thèse

RÉSUMÉ
La thèse s’inscrit dans un projet de recherche global visant à caractériser les tumeurs thyroïdiennes sur
le plan moléculaire, afin de mieux comprendre leur physiopathologie et afin d’identifier des
biomarqueurs (signatures moléculaires) qui pourront être utilisés pour le diagnostic, le pronostic et
leur traitement. Parmi celles-ci, nous distinguons les adénomes autonomes (AA) et folliculaires (FTA)
tumeurs bénignes encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes
subdivisés en carcinomes différenciés, folliculaires (FTC) ou papillaires (PTC), et peuvent évoluer en
carcinomes anaplasiques (ATC), totalement dédifférenciés. Un autre type de tumeurs bénignes
différenciées, très rares, existe: l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH). Ces tumeurs
sont causées pour la plupart par des mutations qui activent de manière constitutive des cascades de
signalisation, essentiellement la cascade de l’AMPc et la cascade des MAPK. Le but de notre thèse
était de valider un système expérimental in vitro des PTC, d’étudier les profils d’expression génique
des FNAH et de les comparer avec ceux des AA, et de définir les profils ARNm et miRNA des ATC
pour les comparer à ceux des PTC pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Pour
réaliser ces objectifs, nous avons utilisé la technologie des microarrays qui permet d’analyser
simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes conditions. Nous avons donc utilisé
une approche multidisciplinaire alliant une partie expérimentale et une partie bioinformatique.
La première partie du travail a consisté à réaliser un modèle d’étude in vitro pour caractériser les PTC
au niveau moléculaire. A cet effet, des cultures primaires de thyrocytes ont été traitées avec de l’EGF
et du sérum pendant différents temps (1,5h, 3h, 16h, 24h et 48h) ce qui stimule la cascade des MAPK,
activée constitutivement dans les PTC. Nous avons hybridé sur des lames microarrays maison les
différents échantillons et nous avons montré que les cultures primaires stimulées pendant des temps
longs (24h et 48h) ont des profils d’expression génique qui ressemblent à ceux des PTC et constituent
donc un bon modèle d’étude de cette tumeur.
La seconde partie a pour objectif de définir les phénotypes moléculaires et fonctionnels des FNAH et
de les comparer aux AA. Ces deux pathologies résultent d’une mutation dans le récepteur de la TSH
(TSHR) activant de manière constitutive la cascade de l’AMPc. Dans le cas des FNAH, la mutation est
héréditaire et toute la glande est affectée contrairement aux AA où la mutation survient plus tard,
généralement à l’âge adulte, et où seule une partie de la glande est affectée. Nous avons comparé le
profil d’expression génique des FNAH avec celui des AA, par hybridation sur des lames microarrays
HEEBO. L’intégration de ces différentes données montre que les AA et les FNAH sont deux soustypes différents de la même maladie: l’hyperthyroïdie génétique. Les caractéristiques de chacun de ces
sous-types dépendent de l’intensité de la mutation, du nombre de cellules initialement affectées et du
stade de développement au moment duquel la mutation survient.
Dans la dernière partie de ce travail, nous avons caractérisé les ATC au niveau du profil d’expression
des ARNm et des miRNA par hybridation respectivement sur lames Affymetrix ou sur lames miRNA
maison et au niveau de leur état mutationnel du gène p53. Le profil d’expression génique des ATC a
été comparé avec celui des PTC afin de mettre en évidence des gènes différentiellement exprimés
entre les 2 types de cancers, que nous avons ensuite tenté d’invalider par siRNA, dans un modèle in
vitro de lignée cellulaire thyroïdienne dérivée d’un ATC (8505C). Les résultats obtenus jusqu’ici ne
sont malheureusement pas prometteurs. Le profil d’expression des miRNA nous a permis d’identifier
une signature de 34 miRNA caractéristique des ATC.
1
AVANT-PROPOS
Premièrement, je tiens à remercier tous ceux qui m’ont apporté aide et conseils
durant ma thèse et particulièrement le Pr. Vassart, pour m’avoir accueillie au sein
de son laboratoire, le Pr. Dumont pour ses conseils, les discussions enrichissantes et
son optimisme à toute épreuve et aussi ma promotrice de recherche, Dr. Carine
Maenhaut, pour son attention, sa disponibilité et ses bons conseils scientifiques.
J’aimerais également adresser des remerciements particuliers à Chantal Degraef qui
m’a appris, avec patience, la rigueur des techniques de laboratoire, Dr. Anne Lefort
et Dr. Frédérick Libert pour leur expertise et pour nous avoir fourni une partie des
lames microarrays.
Je remercie également tous les membres du laboratoire, pour leurs conseils
scientifiques avisés et leurs attentions, qui ont fait de mon séjour à l’IRIBHM une
expérience unique et inoubliable, soit Wilma, Sébastien, Sandra, Geneviève,
Soetkin, Julie, Sheela, Sara, Vanessa et les bioinformaticiens, David et Vincent. Je
remercie aussi Danièle, Joëlle, Yves, Claude et Christian de m’avoir apporté leur
soutien logistique et informatique. Je tiens aussi à remercier toute ma famille.
Ce travail de recherche a pu être mené à bien grâce au soutien et au financement du
FNRS (Télévie), de la bourse Van Buuren et de la Fondation de la Vocation qui m’a
permis d’effectuer un stage dans le laboratoire du Pr. Patrick Brown, Université de
Stanford.
2
LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS
AA : autonomous adenoma
AMPc : cyclic adenosine monophosphate
ARNdb: double-stranded RNA
ATC : anaplastic thyroid carcinoma
DAG : diacylglycerol
DIT: diiodotyrosine
EGF : epidermal growth factor
EMT : epithelial-mesenchymal transition
EPAC: exchange protein directly activated by cAMP
ERK: extracellular signal-regulated kinase
FBS: fetal bovine serum
FGF: fibroblast growth factor
FTA: follicular thyroid adenoma
FNAB: fine needle aspiration biopsy
FNAH: familial nonautoimmune hyperthyroidism
FTC: follicular thyroid carcinoma
GDP : guanosine diphosphate
GTP : guanosine triphosphate
HGF: hepatocyte growth factor
IGF-1: insulin-like growth factor
IP3: inositol-1,4,5-triphosphate
IP: inositol phosphate
Lowess: locally weighted scatter plot smoothing
MAPK: mitogen-Activated Protein kinase
MDS: multidimensional scaling
miRISC: miRNA-containing RNA-induced silencing complex
miRNA : microRNA
MIT : monoiodotyrosine
NIS : Na+/I- symporter
3
PCR : polymerase chain reaction
PDC: poorly differentiated carcinoma
PDGF: platelet derived growth factor
PDK1: phosphatidylinositol-dependent kinase 1
PI3K: phosphoinositide 3-kinase
PIP2 : phosphatidylinositol-4,5-biphosphate
PKA : cAMP dependent protein kinase
PKC : protein kinase C
PLC : phospholipase C
PTC: papillary thyroid carcinoma
PTEN: phosphatase with tensin homology
qRT-PCR: quantitative RT-PCR
RISC: RNA-induced silencing complex
RT-PCR: reverse transcription PCR
SAM: significant analysis of microarrays
SCNAH: sporadic congenital nonautoimmune hyperthyroidism
siRNA : small interfering RNA
T3: triiodotyronine
T4: thyroxine
Tg: thyroglobulin
TPO: thyroid peroxydase
TRH: thyrotropin releasing hormone
TSH: thyroid stimulating hormone or thyrotropin
TSHR: TSH receptor
4
TABLE DES MATIERES
CHAPITRE I : INTRODUCTION
8
1. Le cancer
1.1 Introduction
1.2 Génétique et cancer
1.3 Morphologie des cellules cancéreuses
1.4 Caractéristiques des cellules cancéreuses
1.5 L’angiogénèse
1.6 La lymphangiogénèse
8
8
8
9
9
10
11
2. La thyroïde
2.1 La thyroïde normale
2.1.1 Introduction
2.1.2 Synthèse des hormones thyroïdiennes
2.1.3 Régulation des cellules thyroïdiennes
2.1.4 Cascades de signalisation principales impliquées dans la prolifération
thyroïdienne normale.
2.2 Tumeurs thyroïdiennes
2.2.1 Introduction
2.2.2 Tumeurs bénignes
2.2.3 Tumeurs malignes
2.3 Modèles expérimentaux in vitro des tumeurs thyroïdiennes
2.3.1 Cultures primaires de cellules thyroïdiennes humaines
2.3.2 Lignées cellulaires
11
11
11
12
14
3. Régulation post-transcriptionnelle des protéines : les miRNA
3.1 Introduction
3.2 Biosynthèse des miRNA
3.3 miRNA et Cancers
27
27
28
29
4. Analyse de l’expression génique par microarrays.
4.1 Principe général
4.2 Microarrays double canaux
4.3 Microarrays simple canal: les lames Affymetrix
29
29
30
31
5. Analyse des données microarrays
5.1 Correction du bruit de fond
5.2 La normalisation
5.2.1 La normalisation par rapport à la moyenne globale des intensités
5.2.2 La normalisation par rapport à des gènes de contrôle externes
5.2.3 La normalisation «Lowess »
5.3 La mesure de l’expression différentielle : SAM
5.4 Visualisation des données
5.4.1 Le clustering hiérarchique
31
31
32
32
32
33
33
34
34
14
18
18
19
22
26
26
27
5
5.4.2 Le MDS (Multidimensional Scaling)
35
6. Analyses fonctionnelles in vitro
6.1 Introduction
6.2 SiRNA
35
35
35
CHAPITRE II : BUT DU TRAVAIL
37
CHAPITRE III : RESULTATS
39
1. Validation d’un modèle expérimental des carcinomes papillaires : les
thyrocytes humains en culture primaire stimulés par de l’EGF et du sérum. 39
2. Caractérisation moléculaire de deux tumeurs thyroïdiennes bénignes : les
adénomes autonomes et l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale
51
3. Caractérisation moléculaire des carcinomes anaplasiques (ATC)
3.1 Analyse des mutations p53
3.2 Analyse fonctionnelle par SiRNA
3.3 Etude de l’expression des miRNA dans les ATC par microarrays.
61
61
62
67
CHAPITRE V : MATERIELS ET METHODES
76
1. Matériels
1.1 Lignées cellulaires
1.2 Milieux de culture
1.3 SiRNA
1.4 Agent de transfection
1.5 Solutions pour la manipulation des protéines
1.5.1 Lyse des cellules
1.5.2 Quantification des protéines
1.5.3 Séparation des protéines
1.5.4 Immunodétection (Western blotting)
1.6 Anticorps
1.6.1 Anticorps primaires
1.6.2 Anticorps secondaires
1.7 Amorces pour le séquençage de p53
76
76
76
76
76
77
77
77
77
77
78
78
78
78
2. Méthodes
79
2.1 Analyse de l’expression génique sur lames Affymetrix
79
2.1.1 Hybridation
79
2.1.2 Traitement des données pour l’analyse ATC et PTC
79
2.2 Analyse de l’expression des miRNA sur lames « maison »Lames microRNA
79
2.2.1 Hybridation
79
2.2.2 Traitement des données pour l’analyse miRNA
80
2.3 Transfection des siRNA dans les lignées cellulaires
80
6
2.4 Analyse des protéines
2.4.1 Lyse des cellules
2.4.2 Quantification des protéines
2.4.3 Séparation des protéines par électrophorèse
2.4.4 Immunodétection (Western blotting)
2.5 Séquençages d’ADN
CHAPITRE VI : BIBLIOGRAPHIE
81
81
81
81
82
82
83
7
CHAPITRE I : INTRODUCTION
1. Le cancer
1.1 Introduction
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération incontrôlée des
cellules au sein d’un tissu normal de l’organisme. Ces cellules dérivent toutes
d’une seule cellule qui a acquis certaines caractéristiques lui permettant de se
diviser indéfiniment. Au cours de l’évolution de la maladie, certaines cellules
peuvent se détacher de la tumeur, migrer et former des métastases. Le nombre de
cancer est en augmentation, probablement dû à des facteurs environnementaux, au
mode de vie, au vieillissement de la population et à de meilleures méthodes de
détection. De 1980 à 2005, le nombre de cancers a augmenté de 35 % pour les
hommes et de 43 % pour les femmes. Le nombre de décès par cancer en France,
en 2004, est de 241 pour 100 000 habitants. C’est donc la première cause de
mortalité juste avant les maladies cardio-vasculaires. Les 3 cancers les plus
fréquents chez l’homme sont celui de la prostate, du poumon et du colon-rectum
et chez la femme, celui du sein, du poumon et du colon-rectum (Figure 1).
1.2 Génétique et cancer
Trois grandes catégories de gènes sont associées aux pathologies cancéreuses : les
oncogènes, les gènes suppresseurs de tumeurs et les gènes de réparation de l’ADN
(1).
1. Les oncogènes (appelés proto-oncogènes dans leur version normale) sont
les régulateurs positifs de la prolifération cellulaire. Des mutations
activatrices dominantes leur confèrent une activité constitutive (la
mutation d’une seule des deux copies du gène est suffisante).
Actuellement plus de 100 oncogènes ont été identifiés, dont les plus
connus sont les gènes ras, myc, ou abl.
8
Introduction
2. Les gènes suppresseurs de tumeurs sont des régulateurs négatifs de la
prolifération cellulaire. Des mutations récessives les rendent inactifs (les
deux copies de ces gènes sont inactivées dans les cancers).
3. Les gènes de réparation codent pour des protéines capables de détecter et
de réparer les lésions de l’ADN et sont également souvent inactivés dans
les cellules cancéreuses.
1.3 Morphologie des cellules cancéreuses
Les cellules tumorales acquièrent des propriétés nouvelles lors de la
transformation maligne. La cellule tumorale est souvent plus grande, avec une
augmentation du volume nucléaire. Elle présente généralement un noyau d’aspect
irrégulier. Le cytoplasme est souvent peu abondant avec un réseau de filaments
d’actine désorganisé et une augmentation du nombre de ribosomes. Le nombre de
mitochondries est réduit. Celles-ci sont parfois fragmentées et présentent un
nombre de crêtes inférieur à celui des cellules non cancéreuses. Le génome
mitochondrial peut se révéler anormal avec une quantité d’ADN augmenté. Les
membranes cellulaires ont un aspect irrégulier, une structure épaissie et présentent
des microvillosités. Les desmosomes sont également altérés ce qui rend les
cellules moins cohésives.
1.4 Caractéristiques des cellules cancéreuses

La division des cellules cancéreuses est incontrôlée: elles prolifèrent et
leur multiplication cause l’accumulation d’un grand nombre d’anomalies
génomiques, ce qui est un événement précoce et fréquent dans la
progression tumorale.

L’autonomisation de la fonction cellulaire: les cellules cancéreuses
perdent une partie des capacités de relation cellule-cellule et deviennent
moins sensibles aux régulations transmises par les cellules voisines.
9
Introduction

Perte d’inhibition de contact: les cellules cancéreuses poursuivent leur
prolifération même lorsqu’elles arrivent en contact les unes avec les
autres. Ce phénomène est à l’origine du développement d’une hyperplasie
et puis d’une tumeur .

Capacité de migration dans les tissus voisins: Les cellules métastatiques
peuvent se détacher du foyer tumoral, s’infiltrer au travers des tissus
voisins grâce à la sécrétion de protéases et éventuellement rejoindre la
circulation sanguine ou lymphatique. Les cellules métastatiques peuvent
ainsi se déplacer, tout en poursuivant leur prolifération, et peuvent alors
coloniser de nouveaux organes. La disposition d’une tumeur primitive à
métastaser dépend principalement de l’instabilité génomique et de
l’incapacité du système immunitaire à détruire les cellules tumorales au
cours du processus métastatique.

