Le monde microbien
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Le monde microbien I] Le contrôle des microorganismes Les microorganismes sont bénéfiques et nécessaires au bien être humain mais certaines activités microbiennes peuvent avoir des conséquences indésirables comme la détérioration de la nourriture ou la maladie. En conséquence il est indispensable de pouvoir détruire ces microorganismes ou d'inhiber leur développement de manière à minimiser leurs effets destructeurs. En bref, il est indispensable de les contrôler. Les moyens de contrôle sont nombreux, parmi eux : des agents physiques comme la température ou encore les radiations - des agents chimiques, certains sont très actifs et nocifs non seulement pour les microorganismes mais également pour les cellules de l'hôte infecté. De ce fait ces agents ne seront pas utilisés comme médicaments. - des agents chimiques à toxicité sélectives, c'est à dire qui vont avoir pour cibles les microorganismes et qui seront donc utilisés en thérapeutique. Dans ce chapitre, nous étudierons les deux premiers types d'agents. I.1) Le contrôle des microorganismes par les agents physiques et chimiques - Généralités a) Définition des termes fréquemment utilisés Exemple : le traitement appliqué sur de la vaisselle ou sur des instruments chirurgicaux vise dans les deux cas à éliminer les microorganismes ainsi que la matière organique. C'est un processus de nettoyage mais dans le cadre de la vaisselle, le but à atteindre est une élimination partielle des microorganismes (le plus possible), dans le deuxième cas, il faut arriver à une "destruction totale" de la population microbienne. - Stérilisation : C'est le procédé par lequel on détruit ou on élimine d'un objet ou d'un lieu toutes les cellules vivantes, les spores viables et les virus. Un objet stérile est totalement dépourvu de microorganismes et de spores, l'agent chimique qui permet la stérilisation est appelé agent stérilisant. Spores : Corpuscules reproducteurs de certaines cellules eucaryotes - Spores bactériennes : formation arrondie sous laquelle peuvent se présenter certaines bactéries et qui sont plus résistantes à des conditions défavorables que les formes végétatives correspondantes. - Désinfection : C'est la destruction, l'inhibition ou l'élimination des microorganismes potentiellement pathogènes. Les désinfectants sont des agents généralement chimiques et employés sur des objets. Lorsqu'on utilise un désinfectant, on obtient pas toujours l'élimination totale des microorganismes car il peut rester des spores et quelques microorganismes. - Décontamination : Elle est associée à la désinfection, par ce processus, la population microbienne est réduite à des niveaux considérés sans dangers par les normes de santé publique. Exemple : des agents de décontamination sont utilisés pour nettoyer la vaisselle dans les restaurants ou dans les industries agroalimentaires. Jusqu'ici nous avons défini des traitements utilisés sur de la matière mais il est souvent nécessaire d 'éliminer des microorganismes sur des tissus vivants - Antisepsie : C'est la prévention de l'infection par l'utilisation d'antiseptiques qui sont des agents chimiques à toxicité sélective appliquée sur le tissus dans le but de détruire ou d'inhiber le développement des agents pathogènes. Agents antimicrobiens : Effet destructeur : suffixe -cide (germicide, bactéricide, virucide, algicide, fongicide, sporicide, ...) Blocage de la croissance : suffixe -statique (bactériostatique, ...) b) Cinétique de la létalité microbienne La mort des microorganismes n'est pas immédiate, elle est généralement exponentielle, c'est à dire qu'une même fraction de population est tuée à intervalle de temps constant. ( Figure 5 - tableau 3 ) Expérience microbienne : * La population microbienne est de 10^6 cellules à t0 * 90% des microorganismes meurent chaque minute * Les microorganismes sont dans le même état physiologique au début de l'expérience (même sensibilité au traitement appliqué) Pour calculer cinétique de la létalité des microorganismes, on trace le logarithme du nombre de survivants en fonction du temps et on obtient une droite caractérisée par le taux de mortalité (pente de la droite). Le taux de mortalité est d'autant plus grand que le traitement est efficace. Au bout d'un certain temps de traitement, le taux de mortalité peut diminuer du fait de l'apparition de microorganismes résistants. Le problème qui se pose dans une telle étude de cinétique est le test de viabilité. Savoir quand le microorganisme est mort ou vivant. Ce problème se pose parce que l'on va mettre en culture les microorganismes restant, et cette mise en culture sera très variable en fonction du type de microorganisme dont on veut étudier la survie. - Problème pour choisir la composition du milieu de culture (il n'existe pas de règle générale permettant de choisir le type de milieu du fait que les exigences nutritionnelles des microorganismes sont très variables) - Problème du choix des conditions de culture c'est à dire : - du pH (les levures et les moisissures se développent à pH acide (3-6), les bactéries se développent à pH neutre voire légèrement alcalin (7-7,5) ), la tolérance des microorganismes est assez large Exemple : E-coli (4-8) - de la température, on peut classer les microorganismes en trois groupes : - mésophiles (environ 30 ºC) - psychrophiles (environ 0 ºC) - thermophiles (environ 50 ºC) Cette classification est très schématique et simplificatrice puisqu'il existe par exemple des thermophiles facultatifs mésophiles - Problème d'adaptation parfois nécessaire. Dans certains cas, les microorganismes, à la suite d'un traitement ne peuvent pas se multiplier dans leur milieu habituel, il faut les revivifier en les mettant d'abord au contact d'une solution particulière. c) Facteurs influençant l'action anti-microbienne - Généralité : La destruction des microorganismes ou l'inhibition de leur développement n'est pas simple car l'efficacité d'un agent anti-microbien dépend d'au moins six facteurs. - Taille de la