thèse

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RÉSUMÉ
La thèse s’inscrit dans un projet de recherche global visant à caractériser les tumeurs thyroïdiennes sur
le plan moléculaire, afin de mieux comprendre leur physiopathologie et afin d’identifier des
biomarqueurs (signatures moléculaires) qui pourront être utilisés pour le diagnostic, le pronostic et
leur traitement. Parmi celles-ci, nous distinguons les adénomes autonomes (AA) et folliculaires (FTA)
tumeurs bénignes encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes
subdivisés en carcinomes différenciés, folliculaires (FTC) ou papillaires (PTC), et peuvent évoluer en
carcinomes anaplasiques (ATC), totalement dédifférenciés. Un autre type de tumeurs bénignes
différenciées, très rares, existe: l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH). Ces tumeurs
sont causées pour la plupart par des mutations qui activent de manière constitutive des cascades de
signalisation, essentiellement la cascade de l’AMPc et la cascade des MAPK. Le but de notre thèse
était de valider un système expérimental in vitro des PTC, d’étudier les profils d’expression génique
des FNAH et de les comparer avec ceux des AA, et de définir les profils ARNm et miRNA des ATC
pour les comparer à ceux des PTC pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Pour
réaliser ces objectifs, nous avons utilisé la technologie des microarrays qui permet d’analyser
simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes conditions. Nous avons donc utilisé
une approche multidisciplinaire alliant une partie expérimentale et une partie bioinformatique.
La première partie du travail a consisté à réaliser un modèle d’étude in vitro pour caractériser les PTC
au niveau moléculaire. A cet effet, des cultures primaires de thyrocytes ont été traitées avec de l’EGF
et du sérum pendant différents temps (1,5h, 3h, 16h, 24h et 48h) ce qui stimule la cascade des MAPK,
activée constitutivement dans les PTC. Nous avons hybridé sur des lames microarrays maison les
différents échantillons et nous avons montré que les cultures primaires stimulées pendant des temps
longs (24h et 48h) ont des profils d’expression génique qui ressemblent à ceux des PTC et constituent
donc un bon modèle d’étude de cette tumeur.
La seconde partie a pour objectif de définir les phénotypes moléculaires et fonctionnels des FNAH et
de les comparer aux AA. Ces deux pathologies résultent d’une mutation dans le récepteur de la TSH
(TSHR) activant de manière constitutive la cascade de l’AMPc. Dans le cas des FNAH, la mutation est
héréditaire et toute la glande est affectée contrairement aux AA où la mutation survient plus tard,
généralement à l’âge adulte, et où seule une partie de la glande est affectée. Nous avons comparé le
profil d’expression génique des FNAH avec celui des AA, par hybridation sur des lames microarrays
HEEBO. L’intégration de ces différentes données montre que les AA et les FNAH sont deux sous-
types différents de la même maladie: l’hyperthyroïdie génétique. Les caractéristiques de chacun de ces
sous-types dépendent de l’intensité de la mutation, du nombre de cellules initialement affectées et du
stade de développement au moment duquel la mutation survient.
Dans la dernière partie de ce travail, nous avons caractérisé les ATC au niveau du profil d’expression
des ARNm et des miRNA par hybridation respectivement sur lames Affymetrix ou sur lames miRNA
maison et au niveau de leur état mutationnel du gène p53. Le profil d’expression génique des ATC a
été comparé avec celui des PTC afin de mettre en évidence des gènes différentiellement exprimés
entre les 2 types de cancers, que nous avons ensuite tenté d’invalider par siRNA, dans un modèle in
vitro de lignée cellulaire thyroïdienne dérivée d’un ATC (8505C). Les résultats obtenus jusqu’ici ne
sont malheureusement pas prometteurs. Le profil d’expression des miRNA nous a permis d’identifier
une signature de 34 miRNA caractéristique des ATC.

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AVANT-PROPOS
Premièrement, je tiens à remercier tous ceux qui m’ont apporté aide et conseils
durant ma thèse et particulièrement le Pr. Vassart, pour m’avoir accueillie au sein
de son laboratoire, le Pr. Dumont pour ses conseils, les discussions enrichissantes et
son optimisme à toute épreuve et aussi ma promotrice de recherche, Dr. Carine
Maenhaut, pour son attention, sa disponibilité et ses bons conseils scientifiques.
J’aimerais également adresser des remerciements particuliers à Chantal Degraef qui
m’a appris, avec patience, la rigueur des techniques de laboratoire, Dr. Anne Lefort
et Dr. Frédérick Libert pour leur expertise et pour nous avoir fourni une partie des
lames microarrays.
Je remercie également tous les membres du laboratoire, pour leurs conseils
scientifiques avisés et leurs attentions, qui ont fait de mon séjour à l’IRIBHM une
expérience unique et inoubliable, soit Wilma, Sébastien, Sandra, Geneviève,
Soetkin, Julie, Sheela, Sara, Vanessa et les bioinformaticiens, David et Vincent. Je
remercie aussi Danièle, Joëlle, Yves, Claude et Christian de m’avoir apporté leur
soutien logistique et informatique. Je tiens aussi à remercier toute ma famille.
Ce travail de recherche a pu être mené à bien grâce au soutien et au financement du
FNRS (Télévie), de la bourse Van Buuren et de la Fondation de la Vocation qui m’a
permis d’effectuer un stage dans le laboratoire du Pr. Patrick Brown, Université de
Stanford.