Perte de la nécessité d’ancrage: les cellules cancéreuses acquièrent la
capacité de se développer selon des conditions variables et de poursuivre
leur prolifération en milieu semi-fluide ou fluide.
1.5 L’angiogénèse
L’angiogénèse est le processus par lequel se forment de nouveaux vaisseaux
sanguins à partir du réseau vasculaire pré-existant. En effet, afin d’assurer leur
prolifération, les cellules tumorales ont besoin d’un apport en oxygène et en
nutriments proportionnels à leur forte consommation énergétique et d’éliminer les
déchets provenant de leur métabolisme. Tant que le volume de la tumeur est
inférieur à 1 ou 2 mm3, la simple diffusion à travers la paroi des vaisseaux à
proximité suffit généralement à permettre ces échanges. La distance maximale
entre le foyer et un vaisseau excède rarement 150 à 200 microns, au-delà,
l’oxygène est consommé avant d’atteindre les cellules centrales. Pour poursuivre
son développement prolifératif et répondre à cette nécessité de vascularisation, la
tumeur doit donc synthétiser et sécréter des facteurs de croissance de vaisseaux
destinés à stimuler l’angiogénèse à sa proximité immédiate. Les vaisseaux des
10
Introduction
tumeurs solides ne sont plus ordonnés en artères, capillaires et veines et n’ont plus
de diamètres réguliers (2).
1.6 La lymphangiogénèse
D’une manière analogue au processus angiogénique, les tumeurs ont la capacité
d’induire la formation de néo-vaisseaux lymphatiques en direction du tissu
tumoral, à partir de vaisseaux préexistants. Ceux-ci permettent d’assurer le
drainage du tissu tumoral. Certains cancers, comme ceux du sein, de la thyroïde,
du poumon, de la peau, des testicules, du col de l’utérus, ainsi que les tumeurs
gastriques, ont un mode de dissémination métastatique qui s’effectue
préférentiellement par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques. En effet, ceuxci irriguent tous les tissus (à l’exception du cerveau) et possèdent un endothélium
très fin formé d’une couche unique discontinue de cellules aplaties bordée par une
membrane basale interrompue voire inexistante. Leur paroi est plus souple que
celle des capillaires sanguins et la dégradation de l’endothélium par les enzymes
protéolytiques synthétisées par les cellules métastatiques est donc plus efficace.
Les capillaires lymphatiques présentent un diamètre plus important que les
capillaires sanguins et offrent ainsi une plus grande surface de contact pour
l’intrusion des cellules malignes. De plus, le flux à l’intérieur des vaisseaux
lymphatiques est significativement plus faible que celui du système sanguin et la
différence de pression en résultant pourrait favoriser la pénétration à l’intérieur du
réseau lymphatique.
2. La thyroïde
2.1 La thyroïde normale
2.1.1 Introduction
La thyroïde est une glande endocrine de 10 à 20 grammes, constituée de deux
lobes unis par un isthme médian, et située à la base de la partie antérieure du cou
11
Introduction
(Figure 2). L’unité fonctionnelle de la thyroïde est le follicule, constituée
principalement de thyrocytes (70% des cellules de la thyroïde), cellules cubiques
et polarisées entourant une lumière contenant la colloïde (Figure 3). Le principal
constituant de cette colloïde est une glycoprotéine, la thyroglobuline, précurseur
des hormones thyroïdiennes T3 (tri-iodothyronine) et T4 (tétra-iodothyronine ou
thyroxine). T4 est l’hormone inactive et peut être désiodée en T3, l’hormone active
ou en rT3, inactive, selon les besoins de l’organisme. Les hormones thyroïdiennes
sont nécessaires à la croissance, au développement de tous les tissus (squelette,
système nerveux et cardiovasculaire,…). Elles participent également au
métabolisme des glucides et des lipides et stimulent les fonctions végétatives et le
métabolisme général de l’organisme.
Outre les thyrocytes, la thyroïde est aussi constituée de cellules C ou
parafolliculaires qui produisent la calcitonine, de cellules endothéliales formant la
paroi des vaisseaux et de fibroblastes.
2.1.2 Synthèse des hormones thyroïdiennes
La synthèse des hormones thyroïdiennes peut être divisée en trois grandes
étapes (Figure 4):
2.1.2.1 Captation et organification de l’iodure
L’iodure est capté au niveau de la membrane basolatérale du thyrocyte grâce à un
mécanisme de transport actif utilisant une pompe à iode, le symporteur Na+/I(NIS). L’iodure est ensuite transporté du cytoplasme dans la lumière folliculaire à
travers la membrane apicale par un transport passif. Deux transporteurs potentiels
ont été identifiés, la pendrine et l’AIT (Apical Iodide Transporter). Leur fonction
de transporteur d’iode est néanmoins controversée.
12
Introduction
2.1.2.2 Iodation de la thyroglobuline
L’iodure est oxydée par la thyroperoxydase (TPO) en présence de H2O2. L’ H2O2
est produit au niveau de la membrane plasmique apicale par deux NADPH
oxydases (THOX1 et THOX2). Une fois oxydé, l’iodure se fixe sur les résidus
tyrosines de la thyroglobuline (Tg) et forme des dérivés monoiodés (MIT) et
diiodés (DIT). Des couplages, catalysés par la TPO, entre deux groupes DIT
forment les hormones T4 tandis que des couplages entre un groupe DIT et un
groupe MIT forment les hormones T3 (Figure 5).
Figure 5: Synthèse de T3 et T4
2.1.2.3 Libération des hormones thyroïdiennes
La
thyroglobuline
chargée
d’hormones
T3
et
T4 est
endocytée
par
micropinocytose et la fusion avec des lysosomes mène au clivage protéolytique de
la thyroglobuline libérant T3 et T4 qui sont excrétées dans le flux sanguin. Les T4
sont désiodées en T3 en fonction de la nutrition et l’état fonctionnel de
l’organisme et l’iodure est recyclé. En cas de déficience en iode, une
augmentation relative de la synthèse de T3 par rapport à T4 est observée.
13
Introduction
2.1.3 Régulation des cellules thyroïdiennes
La fonction et la croissance de la thyroïde sont régulées par la TSH (thyrotropine
ou Thyroid Stimulating Hormone) qui est produite par l’hypophyse en réponse à
la TRH (Thyroid Releasing Hormone) produite par l’hypothalamus (Figure 6).
La sécrétion des hormones thyroïdiennes et leur régulation sont contrôlées par un
mécanisme de rétro-contrôle négatif. Lorsque la concentration sanguine
d’hormones thyroïdiennes diminue, l’hypothalamus libère de la TRH qui va
stimuler l’hypophyse entraînant la libération de la TSH. Cette dernière va induire
la production d’hormones thyroïdiennes. Au contraire, lorsque les hormones sont
abondantes dans le sang, elles inhibent la production de la TRH par
l’hypothalamus et de la TSH par l’hypophyse ce qui interrompt la stimulation
thyroïdienne et mène à l’arrêt de la sécrétion de T3 et T4.
L’effet positif de la TRH d’une part et l’effet négatif des hormones d’autre part
ont pour conséquence une grande stabilité du taux de TSH sanguin, et donc aussi
des hormones thyroïdiennes. Un niveau anormal de TSH indique généralement la
présence d’un désordre thyroïdien.
2.1.4 Cascades de signalisation principales impliquées dans la prolifération
thyroïdienne normale.
La
fonction
thyroïdienne
implique
principalement
quatre
cascades
de
signalisation: la cascade de l’AMPc, la cascade des inositols phosphates, la
cascade des MAPK et la cascade des PI3K (Figure 7). Leur stimulation par des
signaux extracellulaires comme les hormones, les facteurs de croissance ou les
neurotransmetteurs va initier une série de réponses en se liant à des récepteurs
membranaires spécifiques et activer un ensemble de gènes spécifiques du
stimulus. La majorité de ces gènes sont des facteurs de transcription qui
déclenchent alors l’expression de nouveaux gènes.
14
Introduction
2.1.4.1 Cascade de l’AMPc
L’activation de la cascade de l’AMPc stimule la prolifération et la différentiation
des thyrocytes (3). La TSH active cette cascade de signalisation tout comme la
forskoline (en activant l’adenylate cyclase), la choléra toxine (en activant la
protéine Gs) et les analogues de l’AMPc (4;5). La présence d’insuline ou d’IGF-I
avec la TSH est requise pour un effet mitogénique (6-8). Les thyrocytes stimulés
par la TSH présentent une morphologie d’épithélium cuboïdal (9). La TSH induit
l’expression de gènes de différenciation spécifiques de la thyroïde tels que Tg,
TPO, NIS, TSHR, THOX1 et THOX2. La transcription de ces gènes de
différenciation est régulée essentiellement par trois facteurs de transcription:
TTF1, TTF2 et PAX8 qui agissent de manière coordonnée.
Le récepteur de la TSH (TSHR) est un récepteur à sept domaines
transmembranaires. Lorsque la TSH se lie au récepteur, celui-ci, par
l’intermédiaire de la sous-unité α de la petite protéine Gs (Gαs) catalysant le
remplacement du GDP par du GTP, active l’adénylate cyclase, provoquant une
augmentation du taux intracellulaire d’AMPc (Figure 7 en mauve). L’AMPc se lie
à la sous-unité régulatrice de la protéine kinase A (PKA). La sous-unité
catalytique de PKA entre dans le noyau et phosphoryle des protéines nucléaires
spécifiques. L’AMPc active également EPAC (Exchange Proteins directly
Activated by AMPc) et par conséquent la petite protéine G, Rap1. La cascade de
l’AMPc est aussi contrôlée par de nombreux rétro-contrôles négatifs, parmi
lesquels les phosphodiestérases qui hydrolysent l’AMPc en ATP, induisant ainsi
l’arrêt du signal.
2.1.4.2 Cascade des inositols phosphates (IP)
L’activation de la cascade des IP induit également la prolifération mais inhibe
l’expression de la différentiation des thyrocytes. Celle-ci est activée des agents
comme le carbachol ou la TSH qui nécessite cependant une concentration 10 fois
plus élevée que pour l’activation de la cascade de l’AMPc (10-13).
15
Introduction
L’interaction du ligand avec son récepteur provoque la stimulation de la
phospholipase C (PLC) par l’intermédiaire de la sous-unité α de la protéine Gq
(Gαq) catalysant le remplacement du GDP par du GTP (Figure 7 en rose). La PLC
hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) situé dans la membrane
plasmique, en inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et en diacylglycérol (DAG). L’IP3
peut alors se lier à un récepteur spécifique du réticulum endoplasmique et
entraîner la libération de Ca2+. Le DAG active la protéine kinase C (PKC) qui à
son tour va phosphoryler spécifiquement des protéines en aval. La PKC peut
également être activée directement par les esters de phorbol et les analogues du
diacylglycérol.
2.1.4.3 Cascade MAPK
La cascade des MAPK est généralement exprimée dans tous les types cellulaires
et induit la prolifération, l’apoptose, la survie, la migration et le développement.
Dans les thyrocytes, la cascade des MAPK (ERK1/2) est activée par les facteurs
de croissance comme l’EGF et l’HGF, et son activation induit la prolifération et
inhibe l’expression de la différentiation des thyrocytes. Comme dans le cas de la
TSH, la combinaison d’insuline ou d’IGF-1 et d’EGF est requise pour un effet
mitogène (14;15). L’HGF, par contre, ne requiert pas d’insuline ou d’IGF-1 pour
exercer son effet mitogène (16-18). Les thyrocytes stimulés avec de l’EGF
présentent une morphologie fusiforme, similaire à des fibroblastes (19).
La liaison d’un facteur de croissance à son récepteur conduit à la dimérisation
puis à l’autophosphorylation de résidus tyrosine du récepteur et ensuite au
recrutement de protéines adaptatrices comme Grb2-Sos (Figure 7 en vert). Ce
complexe active la protéine Ras (en catalysant le remplacement du GDP par du
GTP) qui recrute à son tour la sérine thréonine kinase Raf (ou MAPKKK) près de
la membrane. Raf phosphoryle les MAPKK (ou MEK) qui phosphorylent à leur
tour les MAPK (ERK1/2) qui migrent dans le noyau pour activer des facteurs de
transcription spécifiques comme Elk-1, c-Jun et ATF-2.
16
Introduction
Trois sous-familles de protéines MAPK ont été caractérisées chez les vertébrés:
- les protéines ERK (Extracellular signal-Regulated Kinases) (ERK1/2 ou
p42/p44), qui sont phosphorylées par MEK1 et MEK2 sur la séquence Thr-GluTyr. Elles sont activées par les facteurs de croissance, le sérum, les phorbol esters
et cytokines (20).
- les protéines JNK (Jun N-terminal Kinases) (JNK1/2), qui sont phosphorylées
par MEK4 et MEK7 sur la séquence Thr-Pro-Tyr. Elles sont activées par les
cytokines et l’exposition à un stress environnemental comme les radiations
ionisantes, le stress oxydatif et le dommage à l’ADN (21).
- les protéines p38 qui sont phosphorylées par MEK3, MEK6 et MEK7 sur la
séquence Thr-Gly-Tyr. Elles sont activées par l’exposition à un stress cellulaire
comme la radiation aux UV, le choc osmotique, l’hypoxie et les cytokines (22).
2.1.4.4 Cascade des PI3K/Akt
Les facteurs de croissance à récepteurs tyrosines kinases stimulent cette cascade
en activant la PI3K directement ou via RAS.
La PI3K activée convertit le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) situé
dans
la
membrane
plasmique,
en
phosphatidylinositol
4,5-triphosphate
(PIP3) (Figure 7 en bleu). PIP3 recrute et active la PDK1 (phosphatidylinositoldependent kinase 1). PDK1 phosphoryle et active la protéine kinase B (PKB ou
Akt) qui, à son tour phosphoryle différents substrats. La phosphatase (PTEN
(tumor-suppressor phosphatase with tensin homology), un suppresseur de tumeur,
régule négativement la cascade PI3K en déphosphorylant PIP3 en PIP2.
2.1.4.5 Conclusion
Les cascades de l’AMPc, des MAPK et PI3K induisent la prolifération des
thyrocytes. Toute mutation dans une de ces cascades peut donc avoir comme
conséquence une prolifération anormale des thyrocytes et entraîner la
tumorigénèse.
17
Introduction
2.2 Tumeurs thyroïdiennes
2.2.1 Introduction
Les tumeurs thyroïdiennes sont les tumeurs endocrines les plus fréquentes
représentant environ 1% de l’ensemble des tumeurs. Environ 5 % de la population
serait porteuse d’un nodule visible à l’œil nu ou détectable par la palpation du
cou. Il est plus fréquent chez la femme que chez l’homme (2-3 :1), le sujet âgé,
les sujets vivants en zone de carence iodée ou ayant subi une irradiation de la
région cervicale durant l'enfance. Vingt à 40% des femmes de plus de 50 ans ont
des nodules cliniquement détectables. L’incidence du cancer thyroïdien et
particulièrement le cancer papillaire, croit de 8.1 et 6.2% par an respectivement
chez la femme et chez l’homme depuis 1970 (23) (Figure 8). Les sujets jeunes
sont plus exposés au développement du cancer du fait d'une plus grande
sensibilité de leur thyroïde à l'irradiation.
Même si les nodules thyroïdiens sont habituellement asymptomatiques, un
diagnostic est nécessaire si l’on soupçonne leur présence, car environ 5 % des
masses palpables sur la thyroïde sont cancéreuses (23). De plus, un nodule
toxique produit un excès d’hormones thyroïdiennes, ce qui cause un état
d’hyperthyroïdie, avec des symptômes plus ou moins prononcés (palpitations,
tremblements, nervosité, diarrhée). À long terme, l’hyperthyroïdie est néfaste
pour le corps. Toutefois, un traitement adapté permet de rétablir un taux
d’hormones normales.
Les tumeurs sont classées en tumeurs bénignes (adénomes) et tumeurs malignes
(carcinomes). On distingue les carcinomes (>1cm) des microcarcinomes (<1cm) :
ceux-ci sont beaucoup plus fréquents que les carcinomes (5 à 36% des adultes à
l’autopsie) et ont un potentiel évolutif très faible. Des altérations génétiques
causent et caractérisent les différents types de tumeurs thyroïdiennes ce qui les
rend particulièrement intéressantes à étudier pour comprendre les mécanismes
généraux de la carcinogénèse (Figure 9). Ces altérations peuvent être soit des
18
Introduction
mutations soit des réarrangements chromosomiques qui ont pour conséquence de
donner un avantage prolifératif à la cellule concernée par rapport aux autres.
Une tumeur maligne est suspectée si le nodule est solide, irrégulier ou s’il ne
capte plus d’iode à la scintigraphie. Une cytoponction à l’aiguille fine (Fine
Needle Aspiration Biopsy ou FNAB) permet de diagnostiquer les principaux
types de tumeur. Pour les tumeurs malignes, la thyroïdectomie totale est souvent
de rigueur avec un traitement complémentaire à l’I131 pour les tumeurs qui captent
encore l’iode afin de détruire d’éventuels restes de tissu cancéreux (les
carcinomes anaplasiques et les carcinomes médullaires ne sont pas concernés par
ce traitement). Les cancers thyroïdiens les plus fréquents (papillaires et
folliculaires) sont guéris dans 80 à 90% des cas (23). Des métastases à distance
sont observées dans 10% des cas, le plus fréquemment dans les poumons et les os
(23).
Cependant, la classification et le diagnostic des différentes tumeurs sont
compliqués et subjectifs, et dépendent très fort du pathologiste (24;25). En effet,
dans 10 à 20% des cas, il n’est pas possible de poser un diagnostic précis entre
adénome folliculaire et carcinome folliculaire. Dans le cas d’une lésion suspecte,
les patients subissent une opération chirurgicale, mais seulement 8 à 17% des
nodules se révèlent malins. Par conséquent, une amélioration des outils
diagnostiques préopératoires permettrait d’éviter des résections chirurgicales qui
se révèlent à posteriori inutiles (26;27).
2.2.2 Tumeurs bénignes
2.2.2.1 Adénomes autonomes
Les adénomes autonomes hyperfonctionnels (AA) ou nodules « chauds » sont des
tumeurs monoclonales, bordées d’une capsule fibreuse. Elles sont constituées de
cellules possédant une hyperactivité proliférative et fonctionnelle mettant le reste
de la glande au repos. Elles sont diagnostiquées chez les patients âgés entre 30 et
60 ans et spécialement dans les régions où la consommation d’iode est moindre
(47% des cas) (28;29).
19
Introduction
Les AA sont caractérisés par une croissance lente (prolifération cellulaire
principalement à la périphérie du nodule) (30) et un faible taux d’apoptose
(31;32). Les patients ont un taux de TSH bas et un niveau de T4 et T3 normales ou
élevées (33;34).
Les AA présentent des mutations activatrices du TSHR (70-80%) ou de Gs (8%)
menant à une activation constitutive de la voie de l’AMPc qui induit la
prolifération et la différenciation des thyrocytes (35). Dans 20-30% des adénomes
autonomes, aucune mutation du TSHR ou de Gs n’a été trouvée ce qui suggère
l’existence d’altérations génétiques dans d’autres protéines impliquées dans la
cascade de l’AMPc.
2.2.2.2 Hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH) et hyperthyroïdie
congénitale sporadique (SCNAH)
La FNAH et le SCNAH sont deux maladies thyroïdiennes rares apparaissant au
cours de l’embryogenèse, causées par une mutation dans le récepteur de la TSH
activant de manière constitutive la voie de l’AMPc et dans certains cas, la cascade
des inositols phosphates. Dans le cas des FNAH, la mutation est héréditaire alors
que dans le cas des SCNAH, elle survient pendant la gestation. Dans les deux cas,
toute la glande est affectée contrairement aux AA où la mutation survient plus
tard, généralement à l’âge adulte, et dans lesquels seule une partie de la glande est
affectée. Ces rares cas de FNAH et de SCNAH doivent être différenciés de la
maladie de Graves, forme bien plus courante d’hyperthyroïdie, causée par le
passage d’anti-corps maternels qui stimulent le TSHR. Cette hyperthyroïdie est
transitoire chez le foetus, la glande redevenant normale peu après la naissance,
suite à la disparition des anticorps. Jusqu’à aujourd’hui, 31 mutations différentes
ont été identifiées dans les FNAH et SCNAH. Celles-ci sont dominantes et
principalement localisées dans le domaine transmembranaire du récepteur
(exon10) (36-59). La majorité des mutations affectant le TSHR est propre à
chacune des deux pathologies : 73% des mutations du TSHR des SCNAH sont
aussi trouvées dans AA alors que seulement 27% des mutations des FNAH sont
communes avec les AA. La pathologie de SCNAH est plus sévère que celle de
20
Introduction
FNAH ce qui laisse supposer que les mutations affectant les AA et SCNAH sont
plus agressives que celles affectant FNAH (60-62). Les signes cliniques de ces
deux pathologies sont reprises dans le tableau ci-contre (Table 1). Les patients
présentent un taux de TSH bas et de T3 et T4 élevés (63). Contrairement aux AA,
la thyroïdectomie est le seul traitement pour guérir les patients FNAH ou
SCNAH. Du propylthiouracil est généralement administré. Son avantage par
rapport au méthimazole ou au carbimazole, c’est qu’en plus de bloquer la
synthèse des hormones thyroïdiennes, il diminue la conversion de T4 en T3 (64).
2.2.2.3 Adénomes folliculaires
A l’inverse des adénomes autonomes hyperfonctionnels, les adénomes
folliculaires (FTA) froids ou nodules « froids », sont caractérisés par une
diminution d’activité. Environ 5% d’entre eux peuvent évoluer en carcinomes
folliculaires. Ils sont principalement caractérisés par des mutations activatrices de
RAS et des réarrangements chromosomiques PAX8-PPARγ (30%).
Les protéines RAS sont des protéines G qui hydrolysent le GTP en GDP et
activent la cascade des MAPK et PI3K/Akt. Il existe trois sous-types de RAS : HRAS, K-RAS et N-RAS et des mutations activatrices dans les gènes
correspondants sont détectées dans plus de 30% des cancers (dans le codon 61
pour H-RAS et N-RAS et dans le codon 12 pour K-RAS).
Le gène PAX8 code pour un facteur de transcription requis pour la régulation de
l’expression de gènes spécifiques thyroïdiens. PPARγ est un membre de la
superfamille des récepteurs hormonaux et a été décrit comme un suppresseur de
tumeurs
(65).
Le
réarrangement
PAX8-PPARγ
est
une
translocation
chromosomique qui génère une protéine à un effet dominant négatif sur PPARγ.
La cascade de signalisation PI3K/Akt est dérégulée dans 31% des adénome
folliculaire (66).
21
Introduction
2.2.3 Tumeurs malignes
L’organisation histologique et l’état de différenciation des thyrocytes permettent
de distinguer les carcinomes différenciés (carcinome papillaire (PTC) ou
carcinomes folliculaires (FTC)) et les carcinomes dédifférenciés (carcinomes
anaplasiques (ATC)).
2.2.3.1 Carcinomes papillaires
Les carcinomes papillaires (PTC) représentent 85-90% des carcinomes
thyroïdiens et 1% des cancers humains. Ils ont un bon pronostic avec un taux de
survie de 80-90% sur 5-10 ans. Ils touchent toutes les tranches d’âges mais plus
particulièrement les 30 à 40 ans (67). Les PTC métastasent souvent dans les
ganglions par voie lymphatique mais peu dans les poumons et les os (5 à 7 % au
moment du diagnostic). Les PTC sont reconnaissables par leur architecture en
papille et l’aspect caractéristique de leur noyau (aspect vitreux « en verre dépoli »
et irrégulier avec des inclusions). Différents sous-types de PTC existent dont la
variante classique (la plus courante), la variante folliculaire (ressemblant à un
FTC mais avec les caractéristiques nucléaires des PTC), la variante à grandes
cellules (chez les patients plus âgés et de moins bon pronostic), la variante solide
(très agressive). Les PTC sont caractérisés par l’activation constitutive de la voie
des MAPK qui induit la prolifération et la dédifférenciation des thyrocytes.
L’altération d’un seul élément de cette cascade est suffisante in vitro pour induire
la transformation cellulaire et in vivo pour induire un PTC chez la souris (68-72).
Ces résultats suggèrent que l’activation constitutive de la cascade des MAPK est
un événement initiateur des PTC.
Les PTC présentent principalement des mutations ponctuelles activatrices dans la
protéine BRAF (40%), des réarrangements chromosomiques RET/PTC (20-80%,
principalement les réarrangements RET/PTC1 et RET/PTC3) et plus rarement des
mutations activatrices de RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS), des réarrangements de
TRK ou le réarrangement AKAP9/BRAF (73) (Table 2).
22
Introduction
BRAF code pour une sérine/thréonine kinase cytoplasmique qui intervient dans la
cascade de signalisation des MAPK/ERK1/2. Des mutations activatrices
mimiquent la phosphorylation de la protéine menant à une activité kinase
indépendante de RAS induisant la prolifération cellulaire (74). La mutation la
plus fréquente est la mutation de la thymine en position 1799 en adénine
(T1799A) qui résulte en une substitution de valine en acide glutamique en la
position 600 (V600E).
L’oncogène RET/PTC résulte de la fusion du domaine tyrosine kinase
intracellulaire du gène RET avec la partie 5’ d’un gène ubiquitaire possédant un
domaine de dimérisation (par exemple, H4 pour le réarrangement RET/PTC1 et
RFG/ELE1 pour le réarrangement RET/PTC3) (75). Le gène RET code pour un
récepteur membranaire à activité tyrosine kinase qui est impliqué dans la
régulation de la croissance, survie, différenciation et migration des cellules de la
crête neurale. Ce gène n’est normalement pas exprimé dans les thyrocytes, mais le
récepteur est présent dans les cellules C parafolliculaire. La protéine de fusion
RET/PTC possède une activité tyrosine kinase constitutive. Au moins 15
partenaires différents ont été identifiés à l’heure actuelle.
Le réarrangement TRK résulte de la fusion du proto-oncogène NTRK1 (récepteur
au NGF à activité tyrosine kinase) avec la région 5’ promotrice d’un gène
ubiquitaire (TPM3, TPR, TFG) (76). Comme pour les réarrangements RET/PTC,
la protéine chimérique est caractérisée par une activité tyrosine kinase
constitutive.
Le réarrangement AKAP9-BRAF résulte d’une inversion paracentrique du long
bras du chromosome 7 menant à la fusion des huit premiers exons de AKAP9
avec la région C- terminale du proto-oncogène BRAF (77). Cette fusion génère
une protéine à activité tyrosine kinase constitutive.
Les mutations activatrices BRAF sont principalement trouvées dans la variante
classique des PTC ou les PTC à grandes cellules et sont associées à un mauvais
pronostic (78;79). Elles concernent des patients plus âgés (au-delà de la
cinquantaine) qui ne répondent plus au traitement à l’iode radioactif et qui
présentent des extensions extrathyroïdiennes (80;81).
23
Introduction
Les réarrangements RET/PTC sont principalement trouvées dans les PTC radioinduits (ex. Tchernobyl) (82), RET/PTC3 dans les PTC à variante solide, forme
très agressive (83) et RET/PTC1 dans les PTC à variante classique, forme moins
agressive (84;85).
Les réarrangements de TRK et le réarrangement AKAP9/BRAF sont
principalement trouvés dans les PTC radio-induits.
En plus des mutations décrites ci-dessous, les mutations RAS et des
réarrangements PAX8/PPAR ont également été identifiés dans la variante
folliculaire des PTC (86-88).
Ces mutations ou réarrangements sont détectés dans plus de 70% des PTC et sont
mutuellement exclusives (89).
La cascade de signalisation PI3K/Akt est également dérégulée dans 24% des PTC
(90). La PI3KCA, sous-unité catalytique de la PI3K, est mutée et constitutivement
activée dans 2% des PTC et le gène correspondant est amplifié dans 12% des
PTC.
2.2.3.2 Carcinomes folliculaires
Les carcinomes folliculaires (FTC) représentent 10 à 20% des carcinomes
thyroïdiens et dérivent des adénomes folliculaires. Le taux de survie des patients
est de 60% sur 10 ans. Ces tumeurs touchent toutes les tranches d’âge mais plus
particulièrement les 50 à 60 ans (91). Contrairement aux PTC, 11-20% des FTC
métastasent dans les poumons et les os. La distinction entre le carcinome et
l’adénome folliculaire peut s’avérer extrêmement difficile. En effet, il n’existe
aucun critère cellulaire ou architectural qui, à lui seul, permette d’en affirmer la
malignité excepté la présence d’invasion capsulaire et/ou vasculaire. Les
carcinomes folliculaires sont principalement caractérisées par des mutations RAS
(N-RAS, K-RAS, H-RAS) (20-50%) et des réarrangements chromosomiques
PAX8/PPAR (25-50%) (Table 2).
La cascade de signalisation PI3K/Akt est dérégulée dans 55% des FTC (92). La
PI3KCA est mutée dans 8-13% des FTC et amplifiée dans 28% des FTC.
24
Introduction
2.2.3.3 Carcinomes anaplasiques
Les carcinomes anaplasiques (ATC) représentent 1-7 % des carcinomes
thyroïdiens (93). Les ATC sont une des tumeurs humaines les plus agressives
représentant plus de 40% des mortalités des cancers thyroïdiens (94;95). Malgré
les thérapies telles que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie,
traitements auxquels ces cancers répondent très mal, le taux de survie moyen n’est
que de 6 mois (96). Ces tumeurs touchent principalement les personnes au-delà
des 60 ans (97) et métastasent dans les poumons, la plèvre, les os et le cerveau
(98). Du point de vue histologique, ces tumeurs présentent de larges zones de
nécroses et sont très vascularisées.
Une partie des ATC semble dériver des FTC et PTC (99-102) et un des éléments
causal du passage des tumeurs différenciées à un état complètement dédifférencié
est la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur p53 dont les mutations
sont retrouvées dans environ 59% des ATC (103;104) (Table 2). La protéine p53
est un facteur de transcription qui agit comme suppresseur de tumeur en induisant
l’arrêt du cycle cellulaire, la sénescence, la réparation de l’ADN et diminue
l’angiogénèse (105-107). Les mutations p53 sont trouvées dans près de la moitié
des cancers de la tête et du cou, des ovaires, de l’œsophage, du colon et du
pancréas (108). La majorité des mutations p53 se situent dans la partie liant
l’ADN, l’empêchant de se lier à ce dernier (109;110). Néanmoins, la progression
de tumeurs différenciées à complètement dédifférenciées semble requérir la perte
de fonction d’autres gènes suppresseurs de tumeurs qui régulent négativement la
prolifération des cellules thyroïdiennes (111). L’agressivité des ATC est
principalement liée à l’activation des protéines de la cascade des MAPK. Entre 22
et 53% des ATC présentent une mutation RAS. Etant donné que les mutations
RAS sont principalement présentes dans les FTC et la variante folliculaire des
PTC, une fraction d’ATC dérive probablement de ces deux types de tumeurs
(112). Entre 15 et 26% des ATC présentent une mutation BRAF et ceux-ci
dérivent probablement des PTC (113;114). Par ailleurs, Aherne et al. ont
démontré que certains ATC ne dérivent ni de PTC ni de FTC mais sont la
conséquence d’une succession de mutations indépendantes (115). La β-caténine,
25
Introduction
composante de la cascade Wnt et régulateur de l’adhésion cellule-cellule, est
mutée dans 38-66% des ATC et dans 16-32% des carcinomes peu différenciés
mais pas dans les carcinomes différenciés. Une localisation nucléaire anormale est
retrouvée dans la moitié des échantillons contenant la mutation (116).
La cascade de signalisation PI3K/Akt est dérégulée dans 58% des ATC (117). La
PI3KCA est mutée dans 12-23% de ces tumeurs et des amplifications du gène
sont retrouvées dans 42% des ATC (118;119).
2.2.3.4 Carcinomes pauvrement différenciés
Les carcinomes pauvrement différenciés (PDC) regroupent les tumeurs
intermédiaires entre les tumeurs différenciées et anaplasiques. Les mutations
RAS, p53, BRAF et β-caténine sont principalement retrouvées dans ce type de
tumeur (Table 2).
2.3 Modèles expérimentaux in vitro des tumeurs thyroïdiennes
2.3.1 Cultures primaires de cellules thyroïdiennes humaines
Les cultures primaires de thyrocytes sont un bon modèle d’étude thyroïdien étant
donné qu’elles présentent une grande correspondance fonctionnelle et
biochimique avec le tissu d’origine. Après une digestion enzymatique de tissu
thyroïdien, les thyrocytes sont mis en culture pendant 4 jours. Ce modèle
expérimental a permis d’étudier in vitro les mécanismes moléculaires impliqués
dans la prolifération et la différenciation (120). Ces cultures primaires ont
également permis de réaliser un modèle d’étude des adénomes autonomes
hyperfonctionnels, caractérisés par une activation constitutive de la cascade de