population microbienne (plus la population microbienne est initialement importante, plus il faudra de temps pour la réduire fortement et aller jusqu'à la destruction) - Composition de la population (l'efficacité d'un agent varie fortement avec le type de microorganisme traité car tous n'ont pas la même sensibilité Ex : les spores bactériennes sont en général plus résistantes à la plupart des traitements que les formes végétatives, des cellules jeunes sont en général plus sensibles que des cellules issues d'une culture plus vieille. Au sein d'un même microorganisme, certaines espèces sont plus résistantes que d'autres comme la bactérie Mycobacterium tuberculosis (responsable de la tuberculose) - Concentration ou intensité de l'agent anti-microbien. Souvent mais pas toujours, plus un agent chimique est concentré ou plus un agent physique est intense, plus les microorganismes sont détruits rapidement. En général, l'efficacité d'un agent chimique augmente de façon exponentielle avec une augmentation de la concentration. Ceci est vrai dans une certaine gamme de concentration mais passé une certaine valeur, une grande augmentation de la concentration entraîne une faible augmentation de l'efficacité. Dans certains cas, un agent sera plus efficace à faible concentration. En effet, l'éthanol est plus efficace à 70% par rapport à 95% - La Durée de l'exposition. Plus le traitement est long, plus le nombre de microorganismes tués sera grand. Pour réussir une stérilisation, il faut un temps de traitement suffisant pour réduire la probabilité de survie à 10^-6 au moins - La Température. Une accroissement de la température à laquelle une substance chimique agit augmente souvent son activité. Dans le cas d'une utilisation industrielle, il faudra considérer la température et la concentration à condition d'avoir un atout économique. - L'environnement local. Les microorganismes que l'on souhaite détruire ou dont on veut inhiber la croissance ne sont pas isolés. On fait ça dans un environnement qui va soit offrir une protection, soit favoriser leur destruction. Favorisant de la destruction : La chaleur tue plus facilement à pH acide, de cette façon, les boissons type jus de fruits seront plus facilement pasteurisées que des boissons neutres voire légèrement basiques comme le lait. Offre un protection : La matière organique peut protéger les microorganismes contre la chaleur et les désinfectants chimiques. De ce fait, il est préférable de nettoyer des objets avant de les désinfecter ou de les stériliser. Dans le cas de la préparation de l'eau potable, plus l'eau est chargée en matière organique, plus il faut rajouter du chlore. I.2) Utilisation d'agents physiques Les microorganismes sont capables de se développer dans certaines conditions physico-chimiques Dans des conditions défavorables, ils ne pourront plus se multiplier et pour certains ils seront menacés de survie donc traitement en milieu défavorable. L'exemple le plus évident est le traitement par la chaleur mais on utilise généralement trois types d'agents physiques : les radiations et la filtration. a) La chaleur Le feu est l'eau bouillante sont utilisés pour la stérilisation et la désinfection depuis l'antiquité. Aujourd'hui, la chaleur est encore un des moyens les plus courants de destruction des microorganismes. On distingue deux types de chaleur: - La chaleur humide - La chaleur sèche a) Chaleur humide A 100ºC on détruit facilement les virus, les mycéts et les bactéries. En général, quelques minutes suffisent à la destruction de ces microorganismes. On peut même détruire les spores eucaryotes. Cependant, les spores bactériennes résistent à des heures d'ébullition. De ce fait, l'ébullition sera utilisée pour une désinfection et non pas pour une stérilisation. Ce traitement à 100ºC sera utilisé pour désinfecter des solutions et des objets qui peuvent être immergés dans l'eau. Etant donné l'utilisation importante de e type de traitement, il était indispensable de définir une donnée permettant de mesurer l'efficacité du contrôle et du traitement. - La première donnée définie est la DTM ( Durée Thermique Mortelle) : c'est la période de temps la plus courte requise pour tuer tous les organismes d'une suspension microbienne à une température spécifique est dans des conditions déterminées. On sait quand même que théoriquement il n'est pas possible de tuer complètement une population microbienne. De ce fait, une seconde donnée a été proposée, la valeur D - La valeur D est la valeur de réduction décimale. C'est le temps requis pour tuer 90% des microorganismes ou des spores dans un échantillon à une température spécifique. En général, on pour en indice de la valeur D la température du traitement. Fig 5 : D121ºC = 1 min par exemple. La valeur D peut être déterminée à différentes température d façon à estimer la résistance des microorganismes à la chaleur. On peut alors calculer la valeur Z, c'est à dire l'accroissement de température nécessaire pour réduire D à 1/10 de sa valeur. Fig 5 : D100 = 100 min Ces valeurs sont très utilisées dans l'industrie alimentaire. Dans le cas de la mise en conserve, le traitement des boites est effectué de façon à éviter le botulisme ( maladie provoquée par la consommation de bactéries clostridium botulinum, ces bactéries ont la particularité de former des spores ) donc le traitement thermique appliqué aux boites de conserves devra être suffisant pour permettre la destruction de ces spores. 