Ronéo

TP2 de bactériologie
Vendredi 24 Octobre 2008
14h-17h
Ronéotypeur : Nam-Son VUONG
La flore normale oro-naso-pharyngée (rappel)
Classification des streptocoques
Diagnostic bactériologique d’une pneumonie à
pneumocoque
Diagnostique bactériologique d’une angine
streptococcique
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Plan du cours :
I)
La flore normale oro-naso-pharyngée (rappel)
A- Bouche
B- Naso-pharynx
II)
Classification des streptocoques
A- En fonction du pouvoir pathogène naturel
B- Par espèce (groupes)
III)
Diagnostic bactériologique d’une pneumonie à pneumocoque
A- Définition
B- Cas clinique
C- Généralités sur les pneumonies à pneumocoque
D- Les examens bactériologiques utiles au diagnostic
E- Le streptococcus pneumoniae ou pneumocoque
IV)
Cas clinique : diagnostic bactériologique d’une angine
streptococcique (physiopathologie, diagnostic)
A- Cas clinique : généralités sur l’angine streptoccique
B- Diagnostic bactériologique d’une angine à streptocoque A
C- Choix de l’antibiotique
D- Facteurs de pathogénicité du streptocoque A
E- Diagnostic indirect (non traité en TP)
Comme cela a été précisé dans la ronéo sur le TP1, les enseignements ne sont pas tout a fait
identiques selon les salles et les jours des TP. Ainsi il est probable que certains points soient
plus ou moins détaillés par rapport au TP auquel tu as assisté. Les notions importantes pour
les interros de début de cours et pour l’examen de janvier se trouvent dans le poly.
Je me suis aussi permis de modifier un petit peu le plan de base histoire d’éclaircir le tout, en
espérant que tout ça sera compréhensible.
Ba voila… bon courage !
2
I) La flore commensale oro-naso-pharyngée (p.19 et 20)
A- Bouche
La cavité buccale abrite un écosystème bactérien complexe. On y trouve en
effet une flore abondante et concentrée avec environ 109 bactéries/ml. Cette
flore a pour rôle principal de protéger les muqueuses.
Pour illustrer cette abondance, on peut noter qu’1ml de salive contient près de
750 millions de bactéries dont 100 millions cultivables.
→ Muqueuse buccale : - Streptocoques,
- Micrococcus,
- Anaérobies (Fusobacterium et Bacteroïdes).
Au niveau des dents, on trouve de nombreuses bactéries qui, pour se protéger
contre certaines enzymes et certains antibiotiques, produisent un biofilm(1). Ce
biofilm adhérant à l’émail constitue ce que l’on nomme la plaque dentaire qui
est donc essentiellement constituée de bactéries et de substrats produits par ces
dernières.
(1)
On peut également trouver des biofilms sur les matériels étrangers comme les cathéters.
→ Plaque dentaire :
- Streptocoques,
- Anaérobies (Actinomyces, Bactéroïdes, Veillonella).
→ Sillon gingival :
- 80% d’anaérobies stricts (Bacteroïdes,
Fusobacterium, Peptostreptococcus, Veillonella).
B- Naso-pharynx
→ Naso-pharynx :
- Streptocoques (dont pneumocoques),
- Haemophilus,
- Neisseria sp,
- Branhamella sp,
- Anaérobies.
La flore commensale oro-naso-pharyngée est surtout composée de
streptocoques non pathogènes et d’autres bactéries de type anaérobie.
Chez des individus pourtant sains, on peut aussi trouver une flore transitoire
constituée de germes de portage avec notamment des Pneumocoques, des
Haemophilus mais aussi des Neisseria meningitidis, des Staphilococcus Aureus
et des Streptocoques de type A.
3
Toutes ces bactéries peuvent donc être observées en faible quantité sur des
échantillons obtenus à partir de prélèvements effectués sur des individus sains ;
ceci doit être pris en compte lors de l’interprétation d’un examen
bactériologique.
II) Classification des streptocoques (p.24 et 25)
Les streptocoques sont des cocci à Gram positif en chaînette ; ils ont donc
une membrane cytoplasmique avec un peptidoglycane ainsi qu’un polyoside C.