l’AMPc, en stimulant les thyrocytes en culture primaire avec de la TSH, pendant
des temps longs (24h et 48h) (121).
26
Introduction
2.3.2 Lignées cellulaires
Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules provenant d’une
même cellule mère demeurant stable après des mitoses successives, et ayant en
théorie une capacité illimitée de division.
Différentes lignées cellulaires thyroïdiennes sont disponibles dans le laboratoire :
FTC-133 et WRO (provenant de carcinomes folliculaires), BCPAP et TPC-1
(provenant de carcinomes papillaires) et 8505C (provenant d’un carcinome
anaplasique). Ces lignées cellulaires ont un profil d’expression génique similaire
et sont plus près du profil d’expression génique des ATC que de celui de leur
tumeur d’origine ce qui permet de supposer qu’elles ont évoluées vers un
phénotype dédifférencié commun après avoir perdu toutes leurs caractéristiques
de départ. De plus, contrairement aux carcinomes différenciés, ces lignées ont
perdu l’expression de la plupart des gènes de différenciation de la thyroïde
(TSHR, NIS, TG, TPO, THOX2) et ne répondent plus à la TSH. Elles conservent,
néanmoins, l’expression de facteurs de transcription spécifiques dans la plupart
des lignées (TTF1, TTF2, PAX8). Les lignées cellulaires sont donc un meilleur
modèle pour les tumeurs dédifférenciées que pour les tumeurs différenciées (122).
3. Régulation post-transcriptionnelle des protéines : les miRNA
3.1 Introduction
Une cellule humaine contient plus de 3 milliards de paires de bases pour coder
plusieurs millions de polypeptides différents. On estime que le génome de
mammifères contient environ 20.000 gènes codant pour des protéines. Une cellule
fabriquerait à tout moment environ 5.000 polypeptides différents. La régulation
de l’expression des gènes est donc très complexe. Seules 1 à 2 % des séquences
d'ARN produites sont traduites en protéines. Il existe donc une multitude de
phénomènes capables de réguler la synthèse des protéines, en agissant à toutes les
étapes. Parmi les ARN non codants, les miRNA ont été identifiés comme des
acteurs majeurs dans la régulation de l'expression des gènes au niveau post27
Introduction
transcriptionnel. On estime à 30% les gènes humains potentiellement régulés par
des miRNA (123). Ils sont impliqués dans un grand nombre de fonctions
physiologiques essentielles telles que la croissance cellulaire, la différenciation,
l'apoptose, le métabolisme….
3.2 Biosynthèse des miRNA
Les miRNA sont des ARN simple brin d’une longueur de 21 à 25 nucléotides très
conservés au travers de l’évolution (124). Ils régulent négativement l’expression
génique à un niveau post-transcriptionnel en empêchant la traduction de l’ARNm
ou en induisant sa dégradation (125). Jusqu’à présent environ 800 miRNA
humains ont été identifiés (126). Ils sont transcrits majoritairement par l’ARN
polymérase II. En effet, les pri-miRNA, transcrits primaires des miRNA,
contiennent une structure CAP (7-méthyl-guanosine) en 5’ et une queue poly-A
en 3’. Ils contiennent également une structure en forme d’épingle à cheveux qui
est clivée par Drosha (Rnase III d’environ 160 kDa) pour aboutir au précurseur
pre-miRNA d’environ 70 nucléotides (Figure 10) (127). Le pre-miRNA est
ensuite exporté du noyau par l’exportine 5 et une fois dans le cytoplasme, il est
clivé par Dicer (Rnase III) en un petit ARN double brin d’environ 22 nucléotides
(un brin mature (miRNA) et un brin complémentaire (miRNA*)). Le miRNA* est
rapidement dégradé (128) et le miRNA mature est incorporé dans un complexe
effecteur, miRISC (miRNA-containing RNA-induced silencing complex),
complexe multiprotéique d’environ 500 kDa. Une des protéines essentielles qui le
compose est la protéine argonaute. Les miRNA, associés au complexe miRISC,
peuvent
inhiber
l’expression
génique
par
deux
mécanismes
post-
transcriptionnels : par clivage de l’ARNm cible si le miRNA se lie à l’ARNm
cible de manière parfaitement complémentaire ou par répression traductionnelle
de celui-ci si la complémentarité est imparfaite. Cependant chez les animaux, les
miRNA montrent généralement une complémentarité imparfaite.
28
Introduction
3.3 miRNA et Cancers
Depuis quelques années, les miRNAs ont été décrits comme dérégulés dans un
grand nombre de tumeurs. Ils peuvent agir comme oncogène ou en tant que
suppresseurs de tumeurs. La surexpression d'un miRNA contrôlant un gène
suppresseur de tumeur aboutit à une diminution de la production d'une protéine
anti-oncogénique (129;130). A l’inverse, un effet positif sur le développement
tumoral est observé en cas de diminution de l'expression d'un miRNA contrôlant
un oncogène (Figure 11). Par exemple, mir-21 voit son expression diminuer dans
les gliomes, les cancers du colon, du foie et de la glande thyroïde. Les miRNA de
la famille Let-7, inhibiteurs de la prolifération cellulaire contrôlant négativement
l'expression du proto-oncogène RAS, sont également diminués dans de nombreux
cancers.
Plusieurs études ont montré que la classification moléculaire des tumeurs basée
sur les microRNA (miRNA) est plus précise que celle basée sur les ARNm (131137). Etant donné que les miRNA sont des éléments régulateurs qui interviennent
en amont de la traduction des ARNm et peuvent donc réguler plusieurs gènes,
l’analyse des microarrays miRNA est souvent moins lourde que celle des
microarrays ARNm.
4. Analyse de l’expression génique par microarrays.
4.1 Principe général
Les microarrays permettent l’analyse simultanée de l’expression de plusieurs
milliers de gènes dans différentes cellules et dans différentes conditions
physiologiques, pathologiques ou toxicologiques. Le terme de « cible » (ou target)
désigne l’ARNm que l’on cherche à identifier ou à quantifier, tandis que le terme
de « sonde » (ou probe) correspond à une séquence nucléotidique connue et est
soit greffée sur le support, soit synthétisée in situ. Le terme spot désigne
l’ensemble des sondes identiques à un endroit précis de la lame de microarrays.
La cible marquée d’un fluorophore s’hybride sur la sonde et le signal en résultant
29
Introduction
est proportionnel à la quantité d’ARNm présent dans la cellule dont il provient.
Deux technologies sont principalement utilisées pour analyser les ARNm : les
microarrays double canaux et les microarrays simple canal. Les microarrays
permettent également l’analyse simultanée de l’expression de miRNA dans
différentes conditions.
4.2 Microarrays double canaux
Ces microarrays sont constitués de lames de verre sur lesquelles des milliers
d’ADNc ou oligonucléotides sont déposés: chaque gène (de fonction connue ou
inconnue) est représenté par un seul point sur la lame. Deux échantillons d’ARN,
l’un issu d’une population cellulaire contrôle et l’autre issu de la population à
étudier, sont réverse-transcrits en ADNc, et marqués par des fluorophores
différents (cyanine-5, rouge et cyanine-3, vert). Les deux échantillons sont ensuite
déposés simultanément sur le microarray de manière à s’hybrider avec les
séquences complémentaires présentes sur la lame. Le microarray est ensuite
analysé par un scanner à laser (microscope confocal). Selon la longueur d’onde
émise par le laser, le scanner détectera le signal renvoyé par l’un ou l’autre
fluorophore. Le rapport des fluorescences rouge/vert est ainsi déterminé pour
chaque spot et permet de comparer le niveau d’expression relatif de chacun des
gènes pour les deux échantillons de départ (Figure 12).
Cette technique a été adaptée à l’étude des microRNA : Les sondes déposées
correspondent à l’ensemble des miRNA connus ou prédits. L’ARN n’est plus
rétrotranscrit en ADNc mais directement marqué par les fluorophores (Hyanine 5,
rouge et Hyanine 3, vert).
Les lames utilisées pour l’analyse des ARNm sont confectionnées par Frédéric
Libert (IRIBHM). Elles contiennent 23.232 spots dont 7.541 ADNc différents
identifiés provenant essentiellement de lymphocytes, de leucocytes et de cellules
de cerveau fœtal et des lames commerciales HEEBO contenant 48,958
oligonucleotides 70-mer représentant tout le génome. Les lames utilisées pour
l’analyse des miRNA sont préparées à l’IRIBHM par l’équipe de F. libert et
30
Introduction
contiennent 1269 miRNA connus (banque Exiqon, pour description voir chapitre
matériel et méthodes).
4.3 Microarrays simple canal: les lames Affymetrix
Dans le cas des microarrays simples canaux, nous avons utilisé la technologie
Affymetrix, dans laquelle des oligonucléotides de petite taille (25-mers) sont
synthétisés in situ. Chaque gène est représenté par 11 à 20 paires
d’oligonucléotides: des oligonucléotides complémentaires à la séquence du gène
qualifiés de « perfect-match » (PM), et des oligonucléotides différant du PM par
une mutation du nucléotide situé en position centrale (position 13), et qualifiés de
« mis-match » (MM). L’objectif de ces doublons est de contrôler les hybridations
non spécifiques. Le principe général est le même que pour les microarrays double
canaux mais ici, un seul type de fluorophore est utilisé pour la cible (streptavidine
couplée à la phycoérythrine).
5. Analyse des données microarrays
Trois considérations doivent être prises en compte en vue d’analyser les données:
1)
Comment détecter un signal utilisable pour chaque gène? Voir
paragraphe 5.1 et 5.2.
2)
Comment utiliser ce signal pour trouver les gènes différentiellement
exprimés? Voir paragraphe 5.3.
3)
Comment regrouper des gènes ou des échantillons ayant un profil
génique similaire? Voir paragraphe 5.4.
5.1 Correction du bruit de fond
Les spots sont préalablement localisés grâce au placement d’une grille. Une étape
préliminaire à la normalisation consiste à soustraire l’intensité du bruit de fond à
31
Introduction
celle du signal. Les spots dont le rapport d’intensité signal sur bruit n’est pas
assez élevé (SNR<2, critère arbitraire) sont alors supprimés (filtering).
5.2 La normalisation
La normalisation consiste à corriger les biais techniques qui tendent à
déséquilibrer le signal de l’un des flurophores par rapport à l’autre. Ces biais
techniques sont dus, en particulier, aux différences de caractéristiques des deux
fluorophores cy3 et cy5 (à incorporation égale, cy3 émet un signal plus fort que
cy5 et cy5 est plus sensible à la lumière et à l’ozone que cy3), aux différences
d’incorporation des marqueurs lors de la synthèse des cibles (cy3 a un plus grand
encombrement stérique), et aux paramètres de lecture au scanner (par exemple
réglages de la puissance des lasers…). Il existe plusieurs méthodes pour
normaliser les données :
5.2.1 La normalisation par rapport à la moyenne globale des intensités
Cette méthode suppose qu’il y a autant de gènes sur-exprimés que sous-exprimés.
Dans ces conditions, la moyenne géométrique des ratios d’expression Ri/Gi (où
Ri est le niveau d’expression d’un spot i marqué par un fluorophore rouge et Gi
est le niveau d’expression d’un spot i marqué par un fluorophore vert) de tous les
spots devrait être égale à 1. Les ratios d’expressions sont donc corrigés par un
même facteur de normalisation.
5.2.2 La normalisation par rapport à des gènes de contrôle externes
Cette méthode consiste à calculer le facteur de normalisation à partir de spots où
s’hybrident de l’ARN ajouté artificiellement aux échantillons à étudier (spikeins). Cette normalisation est préférable à la précédente s’il y a beaucoup de gènes
exprimés de manière différentielle, si la distribution des ratios d’expression est
asymétrique ou dans le cas de la normalisation de lames miARN, étant donné un
nombre plus restreint de spots par rapport aux lames ARNm. Les spike-ins
32
Introduction
permettent également de contrôler l’expérience d’hybridation au niveau de la
préparation de l’ARN, le marquage et la reproductibilité inter-lames.
5.2.3 La normalisation «Lowess »
Le nuage de points représentant les log2 Ri/Gi (=M) en fonction de 1/2 log2 RiGi
(=A) peut être représenté sous la forme d’un graphe (graphe MA). Le nuage tend
à s’incurver aux faibles intensités au lieu de rester centré autour de la droite
d’équation Ri/Gi = 1. La méthode de normalisation Lowess (Locally weighted
scatter plot smoothing) permet d’ajuster une courbe de normalisation à la forme
du nuage par une régression linéaire locale. La méthode de normalisation Loess
est une variante de la normalisation lowess.
Remarque: Pour compenser les biais techniques qui peuvent apparaître lors du
marquage ou de l’hybridation, une technique courante est de réaliser deux fois la
même expérience en intervertissant les fluorophores cy3 et cy5 (dye-swap).
Généralement, la valeur d’intensité de chaque élément est la moyenne
arithmétique du log2 des rapports.
Ces trois types de normalisation décrits ci-dessus concernent la normalisation des
microarrays double canaux. Pour la normalisation des microarrays simple canal
(Affymetrix), l’algorithme GCRMA est le plus souvent utilisé puisqu’il présente
le meilleur compromis entre la précision (qui fait référence à la capacité de
séparer les gènes régulés des non-régulés) et l’exactitude (qui reflète la différence
entre les valeurs d’expression réelles et estimées) (138).
5.3 La mesure de l’expression différentielle : SAM
Classiquement, un gène est considéré comme significativement surexprimé dans
l’échantillon par rapport au contrôle si Ri/Gi ≥ 2 (soit log2(Ri/Gi) = 1), et
inversement, significativement sous-exprimé si Ri/Gi ≤ 0,5 (soit log2(Ri/Gi) = -1).
33
Introduction
SAM (Significant Analysis of Microarrays) (139) est un algorithme qui permet
d’identifier les gènes qui sont statistiquement régulés dans tous les échantillons.
Plusieurs variantes de cet algorithme existent dont SAM une classe et SAM deux
classes. SAM une classe identifie, pour un groupe d’échantillons donné, les gènes
dont le niveau d’expression varie peu au travers des échantillons de ce groupe.
SAM deux classes compare deux classes d’échantillons et sélectionne les gènes
dont le niveau d’expression est significativement différent dans les deux classes.
5.4 Visualisation des données
5.4.1 Le clustering hiérarchique
Le clustering consiste à regrouper des gènes présentant des profils d’expressions
similaires dans les expériences considérées ou de regrouper des échantillons ayant
des profils d’expressions géniques similaires. Ceci permet d’établir des groupes
de gènes co-régulés dans les conditions étudiées sans préjuger de leur fonction.
Des hypothèses sur la fonction de gènes non caractérisés peuvent donc être
émises en se référant aux fonctions connues des autres gènes co-régulés, en se
basant sur l’hypothèse que des gènes impliqués dans une même fonction cellulaire
sont susceptibles d’être exprimés de manière coordonnée. D’autre part, regrouper
des échantillons de profils d’expressions similaires permet de définir des groupes
et sous-groupes d’échantillons de physiologie similaire.
Le clustering hiérarchique utilise un algorithme qui compare les gènes ou les
échantillons deux à deux en fonction du degré de similitude entre leurs profils
d’expression. Les gènes ou les échantillons montrant la plus faible distance entre
leurs profils sont groupés sous un « noeud ». Un profil représentatif du groupe de
gènes ou d’échantillons est attribué à ce nœud. Ce nœud correspond au profil
moyen du groupe dans la méthode dite «average linkage», au profil du gène le
plus éloigné du groupe voisin pour la «complete linkage» ou au profil du gène le
plus proche pour la «single linkage») (Figure 13). Le noeud est ensuite lui-même
comparé à un autre gène ou à un autre échantillon et ainsi, de proche en proche,
les gènes ou les échantillons sont ordonnés de manière hiérarchique dans un
34
Introduction
dendrogramme. La longueur des branches de l’arbre représente la distance entre
chaque nœud. Elle est inversement proportionnelle à la similarité entre les gènes
ou les échantillons.
5.4.2 Le MDS (Multidimensional Scaling)
Le MDS est une autre méthode de classification qui permet de visualiser les
échantillons dans un espace à deux dimensions. L’algorithme va réduire un
espace à n dimensions (où n est le nombre de spots) à un espace à deux
dimensions en respectant au mieux les distances entre les échantillons.
6. Analyses fonctionnelles in vitro
6.1 Introduction
Les résultats des analyses microarrays permettent donc de mettre en évidence un
ensemble
de
gènes
régulés
dans
un
processus
physiologique
ou
pathophysiologique donné, dont certains pourraient jouer un rôle crucial dans le
développement de ce processus et constituer des cibles thérapeutiques ou des
outils pronostiques. D’autre part, la fonction de certains de ces gènes est
inconnue.
Inhiber la fonction d’un de ces gènes est une manière d’évaluer son rôle exact
dans la cellule, par exemple dans la prolifération, la différenciation, l’apoptose….
Les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles
thérapeutiques.
6.2 SiRNA
Les siRNA (Small-interfering RNA) régulent l’expression génique par un
processus semblable à celui des miRNA: Les longues molécules d’ ARN double
brin (ARNdb) sont clivées par la protéine Dicer (une nucléase de la famille des
RNases-III) en petits fragments d’ARNdb de 21 à 25 nucléotides de long, les
35
Introduction
siRNA (small interfering RNAs). Les siRNA, phosphorylés en 5’, sont ensuite
incorporés dans un complexe ribonucléasique, le complexe RISC (RNA-induced
silencing complex). Un des brins du siRNA est éliminé tandis que l'autre, le brin
guide, dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence
complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le siRNA et l'ARNm
cible est parfaite, le complexe RISC clive l'ARNm cible qui est alors dégradé et
n'est donc plus traduit en protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent
pour empêcher le clivage (Figure 14) (140).
Les siRNA forment le plus souvent des duplex parfaitement appariés avec leurs
cibles induisant un clivage au niveau du site complémentaire contrairement aux
miRNA où la complémentarité est partielle et donc exclut un clivage
endonucléotidique mais favorise une inhibition traductionnelle (Figure 14). Les
miRNA sont issus d’un précurseur spécifique encodé par le génome alors que les
siRNA sont introduits de manière exogène dans la cellule (141).
36
CHAPITRE II : BUT DU TRAVAIL
En 2002, le nombre de nouveaux cas de cancers a été estimé à 10,9 millions (5,8
pour les hommes et 5,1 pour les femmes) et le nombre de décès à 6,7 millions (3,8
pour les hommes et 2,9 pour les femmes). Au cours des prochaines décennies, le
vieillissement de la population entraînera une augmentation du nombre de cas et
en 2030, le nombre total de décès devrait dépasser les 11 millions (142). Un
élément clef pour endiguer la maladie est la compréhension des mécanismes
moléculaires liés au développement des cancers.
Les tumeurs thyroïdiennes sont particulièrement intéressantes à étudier pour
comprendre les mécanismes généraux de la carcinogénèse étant donné que les
cellules thyroïdiennes (les thyrocytes) peuvent évoluer vers différents types de
tumeurs bénignes et malignes, les carcinomes. Parmi les tumeurs bénignes, nous
distinguons les adénomes autonomes (AA) et folliculaires (FTA), tumeurs
encapsulées et facilement curables, et l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale
(FNAH), tumeurs très rares. Les carcinomes sont subdivisés en carcinomes
différenciés, folliculaires (FTC) ou papillaires (PTC), et ceux-ci peuvent évoluer
en carcinomes anaplasiques (ATC), totalement dédifférenciés et très agressifs.
Des altérations géniques causent et caractérisent ces différents types de tumeurs
thyroïdiennes dont la classification sur base d’examen histologique est parfois fort
subjective, voir impossible (143-145).
La technologie des microarrays permet d’analyser simultanément l’expression de
milliers de gènes dans différentes conditions et ainsi de classer les tumeurs selon
leurs signatures moléculaires. La combinaison des analyses microarrays avec les
examens anatomopathologiques pourrait permettre de raffiner la classification
actuelle. Nous avons donc utilisé cette méthodologie, qui allie une partie
expérimentale et une partie bioinformatique, pour définir les signatures
37
But du travail
moléculaires de différentes tumeurs thyroïdiennes et pour valider un modèle
expérimental in vitro des carcinomes papillaires.
Les buts du travail sont :
1) Valider un modèle expérimental in vitro des PTC au niveau moléculaire: des
thyrocytes humains en culture primaire sont traités avec de l’EGF et du sérum,
pour différents temps de stimulation, en vue d’activer la cascade des
RAS/RAF/MAPK qui est constitutivement activée dans les PTC.
2) Etudier les profils d’expression génique des FNAH et les comparer avec ceux
des AA. Les résultats peuvent être mis en relation avec le phénotype fonctionnel
des FNAH, précédemment étudié au laboratoire par Drs. P. Roger et J. Van
Sande.
3) Définir les profils ARNm et miRNA des ATC, et mettre ces profils en relation
avec la présence éventuelle d’une mutation de la protéine p53 dans ces tumeurs.
Les profils d’expression génique des ATC sont comparés avec ceux des PTC afin
de mettre en évidence des cibles thérapeutiques éventuelles et de les bloquer par
la technique des siRNA dans un modèle in vitro de lignée cellulaire.
38
CHAPITRE III : RESULTATS
1. Validation d’un modèle expérimental des carcinomes papillaires : les
thyrocytes humains en culture primaire stimulés par de l’EGF et du sérum.
Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le
développement des carcinomes papillaires, nous avons développé un modèle
d’étude in vitro en stimulant des thyrocytes humains avec de l’EGF (25 ng/ml) et
du sérum (10%) (EGF/sérum). Les carcinomes papillaires sont caractérisés par
une activation constitutive de la voie des MAPK, et en stimulant des thyrocytes
normaux en culture primaire, avec l’EGF/sérum, cette même cascade est activée.
Nous avons donc mis en culture primaire les thyrocytes provenant de tissus
normaux adjacents de 7 patients différents et nous les avons stimulés avec 25
ng/ml d’EGF et 10% de sérum pendant 5 temps différents (1,5h, 3h, 16h, 24h,
48h) en prenant soin de garder pour chaque condition un contrôle non stimulé.
Nous avons ensuite extrait et rétrotranscrit l’ARN, synthétisé et marqué le ADNc
avec des fluorophores (cy3 et cy5) et nous les avons hybridés sur des lames
fabriquées à l’IRIBHM (F. Libert) contenant 23 232 spots dont 7 541 ADNc
différents. D’autre part, précédemment à l’IRIBHM, L. Delys a hybridé, sur la
même plate-forme, le ADNc provenant de 16 paires de PTC (10 sporadiques et 6
post-chernobyl). W. van Staveren a hybridé le ADNc provenant d’un pool de 5
adénomes autonomes (AA) et de thyrocytes humaines (7 patients différents)
stimulés avec 0.3 mU/ml de TSH pendant 5 temps différents (1,5h, 3h, 16h, 24h,
48h) (146). Comme décrit ci-après dans la publication parue en 2007 dans
Experimental Cell Research, nous avons comparé les différents profils
d’expression génique des cultures primaires stimulés avec l’EGF/sérum ou avec la
TSH pendant les 5 temps différents de stimulation et les profils d’expression
39
Résultats
génique des PTC et des AA. Nous avons mis en évidence différents points
intéressants: (1) les thyrocytes stimulés pendant 48h avec de l’EGF et du sérum
présentent une morphologie fusiforme comme des fibroblastes, caractéristique de
la perte de différentiation; (2) les profils d’expression génique des thyrocytes
traités avec de l’EGF/sérum sont séparés en 2 groupes : les temps courts (1,5h et 3
h) les temps longs (16h, 24h, 48h) ; (3) les thyrocytes traités avec l’EGF/sérum
pendant des temps longs de stimulation ont leurs profils d’expression génique
plus similaire à celui des PTC que ceux traités pendant des temps courts de
stimulation (4) les profils d’expression génique des thyrocytes traités avec
l’EGF/sérum et des PTC sont distincts du profil des thyrocytes traités avec la TSH
et des AA ; (5) les thyrocytes traités avec l’EGF/sérum et ceux traités avec la TSH
pendant des temps courts présentent néanmoins un certain nombre de gènes en
commun (« immediate early genes »); (6) le clustering hiérachique sur les gènes a
permis de mettre en évidence des groupes de gènes de fonctions similaires qui
sont corégulés au cours de la cinétique.
Les informations supplémentaires associées à cet article sont disponibles sur la
version en ligne (doi :10.1016/j.yexcr.2007.06.019).
Nous avons également comparé le modèle de culture primaire de thyrocytes avec
le modèle des lignées cellulaires. Pour se faire, nous avons comparé les
expressions géniques de lignées cellulaires thyroïdiennes (une dérivée d’adénome
folliculaire (KAK-1), deux dérivées de FTC (FTC-133 et WRO), trois dérivées de
PTC (B-CPAP, KAT-10 et TPC-1) et deux dérivées de ATC (8505C et KAT-4))
avec l’expression génique de thyrocytes stimulés avec EGF/sérum d’une part et
TSH d’autre part (Figure 15). Nos résultats suggèrent que les lignées cellulaires
ont un profil d’expression génique plus éloigné des PTC que notre modèle.
La mutation BRAF active uniquement la cascade des MAPK-ERK1/2 alors que le
réarrangement RET/PTC, tout comme une stimulation par l’EGF/sérum, active
également la cascade des PI3K. Nous espérions un profil d’expression génique
40
Résultats
différent pour les deux types de PTC, avec une plus grande similarité des profils
des PTC présentant le réarrangement RET/PTC avec ceux des thyrocytes traités
avec l’EGF/sérum. Malheureusement cette séparation n’a pas pu être réalisée avec
les microarrays de l’IRIBHM utilisés (Figure 16).
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Résultats
2. Caractérisation moléculaire de deux tumeurs thyroïdiennes bénignes : les
adénomes autonomes et l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale
Dans l’article présenté ci-après et publié en 2009 dans JCEM, nous avons
caractérisé le phénotype fonctionnel et moléculaire de l’hyperthyroïdie non autoimmune familiale (FNAH) et nous l’avons comparé au phénotype des adénomes
autonomes (AA). Etant donné la rareté de cette maladie (seulement 152 cas
connus provenant de 28 familles différentes), les mécanismes moléculaires sont
peu connus. Nous avons hybridé l’ARN provenant de cinq patients FNAH sur des
lames HEEBO (contenant 48.958 spots représentant tout le génome) ainsi qu’un
pool de 4 AA et nous avons comparé leurs profils d’expression génique. De plus,
précédemment au laboratoire, le groupe de Jacqueline Van Sande avait caractérisé
le phénotype fonctionnel de six FNAH provenant d’une même famille, en
étudiant, sur des tranches de tissus FNAH stimulées ou non par la TSH, le
métabolisme de l’iodure et la génération d’H2O2, d’AMPc et d’inositol phosphate.
Le groupe de Pierre Roger avait également mesuré la prolifération cellulaire de
thyrocytes provenant d’FNAH, mis en culture et stimulés ou non par la TSH, en
présence ou en absence d’insuline ou d’IGF-1. L’intégration de ces différentes
données montre que: (1) Au niveau du métabolisme de l’iodure et de la génération
d’H2O2, d’AMPc et d’inositol phosphate, les FNAH se comportent comme du
tissu normal ; (2) La réponse mitogénique à la TSH des thyrocytes provenant de
FNAH est normale mais plus sensible que des thyrocytes normaux puisque nous
observons une prolifération cellulaire en absence d’insuline ou d’IGF-1 et à faible
concentration de TSH (ce qui n’est pas observé avec des thyrocytes normaux) ;
(3) sur les 474 gènes régulés dans les FNAH, 93% sont régulés dans le même sens
dans les AA, 6% ne sont pas régulés dans les AA et seulement 0,4% sont régulés
dans le sens opposé; (4) 783 gènes ne sont régulés que dans les AA (5) sur
l’ensemble des gènes sous-exprimés dans les AA et les FNAH, 76% d’entre eux
sont plus régulés dans les AA que dans les FNAH ; (6) l’analyse des voies de
signalisation altérées dans ces tumeurs par le programme DAVID a mis en
51
Résultats
évidence des caractéristiques communes des FNAH et des AA : la sousexpression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire, dans l’apoptose ou
dans l’adhésion cellule/cellule et cellule/matrice extracellulaire. Par ailleurs,
différentes voies de biosynthèse sont augmentées exclusivement dans les AA; (7)
la majorité des mutations du TSHR dans les SCNAH sont les mêmes que celles
retrouvées dans les AA ; (8) Les signes cliniques des SCNAH sont plus sévères
que ceux des FNAH (Table 1).
Ces résultats illustrent le fait que les mutations du TSHR dans les AA et les
SCNAH sont probablement plus agressives que celles dans les FNAH.
Néanmoins, étant donné la grande similarité du profil d’expression génique entre
les AA et les FNAH, nous concluons que les AA, les FNAH et les SCNAH sont
trois sous-types différents de la même maladie: l’hyperthyroïdie génétique. Les
caractéristiques de chacun de ces sous-types dépendent de l’intensité de la
mutation, du nombre de cellules initialement affectées et du stade de
développement au moment duquel la mutation survient.
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Résultats
3. Caractérisation moléculaire des carcinomes anaplasiques (ATC)
Neuf ATC et 20 PTC ont été hybridés précédemment sur des lames Affymetrix
(Laurent Delys, thèse de doctorat). Les PTC et les ATC ont un profil d’expression
génique bien distinct comme le montre le MDS réalisé sur l’ensemble des
données (ratios d’expression tumeur/normal) (Figure 17).
3.1 Analyse des mutations p53
Les mutations inactivatrices du gène suppresseur de tumeur p53 sont présentes
dans environ 60% des ATC et sont très rarement présentes dans les carcinomes
différenciés (PTC et FTC) (147). L’inactivation du gène p53 serait un événement
clef dans le processus malin d’évolution des carcinomes différenciés vers des
carcinomes complètement dédifférenciés, les ATC (148;149).
Nous avons
recherché la présence d’une mutation p53 dans 5 des 9 ATC hybridés sur les
lames Affymetrix (il ne restait malheureusement plus assez de tissus pour les 4
autres ATC). Les échantillons possédant la mutation p53 pourraient présenter un
profil d’expression génique similaire.
Nous avons séquencé les exons 2 à 12 du gène p53 au niveau de son ARNm, ce
qui recouvre les exons les plus fréquemment mutés (90% des mutations se
trouvent dans les exons 5 à 9) (150). Sur les 5 ATC investigués, seule une
mutation consistant en un remplacement d’une arginine par un tryptophane
(CGG->TGG) a été trouvée dans l’ATC10 à la position 934, codon 267, exon 9.
Des résultats similaires ont été rapportés par Zou et al.: un seul des ATC sur les 5
testés présente une mutation p53 (151). Cinquante pourcent des mutations p53
sont des transitions G:C vers A:T et 75% des mutations se situent dans les exons
8 et 9 (152). Les mutations dans le codon 267 sont relativement fréquentes,
puisque 65 mutations ont été recensés dans ce codon (http://p53.free.fr).
L’ATC10 qui présente la mutation p53 ne semble pas avoir un profil d’expression
génique particulier, comme le montre le MDS (Figure 18).
61
Résultats
3.2 Analyse fonctionnelle par SiRNA
Afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques potentielles, nous avons
sélectionné l’ensemble des gènes différentiellement exprimés entre les ATC et les
PTC avec un critère arbitraire (sélection d’un gène s’il est régulé plus de 2 fois
dans 80% des échantillons, sans régulation inverse): nous avons ainsi sélectionné
125 gènes. Parmi ceux-ci, 5 gènes ont attiré particulièrement notre attention parce
qu’ils n’ont pas ou peu été caractérisés dans la littérature en tant que oncogène ou
gènes suppresseur de tumeurs dans la thyroïde: ACVR2B, DAPK2, FOXD1,
DEPDC1 et AGO2.