100ºC est insuffisant pour traiter les boites de conserve. On travaille donc à une température de 121ºC. Le traitement doit être suffisant pour réduire une population de 10^12 spores à 1 spore. Dans ce cas on aura pas une chance de trouver une spore par boite de conserve. exo : D121 = 0.204 min Z = 10ºC T= 12 D car 10^12 spores = 12 * 0.204 = 2.5 min 111 = 121 - 10 D111 = 10 * D121 = 2.04 min T111 = 12 D = 24,5 min -> Autoclavage (121ºC , 1 bar) <=> stérilisation Si on travaille à une température supérieure à 100ºC c'est qu'il faut détruire les spores bactériennes. Cette température est obtenue avec de la vapeur saturée sous pression. Cette vapeur vient remplir un appareil appelé autoclave similaire à une cocotte-minute. De l'eau réchauffée pour produire de la vapeur qui entre dans la chambre de l'autoclave et chasse l'air initialement présente. Lorsque tout l'air a été chassé, on ferme les échappements et la vapeur continue de rentrer dans l'autoclave jusqu'à ce que les conditions de stérilisation soient atteintes. Cette technique présente quelques difficultés qui viennent du fait que l'on a besoin d'être sur de notre traitement (sur d'avoir atteint la stérilisation). - Si tout l'air n'a pas été chassé, on atteint pas les conditions de 121ºC, 1 bar. Il ne faut pas remplir trop fortement la chambre de l'autoclave pour que la vapeur puisse circuler entre les objets. - Si on veut stériliser des solutions de grand volume, la durée de traitement doit être suffisante pour que le cœur de ces solutions atteigne 121ºC Face à de telles difficultés, on autoclave souvent un indicateur biologique avec les objets à stériliser. Cet indicateur est un tube de culture contenant une ampoule de milieu de culture stérile et également une tige de papier recouverte de spores bactériennes. Après l'autoclavage, l'ampoule est casée, de ce fait, la tige de papier se trouve plongée dans le milieu de culture. Le tout est incubé et si l'on observe pas de croissance bactérienne, c'est que l'autoclavage est réussi. Ce procédé est assez sur mais l'inconvénient est qu'il est long donc très souvent, au lieu d rajouter cet indicateur biologique, on colle un morceau d ruban adhésif sur chaque objet à stériliser, le ruban change de couleur au cours de l'autoclavage qui indique que la stérilisation est correcte. -> Effet de ce traitement à la chaleur sur les cellules La chaleur a pour effet de dégrader les acides nucléiques (ADN, ARN). Elle dégrade également les enzymes et autres protéines et dans quelques cas, la chaleur dégrade également les membranes cellulaires. Tout ceci entraînant la mort des cellules -> Cas particulier de traitements pour des objets ou solutions sensibles à la chaleur Dans ce cas là, on utilise un traitement appelé Tyndallisation, inventé par M. Tyndall, on appelle ça également une stérilisation fractionnée à la vapeur. Le procédé consiste à chauffer à 60-70ºC pendant 30 minutes - 1 heure, une fois par jour, trois jours consécutivement et incubation entre chaque chauffage. Le premier traitement thermique permet de détruire toutes les cellules sauf les spores bactériennes. La plupart de ces spores germent au cours de la première incubation et sont par conséquent détruite lors du deuxième traitement thermique. Les spores restantes ayant germées au cours de la deuxième incubation sont détruites lors du troisième traitement thermique. -> Pasteurisation (Louis Pasteur) C'est un traitement thermique qui permet d'augmenter la conservation de boissons comme le lait ou la bière grâce à un chauffage à basse température. La pasteurisation n'est pas une stérilisation, le but de ce traitement est la destruction des germes pathogènes et la destruction d'autres microorganismes de telle façon que la durée de conservation est augmentée. Dans l'exemple du lait, la pasteurisation est un chauffage à 63ºC pendant 30 minutes. Et maintenant la flash pasteurisation : 71ºC pendant 15 secondes. Ces traitements thermiques sont refroidit très rapidement. La pasteurisation est appliquée aux produits naturels dont on veut conserver les caractères organoleptiques (couleur, odeur, saveur) et augmenter la durée de conservation. b) Chaleur sèche C'est un traitement utilisé dans le cas de produits qu'il n'est pas souhaitable de mettre en contact avec l'humidité. C'est un traitement qui peut permettre d'atteindre la stérilisation, le matériel ou les produits à stériliser sont placés dans un four (160-170ºC) pendant en général 2-3 heures. La chaleur sèche entraîne une dénaturation des protéines et une oxydation des constituants cellulaires, ce qui fait que les microorganismes mouront à la fin du traitement. Avantages : Contrairement à la chaleur, n'entraîne pas de corrosion (verrerie ou métaux) Stérilisation de poudres, huiles... Inconvénients : Processus lent : les spores de clostridium botulinum détruites en 5 minutes à 121ºC par la chaleur sèche seront détruites en 2 h à 160ºC par la chaleur sèche. Traitement inapplicable sur les matières thermosensibles b) Les radiations On connaît depuis longtemps l'effet des rayonnements sur les bactéries, c'est un effet bactéricide. Le rayonnement solaire et plus particulièrement les radiations UV sont des agents naturels de stérilisation. C'est ce qui fait que la surface des eaux est dépourvue de microorganismes. a) radiations électromagnétiques Les radiations électromagnétiques sont des agents stérilisants utilisés notamment pour la conservation des aliments. L'action des radiations sur les microorganismes dépendent des longueurs d'ondes. Cette action sera d'autant plus efficace que la longueur d'onde est faible (E = h C/ ). Les premiers rayonnements connus pour leur action anti-microbienne sont les UV, ce sont aussi les moins efficaces du fait de leur grande longueur d'onde. Viennent ensuite les rayons X et les rayons gamme beaucoup plus efficaces et pouvant pénétrer dans la matière de quelques centimètres pour les rayons X et quelques dizaines de centimètres pour les rayons gamma. - rayons UV Ce sont les radiations les plus utilisées malgré leur faible efficacité, la région la plus active de leur spectre d'émission est la région 260-270 nanomètres, c'est dans cette région qu'émettent les lampes germicides situées dans des sales chirurgicales ou dans certaines enceintes de laboratoires. Grâce aux rayonnements produits par ces lampes, l'air ambiant et également les surfaces et objets exposés sont décontaminés. Inconvénients : - ces rayons présentent des dangers pour l'homme. - Les rayons UV ne pénètrent pratiquement pas dans la matière par conséquent, leur action ne sera que superficielle. Exemple d'utilisation : Traitement de l'eau. On s'est aperçu que