concentration intercellulaire en glucose, qui va sortir des hépatocytes vers le sang, ce
qui va faire remonter la glycémie, et explique alors la deuxième phase de la courbe, où la valeur de
la glycémie augmente.
Pour la courbe du rat 4, on constate que la valeur baisse à nouveau, à la fin. Ceci peut être dû à un
problème de dosage ou de prélèvement, mais pourrait s’expliquer aussi par le fait que l’organisme
aurait compensé trop fortement la baisse de glucose, en sécrétant trop de glucagon, et qu’il devrait
alors compenser avec de l’insuline pour fait descendre la valeur de la glycémie jusqu’à la valeur de
base.
5 Conclusion
On a donc montré que l’insuline était une hormone hypoglycémiante, qui intervient normalement en
réponse à une hyperglycémie post-prandiale, mais qui ici à été détournée pour provoquer une
hypoglycémie chez un individu dont le taux de glucose sanguin était normal. On a donc montré,
après l’effet de cette hormone, la réponse opposée de l’organisme qui s’adapte à ce contexte
hypoglycémique, typique de la période de jeûne séparant deux repas, en faisant remonter son taux
de glucose sanguin par la sécrétion de l’hormone antagoniste à l’insuline qu’est le glucagon. On
montre ici l’importance biologique de ces deux hormones, synthétisées et sécrétées par le pancréas,
dans la régulation de la glycémie, valeur qui doit rester constante à une valeur permettant la bonne
alimentation des cellules de l’organisme, et notamment les structures glucodépendantes comme les
hématies, qui ne tirent leur énergie que de la glycolyse ; et le cerveau qui n’utilise que le glucose (ou
dans un contexte particulier, dans le cas d’une carence prolongée en glucose, les corps cétoniques
que sont l’acétoacétate et le β-hydroxybutyrate) comme source d’énergie.
L’insuline est une hormone assez connue du grand public, à notre époque, car elle est en cause dans
une maladie malheureusement assez répandue, le diabète. Le Diabète de type I et le Diabète de type
II sont deux maladies qui mettent en cause l’insuline : soit sa synthèse par le pancréas (type I), soit
son action cellulaire (type II). Sans traitement, cette maladie ne permettrait pas aux individus atteints
de vivre, ce qui montre encore l’importance de l’insuline (et du glucagon) et de son rôle
physiologique.
Notons qu’outre son rôle décrit et mis en évidence dans les manipulations, sur la glycémie, l’insuline
(le glucagon également) joue un rôle sur d’autres métabolismes, ce qui a été rapidement abordé.
Ainsi l’insuline va également faciliter la synthèse de cholestérol et de triglycérides, ce qui va
augmenter le taux sanguin en ces molécules.
Remarquons également que l’effet de l’insuline dépend aussi de l’expression du gène responsable de
sa synthèse, de l’expression et de l’activité du récepteur à l’insuline. L’entrée du glucose dans les
cellules va dépendre lui de l’expression du gène responsable de la synthèse du récepteur au glucose
ainsi que de son activité. On comprend alors que la régulation de la glycémie, et que le phénotype lié
à cette valeur dépendra des prédispositions génétiques de l’individu.
Par ailleurs, pour vérifier que c’est bien par l’intermédiaire des récepteurs cités que l’insuline joue un
rôle, on pourrait utiliser des antagonistes de ceux-ci, pour étudier la réponse de l’individu privé de
l’action des récepteurs et alors conforter ou non les hypothèses émises.
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