ACVR2B (activin A receptor, type IIB) est sur-exprimé dans les ATC et n’est
pas régulé dans les PTC. Cette protéine est un récepteur transmembranaire
appartenant à la famille des récepteurs TGF-beta sérine/thréonine kinase. La
dérégulation de l’activité des membres de la famille des TGF-beta est associée
à une différenciation et une prolifération cellulaire aberrante (153).

DAPK2 (death-associated protein kinase 2) est sous-exprimé dans les ATC et
est sur-exprimé dans les PTC. Il appartient à la famille des sérine/thréonine
kinases et sa sur-expression induit l’apoptose (154).

FOXD1 (forkhead box D1) est sur-exprimé dans les ATC et n’est pas régulé
dans le PTC. Cette protéine est un facteur de transcription dont la fonction
n’est pas connue mais elle jouerait un rôle dans la formation de tumeur (155).
D’autres membres de la famille FOX sont dérégulés dans nos données ATC:
FOXM1, FOXN3 et FOXK2 sont sur-exprimés et FOXO1, FOXO3, FOXP2
et FOXE1 sont sous- exprimés.

DEPDC1 (DEP domain containg 1) est sur-exprimé dans les ATC et n’est pas
régulé dans les PTC. Sa fonction n’est pas connue. Le groupe de Katagiri a
montré que ce gène est impliqué dans la croissance cellulaire dans les tumeurs
de la vessie (156).