ce traitement ne pouvait pas être utilisé du fait que les rayons UV rentrent de quelques millimètres dans l'eau et d'autre part, ils sont arrêtés par la moindre particule de matière. C'est ce qui fait que l'on utilisera plutôt le chlore (agent chimique) En conclusion, les rayons UV ne peuvent pas être utilisés pour stériliser une atmosphère ou un objet mais simplement pour les décontaminer. - Rayons X et rayons gamma Ces rayonnements sont sans doute plus efficaces que les UV du fait de leur fort pouvoir de pénétration. On les considère comme un moyen idéal de stérilisation à froid des conserves alimentaires. Le problème est que l'utilisation de ces rayons présente plusieurs inconvénients Inconvénients : - Coût de l'installation pour produire ces rayons et atteindre les aliments - Danger que représentent ces rayons pour les personnes avoisinantes - Dommage qu'ils causent sur les substances touchées. Ces problèmes viennent du fait que ce sont des radiations ionisantes. Dans certains pays, ces radiations sont utilisées pour augmenter la durée de conservation de la viande (volaille), des fruits de mer et des fruits. Elle seront peut être employées plus largement dans le futur dans le domaine alimentaire. On les utilise aujourd'hui pour stériliser à froid des antibiotiques, des hormones ou encore des objets en plastique. b) Ultrasons Les ultrasons ont le pouvoir de tuer des microorganismes en suspension dans une solution en faisant éclater les cellules. On parle de lyse des cellules. De la même façon, ils vont endommager d'autres substances chimiques en solution. De ce fait, les ultrasons ne sont pas utilisés comme agents antimicrobiens mais pour la purification de composés intracellulaires ou encore de composés membranaires c) La filtration C'est une excellente méthode pour réduire la population microbienne dans des solutions renfermant des substances thermosensibles (les protéines ne supportent pas des températures souvent inférieures à 100ºC) et parfois de stériliser des solutions. Le principe de cette méthode est une rétention et non pas une destruction des microorganismes. Plusieurs types de filtres ont été mis au point. On en distingue deux catégories : - Les filtres épais (filtres anciens). Ces filtres sont constitués de matière fibreuse ou granulaire formant une couche épaisse contenant des canaux tortueux de faible diamètre (ex : filtres en porcelaine mate (non vernis)). La solution a filtrer passe au travers de cette couche épaisse par dépression. Les microorganismes sont piégés physiquement dans les canaux tortueux et ils sont également éliminés par adsorption à la surface du filtre. - Les membranes filtrantes (remplacent les filtres épais dans de nombreux cas) sont en forme de disques d'une épaisseur légèrement supérieure à 0.1 millimètre. Elles sont faites souvent d'acétate ou de nitrate de cellulose ou autres matières synthétiques. Elles sont poreuses et il existe un très grande variété de tailles de pores sur le marché. Dans le cas ou l'on veut stériliser une solution, on utilise des pores de 0.2 microns de diamètre. Cette taille de pore permet d'éliminer les cellules végétatives. Ces membranes sont maintenues dans des supports spéciaux, la solution a filtrer est aspirée par dépression ou passe à travers le filtre par pression d'une seringue, d'un pompe... Le filtrat est recueillis dans un récipient stérile. Dans le cas de cette filtration, les microorganismes sont retenus comme dans le cas d'un tamis. On utilise ces filtres pour stériliser des produits pharmaceutique type antibiotique ou encore stériliser des milieux d cultures,... La filtration est également utilisée pour stériliser l'air. Exemples : Masques chirurgicaux Bouchons de cotons que l'on place sur les flacon de milieu de culture pour permettre à l'air de passer mais pas les microorganismes Filtres des hottes de sécurité biologique à flux laminaire. On les appelle filtres HEPA (Highefficiency particulate air) : ces filtres ont la capacité de retenir pratiquement 100% des microorganismes ou des particules d'une taille supérieure ou égale à 0.3 microns Dans ces hottes, le passage de l'air est forcé au travers d'un filtre et part pour former un rideau vertical d'air stérile. Ce rideau se trouvant devant l'ouverture de la hotte. De cette façon, le travail est protégé des microorganismes qu'il manipule à l'intérieur et d'autre part, cela permet d'éviter une contamination de la pièce. Grâce à ces hottes, on dispose également d'une surface et d'une atmosphère stérile pour effectuer certains types de manipulations. Remarque : il existe un autre procédé mécanique permettant de séparer des microorganismes d'un milieu liquide. On appelle ce procédé la centrifugation qui est effectuée dans des appareils particuliers appelés centrifugeuses. Dans ces appareils, les solutions sont soumises à une très forte accélération et par la force centrifuge, les microorganismes sont rassemblés en fond du récipient Avec cette technique, on élimine partiellement les microorganismes. On l'utilise assez couramment pour de faibles quantités de liquides dans le but de réduire fortement la population microbienne (il y a quand même d'autres utilisation de la centrifugation) Un exemple d'utilisation dans des conditions industrielles : cas de certaines industries laitières qui pratiquent la bactofugation. C'est la centrifugation du lait avant sa pasteurisation. L'intérêt d'effectuer une centrifugation avant le traitement thermique est de réduire la population microbienne de façon à améliorer l'effet de la pasteurisation. La centrifugation est également utilisé avant une filtration de façon à éviter de colmater trop vite les filtres. I.3) Utilisation d'agents chimiques Les objets sont parfois désinfectés aux moyens d'agents physiques mais on emploie plus souvent des agents chimiques pour la désinfection et même la stérilisation. De nombreux facteurs influences l'efficacité de ces agents, ces facteurs doivent être pris en considération de façon à choisir et à utiliser correctement le produit chimique. Le choix