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LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS
AA : autonomous adenoma
AMPc : cyclic adenosine monophosphate
ARNdb: double-stranded RNA
ATC : anaplastic thyroid carcinoma
DAG : diacylglycerol
DIT: diiodotyrosine
EGF : epidermal growth factor
EMT : epithelial-mesenchymal transition
EPAC: exchange protein directly activated by cAMP
ERK: extracellular signal-regulated kinase
FBS: fetal bovine serum
FGF: fibroblast growth factor
FTA: follicular thyroid adenoma
FNAB: fine needle aspiration biopsy
FNAH: familial nonautoimmune hyperthyroidism
FTC: follicular thyroid carcinoma
GDP : guanosine diphosphate
GTP : guanosine triphosphate
HGF: hepatocyte growth factor
IGF-1: insulin-like growth factor
IP3: inositol-1,4,5-triphosphate
IP: inositol phosphate
Lowess: locally weighted scatter plot smoothing
MAPK: mitogen-Activated Protein kinase
MDS: multidimensional scaling
miRISC: miRNA-containing RNA-induced silencing complex
miRNA : microRNA
MIT : monoiodotyrosine
NIS : Na+/I- symporter

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PCR : polymerase chain reaction
PDC: poorly differentiated carcinoma
PDGF: platelet derived growth factor
PDK1: phosphatidylinositol-dependent kinase 1
PI3K: phosphoinositide 3-kinase
PIP2 : phosphatidylinositol-4,5-biphosphate
PKA : cAMP dependent protein kinase
PKC : protein kinase C
PLC : phospholipase C
PTC: papillary thyroid carcinoma
PTEN: phosphatase with tensin homology
qRT-PCR: quantitative RT-PCR
RISC: RNA-induced silencing complex
RT-PCR: reverse transcription PCR
SAM: significant analysis of microarrays
SCNAH: sporadic congenital nonautoimmune hyperthyroidism
siRNA : small interfering RNA
T3: triiodotyronine
T4: thyroxine
Tg: thyroglobulin
TPO: thyroid peroxydase
TRH: thyrotropin releasing hormone
TSH: thyroid stimulating hormone or thyrotropin
TSHR: TSH receptor

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TABLE DES MATIERES
CHAPITRE I : INTRODUCTION 8
1. Le cancer 8
1.1 Introduction 8
1.2 Génétique et cancer 8
1.3 Morphologie des cellules cancéreuses 9
1.4 Caractéristiques des cellules cancéreuses 9
1.5 L’angiogénèse 10
1.6 La lymphangiogénèse 11
2. La thyroïde 11
2.1 La thyroïde normale 11
2.1.1 Introduction 11
2.1.2 Synthèse des hormones thyroïdiennes 12
2.1.3 Régulation des cellules thyroïdiennes 14
2.1.4 Cascades de signalisation principales impliquées dans la prolifération
thyroïdienne normale. 14
2.2 Tumeurs thyroïdiennes 18
2.2.1 Introduction 18
2.2.2 Tumeurs bénignes 19
2.2.3 Tumeurs malignes 22
2.3 Modèles expérimentaux in vitro des tumeurs thyroïdiennes 26
2.3.1 Cultures primaires de cellules thyroïdiennes humaines 26
2.3.2 Lignées cellulaires 27
3. Régulation post-transcriptionnelle des protéines : les miRNA 27
3.1 Introduction 27
3.2 Biosynthèse des miRNA 28
3.3 miRNA et Cancers 29
4. Analyse de l’expression génique par microarrays. 29
4.1 Principe général 29
4.2 Microarrays double canaux 30
4.3 Microarrays simple canal: les lames Affymetrix 31
5. Analyse des données microarrays 31
5.1 Correction du bruit de fond 31
5.2 La normalisation 32
5.2.1 La normalisation par rapport à la moyenne globale des intensités 32
5.2.2 La normalisation par rapport à des gènes de contrôle externes 32
5.2.3 La normalisation «Lowess » 33
5.3 La mesure de l’expression différentielle : SAM 33
5.4 Visualisation des données 34
5.4.1 Le clustering hiérarchique 34