EIF2C2 (ou AGO2) est sur-exprimé dans les ATC et n’est pas régulé dans le
PTC. La protéine Argonaute 2 fait partie du complexe RISC qui intervient
62
Résultats
dans le mécanisme d’action des miRNA. AGO1, AGO3 et AGO4 sont
également sur-exprimés dans les ATC.
Nous avons décidé de caractériser le rôle de ces gènes en procédant à leur
invalidation (« knockout ») par siRNA dans des lignées cellulaires. Dans un
premier temps, pour pouvoir étudier la régulation des protéines codées par ces
différents gènes, nous nous sommes procurés les anticorps correspondants et nous
les avons testés. Nous avons trouvé des anticorps spécifiques contre les protéines
ACVR2B, DAPK2, FOXD1 et AGO2. Par contre, nous n’avons pas trouvé
d’anticorps contre la protéine DEPDC1, nous avons donc jugé inutile de
poursuivre les expériences avec ce gène.
Nous avons ensuite entamé les expériences de transfection des siRNA
correspondants dans des lignées cellulaires. Afin d’optimiser le pourcentage de
cellules transfectées par les différents siRNA, nous avons testé au préalable trois
agents de transfection : Dharmafect2 (2µl/ml), Lipofectamine (4µl/ml) et
Oligofectamine (12µl/ml) sur deux lignées cellulaires différentes, 8505C (dérivée
d’un cancer thyroïdien anaplasique) et BCPAP (dérivé d’un cancer thyroïdien
papillaire), avec trois confluences cellulaires différentes (40%, 60% et 80%). La
transfection avec l’Oligofectamine donne les meilleurs résultats (environ 70% de
cellules transfectées). Nous avons obtenu des résultats similaires avec les
différentes confluences cellulaires ainsi qu’avec les deux lignées, 8505C et
BCPAP.
Nous avons choisi d’utiliser la lignée cellulaire 8505C, avec une confluence
d’environ 60%, et de la traiter avec l’agent de transfection Oligofectamine et les
siRNA dirigés contre l’ARNm de chacun des quatre gènes décrits ci-dessus. Pour
certains des siRNA testés nous avons vérifié si la protéine et/ou l’ARNm
correspondant présente une diminution de son expression par Western blotting ou
par RT-PCR respectivement. Pour certaines de ces protéines, nous avons
également évalué leur stabilité en inhibant la traduction de leurs ARNm par la
63
Résultats
cycloheximide (10ng/µl). La cycloheximide est un antibiotique qui bloque la
synthèse protéique au niveau de la phase d'initiation et d'élongation. Nous avons
utilisé comme contrôle positif de l’action de la cycloheximide, la cyclin D1,
protéine du cycle cellulaire dont la demi-vie est courte. La quantité égale de
protéines dans chaque puit est validée en révélant la protéine de l’actine, dont la
demi-vie est très longue. La table 3 récapitule les différents gènes et étapes testés.

Nous avons traité la lignée cellulaire 8505C avec le siRNA dirigé contre
l’ARNm du gène ACVR2B pendant 48h, 72h et 98h pour bloquer son
expression au niveau de la protéine et pendant 7h, 16h, 20h, 24h, 40h et 48h
pour bloquer son expression au niveau de l’ARNm. Nous avons observé
aucun effet des siRNA au niveau de la protéine par Western blotting (Figure
19a). Par contre, nous observons, par RT-PCR, une nette diminution au niveau
de l’ARNm des cellules transfectées par le siRNA par rapport au contrôle à
partir de 16h d’incubation (Figure 19b), ce qui suggère que la protéine
ACVR2B est très stable. En effet, en bloquant la traduction de l’ARNm
correspondant avec de la cycloheximide, nous confirmons cette hypothèse:
aucune diminution du taux de ACVR2B n’est observée après traitement
(Figure 20).

DAPK2 semble également être une protéine très stable, dans la mesure où le
traitement à la cycloheximide ne modifie pas le taux de protéines présentes
dans les cellules (Figure 20). Nous avons donc jugé inutile de poursuivre les
expériences avec ce gène.

L’étude de la stabilité de FOXD1 suggère que cette protéine semble moins
stable que ACRV2B et DAPK2: en effet, le taux de protéine semble diminué à
partir de 24h (Figure 20). Nous avons donc traité les cellules 8505C avec le
siRNA dirigé contre l’ARNm du gène FOXD1 pendant 24h, 48h, 72h et 96h
afin de bloquer son expression. Nous n’avons pas observé d’effet des siRNA
au niveau de la protéine par Western blotting (Figure 21). L’expression de
64
Résultats
FOXD1 n’a pas pu être vérifiée au niveau de l’ARNm, car nous ne sommes
pas parvenu à amplifier cet ARNm par RT-PCR. Après avoir vérifié la qualité
des ADNc (par RT-PCR avec des amorces permettant l’amplification de
l’ADNc PBGD), nous avons testé quatre paires d’amorces pour amplifier
FOXD1 (sélectionnées par le programme Primer 3), sur 2 ADNc différents
provenant de 2 lignées cellulaires différentes (8505C et Hela (lignée cellulaire
provenant d’un cancer du col de l’utérus)) avec différentes conditions PCR (8
Tm différents (48°C, 50°C, 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C) et 30 ou 35
cycles de PCR). Seul l’ADNc provenant de la lignée cellulaire Hela a pu être
amplifié (avec les conditions PCR suivantes: Tm de 48°C ou 50°C et 35
cycles). De plus, nous n’avons amplifié aucun fragment par qRT-PCR
(Sybrgreen) dans aucune des 8 lignées thyroïdiennes testées (FTC, BCPAP,
TPC1, WRO, 8505C, HTORI, KAT4, KAT10) (Ct>32). Nous en avons déduit
que l’ARNm est présent en très faible quantité dans les lignées cellulaires
testées excepté dans les cellules Hela. Nous avons donc jugé inutile de
poursuivre les expériences avec ce gène.