devra se faire en fonction de l'usage car il n'existe pas d'agent chimique efficace dans tous les cas. La qualité importante que devra avoir l'agent chimique choisi, c'est un spectre d'action large (gamme de microorganismes touchés). C'est à dire qu'il devra être si possible à la fois bactéricide, fongicide et virucide. Concernant l'activité des agents sur les microorganismes, elle est très variable et on peut distinguer trois types d'effets générés sur un microorganisme entraînant la mort de la cellule. - Oxydation ou dénaturation des protéines - Altération des structures membranaires - Inactivation de composés ou de fonctions essentielles Propriétés et utilisation de quelques groupes de désinfectants et antiseptiques courants - Les composés phénoliques : (Phénol : 1er désinfectant et antiseptique largement utilisé) Activité : - Dénaturation des protéines - Altération des membranes cellulaires Avantages : - Actifs longtemps après leur application inconvénients : - Odeur désagréable - Les alcools : Parmi les désinfectants et les antiseptiques les plus utilisés Forme : - Ethanol - Isopropanol à 70-80 % Activité : - Dénaturation des protéines - Les halogènes - Iode (antiseptique de la peau) Activité - Oxydation des constituants cellulaires - Protéines cellulaires iodées Forme - Teinture d'iode - Iode + éthanol Inconvénients - Risque d'allergie - Iodophores : iode complexé à des transporteurs organiques Avantages - Solubles dans l'eau, non tachants, plutôt stable - Brûlures et irritation de la peau réduite Utilisation - Antisepsie préopératoire de la peau - Désinfectants (hôpitaux, labos) Exemples - Bétadine et proviodine - Chlores : un des désinfectants les plus communs (traitement des eaux - désinfection de locaux) Forme - Gaz (Cl2) - Hypochlorite de calcium - Hypochlorite de sodium Activité Oxydation des constituants cellulaires - Eau oxygénée : agent oxydant (H2O2) - Métaux lourds : - Effets bactéricide de certains métaux - sels de métaux lourds + efficaces (Ex. sulfate de cuivre) Activité - Dénaturation des protéines - Les ammoniums quaternaires - Savons : Pouvoir antiseptique variable ~ Agents mouillants - Détergeant : Agents mouillants (tensioactifs) - anioniques : renforcent l'action d'autres désinfectants - cationiques = désinfectants + efficaces Composé d'ammonium quaternaire Activité : Déstructuration de la membrane plasmique Avantages : Stable, Incolores, inodores utilisation : thérapeutique locale - Les aldéhydes Forme - Formaldéhyde - Glutaraldéhyde Activité - Inactivation des protéines - Les gaz stérilisants Utilisation - Produits ou objets instables à la chaleur - Désinfection de locaux -> Vapeurs de formaldéhyde Spectre d'action - pouvoir bactéricide puissant Inconvénients - Toxiques -> Oxyde d'éthylène Activité Inconvénients Dénaturation des protéines Très toxique Il existe des essences naturelles ayant un pouvoir bactériostatique grâce à leurs composés phénoliques et terpéniques. Parmi ces essences : - l'essence d'eucalyptus utilisée comme antiseptique dans les voies respiratoires - l'essence de girofle utilisé comme antiseptique et cautérisant en chirurgie dentaire - l'essence de thym utilisé comme antiseptique intestinal et respiratoire. I.4) Evaluation de l'efficacité d'un agent antimicrobien Le contrôle des agents antimicrobiens est un processus complexe soumis à des réglementations internationales ou nationales. Ce contrôle débute souvent par un test d'évaluation destiné à vérifier si l'agent est efficace et à quelle concentration. Il peut être suivit par une analyse dans des conditions plus réelles et proches des conditions d'utilisation. Le test d'évaluation des désinfectants le mieux connu est la méthode du coefficient phénol. - Méthode du coefficient phénol Désinfectant de référence : phénol Bactéries de référence : - Salmonella typht - Staphylococcus aureus Température du test : 20 ou 37ºC Protocole : Dans un premier temps, on prépare différentes solutions de phénol et de désinfectant à tester. Ces solutions sont inoculées (contaminées) avec des bactéries de référence et plongées dans un bain-marie. Des échantillons sont prélevés toutes les cinq minutes, ajoutés à du milieu de culture frais, le tout et incubé à peu près deux jours. Les dilutions les plus élevées capables de tuer les bactéries après une exposition de dix minutes exactement servent à calculer le coefficient phénol, c'est à dire le rapport du facteur de dilution approprié du désinfectant sur le facteur de dilution du phénol. Coeff. phénol = 5000 / 1000 = 5 Ce coefficient permet d'approuver l'efficacité d'un désinfectant; Si le coeff. phénol est supérieur à 1, il est plus efficace que le phénol, plus il est important, plus le désinfectant est efficace Méthode intéressante pour comparer les désinfectants, standardisé, elle se base sur la destruction de souche bactérienne pures alors que la plupart du temps, on cherche à détruire des populations complexes de microorganismes en présence de matière organique et dans un environnement qui évolue en pH et en température. De ce fait, d'autres méthodes sont utilisées pour se rapprocher des conditions d'utilisation du produit chimiques. Méthode des"portes-germes" On utilise un support cylindrique d'acier inoxydables Les cylindres sont contaminés à l'aide de microorganismes choisis, plongés dans les solutions de désinfectant à tester pendant 10 minutes puis transférés dans des milieux de culture frais et incubés pendant environ 2 jours On peut déterminer alors la concentration minimale de désinfectant à partir de laquelle les microorganismes ont été détruits D'autres méthodes peuvent être mises au point. Ces méthodes sont choisies intégralement en fonctions de situations réelles particulières. Exemple : Dans le cas de la préparation de désinfectants pour le nettoyage des cuves en industrie laitière. Le désinfectant est testé sur des microorganismes présents dans le lait à des proportions équivalents et en présence de lait dans la solution de désinfectant. II] La microbiologie alimentaire Les aliments n'ont pas seulement