Afin d’évaluer la stabilité de la protéine AGO2, nous avons traité les lignées
cellulaires 8505C et BCPAP avec de la cycloheximide et nous avons montré
une possible légère diminution de la protéine AGO2 après 24h de traitement
des cellules 8505C (Figure 22). Malgré cette faible diminution, nous avons
quand même décidé de traiter ces cellules avec le siRNA dirigé contre
l’ARNm AGO2 pendant 48h, 72h et 96h afin de bloquer son expression au
niveau de la protéine et pendant 16h, 20h, 24h, 40h et 48h afin de bloquer son
expression au niveau de l’ARNm. Nous n’avons observé aucune diminution
d’AGO2, ni au niveau de la protéine, ni au niveau de l’ARNm, dans les
cellules transfectées par le siRNA (Figure 23a et 23b).
Pour conclure, dans ces études fonctionnelles aucun siRNA n’a pu diminuer
l’expression de la protéine contre laquelle il était dirigé. Seul le siRNA dirigé
contre ACVR2B a diminué l’expression au niveau de l’ARNm mais pas au niveau
65
Résultats
protéique. Etant donné la stabilité de la protéine ACVR2B, nous envisageons de
prolonger le traitement avec le siRNA jusqu’à 8 jours, en espérant diminuer
significativement l’expression de la protéine. Si les résultats sont concluants, nous
étudierons l’impact de cette diminution au niveau de la prolifération, l’apoptose,
la différenciation et la migration cellulaires dans les lignées 8505C.
66
Résultats
3.3 Etude de l’expression des miRNA dans les ATC par microarrays.
Dans le cadre d’un projet global du laboratoire visant à caractériser l’ensemble
des tumeurs thyroïdiennes au niveau de l’expression des miRNA, nous avons
entamé l’étude des miRNA dans les ATC et PTC.
Nous avons investigué 11 ATC et 4 PTC en utilisant des lames fabriquées par F.
Libert contenant 1269 miRNA humains-murins-rats. D’autre part, W. van
Staveren a hybridé, sur les mêmes lames, 5 PTC qui ont métastasé au niveau des
ganglions. L’un des échantillons (PTC50) a été hybridé avec 2 quantités
différentes d’ARN (1 µg et 2 µg). Les données d’expression (ratios tumeurnormal) des miRNA humains ont été analysées par MDS et montrent que les ATC
présentent des profils d’expression génique similaires et sont séparés des PTC
(Figure 24). Une signature de 561 miRNA humains qui sépare les ATC et les PTC
a été obtenue par l’algorithme SAM 2 classes (q-value < 5%). Ce chiffre élevé
reflète la grande différence génétique entre les deux types de tumeurs.
Nous avons ensuite identifié l’ensemble des miRNA régulés dans les ATC en
sélectionnant un miRNA s’il est régulé plus de 1.5 fois dans tous les échantillons
ATC (34 miRNA différents, 32 sous-exprimés et 2 sur-exprimés) (Table 4).
Nos données sont en accord avec plusieurs autres études, et en particulier avec
celles de l’équipe de Croce et Fusco, qui ont également obtenu plus de miRNA
sous-exprimés que sur-exprimés dans les ATC (157;158). La sous-expression des
miRNA miR-148b (115), miR-30a (115), miR-125b (115;159), miR-29b (160),
miR-135 (161), let-7 (162), rapportée pour chacun par certains groupes, est
également en accord avec nos résultats.
Ces régulations doivent encore être confirmées par qRT-PCR. Par ailleurs, nous
allons également étudier les profils d’expression ARNm de chacun des ATC, en
les hybridant sur des lames Affymetrix, ce qui nous permettra de faire une
correspondance entre les ARNm et miRNA exprimés dans ces cancers, ce qui n’a
jamais été réalisé précédemment.
67
Résultats
Enfin, nous tenterons de prédire les cibles ARNm potentielles des miRNA en
utilisant
des
programmes
(http://www.targetscan.org/),
bioinformatiques
Pictar
(par
exemple :
TargetScan
(http://www.pictar.org/),
miRanda
(http://www.microrna.org/microrna/home.do),
miRGator
(http://genome.ewha.ac.kr/miRGator/miRGator.html)).
En intégrant l’ensemble des données obtenues sur les différentes tumeurs
thyroïdiennes, nous espérons obtenir un set de miRNA caractéristique de chaque
tumeur.
68
CHAPITRE IV : DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
La thèse s’inscrit dans un projet global du laboratoire visant à approfondir les
mécanismes moléculaires de tumorigénèse de différentes tumeurs thyroïdiennes
bénignes et malignes, en utilisant la technologie des microarrays.
Plusieurs modèles in vitro de tumeurs thyroïdiennes ont été développés
précédemment: Les tranches de tissu thyroïdien présentent l’avantage de retenir la
plupart des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles mais leur survie est
limitée à quelques heures (163). Les lignées cellulaires thyroïdiennes, provenant
de PTC, de FTC ou d’ATC, ont évolué vers un phénotype dédifférencié commun
et ont perdu toutes leurs caractéristiques de différenciation de départ. Elles
pourraient néanmoins être un bon modèle pour étudier les tumeurs dédifférenciées
plutôt que les tumeurs dont elles dérivent (164).
Nous avons réalisé au cours de la première partie de cette thèse un modèle d’étude
de PTC en traitant des thyrocytes humains en culture primaire, avec de l’EGF et
du sérum, pendant des temps longs de stimulation (24h et 48h). L’analyse de
l’expression génique de ces cellules par microarrays nous a permis de mettre en
évidence les mécanismes moléculaires de la stimulation de la cascade des MAPK
dans les thyrocytes humains in vitro et de les comparer à ceux des PTC dans
lesquels cette cascade de signalisation est activée constitutivement.
Les profils d’expression génique des thyrocytes traités avec de l’EGF et du sérum
pendant les temps courts de stimulation (1,5h et 3 h) sont clairement distincts de
ceux traités pendant des temps longs de stimulation (16h, 24h, 48h), mettant en
évidence différentes vagues successives d’activation de groupes de gènes : les
‘immediate early genes’, principalement composés de facteurs de transcription
initiant le programme cellulaire, suivis par l’activation séquentielle de groupes de
gènes impliqués dans l’inflammation, le métabolisme, le cytosquelette et
l’adhésion cellulaire. Ce programme séquentiel d’activations géniques reproduit
partiellement celui qui a probablement induit la tumorigénèse dans les PTC.
69
Discussion et perspectives
La stimulation de la cascade des MAPK par l’EGF et le sérum active, dans les
thyrocytes normaux, un programme transcriptionnel lié à l’inflammation,
retrouvée dans environ 30% des PTC (165). Ces résultats établissent un lien direct
entre la transformation oncogénique par l’activation de la cascade des MAPK et
l’activation d’un programme pro-inflammatoire. De plus, l’inflammation peut
avoir un rôle pro-tumoral en induisant la prolifération et la survie des cellules
malignes, en promouvant l’angiogénèse et les métastases (166). La transformation
oncogénique est donc suivie par un programme pro-inflammatoire qui, lui-même,
va favoriser la transformation oncogénique.
La sur-expression de gènes impliqués dans l’adhésion cellulaire dans les
thyrocytes stimulés par l’EGF et le sérum et dans les PTC reflète probablement la
modification morphologique observée en histologie, notamment une transition
épithélio-mésenchymateuse (EMT) associée à la carcinogénèse. Cette dernière
implique la perte d’adhésion des cellules entre elles, ce qui permet leur
dissémination dans l’organisme.
La perte de différenciation induite par l’activation de la cascade des
MAPK, a été quantifiée par Marina Hinnens, au cours de son mémoire. Celle-ci
a compilé un index de différentiation thyroïdien (T-index) en se basant sur une
liste de gènes exprimés préférentiellement dans la thyroïde par rapport aux autres
organes, obtenu à partir de profils d’expression géniques de nombreux tissus. Le
T-index d’un tissu est défini comme la médiane de l’expression de ces gènes
thyroïdiens dans ce tissu. Vincent Detours, par une approche similaire, a
également défini un index de prolifération (index super-PCNA) (article soumis).
En appliquant le T-index et l’index super-PCNA à nos données microarrays
EGF/sérum, nous constatons, comme escompté, une diminution de la
différenciation et une augmentation de la prolifération des thyrocytes
proportionnellement au temps d’exposition à l’EGF/sérum (Figure 25).
70
Discussion et perspectives
Nos données in vitro confirment et expliquent le rôle de l’activation de la cascade
RAS/RAF/MAPK, induisant la dédifférentiation des thyrocytes, dans le processus
de carcinogénèse des PTC. D’autre part, l’activation constitutive de la cascade de
l’AMPc, induisant la différentiation des thyrocytes, est une caractéristique de
certaines tumeurs bénignes (les AA). Le MDS (Figure 3 dans l’article, chapitre
III.1) montre l’évolution des profils d’expression génique de thyrocytes normaux,
dont soit la cascade des MAPK soit la cascade de l’AMPc est activée, vers les
tumeurs malignes ou bénignes correspondantes dans lesquelles ces cascades sont
activées de manière constitutive.
Ce modèle in vitro présente l’avantage d’étudier spécifiquement les thyrocytes et
non un ensemble de types cellulaires comme dans le tissu in vitro. Par contre, les
interactions des thyrocytes avec les autres types cellulaires comme les
fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules sanguines et parfois des
lymphocytes influencent le développement de la tumeur et ne sont donc pas pris
en compte. Le modèle ne reflète pas non plus, les années de stimulation des
cascades des MAPK dans les PTC et de l’AMPc dans les AA.
De plus, les conditions de culture in vitro influencent les profils d’expression
génique: (1) Nous avons retrouvé, dans les thyrocytes en culture primaire stimulés
avec l’EGF et du sérum, un ensemble de gènes sous-exprimés, par rapport aux
thyrocytes non stimulés, impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Cette
sous-expression peut être expliquée par l’apport extérieur aux thyrocytes, de
cholestérol contenu dans le sérum du milieu d’incubation; (2) Les conditions de
culture avec les 21% d’O2 atmosphérique sont différentes des 2-9% d’O2
physiologique des tissus normaux et des 0.5% d’O2 dans certaines parties de la
tumeur. De plus, le modèle in vitro ne reproduit pas les conditions oncogéniques
extrêmes dans les tissus cancéreux. L’hypoxie avec moins de 0.5% d’O2 promeut
la progression tumorale en sélectionnant les cellules avec des mutations qui leur
permettent de survivre dans des conditions extrêmes. L’hypoxie active également
la néovascularisation facilitant l’invasion, la migration, l’adhésion et les
71
Discussion et perspectives
métastases cellulaires (167;168); (3) L’adhérence des cellules sur le support des
boîtes de culture influence également le comportement des cellules et une culture
en 3D pourrait améliorer notre modèle.
La comparaison entre les conditions de culture in vitro et les conditions in vivo est
présentée dans la Table 5.
Au cours de la deuxième partie de la thèse, nous avons comparé les signatures
moléculaires et les phénotypes fonctionnels de deux tumeurs bénignes, les AA,
tumeurs très fréquentes et les FNAH, tumeurs très rares. Toutes deux sont causées
par une mutation dans le récepteur de la TSH (TSHR) activant de manière
constitutive la cascade de l’AMPc. Néanmoins, dans les FNAH, la mutation est
héréditaire et affecte toute la glande, contrairement aux AA où la mutation
survient après la formation de la glande, à l’âge adulte, et où seule une partie de la
glande est affectée. Nous avons comparé les profils d’expression génique de ces
deux tumeurs et nous avons constaté qu’ils étaient très similaires, la seule
différence majeure étant le nombre plus important de gènes dérégulés et une
intensité augmentée des gènes sous-exprimés dans les AA que dans les FNAH.
Nous avons conclu que les AA et les FNAH sont deux sous-types différents de la
même maladie: l’hyperthyroïdie génétique. Les caractéristiques de chacun de ces
sous-types dépendent de l’intensité de la mutation, du nombre de cellules
affectées et du stade de développement au moment auquel la mutation survient.
Malheureusement, cette étude a été limitée à cause du nombre très faible
d’échantillons de FNAH à notre disposition.
Actuellement, la plupart des patients présentant un carcinome différencié peuvent
être soignés par la chirurgie et la radiothérapie. Cependant, environ 30% d’entre
eux vont développer des métastases et d’autres ne vont pas répondre au
traitement. La classification des tumeurs sur base histologique est courante mais
les critères sont subjectifs et parfois difficiles à implémenter. Les prédictions de
survie actuelles basées sur des caractéristiques cliniques simples comme l’âge du
patient et la taille de la tumeur ne sont pas suffisantes. Actuellement, le taux
72
Discussion et perspectives
moyen de survie des patients présentant un ATC est d’environ 6 mois. La
thyroïdectomie totale est requise mais peut-être difficile à pratiquer et entraîne un
taux de mortalité opératoire non négligeable. Il n’existe pas actuellement sur le
marché d’autres traitements efficaces pour ce type de tumeur. Une meilleure
compréhension des mécanismes moléculaires des tumeurs thyroïdiennes est dès
lors indispensable pour améliorer leur prise en charge.
Certaines drogues visent des mécanismes moléculaires très spécifiques et une
caractérisation moléculaire précise de la tumeur est requise au préalable avant de
les administrer aux patients. De plus, des biomarqueurs présents dans le sérum ou
dans le plasma seraient utiles pour une détection précoce de la tumeur ou pour
connaître l’identité de la tumeur primaire si elle est inconnue.
L’inactivation du gène suppresseur de tumeur
p53 est considéré comme un
événement clef dans le processus de malignité transformant les carcinomes
différenciés, les PTC ou les FTC, en carcinomes complètement dédifférenciés, les
ATC (169;170). Nous n’avons trouvé qu’un échantillon ATC sur 5 présentant une
mutation dans le gène p53. Néanmoins, ce dernier peut également être inactivé via
d’autres mécanismes comme la sur-expression de protéines inhibitrices ou
l’inhibition fonctionnelle de protéines activatrices. Le gène p53 peut également
avoir un niveau d’expression ou une localisation aberrants (171;172). Cependant,
plusieurs études ont montré qu’une mutation dans le gène p53 n’est pas un
élément suffisant pour induire la transformation tumorale, suggérant la nécessité
de mutations additionnelles supplémentaires (173;174). De plus, plusieurs
groupes ont suggéré que les ATC ne sont pas toujours la conséquence d’une suite
d’événements mutationnels séquentiels comme suggéré à la Figure 9 du chapitre
2.2.1 dans l’Introduction. En effet, les tumeurs multifocales seraient la
conséquence d’un ensemble d’événements mutationnels indépendants qui
surviendraient simultanément et de métastases intrathyroïdiennes (115;175;176).
Dans ce travail, nous avons également mis en évidence 125 gènes
différentiellement exprimés entre les PTC et les ATC, qui pourraient être des
73
Discussion et perspectives
nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Afin d’étudier le rôle fonctionnel des
protéines correspondantes, nous avons sélectionné 5 candidats pour lesquels nous
avons réalisé des expériences de suppression d’expression (par siRNA).
Malheureusement, aucun des 5 candidats testés n’a vu son expression inhibée, de
manière significative, par cette technologie.
De nombreuses études microarrays existent et permettent de séparer les tumeurs
thyroïdiennes au niveau des ARNm (177-186). Cependant, dans d’autres cancers,
les signatures au niveau des miRNA semblent plus sensibles que celles basées sur
les ARNm (187). La caractérisation des tumeurs au niveau miRNA et la mise en
évidence de cibles thérapeutiques représentent un enjeu considérable étant donné
que chaque miRNA régule des centaines d’ARNm. De plus, les miRNA étant plus
résistants à la dégradation RNAse que les ARNm, pourraient également être de
bons biomarqueurs dans le sérum et dans le plasma (188-190).
Nous avons donc étudié le profil d’expression miRNA des ATC, et nous l’avons
comparé à celui des PTC. Les ATC présentent un profil d’expression miRNA
bien distinct de celui des PTC et nous avons trouvé une signature de 561 miRNA
qui sépare les deux tumeurs. Nous avons observé plus de miRNA sous-exprimés
que sur-exprimés dans les ATC alors que dans d’autres tumeurs, comme dans les
PTC, nous observons le phénomène inverse (191). En effet, la dérégulation des
miRNA dans le cancer est un processus complexe qui ne dépend pas seulement du
niveau des miRNA mais aussi d’autres facteurs qui influencent l’interaction des
miRNA sur leurs cibles comme les composants du complexe RISC. Nous avons
montré, dans ce travail, que la famille des protéines AGO est sur-exprimée dans
les ATC. Ces protéines ne sont pas impliquées directement dans la biogénèse des
miRNA mais dans la formation du complexe RISC, et leur sur-expression peut
augmenter la dégradation des cibles des miRNA, sans augmentation du niveau des
miRNA. Les protéines AGO ne sont, par contre, pas dérégulées dans les PTC et
ceux-ci présentent plus de miRNA sur-exprimés.
74
Discussion et perspectives
Les analyses microarrays de cette thèse ont été réalisés sur des tumeurs entières,
or la plupart des tumeurs sont morphologiquement et biologiquement hétérogènes.
L’analyse des différents tissus provenant d’une microdissection au sein de la
même tumeur permettrait de définir des signatures plus précises (115;192). De
plus, il faudrait vérifier que les profils d’expression génique obtenus avec des
prélèvement par FNAB sont similaires à ceux de la tumeur entière (193;194).
L’expression différentielle d’ARNm ne représente que 40% de la variation de
l’expression des protéines reflétant de nombreux niveaux de régulation posttranscriptionnel, traductionnel et post-traductionnel (195;196). Or, étant donné
que la plupart des fonctions biologiques sont exécutées par les protéines plutôt
que par les ARNm, il serait important, dans le futur, d’intégrer aux outils actuels
l’analyse au niveau protéomique (197). La Table 6 synthétise les différentes
approches actuelles avec leurs avantages, leurs limites et leurs perspectives.
Pour conclure, cette thèse nous a permis de comprendre plus en détail les
mécanismes de tumorigénèse des tumeurs thyroïdiennes en étudiant en parallèle
des tumeurs in vivo et un modèle expérimental in vitro, et a permis de caractériser
certaines tumeurs au niveau des ARNm et des miRNA.
75
CHAPITRE V : MATERIELS ET METHODES
Dans cette section, nous décrivons le matériel et les méthodes relatifs à la
section 3 du chapitre résultat. Les matériels et méthodes relatifs aux sections 1 et
2 sont décrits dans les 2 articles publiés.
1. Matériels
1.1 Lignées cellulaires
-
8505C : lignée cellulaire humaine provenant d’un carcinome anaplasique.
-
BCPAP : lignée cellulaire humaine provenant d’un carcinome papillaire.
1.2 Milieux de culture
-
Milieu de culture pour les lignées cellulaires 8505C et BCPAP sans
antibiotiques: RPMI1640 + Lglutamine + 10% FBS.
-
Milieu de culture pour les lignées cellulaires 8505C et BCPAP avec
antibiotiques: RPMI1640 + Lglutamine + 10% FBS + 1% fungizone + 2%
peniciline/streptavidine.
1.3 SiRNA
-
SiRNA-ACVR2B: ON-TARGETplus SMARTpool (Dharmacon)
-
SiRNA-FOXD1: sc-60649 (Santa Cruz)
-
SiRNA-AGO2 : eIF2C2 siRNA (h): sc-44409 (Santa Cruz)
1.4 Agent de transfection
Oligofectamine (Invitrogen)
76
Matériel et méthodes
Lipofectamine (Invitrogen)
Dharmafect 2 (Dharmacon)
1.5 Solutions pour la manipulation des protéines
1.5.1 Lyse des cellules
-
PBS 1× : (NaCl 150 mM, KH2PO4 2mM, Na2HPO4 8mM, KCl 3 mM) pH
7,4
-
Tampon de lyse : (Glycerol 10%, DTT 100 mM, SDS 2%, Tris-HCl 0,06
M pH 6,2) pH6.8 + 0.5M NaF, 100 mM pH10.5 de Vanate de sodium, 60
g/ml Pefabloc et 1 mg/ml Leupeptin.
1.5.2 Quantification des protéines
-
Solution de coloration : 0,5% Bleu de Coomassie G, 7% acide acétique
-
Solution de décoloration : 7% acide acétique
-
Solution d’extraction : méthanol 66%, NH4OH 1%
1.5.3 Séparation des protéines
-
Gel de séparation : 7.5% polyacrylamide, 375 mM Tris/HCl pH 8.8, 0.1%
SDS, 50 l persulfate d’ammonium 10%, 10 l TEMED
-
Gel de concentration : 4% polyacrylamide, 125 mM Tris/HCl pH 6.8, 0.1
% SDS, 25 l persulfate d’ammonium, 10 l TEMED
-
Tampon d’électrophorèse : 25 mM Tris, 0.192 M glycine et 0.1 % SDS
1.5.4 Immunodétection (Western blotting)
-
Tampon de transfert : Tris 20 mM, Glycine 154 mM, Méthanol 20%
-
TBST : 10 mM Tris/HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20
77
Matériel et méthodes
1.6 Anticorps
1.6.1 Anticorps primaires
-
anti-ACVRIIB: polyclonal de chèvre (R&D systems, AF339): dilution
1:500 dans TBST 1X
-
anti-DAPK2: polyclonal de chèvre (Santa Cruz, sc-10081): dilution 1:200
dans TBST 1X
-
anti-FOXD1: polyclonal de lapin (Abcam, ab49156) : dilution 1 : 200 dans
TBST 1X
-
anti-AGO2: polyclonal de lapin (Millipore, 07-590) : dilution 1 : 200 dans
TBST 1X
1.6.2 Anticorps secondaires
-
Anticorps de chèvre (Amersham): dilution 1:15000 dans TBST 1X
-
Anticorps de lapin (GE): dilution 1:15000 dans TBST1X
1.7 Amorces pour le séquençage de p53
Trois paires d’amorces ont été commandées afin de couvrir les exons 2 à
12 de p53 :
p53fw1 : GTGACACGCTTCCCTGGAT
p53rev1 : ACACGCAAATTTCCTTCCAC
p53fw2 : GCTGCTCAGATAGCGATGGT
p53rev2: GTGGGAGGCTGTCAGTGG
p53fw3: CCCTTCCCAGAAAACCTACC
p53rev3: AGCTGTTCCGTCCCAGTAGA
78
Matériel et méthodes
2. Méthodes
2.1 Analyse de l’expression génique sur lames Affymetrix
2.1.1 Hybridation
Neuf ATC, 20 PTC et des 20 tissus normaux adjacents aux PTC avaient été
hybridés en 2007 lors de la thèse de L. Delys selon le protocole Affymetrix à
l’Institut Bordet (groupe de C. Sotiriou) (lames: HGU 133 plus 2.0).
2.1.2 Traitement des données pour l’analyse ATC et PTC
- Normalisation BRBArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html),
algorithme GCRMA.
- Sélection des gènes pour la signature ATC/PTC : sélection d’un gène si il est
régulé plus de 2 fois dans 80% des échantillons (sans régulation inverse).
- MDS: R (package MASS 7.2-29) fonction isoMDS.
2.2 Analyse de l’expression des miRNA sur lames « maison »Lames microRNA
2.2.1 Hybridation
Les lames miRNA sont préparées à l’IRIBHM par l’équipe de F. libert. 1269
miRNA humains-murins-rats, 33 miRNA contrôles et 10 Spike-in (banque
Exiqon mirCURY LNA version 11.0, 25 µM) sont déposés, en double, sur chaque
lame, à l’aide d’un robot.
Après avoir purifié l’ARNtotal sur colonne (miRNeasy Mini Kit, Qiagen), 0.5 à 2
µg d’ARNtot provenant de 11 ATC sont traités avec une phosphatase alcaline
intestinale de veau (CIP) qui retire les groupement phosphates en 5’ et ensuite les
miRNA sont marqués en 3’ par des fluorophores Hyanine 3 et Hyanine 5
(Exiqon). L’ARN marqué et 1 µg de Spike-in (Exiqon) sont ensuite purifiés sur
colonne (RNeasy Mini Kit, Qiagen) et déposés sur les lames pendant 16 à 20h.
Après avoir lavé les lames, celles-ci sont ensuite scannées avec le scanner
79
Matériel et méthodes
GenePix 4000B. Les traitements de l’image ont été réalisés par le programme
GenePix Pro 6.0.
2.2.2 Traitement des données pour l’analyse miRNA
- Sélection des spots dont le rapport signal sur bruit est supérieur à 2 (SNR>2)
pour au-moins un des deux canaux.
- Soustraction du background des données par R (version 2.6.0) (package limma):
méthode normexp avec un offset à 50.
- Normalisation des données par l’algorithme loess par R (package marray 1.6.3).
- Moyenne des quatre réplicats (dye-swap et duplicat de la librarie) si au
minimum deux des quatre valeurs sont présentes.
- Sélection des gènes régulés: ratio > |1.5| dans tous les échantillons ATC
- Clustering hiérarchique: cluster Eisen (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm),
complete linkage.
- MDS: R (package MASS 7.2-29) fonction isoMDS.
2.3 Transfection des siRNA dans les lignées cellulaires
Les cellules 8505C ou BCPAP sont ensemencées dans des boites de 36 mm de
diamètre, à une densité de 20%, dans le milieu de culture sans antibiotique.
Dans deux tubes séparés, 5 µl de siRNA 20 µM ou 12 µl d’Oligofectamine sont
dilués dans 95 µl et 78 µl de milieu sans sérum respectivement. Les deux tubes
sont incubés pendant 5 min à température ambiante et sont ensuite mélangés. Le
nouveau tube est incubé pendant 20 min à température ambiante. Le milieu de
culture des cellules est remplacé par la solution ci-dessus additionnée de 800 µl de
milieu avec sérum sont rajoutés aux cellules (concentration en siRNA dans le
milieu d’incubation : 100nM). Les cellules sont incubées pendant 24, 48, 72 et
96h (24 et 48h pour l’analyse au niveau des ARNm et 48, 72 et 96h pour l’analyse
au niveau des protéines), en prenant soin de garder un contrôle transfecté avec un
siRNA contrôle (Dharmacon, D-001810-10-20) pour chaque condition.
80
Matériel et méthodes
2.4 Analyse des protéines
2.4.1 Lyse des cellules
Les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS 1× et ensuite lysées avec le tampon de
lyse (100-300 µl/boîte de 36 mm de diamètre).
2.4.2 Quantification des protéines
Un filtre en papier Whatman n°1 est divisé en carrés de 1,5 x 1,5 cm. Huit des
carrés sont réservés pour les « blancs ». 8 solutions standards de BSA
(respectivement 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 et 12 µg de protéines), 4 l de protéines du lysat
à doser ainsi que 4 l de tampon de lyse sont déposés, en double, sur le filtre.
Après séchage, le papier est rincé 30 secondes dans du méthanol absolu puis
coloré sous agitation lente à température ambiante, dans 250 ml de solution de
coloration pendant 30 minutes. Il est ensuite décoloré par 3 lavages successifs de
30 minutes dans une solution de décoloration, séché puis découpé. Chacun des
carrés est placé dans un tube Eppendorf auquel on ajoute 1 ml de solution
d’extraction. Les tubes sont ensuite vortexés 2 fois. La densité optique des
solutions est mesurée à 600nm dans une plaque à 96 puits (300 l par puits) par
un spectrophotomètre (Bio-Rad). Les différentes densités optiques des
échantillons et des standards de concentrations connues sont ensuite portées sur
un graphique et la concentration protéique des différents échantillons en est
déduite.
2.4.3 Séparation des protéines par électrophorèse
La séparation de protéines sur gel de polyacrylamide en présence de SDS est
basée sur le rapport charge/masse moléculaire de chaque protéine pendant
l’application d’un champ électrique. Le gel comprend un gel de concentration (à
4%) et un gel de séparation (à 7.5 ou 10%, en fonction de la taille de la protéine
étudiée). 30 µg de protéines dissoutes dans du tampon de lyse et bouillis ainsi
que 7 µl de marqueur de masse moléculaire (Precision Plus ProteinTM Dual Color
81
Matériel et méthodes
Standards, Bio-Rad) sont déposés sur le gel. La migration est effectuée à 25 mA
constant par gel pendant 1h dans le tampon d’électrophorèse.
2.4.4 Immunodétection (Western blotting)
Après séparation des protéines par électrophorèse sur gel SDS-PAGE, celles-ci
sont transférées sur membrane de nitrocellulose à voltage constant (100V) durant
16 heures à 26V, à 4°C ou 90 minutes à 100V, à 4°C dans un tampon de transfert.
La membrane est d'abord incubée dans du TBST contenant 5% de poudre de lait
pendant 1h pour bloquer les sites non-spécifiques, puis incubée 2h en présence de
l’anticorps primaire dilué de façon adéquate. Après 3 lavages de 10 minutes dans
du TBST, la membrane est mise en présence de l'anticorps secondaire pendant 45
minutes. Après 3 lavages de 10 minutes dans du TBST, une solution ECL
(Enhanced Chemiluminescence, Perkin Elmer) est déposée sur la membrane
pendant 1 minute et cette dernière est ensuite exposée à un film (hyperfilm,
Amersham).
2.5 Séquençages d’ADN
Après un traitement à la DNase, l’ARN est rétrotranscrit en ADN puis amplifié
par PCR et ensuite purifié sur colonne (Qiaquick). Les séquençages d’ADN ont
été réalisés par Bernadette Bournonville au sein du laboratoire. La méthode de
séquençage utilisée est le ‘Big Dye Terminator Cycle Sequencing’ (Applied
Biosystems, Foster City, CA, UA).
82
CHAPITRE VI : BIBLIOGRAPHIE
1. Weinberg RA 2007 The biology of cancer, ed. Garland Science: New
York.
2. Shchors K, Evan G 2007 Tumor angiogenesis: cause or consequence of
cancer? Cancer Res 67:7059-7061
3. Maenhaut C, Brabant G, Vassart G, Dumont JE 1992 In vitro and in vivo
regulation of thyrotropin receptor mRNA levels in dog and human thyroid
cells. J Biol Chem 267:3000-3007
4. Roger P, Taton M, Van Sande J, Dumont JE 1988 Mitogenic effects of
thyrotropin and adenosine 3',5'-monophosphate in differentiated normal
human thyroid cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab 66:1158-1165
5. Roger PP, Servais P, Dumont JE 1983 Stimulation by thyrotropin and
cyclic AMP of the proliferation of quiescent canine thyroid cells cultured
in a defined medium containing insulin. FEBS Lett 157:323-329
6. Burikhanov R, Coulonval K, Pirson I, Lamy F, Dumont JE, Roger PP
1996 Thyrotropin via cyclic AMP induces insulin receptor expression and
insulin Co-stimulation of growth and amplifies insulin and insulin-like
growth factor signaling pathways in dog thyroid epithelial cells. J Biol
Chem 271:29400-29406
7. Coulonval K, Vandeput F, Stein RC, Kozma SC, Lamy F, Dumont JE
2000 Phosphatidylinositol 3-kinase, protein kinase B and ribosomal S6
kinases in the stimulation of thyroid epithelial cell proliferation by cAMP
and growth factors in the presence of insulin. Biochem J 348 Pt 2:351-358
8. Roger P, Taton M, Van Sande J, Dumont JE 1988 Mitogenic effects of
thyrotropin and adenosine 3',5'-monophosphate in differentiated normal
human thyroid cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab 66:1158-1165
9. Roger PP, Christophe D, Dumont JE, Pirson I 1997 The dog thyroid
primary culture system: a model of the regulation of function, growth and
differentiation expression by cAMP and other well-defined signaling
cascades. Eur J Endocrinol 137:579-598
83
Biobligraphie
10. Laurent E, Mockel J, Van Sande J, Graff I, Dumont JE 1987 Dual
activation by thyrotropin of the phospholipase C and cyclic AMP cascades
in human thyroid. Mol Cell Endocrinol 52:273-278
11. Van Sande J, Raspe E, Perret J, Lejeune C, Maenhaut C, Vassart G,
Dumont JE 1990 Thyrotropin activates both the cyclic AMP and the PIP2
cascades in CHO cells expressing the human cDNA of TSH receptor. Mol
Cell Endocrinol 74:R1-R6
12. Roger PP, Reuse S, Servais P, Van Heuverswyn B, Dumont JE 1986
Stimulation of cell proliferation and inhibition of differentiation
expression by tumor-promoting phorbol esters in dog thyroid cells in
primary culture. Cancer Res 46:898-906
13. Roger PP, Reuse S, Servais P, Van Heuverswyn B, Dumont JE 1986
Stimulation of cell proliferation and inhibition of differentiation
expression by tumor-promoting phorbol esters in dog thyroid cells in
primary culture. Cancer Res 46:898-906
14. Roger P, Taton M, Van Sande J, Dumont JE 1988 Mitogenic effects of
thyrotropin and adenosine 3',5'-monophosphate in differentiated normal
human thyroid cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab 66:1158-1165
15. Dumont JE, Lamy F, Roger P, Maenhaut C 1992 Physiological and
pathological regulation of thyroid cell proliferation and differentiation by
thyrotropin and other factors. Physiol Rev 72:667-697
16. Burikhanov R, Coulonval K, Pirson I, Lamy F, Dumont JE, Roger PP
1996 Thyrotropin via cyclic AMP induces insulin receptor expression and
insulin Co-stimulation of growth and amplifies insulin and insulin-like
growth factor signaling pathways in dog thyroid epithelial cells. J Biol
Chem 271:29400-29406
17. Deleu S, Pirson I, Coulonval K, Drouin A, Taton M, Clermont F, Roger
PP, Nakamura T, Dumont JE, Maenhaut C 1999 IGF-1 or insulin, and the
TSH cyclic AMP cascade separately control dog and human thyroid cell
growth and DNA synthesis, and complement each other in inducing
mitogenesis. Mol Cell Endocrinol 149:41-51
18. Vandeput F, Perpete S, Coulonval K, Lamy F, Dumont JE 2003 Role of
the different mitogen-activated protein kinase subfamilies in the
stimulation of dog and human thyroid epithelial cell proliferation by cyclic
adenosine 5'-monophosphate and growth factors. Endocrinology
144:1341-1349
19. Roger PP, Christophe D, Dumont JE, Pirson I 1997 The dog thyroid
primary culture system: a model of the regulation of function, growth and
84
Biobligraphie
differentiation expression by cAMP and other well-defined signaling
cascades. Eur J Endocrinol 137:579-598
20. Raman M, Chen W, Cobb MH 2007 Differential regulation and properties
of MAPKs. Oncogene 26:3100-3112
21. Raman M, Chen W, Cobb MH 2007 Differential regulation and properties
of MAPKs. Oncogene 26:3100-3112
22. Raman M, Chen W, Cobb MH 2007 Differential regulation and properties
of MAPKs. Oncogene 26:3100-3112
23. L.Leenhardt, F.Ménégaux, B.Franc, C.Hoang, S.Salem, M.-O.Bernier,
L.Dupasquier-Fédiaevsky, E.Le Marois, A.Rouxel, J.-P.Chigot, L.ChériéChalline, A.Aurengo. Cancers de la thyroïde. 2005.
Ref Type: Thesis/Dissertation
24. Franc B, de la SP, Lange F, Hoang C, Louvel A, de Roquancourt A, Vilde
F, Hejblum G, Chevret S, Chastang C 2003 Interobserver and
intraobserver reproducibility in the histopathology of follicular thyroid
carcinoma. Hum Pathol 34:1092-1100
25. Lloyd RV, Erickson LA, Casey MB, Lam KY, Lohse CM, Asa SL, Chan
JK, DeLellis RA, Harach HR, Kakudo K, LiVolsi VA, Rosai J, Sebo TJ,
Sobrinho-Simoes M, Wenig BM, Lae ME 2004 Observer variation in the
diagnosis of follicular variant of papillary thyroid carcinoma. Am J Surg
Pathol 28:1336-1340
26. Giordano TJ 2008 Genome-wide studies in thyroid neoplasia. Endocrinol
Metab Clin North Am 37:311-viii
27. Durand S, Ferraro-Peyret C, Selmi-Ruby S, Paulin C, El Atifi M, Berger
F, Berger-Dutrieux N, Decaussin M, Peix JL, Bournaud C, Orgiazzi J,
Borson-Chazot F, Rousset B 2008 Evaluation of gene expression profiles
in thyroid nodule biopsy material to diagnose thyroid cancer. J Clin
Endocrinol Metab 93:1195-1202
28. Corvilain B 2003 The natural history of thyroid autonomy and hot
nodules. Ann Endocrinol (Paris) 64:17-22
29. Krohn K, Wohlgemuth S, Gerber H, Paschke R 2000 Hot microscopic
areas of iodine-deficient euthyroid goitres contain constitutively activating
TSH receptor mutations. J Pathol 192:37-42
30. Hamburger JI 1987 The autonomously functioning thyroid nodule:
Goetsch's disease. Endocr Rev 8:439-447
85
Biobligraphie
31. Deleu S, Allory Y, Radulescu A, Pirson I, Carrasco N, Corvilain B,
Salmon I, Franc B, Dumont JE, Van Sande J, Maenhaut C 2000
Characterization of autonomous thyroid adenoma: metabolism, gene
expression, and pathology. Thyroid 10:131-140
32. Wattel S, Mircescu H, Venet D, Burniat A, Franc B, Frank S, Andry G,
Van Sande J, Rocmans P, Dumont JE, Detours V, Maenhaut C 2005 Gene
expression in thyroid autonomous adenomas provides insight into their
physiopathology. Oncogene 24:6902-6916
33. Poertl S, Kirner J, Saller B, Mann K, Hoermann R 1998 T3-release from
autonomously functioning thyroid nodules in vitro. Exp Clin Endocrinol
Diabetes 106:489-493
34. van den Hove-Vandenbroucke MF, De Visscher M, Couvreur-Eppe M
1976 Secretory activity of isolated thyroid adenomas. J Clin Endocrinol
Metab 43:178-181
35. Van Sande J, Parma J, Tonacchera M, Swillens S, Dumont J, Vassart G
1995 Somatic and germline mutations of the TSH receptor gene in thyroid
diseases. J Clin Endocrinol Metab 80:2577-2585
36. Alberti L, Proverbio MC, Costagliola S, Weber G, Beck-Peccoz P,
Chiumello G, Persani L 2001 A novel germline mutation in the TSH
receptor gene causes non-autoimmune autosomal dominant
hyperthyroidism. Eur J Endocrinol 145:249-254
37. Arturi F, Chiefari E, Tumino S, Russo D, Squatrito S, Chazenbalk G,
Persani L, Rapoport B, Filetti S 2002 Similarities and differences in the
phenotype of members of an Italian family with hereditary nonautoimmune hyperthyroidism associated with an activating TSH receptor
germline mutation. J Endocrinol Invest 25:696-701
38. Biebermann H, Schoneberg T, Krude H, Gudermann T, Gruters A 2000
Constitutively activating TSH-receptor mutations as a molecular cause of
non-autoimmune hyperthyroidism in childhood. Langenbecks Arch Surg
385:390-392
39. Biebermann H, Schoneberg T, Hess C, Germak J, Gudermann T, Gruters
A 2001 The first activating TSH receptor mutation in transmembrane
domain 1 identified in a family with nonautoimmune hyperthyroidism. J
Clin Endocrinol Metab 86:4429-4433
40. Corvilain B, Van Sande J, Dumont JE, Vassart G 2001 Somatic and
germline mutations of the TSH receptor and thyroid diseases. Clin
Endocrinol (Oxf) 55:143-158
86
Biobligraphie
41. de Roux N, Polak M, Couet J, Leger J, Czernichow P, Milgrom E, Misrahi
M 1996 A neomutation of the thyroid-stimulating hormone receptor in a
severe neonatal hyperthyroidism. J Clin Endocrinol Metab 81:2023-2026
42. Duprez L, Parma J, Van Sande J, Allgeier A, Leclere J, Schvartz C,
Delisle MJ, Decoulx M, Orgiazzi J, Dumont J, . 1994 Germline mutations
in the thyrotropin receptor gene cause non-autoimmune autosomal
dominant hyperthyroidism. Nat Genet 7:396-401
43. Duprez L, Parma J, Van Sande J, Rodien P, Sabine C, Abramowicz M,
Dumont JE, Vassart G 1999 Pathology of the TSH receptor. J Pediatr
Endocrinol Metab 12 Suppl 1:295-302
44. Esapa CT, Duprez L, Ludgate M, Mustafa MS, Kendall-Taylor P, Vassart
G, Harris PE 1999 A novel thyrotropin receptor mutation in an infant with
severe thyrotoxicosis. Thyroid 9:1005-1010
45. Ferrara AM, Capalbo D, Rossi G, Capuano S, Del Prete G, Esposito V,
Montesano G, Zampella E, Fenzi G, Salerno M, Macchia PE 2007 A new
case of familial nonautoimmune hyperthyroidism caused by the M463V
mutation in the TSH receptor with anticipation of the disease across
generations: a possible role of iodine supplementation. Thyroid 17:677680
46. Fuhrer D, Wonerow P, Willgerodt H, Paschke R 1997 Identification of a
new thyrotropin receptor germline mutation (Leu629Phe) in a family with
neonatal onset of autosomal dominant nonautoimmune hyperthyroidism. J
Clin Endocrinol Metab 82:4234-4238
47. Gruters A, Schoneberg T, Biebermann H, Krude H, Krohn HP, Dralle H,
Gudermann T 1998 Severe congenital hyperthyroidism caused by a germline neo mutation in the extracellular portion of the thyrotropin receptor. J
Clin Endocrinol Metab 83:1431-1436
48. Holzapfel HP, Wonerow P, von Petrykowski W, Henschen M, Scherbaum
WA, Paschke R 1997 Sporadic congenital hyperthyroidism due to a
spontaneous germline mutation in the thyrotropin receptor gene. J Clin
Endocrinol Metab 82:3879-3884
49. Karges B, Krause G, Homoki J, Debatin KM, de Roux N, Karges W 2005
TSH receptor mutation V509A causes familial hyperthyroidism by release
of interhelical constraints between transmembrane helices TMH3 and
TMH5. J Endocrinol 186:377-385
50. Kopp P, Van Sande J, Parma J, Duprez L, Gerber H, Joss E, Jameson JL,
Dumont JE, Vassart G 1995 Brief report: congenital hyperthyroidism
caused by a mutation in the thyrotropin-receptor gene. N Engl J Med
332:150-154
87
Biobligraphie
51. Kopp P, Muirhead S, Jourdain N, Gu WX, Jameson JL, Rodd C 1997
Congenital hyperthyroidism caused by a solitary toxic adenoma harboring
a novel somatic mutation (serine281-->isoleucine) in the extracellular
domain of the thyrotropin receptor. J Clin Invest 100:1634-1639
52. Lee YS, Poh L, Loke KY 2002 An activating mutation of the thyrotropin
receptor gene in hereditary non-autoimmune hyperthyroidism. J Pediatr
Endocrinol Metab 15:211-215
53. Nwosu BU, Gourgiotis L, Gershengorn MC, Neumann S 2006 A novel
activating mutation in transmembrane helix 6 of the thyrotropin receptor
as cause of hereditary nonautoimmune hyperthyroidism. Thyroid 16:505512
54. Pohlenz J, Pfarr N, Kruger S, Hesse V 2006 Subclinical hyperthyroidism
due to a thyrotropin receptor (TSHR) gene mutation (S505R). Acta
Paediatr 95:1685-1687
55. Schwab KO, Sohlemann P, Gerlich M, Broecker M, Petrykowski W,
Holzapfel HP, Paschke R, Gruters A, Derwahl M 1996 Mutations of the
TSH receptor as cause of congenital hyperthyroidism. Exp Clin
Endocrinol Diabetes 104 Suppl 4:124-128
56. Tonacchera M, Van Sande J, Cetani F, Swillens S, Schvartz C,
Winiszewski P, Portmann L, Dumont JE, Vassart G, Parma J 1996
Functional characteristics of three new germline mutations of the
thyrotropin receptor gene causing autosomal dominant toxic thyroid
hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab 81:547-554
57. Tonacchera M, Agretti P, Rosellini V, Ceccarini G, Perri A, Zampolli M,
Longhi R, Larizza D, Pinchera A, Vitti P, Chiovato L 2000 Sporadic
nonautoimmune congenital hyperthyroidism due to a strong activating
mutation of the thyrotropin receptor gene. Thyroid 10:859-863
58. Chester J, Rotenstein D, Ringkananont U, Steuer G, Carlin B, Stewart L,
Grasberger H, Refetoff S 2008 Congenital neonatal hyperthyroidism
caused by germline mutations in the TSH receptor gene. J Pediatr
Endocrinol Metab 21:479-486
59. Kohn B, Grasberger H, Lam LL, Ferrara AM, Refetoff S 2009 A somatic
gain-of-function mutation in the thyrotropin receptor gene producing a
toxic adenoma in an infant. Thyroid 19:187-191
60. Alberti L, Proverbio MC, Costagliola S, Weber G, Beck-Peccoz P,
Chiumello G, Persani L 2001 A novel germline mutation in the TSH
receptor gene causes non-autoimmune autosomal dominant
hyperthyroidism. Eur J Endocrinol 145:249-254
88
Biobligraphie
61. Corvilain B, Van Sande J, Dumont JE, Vassart G 2001 Somatic and
germline mutations of the TSH receptor and thyroid diseases. Clin
Endocrinol (Oxf) 55:143-158
62. Tonacchera M, Van Sande J, Cetani F, Swillens S, Schvartz C,
Winiszewski P, Portmann L, Dumont JE, Vassart G, Parma J 1996
Functional characteristics of three new germline mutations of the
thyrotropin receptor gene causing autosomal dominant toxic thyroid
hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab 81:547-554
63. Chester J, Rotenstein D, Ringkananont U, Steuer G, Carlin B, Stewart L,
Grasberger H, Refetoff S 2008 Congenital neonatal hyperthyroidism
caused by germline mutations in the TSH receptor gene. J Pediatr
Endocrinol Metab 21:479-486
64. Polak M, Legac I, Vuillard E, Guibourdenche J, Castanet M, Luton D
2006 Congenital hyperthyroidism: the fetus as a patient. Horm Res
65:235-242
65. Nikiforov YE 2004 Genetic alterations involved in the transition from
well-differentiated to poorly differentiated and anaplastic thyroid
carcinomas. Endocr Pathol 15:319-327
66. Riesco-Eizaguirre G, Santisteban P 2007 New insights in thyroid follicular
cell biology and its impact in thyroid cancer therapy. Endocr Relat Cancer
14:957-977
67. Gimm O 2001 Thyroid cancer. Cancer Lett 163:143-156
68. Ciampi R, Knauf JA, Kerler R, Gandhi M, Zhu Z, Nikiforova MN, Rabes
HM, Fagin JA, Nikiforov YE 2005 Oncogenic AKAP9-BRAF fusion is a
novel mechanism of MAPK pathway activation in thyroid cancer. J Clin
Invest 115:94-101
69. Jhiang SM, Sagartz JE, Tong Q, Parker-Thornburg J, Capen CC, Cho JY,
Xing S, Ledent C 1996 Targeted expression of the ret/PTC1 oncogene
induces papillary thyroid carcinomas. Endocrinology 137:375-378
70. Knauf JA, Ma X, Smith EP, Zhang L, Mitsutake N, Liao XH, Refetoff S,
Nikiforov YE, Fagin JA 2005 Targeted expression of BRAFV600E in
thyroid cells of transgenic mice results in papillary thyroid cancers that
undergo dedifferentiation. Cancer Res 65:4238-4245
71. Melillo RM, Castellone MD, Guarino V, De F, V, Cirafici AM, Salvatore
G, Caiazzo F, Basolo F, Giannini R, Kruhoffer M, Orntoft T, Fusco A,
Santoro M 2005 The RET/PTC-RAS-BRAF linear signaling cascade
mediates the motile and mitogenic phenotype of thyroid cancer cells. J
Clin Invest 115:1068-1081
89
Biobligraphie
72. Santoro M, Chiappetta G, Cerrato A, Salvatore D, Zhang L, Manzo G,
Picone A, Portella G, Santelli G, Vecchio G, Fusco A 1996 Development
of thyroid papillary carcinomas secondary to tissue-specific expression of
the RET/PTC1 oncogene in transgenic mice. Oncogene 12:1821-1826
73. Beimfohr C, Klugbauer S, Demidchik EP, Lengfelder E, Rabes HM 1999
NTRK1 re-arrangement in papillary thyroid carcinomas of children after
the Chernobyl reactor accident. Int J Cancer 80:842-847
74. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, Teague J,
Woffendin H, Garnett MJ, Bottomley W, Davis N, Dicks E, Ewing R,
Floyd Y, Gray K, Hall S, Hawes R, Hughes J, Kosmidou V, Menzies A,
Mould C, Parker A, Stevens C, Watt S, Hooper S, Wilson R, Jayatilake H,
Gusterson BA, Cooper C, Shipley J, Hargrave D, Pritchard-Jones K,
Maitland N, Chenevix-Trench G, Riggins GJ, Bigner DD, Palmieri G,
Cossu A, Flanagan A, Nicholson A, Ho JW, Leung SY, Yuen ST, Weber
BL, Seigler HF, Darrow TL, Paterson H, Marais R, Marshall CJ, Wooster
R, Stratton MR, Futreal PA 2002 Mutations of the BRAF gene in human
cancer. Nature 417:949-954
75. Grieco M, Santoro M, Berlingieri MT, Melillo RM, Donghi R,
Bongarzone I, Pierotti MA, Della PG, Fusco A, Vecchio G 1990 PTC is a
novel rearranged form of the ret proto-oncogene and is frequently detected
in vivo in human thyroid papillary carcinomas. Cell 60:557-563
76. Alberti L, Carniti C, Miranda C, Roccato E, Pierotti MA 2003 RET and
NTRK1 proto-oncogenes in human diseases. J Cell Physiol 195:168-186
77. Ciampi R, Knauf JA, Rabes HM, Fagin JA, Nikiforov YE 2005 BRAF
kinase activation via chromosomal rearrangement in radiation-induced and
sporadic thyroid cancer. Cell Cycle 4:547-548
78. Riesco-Eizaguirre G, Gutierrez-Martinez P, Garcia-Cabezas MA, Nistal
M, Santisteban P 2006 The oncogene BRAF V600E is associated with a
high risk of recurrence and less differentiated papillary thyroid carcinoma
due to the impairment of Na+/I- targeting to the membrane. Endocr Relat
Cancer 13:257-269
79. Durand S, Ferraro-Peyret C, Joufre M, Chave A, Borson-Chazot F, SelmiRuby S, Rousset B 2009 Molecular characteristics of papillary thyroid
carcinomas without BRAF mutation or RET/PTC rearrangement:
relationship with clinico-pathological features. Endocr Relat Cancer
16:467-481
80. Nikiforova MN, Kimura ET, Gandhi M, Biddinger PW, Knauf JA, Basolo
F, Zhu Z, Giannini R, Salvatore G, Fusco A, Santoro M, Fagin JA,
Nikiforov YE 2003 BRAF mutations in thyroid tumors are restricted to
90
Biobligraphie
papillary carcinomas and anaplastic or poorly differentiated carcinomas
arising from papillary carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 88:5399-5404
81. Riesco-Eizaguirre G, Gutierrez-Martinez P, Garcia-Cabezas MA, Nistal