une valeur nutritive pour l'homme mais ils sont souvent un milieu de culture idéal pour la multiplication microbienne. La croissance microbienne entraîne soit la conservation des aliments soit la détérioration selon les microorganismes impliqués et les conditions de conservation. Le fromage, le pain, le vin, la bière sont des produits transformés par des microorganismes en aliments qui restent consommables ( qui se conserve plus longtemps). En revanche les microorganismes peuvent affecter la qualité des aliments pendant toutes les phases de la manipulation, c'est à dire depuis le producteur jusqu'au consommateur final. Dans ce cas, les aliments peuvent servir de véhicules pour la transmission de maladies. La détection et la limitation des microorganismes responsables de maladies ou avariant la nourriture sont des parties importantes de la microbiologie alimentaire. II.1) Détérioration des aliments Déjà 3000 AV JC la question de la conservation des aliments ont été posées et quelques solutions ont été trouvé comme le salage de viande ou la fabrication du fromage ou de lait caillé et le fumage de la viande ou du poisson. 17 siècle : les microorganismes sont découverts 19 siècle : (1857) date à laquelle Louis Pasteur a ouvert l'ère de la microbiologie alimentaire. Il a découvert que l'altération du lait provenait d la présence de microorganismes. (1860) Il montre que la chaleur permet de maîtriser les microorganismes altérants le vin et la bière. Il existe deux types de facteurs qui influencent cette détérioration, ce sont des facteurs extrinsèques, c'est à dire les facteurs environnementaux et les facteurs intrinsèques, ce sont les facteurs associés à l'aliment. -> Les facteurs intrinsèques : 1) Le pH Les levures et les moisissures se développent plutôt à pH acide compris entre 3 et 6 en général. Les bactéries préfèrent des milieux à pH neutre ou légèrement alcalin (7, 7.5). Il existe des espèces de microorganismes acidophiles et des espèces basophiles. Les limites de tolérance sont souvent larges. Dans le cas du pourrissement des aliments à pH neutre ou alcalin comme les viandes, ce sont les bactéries qui sont responsables de la dégradation. On appelle ça la putréfaction (décomposition des matières organiques par les microorganismes). Dans le cas de la viande, ce sont les protéines qui sont dégradées (protéolyse), cette dégradation produit des dérivés aminés nauséabonds. En fonction du substrat principal (on peut avoir des glucides, lipides) on observe divers types de détérioration. 2) Humidité, disponibilité et activité de l'eau L'eau affecte la capacité qu'ont les microorganismes de coloniser les aliments. En séchant simplement un aliment, on arrive à contrôler voir à empêcher la détérioration. Sans enlever l'eau, on peut aussi diminuer la disponibilité de l'eau en ajoutant des grandes quantités de soluté comme le sucre et le sel. Dans ce cas, les microorganismes sont placés dans des conditions hypertoniques, c'est à dire dans un milieu de faible concentration en eau (= de forte pression osmotique). Dans ces conditions, les microorganismes se déshydratent et ne peuvent plus se multiplier. L'activité de l'eau que l'on note aW est définie comme le rapport entre la pression de vapeur de l'eau d'une substance et la pression de vapeur de l'eau pure à la même température. Ce facteur a une très grande importance pour le développement des microorganismes par les produits alimentaires (tableau 8) Dans le cas des aliments dont les valeurs de l'aW sont élevées (>0.9), presque tous les microorganismes peuvent se développer mais étant donné que les bactéries se développent (se multiplient) beaucoup plus rapidement que les moisissures et un peu plus vite que les levures, elles deviennent rapidement la flore prédominante. Les microorganismes qui résistent le mieux à des valeurs d'a W faibles sont les levures. 3) Structure de l'aliment La structure de l'aliment affecte le déroulement et l'étendue de la décomposition. Premier cas : on broie les aliments ou lorsqu'on les mélange (préparation de saucisses ou de steaks hachés). Une telle action non seulement augmente la surface de la nourriture mais également disperse les germes contaminant partout dans l'aliment. Deuxième cas : les légumes et les fruits ont des épidermes qui les protègent d'une altération, les microorganismes responsables du pourrissement ont souvent des enzymes spécialisées qui les aident à affaiblir et à pénétrer au travers de ces épidermes. Troisième cas : Certains aliments contiennent des agents antimicrobiens naturels parmi lesquels des inhibiteurs chimiques ou encore des enzymes. Exemple d'inhibiteur chimique : dans la cannelle ou la moutarde se trouvent des aldéhydes et des composés phénoliques qui sont des inhibiteurs de la croissance microbienne. Exemple d'enzyme : Les oeufs contiennent une enzyme que l'on appelle le lysozyme capable de dégrader (lyser) les parois bactériennes. Les oeufs ont aussi un moyen de défense venant de leur structure physique (coquille) 4) Eléments nutritifs disponibles En fonction des éléments nutritifs présents dans l'aliment, les microorganismes auront ou non les moyens de se multiplier. -> Les facteurs extrinsèques : 1) Température La température à laquelle un aliment est stocké sera plus ou moins favorable à la croissance des microorganismes. Il est évident que se sont ceux dont la température de croissance optimale est proche de la température qui se développeront plus facilement. 2) Humidité ambiante Ce facteur est également très important. Les microorganismes se développent plus rapidement dans une humidité relative élevée, même à basse température. Si des aliments secs sont placés dans une pièce humide, ils absorbent l'eau en surface, ce qui permet finalement une croissance microbienne. 3) Atmosphère au niveau gazeux (O2,CO2) La quantité d'oxygène ambiante favorise si elle est importante la croissance de microorganismes superficiels. Ceci est particulièrement important dans le cas d'aliments emballés sous plastique du fait que souvent les films plastiques sont perméables à l'oxygène. Le CO 2 a un effet plutôt inverse sur la croissance microbienne, il va la limiter. 4) Types et quantités de microorganismes ajoutés à l'aliment. Plus la quantité de microorganismes ajoutés à l'aliment est importante, plus il y aura de risques de détérioration. Meilleur sera l'hygiène, plus longue sera la durée de conservation. II.2) Les méthodes de conservation des aliments Ces méthodes de conservation sont très nombreuses et variées. Elles sont basées sur plusieurs principes : - Il faut éliminer ou réduire les populations microbiennes pathogènes ou responsables de la dégradation. - Il faut éviter de rajouter des microorganismes - Il faut limiter leur développement a) Elimination physique des microorganismes C'est la méthode de filtration appliquée sur des éléments liquides (eau, bière, autres boissons non alcoolisées). Certains fabricants de bière préfèrent cette méthode à la pasteurisation de façon à préserver le goût et l'arôme du produit d'origine. Filtres bactériologiques (0.2 µm): Ils sont en général utilisés suite à une préfiltration (sur filtres larges) ou encore une centrifugation. Ces deux dernières techniques permettent d'augmenter la durée de vie des filtres et également l'efficacité car elles réduisent fortement la population microbienne. b) Exploitation des effets de la température - Basses températures : Réfrigération (environ 4 ºC) : La réfrigération retarde le développement microbien mais au cours d'un stockage prolongé, les organismes psychrophiles et même psychrotrophes peuvent se développer et détériorer l'aliment. Les psychrophiles sont des organismes dont la température de développement et de 0ºC, les psychrotrophes sont des organismes capable s de se développer dans des températures environnant les 0ºC mais se développent plus rapidement à des températures de 30ºC Congélation : On a observé une croissance microbienne lente à des températures inférieures à -10ºC, particulièrement dans des glaces et dans des jus de fruits concentrés. Il faut une conservation de très longue durée pour qu'un développement significatif se produise. Conclusion : Bien que certains microorganismes soient très sensibles au froid, le froid ne diminue pas les populations microbiennes totales. Globalement, on peut dire qu'il ralenti la multiplication ou la stoppe carrément. Le froid n'élimine pas les microorganismes. - Températures élevées : Les températures élevées permettent de limiter significativement la transmission de maladies et le pourrissement des aliments traités. Le chauffage est un moyen sur de conservation particulièrement dans le procédé de mise en conserve où les aliments sont chauffés à des températures supérieures à 100ºC pendant une trentaine de minutes jusqu'à 100 minutes. La température et la durée du traitement dépendent de la nature de l'aliment. Après le chauffage, les boites sont refroidies le plus rapidement possible (en général avec de l'eau froide). Mise en conserve : -> stérilisation La pasteurisation s'applique sur des liquides. Plusieurs types de pasteurisation : - LTH (Low temperature holding) : 63ºC pendant 30 minutes - HTST (High temperature short time) : 71ºC pendant 15 secondes Stérilisation : - UHT (Ultra High température) : 141ºC pendant 2 secondes Plus la durée du traitement est courte, plus le goût du produit traité est conservé. D'autre part, le température augmente et en même temps, la durée de conservation du produit. Chaque traitement est basé sur une probabilité statistique selon laquelle le nombre de microorganismes survivants sera inférieure à un certain niveau après un temps de chauffage particulier à une température donnée. Dans le cas de ces traitements thermiques, on recherche la destruction des microorganismes pathogènes et en même temps, la réduction des populations microbiennes totales c) Elimination de l'eau, diminution de la disponibilité de l'eau L'élimination de l'eau est effectuée dans la préparation d'aliments déshydratés (lyophilisés). C'est un moyen ordinaire d'empêcher le développement des microorganismes. La diminution de la diminution de l'eau se fait lorsque l'on ajoute à des aliments de grandes quantités de sel ou de sucre. aW diminue. Dans la cas du lait : Lait pasteurisé Lait UHT - Grande conservation Lait en poudre - Grande conservation Lait concentré sucré d) Addition de substances chimiques (conservateurs) Un bon conservateur devra répondre à plusieurs critères : - Il vaut mieux qu'il soit bactéricide que bactériostatique et qu'il agisse sur les levures et les moisissures. - Il doit agir sur les germes pathogènes aussi bien que sur les germes responsables de la détérioration. - Il doit être stable et non détruit au contact de l'aliment - Il ne doit pas favoriser la sélection de résistants - Il ne doit pas diminuer la valeur nutritive de l'aliment - Il doit être inoffensif Exemples de conservateurs : - Anhydride sulfureux : utilisé depuis des siècles pour améliorer la conservation du vin - Acide sulfureux + bisulfite de sodium : produits utilisés dans la préparation de jus de fruits notamment du fait de leur action importante sur les levures. - Acide organique simple : - Acide benzoïque - Acide propionique - Acide scorbique - Nitrite de sodium : utilisé pour les jambons blancs - Oxyde d'éthylène (gaz) : utilisé pour augmenter la durée de conservation des épices et des noix e) Irradiation Radiations UV : ces radiations sont utilisées pour le traitement de surfaces du matériel qui sera au contact des aliments et également quelques aliments Radiations Gamma : elles sont utilisés pour obtenir la stérilisation d'aliments, ceci du fait de leur action en profondeur (viandes, fruits de mer, fruits et légumes) II.3) Les maladies et les aliments Dans cette partie, seulement quelques bactéries et donc quelques maladies seront étudiées Il existe deux grandes types de maladies d'origine alimentaire : - Les infections alimentaires - Les intoxications alimentaires Infection alimentaire : elle implique l'ingestion du germe (microorganisme) suivie d'une multiplication accompagnée