M, Santisteban P 2006 The oncogene BRAF V600E is associated with a
high risk of recurrence and less differentiated papillary thyroid carcinoma
due to the impairment of Na+/I- targeting to the membrane. Endocr Relat
Cancer 13:257-269
82. Ciampi R, Nikiforov YE 2007 RET/PTC rearrangements and BRAF
mutations in thyroid tumorigenesis. Endocrinology 148:936-941
83. Thomas GA, Bunnell H, Cook HA, Williams ED, Nerovnya A, Cherstvoy
ED, Tronko ND, Bogdanova TI, Chiappetta G, Viglietto G, Pentimalli F,
Salvatore G, Fusco A, Santoro M, Vecchio G 1999 High prevalence of
RET/PTC rearrangements in Ukrainian and Belarussian post-Chernobyl
thyroid papillary carcinomas: a strong correlation between RET/PTC3 and
the solid-follicular variant. J Clin Endocrinol Metab 84:4232-4238
84. Unger K, Zitzelsberger H, Salvatore G, Santoro M, Bogdanova T,
Braselmann H, Kastner P, Zurnadzhy L, Tronko N, Hutzler P, Thomas G
2004 Heterogeneity in the distribution of RET/PTC rearrangements within
individual post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol
Metab 89:4272-4279
85. Williams ED, Abrosimov A, Bogdanova T, Demidchik EP, Ito M, LiVolsi
V, Lushnikov E, Rosai J, Sidorov Y, Tronko MD, Tsyb AF, Vowler SL,
Thomas GA 2004 Thyroid carcinoma after Chernobyl latent period,
morphology and aggressiveness. Br J Cancer 90:2219-2224
86. Castro P, Rebocho AP, Soares RJ, Magalhaes J, Roque L, Trovisco V,
Vieira dC, I, Cardoso-de-Oliveira M, Fonseca E, Soares P, SobrinhoSimoes M 2006 PAX8-PPARgamma rearrangement is frequently detected
in the follicular variant of papillary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol
Metab 91:213-220
87. Garcia-Rostan G, Zhao H, Camp RL, Pollan M, Herrero A, Pardo J, Wu
R, Carcangiu ML, Costa J, Tallini G 2003 ras mutations are associated
with aggressive tumor phenotypes and poor prognosis in thyroid cancer. J
Clin Oncol 21:3226-3235
88. Marques AR, Espadinha C, Catarino AL, Moniz S, Pereira T, Sobrinho
LG, Leite V 2002 Expression of PAX8-PPAR gamma 1 rearrangements in
both follicular thyroid carcinomas and adenomas. J Clin Endocrinol Metab
87:3947-3952
89. Melillo RM, Castellone MD, Guarino V, De F, V, Cirafici AM, Salvatore
G, Caiazzo F, Basolo F, Giannini R, Kruhoffer M, Orntoft T, Fusco A,
91
Biobligraphie
Santoro M 2005 The RET/PTC-RAS-BRAF linear signaling cascade
mediates the motile and mitogenic phenotype of thyroid cancer cells. J
Clin Invest 115:1068-1081
90. Riesco-Eizaguirre G, Santisteban P 2007 New insights in thyroid follicular
cell biology and its impact in thyroid cancer therapy. Endocr Relat Cancer
14:957-977
91. Gimm O 2001 Thyroid cancer. Cancer Lett 163:143-156
92. Riesco-Eizaguirre G, Santisteban P 2007 New insights in thyroid follicular
cell biology and its impact in thyroid cancer therapy. Endocr Relat Cancer
14:957-977
93. Smallridge RC, Marlow LA, Copland JA 2009 Anaplastic thyroid cancer:
molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocr Relat Cancer
16:17-44
94. Green LD, Mack L, Pasieka JL 2006 Anaplastic thyroid cancer and
primary thyroid lymphoma: a review of these rare thyroid malignancies. J
Surg Oncol 94:725-736
95. Kondo T, Ezzat S, Asa SL 2006 Pathogenetic mechanisms in thyroid
follicular-cell neoplasia. Nat Rev Cancer 6:292-306
96. Are C, Shaha AR 2006 Anaplastic thyroid carcinoma: biology,
pathogenesis, prognostic factors, and treatment approaches. Ann Surg
Oncol 13:453-464
97. Wang HM, Huang YW, Huang JS, Wang CH, Kok VC, Hung CM, Chen
HM, Tzen CY 2007 Anaplastic carcinoma of the thyroid arising more
often from follicular carcinoma than papillary carcinoma. Ann Surg Oncol
14:3011-3018
98. Sherman SI 2003 Thyroid carcinoma. Lancet 361:501-511
99. Kondo T, Ezzat S, Asa SL 2006 Pathogenetic mechanisms in thyroid
follicular-cell neoplasia. Nat Rev Cancer 6:292-306
100. Hunt JL, Tometsko M, LiVolsi VA, Swalsky P, Finkelstein SD, Barnes
EL 2003 Molecular evidence of anaplastic transformation in coexisting
well-differentiated and anaplastic carcinomas of the thyroid. Am J Surg
Pathol 27:1559-1564
101. Kondo T, Ezzat S, Asa SL 2006 Pathogenetic mechanisms in thyroid
follicular-cell neoplasia. Nat Rev Cancer 6:292-306
92
Biobligraphie
102. Quiros RM, Ding HG, Gattuso P, Prinz RA, Xu X 2005 Evidence that one
subset of anaplastic thyroid carcinomas are derived from papillary
carcinomas due to BRAF and p53 mutations. Cancer 103:2261-2268
103. Malaguarnera R, Vella V, Vigneri R, Frasca F 2007 p53 family proteins in
thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 14:43-60
104. Lam KY, Lo CY, Chan KW, Wan KY 2000 Insular and anaplastic
carcinoma of the thyroid: a 45-year comparative study at a single
institution and a review of the significance of p53 and p21. Ann Surg
231:329-338
105. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ 2000 Surfing the p53 network. Nature
408:307-310
106. Gomez-Lazaro M, Fernandez-Gomez FJ, Jordan J 2004 p53: twenty five
years understanding the mechanism of genome protection. J Physiol
Biochem 60:287-307
107. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ 2000 Surfing the p53 network. Nature
408:307-310
108. Malaguarnera R, Vella V, Vigneri R, Frasca F 2007 p53 family proteins in
thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 14:43-60
109. La Perle KM, Jhiang SM, Capen CC 2000 Loss of p53 promotes anaplasia
and local invasion in ret/PTC1-induced thyroid carcinomas. Am J Pathol
157:671-677
110. Malaguarnera R, Vella V, Vigneri R, Frasca F 2007 p53 family proteins in
thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 14:43-60
111. Martelli ML, Miano MG, Battaglia C, Trapasso F, Stella A, Iuliano R,
Visconti R, Fagin JA, Santoro M, Fusco A 2000 The highly malignant
phenotype of anaplastic thyroid carcinoma cell lines is recessive. Eur J
Endocrinol 143:515-521
112. Wang HM, Huang YW, Huang JS, Wang CH, Kok VC, Hung CM, Chen
HM, Tzen CY 2007 Anaplastic carcinoma of the thyroid arising more
often from follicular carcinoma than papillary carcinoma. Ann Surg Oncol
14:3011-3018
113. Nikiforova MN, Nikiforov YE 2008 Molecular genetics of thyroid cancer:
implications for diagnosis, treatment and prognosis. Expert Rev Mol
Diagn 8:83-95
114. Riesco-Eizaguirre G, Gutierrez-Martinez P, Garcia-Cabezas MA, Nistal
M, Santisteban P 2006 The oncogene BRAF V600E is associated with a
93
Biobligraphie
high risk of recurrence and less differentiated papillary thyroid carcinoma
due to the impairment of Na+/I- targeting to the membrane. Endocr Relat
Cancer 13:257-269
115. Aherne ST, Smyth PC, Flavin RJ, Russell SM, Denning KM, Li JH,
Guenther SM, O'Leary JJ, Sheils OM 2008 Geographical mapping of a
multifocal thyroid tumour using genetic alteration analysis & miRNA
profiling. Mol Cancer 7:89
116. Garcia-Rostan G, Tallini G, Herrero A, D'Aquila TG, Carcangiu ML,
Rimm DL 1999 Frequent mutation and nuclear localization of beta-catenin
in anaplastic thyroid carcinoma. Cancer Res 59:1811-1815
117. Riesco-Eizaguirre G, Santisteban P 2007 New insights in thyroid follicular
cell biology and its impact in thyroid cancer therapy. Endocr Relat Cancer
14:957-977
118. Smallridge RC, Marlow LA, Copland JA 2009 Anaplastic thyroid cancer:
molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocr Relat Cancer
16:17-44
119. Garcia-Rostan G, Costa AM, Pereira-Castro I, Salvatore G, Hernandez R,
Hermsem MJ, Herrero A, Fusco A, Cameselle-Teijeiro J, Santoro M 2005
Mutation of the PIK3CA gene in anaplastic thyroid cancer. Cancer Res
65:10199-10207
120. Roger P, Taton M, Van Sande J, Dumont JE 1988 Mitogenic effects of
thyrotropin and adenosine 3',5'-monophosphate in differentiated normal
human thyroid cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab 66:1158-1165
121. van Staveren WC, Weiss Solis D, Delys L, Venet D, Cappello M, Andry
G, Dumont JE, Libert F, Detours V, Maenhaut C 2006 Gene expression in
human thyrocytes and autonomous adenomas reveals suppression of
negative feedbacks in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 103:413418
122. van Staveren WC, Solis DW, Delys L, Duprez L, Andry G, Franc B,
Thomas G, Libert F, Dumont JE, Detours V, Maenhaut C 2007 Human
thyroid tumor cell lines derived from different tumor types present a
common dedifferentiated phenotype. Cancer Res 67:8113-8120
123. Lewis BP, Burge CB, Bartel DP 2005 Conserved seed pairing, often
flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are
microRNA targets. Cell 120:15-20
124. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X,
Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun
94
Biobligraphie
G, Tuschl T 2003 A uniform system for microRNA annotation. RNA
9:277-279
125. Nilsen TW 2007 Mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in
animal cells. Trends Genet 23:243-249
126. Aslam MI, Taylor K, Pringle JH, Jameson JS 2009 MicroRNAs are novel
biomarkers of colorectal cancer. Br J Surg 96:702-710
127. Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Radmark
O, Kim S, Kim VN 2003 The nuclear RNase III Drosha initiates
microRNA processing. Nature 425:415-419
128. Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD 2003
Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115:199208
129. He H, Jazdzewski K, Li W, Liyanarachchi S, Nagy R, Volinia S, Calin
GA, Liu CG, Franssila K, Suster S, Kloos RT, Croce CM, de la CA 2005
The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma. Proc Natl
Acad Sci U S A 102:19075-19080
130. Weber F, Teresi RE, Broelsch CE, Frilling A, Eng C 2006 A limited set of
human MicroRNA is deregulated in follicular thyroid carcinoma. J Clin
Endocrinol Metab 91:3584-3591
131. Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, Aravin A, Pfeffer S,
Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C, Socci ND, Hermida L,
Fulci V, Chiaretti S, Foa R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel A, Muller RU,
Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M, Weir DB, Choksi R,
De Vita G, Frezzetti D, Trompeter HI, Hornung V, Teng G, Hartmann G,
Palkovits M, Di Lauro R, Wernet P, Macino G, Rogler CE, Nagle JW, Ju
J, Papavasiliou FN, Benzing T, Lichter P, Tam W, Brownstein MJ, Bosio
A, Borkhardt A, Russo JJ, Sander C, Zavolan M, Tuschl T 2007 A
mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library
sequencing. Cell 129:1401-1414
132. Liang Y, Ridzon D, Wong L, Chen C 2007 Characterization of microRNA
expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics 8:166
133. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, SweetCordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T,
Horvitz HR, Golub TR 2005 MicroRNA expression profiles classify
human cancers. Nature 435:834-838
134. Chen YT, Kitabayashi N, Zhou XK, Fahey TJ, III, Scognamiglio T 2008
MicroRNA analysis as a potential diagnostic tool for papillary thyroid
carcinoma. Mod Pathol 21:1139-1146
95
Biobligraphie
135. Nikiforova MN, Tseng GC, Steward D, Diorio D, Nikiforov YE 2008
MicroRNA expression profiling of thyroid tumors: biological significance
and diagnostic utility. J Clin Endocrinol Metab 93:1600-1608
136. Volinia S, Calin GA, Liu CG, Ambs S, Cimmino A, Petrocca F, Visone R,
Iorio M, Roldo C, Ferracin M, Prueitt RL, Yanaihara N, Lanza G, Scarpa
A, Vecchione A, Negrini M, Harris CC, Croce CM 2006 A microRNA
expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.
Proc Natl Acad Sci U S A 103:2257-2261
137. Pallante P, Visone R, Ferracin M, Ferraro A, Berlingieri MT, Troncone G,
Chiappetta G, Liu CG, Santoro M, Negrini M, Croce CM, Fusco A 2006
MicroRNA deregulation in human thyroid papillary carcinomas. Endocr
Relat Cancer 13:497-508
138. Irizarry RA, Wu Z, Jaffee HA 2006 Comparison of Affymetrix GeneChip
expression measures. Bioinformatics 22:789-794
139. Tusher VG, Tibshirani R, Chu G 2001 Significance analysis of
microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci
U S A 98:5116-5121
140. Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA 2003 Killing the messenger: short
RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 4:457-467
141. Hannon GJ 2002 RNA interference. Nature 418:244-251
142. Mathers CD, Loncar D 2006 Projections of global mortality and burden of
disease from 2002 to 2030. PLoS Med 3:e442
143. Franc B, de la SP, Lange F, Hoang C, Louvel A, de Roquancourt A, Vilde
F, Hejblum G, Chevret S, Chastang C 2003 Interobserver and
intraobserver reproducibility in the histopathology of follicular thyroid
carcinoma. Hum Pathol 34:1092-1100
144. Lloyd RV, Erickson LA, Casey MB, Lam KY, Lohse CM, Asa SL, Chan
JK, DeLellis RA, Harach HR, Kakudo K, LiVolsi VA, Rosai J, Sebo TJ,
Sobrinho-Simoes M, Wenig BM, Lae ME 2004 Observer variation in the
diagnosis of follicular variant of papillary thyroid carcinoma. Am J Surg
Pathol 28:1336-1340
145. Giordano TJ 2008 Genome-wide studies in thyroid neoplasia. Endocrinol
Metab Clin North Am 37:311-viii
146. van Staveren WC, Weiss Solis D, Delys L, Venet D, Cappello M, Andry
G, Dumont JE, Libert F, Detours V, Maenhaut C 2006 Gene expression in
human thyrocytes and autonomous adenomas reveals suppression of
96
Biobligraphie
negative feedbacks in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 103:413418
147. Pavelic K, Dedivitis RA, Kapitanovic S, Cacev T, Guirado CR, Danic D,
Radosevic S, Brkic K, Pegan B, Krizanac S, Kusic Z, Spaventi S, Bura M
2006 Molecular genetic alterations of FHIT and p53 genes in benign and
malignant thyroid gland lesions. Mutat Res 599:45-57
148. Sapi Z, Lukacs G, Sztan M, Papp J, Olah E 1995 Contribution of p53 gene
alterations to development of metastatic forms of follicular thyroid
carcinoma. Diagn Mol Pathol 4:256-260
149. Zou M, Shi Y, Farid NR 1993 p53 mutations in all stages of thyroid
carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 77:1054-1058
150. Zou M, Shi Y, Farid NR 1993 p53 mutations in all stages of thyroid
carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 77:1054-1058
151. Zou M, Shi Y, Farid NR 1993 p53 mutations in all stages of thyroid
carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 77:1054-1058
152. Zou M, Shi Y, Farid NR 1993 p53 mutations in all stages of thyroid
carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 77:1054-1058
153. Attisano L, Wrana JL, Montalvo E, Massague J 1996 Activation of
signalling by the activin receptor complex. Mol Cell Biol 16:1066-1073
154. Cohen O, Inbal B, Kissil JL, Raveh T, Berissi H, Spivak-Kroizaman T,
Feinstein E, Kimchi A 1999 DAP-kinase participates in TNF-alpha- and
Fas-induced apoptosis and its function requires the death domain. J Cell
Biol 146:141-148
155. Heul-Nieuwenhuijsen L, Dits N, Van Ijcken W, de Lange D, Jenster G
2009 The FOXF2 pathway in the human prostate stroma. Prostate
69:1538-1547
156. Kanehira M, Harada Y, Takata R, Shuin T, Miki T, Fujioka T, Nakamura
Y, Katagiri T 2007 Involvement of upregulation of DEPDC1 (DEP
domain containing 1) in bladder carcinogenesis. Oncogene 26:6448-6455
157. Pallante P, Visone R, Ferracin M, Ferraro A, Berlingieri MT, Troncone G,
Chiappetta G, Liu CG, Santoro M, Negrini M, Croce CM, Fusco A 2006
MicroRNA deregulation in human thyroid papillary carcinomas. Endocr
Relat Cancer 13:497-508
158. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
97
Biobligraphie
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
159. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
160. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
161. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
162. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
163. van Staveren WC, Solis DY, Hebrant A, Detours V, Dumont JE,
Maenhaut C 2009 Human cancer cell lines: Experimental models for
cancer cells in situ? For cancer stem cells? Biochim Biophys Acta
1795:92-103
164. van Staveren WC, Solis DW, Delys L, Duprez L, Andry G, Franc B,
Thomas G, Libert F, Dumont JE, Detours V, Maenhaut C 2007 Human
thyroid tumor cell lines derived from different tumor types present a
common dedifferentiated phenotype. Cancer Res 67:8113-8120
165. Borrello MG, Alberti L, Fischer A, Degl'innocenti D, Ferrario C,
Gariboldi M, Marchesi F, Allavena P, Greco A, Collini P, Pilotti S,
Cassinelli G, Bressan P, Fugazzola L, Mantovani A, Pierotti MA 2005
Induction of a proinflammatory program in normal human thyrocytes by
the RET/PTC1 oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A 102:14825-14830
166. Balkwill F, Mantovani A 2001 Inflammation and cancer: back to
Virchow? Lancet 357:539-545
98
Biobligraphie
167. Bedogni B, Powell MB 2009 Hypoxia, melanocytes and melanoma survival and tumor development in the permissive microenvironment of
the skin. Pigment Cell Melanoma Res 22:166-174
168. Hammond EM, Kaufmann MR, Giaccia AJ 2007 Oxygen sensing and the
DNA-damage response. Curr Opin Cell Biol 19:680-684
169. Sapi Z, Lukacs G, Sztan M, Papp J, Olah E 1995 Contribution of p53 gene
alterations to development of metastatic forms of follicular thyroid
carcinoma. Diagn Mol Pathol 4:256-260
170. Zou M, Shi Y, Farid NR 1993 p53 mutations in all stages of thyroid
carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 77:1054-1058
171. Malaguarnera R, Vella V, Vigneri R, Frasca F 2007 p53 family proteins in
thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 14:43-60
172. Toledo F, Bardot B 2009 Cancer: Three birds with one stone. Nature
460:466-467
173. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
174. Martelli ML, Miano MG, Battaglia C, Trapasso F, Stella A, Iuliano R,
Visconti R, Fagin JA, Santoro M, Fusco A 2000 The highly malignant
phenotype of anaplastic thyroid carcinoma cell lines is recessive. Eur J
Endocrinol 143:515-521
175. Giannini R, Ugolini C, Lupi C, Proietti A, Elisei R, Salvatore G, Berti P,
Materazzi G, Miccoli P, Santoro M, Basolo F 2007 The heterogeneous
distribution of BRAF mutation supports the independent clonal origin of
distinct tumor foci in multifocal papillary thyroid carcinoma. J Clin
Endocrinol Metab 92:3511-3516
176. Park SY, Park YJ, Lee YJ, Lee HS, Choi SH, Choe G, Jang HC, Park SH,
Park dJ, Cho BY 2006 Analysis of differential BRAF(V600E) mutational
status in multifocal papillary thyroid carcinoma: evidence of independent
clonal origin in distinct tumor foci. Cancer 107:1831-1838
177. Aldred MA, Huang Y, Liyanarachchi S, Pellegata NS, Gimm O, Jhiang S,
Davuluri RV, de la CA, Eng C 2004 Papillary and follicular thyroid
carcinomas show distinctly different microarray expression profiles and
can be distinguished by a minimum of five genes. J Clin Oncol 22:35313539
99
Biobligraphie
178. Barden CB, Shister KW, Zhu B, Guiter G, Greenblatt DY, Zeiger MA,
Fahey TJ, III 2003 Classification of follicular thyroid tumors by molecular
signature: results of gene profiling. Clin Cancer Res 9:1792-1800
179. Chevillard S, Ugolin N, Vielh P, Ory K, Levalois C, Elliott D, Clayman
GL, el Naggar AK 2004 Gene expression profiling of differentiated
thyroid neoplasms: diagnostic and clinical implications. Clin Cancer Res
10:6586-6597
180. Finley DJ, Arora N, Zhu B, Gallagher L, Fahey TJ, III 2004 Molecular
profiling distinguishes papillary carcinoma from benign thyroid nodules. J
Clin Endocrinol Metab 89:3214-3223
181. Huang Y, Prasad M, Lemon WJ, Hampel H, Wright FA, Kornacker K,
LiVolsi V, Frankel W, Kloos RT, Eng C, Pellegata NS, de la CA 2001
Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals highly consistent
profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 98:15044-15049
182. Jarzab B, Gubala E, Lange D 2005 [DNA microarrays and papillary
thyroid carcinoma gene expression profile]. Endokrynol Pol 56:293-301
183. Mazzanti C, Zeiger MA, Costouros NG, Umbricht C, Westra WH, Smith
D, Somervell H, Bevilacqua G, Alexander HR, Libutti SK 2004 Using
gene expression profiling to differentiate benign versus malignant thyroid
tumors. Cancer Res 64:2898-2903
184. Montero-Conde C, Martin-Campos JM, Lerma E, Gimenez G, MartinezGuitarte JL, Combalia N, Montaner D, Matias-Guiu X, Dopazo J, de Leiva
A, Robledo M, Mauricio D 2008 Molecular profiling related to poor
prognosis in thyroid carcinoma. Combining gene expression data and
biological information. Oncogene 27:1554-1561
185. Prasad NB, Somervell H, Tufano RP, Dackiw AP, Marohn MR, Califano
JA, Wang Y, Westra WH, Clark DP, Umbricht CB, Libutti SK, Zeiger
MA 2008 Identification of genes differentially expressed in benign versus
malignant thyroid tumors. Clin Cancer Res 14:3327-3337
186. Wreesmann VB, Sieczka EM, Socci ND, Hezel M, Belbin TJ, Childs G,
Patel SG, Patel KN, Tallini G, Prystowsky M, Shaha AR, Kraus D, Shah
JP, Rao PH, Ghossein R, Singh B 2004 Genome-wide profiling of
papillary thyroid cancer identifies MUC1 as an independent prognostic
marker. Cancer Res 64:3780-3789
187. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, SweetCordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T,
Horvitz HR, Golub TR 2005 MicroRNA expression profiles classify
human cancers. Nature 435:834-838
100
Biobligraphie
188. Aslam MI, Taylor K, Pringle JH, Jameson JS 2009 MicroRNAs are novel
biomarkers of colorectal cancer. Br J Surg 96:702-710
189. He H, Jazdzewski K, Li W, Liyanarachchi S, Nagy R, Volinia S, Calin
GA, Liu CG, Franssila K, Suster S, Kloos RT, Croce CM, de la CA 2005
The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma. Proc Natl
Acad Sci U S A 102:19075-19080
190. Paranjape T, Slack FJ, Weidhaas JB 2009 MicroRNAs: tools for cancer
diagnostics. Gut 58:1546-1554
191. Visone R, Pallante P, Vecchione A, Cirombella R, Ferracin M, Ferraro A,
Volinia S, Coluzzi S, Leone V, Borbone E, Liu CG, Petrocca F, Troncone
G, Calin GA, Scarpa A, Colato C, Tallini G, Santoro M, Croce CM, Fusco
A 2007 Specific microRNAs are downregulated in human thyroid
anaplastic carcinomas. Oncogene 26:7590-7595
192. Are C, Shaha AR 2006 Anaplastic thyroid carcinoma: biology,
pathogenesis, prognostic factors, and treatment approaches. Ann Surg
Oncol 13:453-464
193. Weber F, Teresi RE, Broelsch CE, Frilling A, Eng C 2006 A limited set of
human MicroRNA is deregulated in follicular thyroid carcinoma. J Clin
Endocrinol Metab 91:3584-3591
194. Prasad NB, Somervell H, Tufano RP, Dackiw AP, Marohn MR, Califano
JA, Wang Y, Westra WH, Clark DP, Umbricht CB, Libutti SK, Zeiger
MA 2008 Identification of genes differentially expressed in benign versus
malignant thyroid tumors. Clin Cancer Res 14:3327-3337
195. Eszlinger M, Krohn K, Hauptmann S, Dralle H, Giordano TJ, Paschke R
2008 Perspectives for improved and more accurate classification of
thyroid epithelial tumors. J Clin Endocrinol Metab 93:3286-3294
196. Tian Q, Stepaniants SB, Mao M, Weng L, Feetham MC, Doyle MJ, Yi
EC, Dai H, Thorsson V, Eng J, Goodlett D, Berger JP, Gunter B, Linseley
PS, Stoughton RB, Aebersold R, Collins SJ, Hanlon WA, Hood LE 2004
Integrated genomic and proteomic analyses of gene expression in
Mammalian cells. Mol Cell Proteomics 3:960-969
197. Tian Q, Stepaniants SB, Mao M, Weng L, Feetham MC, Doyle MJ, Yi
EC, Dai H, Thorsson V, Eng J, Goodlett D, Berger JP, Gunter B, Linseley
PS, Stoughton RB, Aebersold R, Collins SJ, Hanlon WA, Hood LE 2004
Integrated genomic and proteomic analyses of gene expression in
Mammalian cells. Mol Cell Proteomics 3:960-969
101