par une invasion tissulaire et/ou la libération de toxines dans l'intestin de l'hôte. La maladie d'origine alimentaire la plus importante et la Gastro-entérite (inflammation des muqueuses gastriques et intestinales). - La gastro-entérite : La Salmonellose (bactérie salmonella) est une bactérie causant la gastro-entérite. Beaucoup d'espèces sont pathogènes pour l'homme. Elles sont transmises par la viande, le poisson, les produits laitiers La campylobactériose est transmise par une bactérie du genre campylobacter. C'est un hôte intestinal des bovidés, des porcs et surtout des volailles. C'est une bactérie qui donne des gastro-entérites aiguës. Cette bactérie est souvent transmise par des produits de volaille crues ou mal cuits. Exemple de transmission : utilisation de planches à découper en bois pour le découpage de poulet qui ira dans la salade. Il suffit de très peu de bactéries (une dizaine) pour causer la maladie. Une cuisson soignée permet d'éviter ce problème. L'E. coli (Escherichia) est un hôte normal des intestins de l'homme et des animaux. On a découvert que des souches étaient pathogènes pour l'homme et responsables d'infections intestinales. - La listériose (bactérie listeria). Atteinte neruo-méningé. Le lait et les produits laitiers peuvent être contaminés. On la trouve également dans les viandes et en particulier de porc. Les charcuteries sont de ce fait surveillées. Bilan des maladies à infection alimentaires : toutes ces maladies sont associées à un défaut d'hygiène, elle se transmettent par voie fécale-orale, les aliments servent de liens entre les différents hôtes. Intoxications alimentaires : Une intoxication alimentaire produit des symptômes très peu de temps après consommation de la nourriture car la croissance des microorganismes pathogènes n'est pas requise. Les toxines produites dans la nourriture associées aux cellules ou libérées par les cellules en sont la cause. - Staphylococcus aureus (staphylocoque doré). Cette bactérie va provoquer une entérite. Cette entérite est provoquée par la toxine libérée par la bactérie, cette toxine sont des protéines thermorésistantes. Par conséquent le chauffage des aliments ne les détruira pas. C'est au bout de 2 à 6 heures qu'apparaissent les premiers symptômes. Le réservoir principal de cette bactérie et la cavité nasale de l'homme. La transmission de cette bactérie se fera par les mains lors de la préparation des aliments. La croissance bactérienne et la libération de la toxine auront lieu lors de la conservation des aliments à température ambiante ceci pendant plusieurs heures. - Clostridium bottulinum. On trouvera cette bactérie dans des conserves mal préparées sous la forme de spores. Elle produisent un toxine qui est un poison très violent lors de leur multiplication dans l'aliment. - Clostridium perfingens. C'est un bactérie capable de former des spores. La toxine de ces bactéries est produite spécifiquement lors de la sporulation qui a lieu dans l'intestin. La contamination se fait par des viandes cuites laissées un certain temps en refroidissement lent. Bacillus cereus. Elle est à l'origine de deux types de symptômes : nausées et vomissements (riz) et diarrhées (large éventail d'aliments) Bilan des maladies à intoxications alimentaires : les problèmes de stérilisation d'aliments, de matériels ou de locaux viennent de l'existence de germes sporulés du genre clostridium ou bacillus, les barèmes de stérilisation doivent tenir compte des propriétés exceptionnelles des spores en particulier leur thermorésistance. II.4) La microbiologie des aliments fermentés L'homme utilise depuis très longtemps les microorganismes pour améliorer la conservation des aliments et pour préparer de nouveaux produits. Ces aliments sont produits à partir de la croissance de populations microbiennes naturelles ou inoculées, les microorganismes entraînant une modification chimique et/ou de texture du produit d'origine. L'ère des biotechnologies s'est ouverte lorsque les procédés de fermentation sont passés de la phase traditionnelle à la phase industrielle. Biotechnologies : techniques, méthodes et procédés qui utilisent les capacités des microorganismes pour réaliser des biotransformations ou bioconversions Exemple : Utilisation des microorganismes dans la transformation du lait Le lait est un aliment complet, ce qui signifie qu'il sera également un bon milieu pour les microorganismes, c'est ce qui fait qu'il ne se conserve pas. Un des moyens découvert par l'homme pour augmenter sa conservation est de le faire transformer de façon plus ou moins contrôlée par certains microorganismes de façon à éviter toute autre altération. En gros, cette conservation repose sur l'élimination d'une grande partie de l'eau et sur l'acidification. défavorise le développement des microorganismes a) Caractéristiques du lait Ex : lait de vache Composition : 905g/L d'eau + vitamines et acides aminés libres 49g/L glucides 35 g/L lipides 34 g/L protides 9 g/L sel Densité : elle varie de 1.028 à 1.036 g/L pH (20ºC) : 6.5 - 6.7 Microflore : Lorsque le lait est prélevé dans de bonnes condition et à partir d'un animal sain, il contient très peu de microorganismes (Moins de 5000 germes par millilitre). Ces germes sont saprophytes c'est à dire non pathogènes. On trouve des bactéries appelées microcoques, streptocoques et lacto bacilles. Lors du transport et du stockage du lait à la ferme ou à l'usine, il est contaminé par une grande variété de microorganismes, une partie seulement pourra se développer si l milieu et la température leur convient, le résultat est que la flore du lait cru est à la fois complexe et variable selon l'échantillon et suivant l'age du lait. Parmi ces microorganismes contaminants, certains sont inoffensifs, d'autres sont pathogènes, certains enfin sont capable de provoquer une détérioration du lait. Conclusion sur la microflore : lorsque l'on parle des microorganismes du alit, il est plus juste de parler des microorganismes se développant dans le lait plutôt que de microorganismes entant que composants du lait.