A la différence des enterococcus, les streptocoques ne poussent que sur des
géloses au sang.
A- Classification en fonction des capacités d’hémolyse
Cette 1ère classification est basée sur le pouvoir pathogène naturel des
streptocoques (sur le caractère hémolytique de chaque bactérie) que l’on va
pouvoir déduire de l’aspect des cultures sur géloses au sang.
On peut ainsi distinguer trois « familles » de streptocoques : les hémolytiques, les -hémolytiques et les non-hémolytiques.
1) Les streptocoques -hémolytiques
En plus de la formation de colonies, on observe une hémolyse franche à bords
nets (= éclaircissement de la gélose) autour de ces dernières qui illustre l’activité
hémolytique des bactéries.
Remarque : Certains staphylocoques ont aussi cette capacité d’hémolyse ; ainsi pour
distinguer un streptocoque -hémolytiques d’un staphylocoque, on peut (en plus de la
coloration Gram) réalisé un test simple qui consiste à mettre les bactéries à identifier dans
l’eau oxygénée (H2O2). L’observation de bulle sera révélatrice d’une production de gaz
provoquée par la présence de catalases dans le tube. Or les streptocoques ne produisent pas de
catalase.
2) Les streptocoques -hémolytiques
Dans les cultures de ce type de bactéries, l’hémolyse sera partielle et verdâtre
(observables dans les cultures à pneumocoques qui sont des streptocoques hémolytiques).
3) Les streptocoques non-hémolytiques
La culture de ce type de streptocoques ne sera pas accompagnée d’une
hémolyse.
B- Classification en fonction des espèces
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1) Pour les streptocoques -hémolytiques dits « groupables »
La caractérisation du polyoside C permet de grouper les streptocoques hémolytiques (selon le sérogroupage de Lancefield, groupes de A à V). En
effet ce polyoside va pouvoir réagir avec des anticorps spécifiques lors d’un test
d’agglutination.
Parmi les -hémolytiques, on a distingue donc :
- les streptocoques A ; dont il n’existe qu’une seule espèce, les streptocoques
pyogenes qui sont responsables de nombreuses pathologies comme l’angine, la
cellulite ou encore l’endocardite.
- les streptocoques B ; dont il n’existe là aussi qu’une espèce à savoir celle des
streptocoques agalactae qui font normalement partie de la flore vaginale mais
qui peuvent être responsables de méningite chez le nouveau né (infection lors de
l’accouchement).
2) Pour les streptocoques - et non-hémolytiques
Dans le cas de ces streptocoques, la plupart sont « non groupables » et leur
identification se fait donc grâce aux caractères biochimiques des bactéries.
Il existe plusieurs espèces :
- les streptocoques D (identifiables par un test d’agglutination) ; dont le
streptococcus bovis qui est responsable d’infections profondes, de septicémies
et d’endocardites.
(à noter que les enterocoques sont groupables dans le groupe D)
- les streptocoques non groupables ;
- le streptococcus pneumoniae.
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III) Diagnostic bactériologique d’une pneumonie à pneumocoque
(p.27, 28 et 45)
A- Définition
Pneumonie communautaire : infection pulmonaire acquise en dehors du
système hospitalier ou développée dans un délai
de moins de 48h suivant l’administration à
l’hôpital.(2)
Ce type de pneumonie est à distinguer des pneumonies nosocomiales (=
infection pulmonaire diagnostiquée dans un délai supérieur à 48h après une
hospitalisation). En effet, les bactéries responsables sont sensiblement
différentes (en termes de pourcentage).
B- Cas clinique
• Mr A, 32 ans et sans antécédents notables, est admis au S.A.U. (Service
d’Accueil des Urgences) de l’hôpital Bichat pour une dyspnée fébrile.
• Anamnèse : installation sur 24h d’une fièvre accompagnée de frissons, d’une
toux grasse, d’une dyspnée et d’une douleur basi thoracique droite.
• Examen : fièvre à 40°C, polypnée (FR = 30/min), hypoxémie (PaO2 =
65mmHg en air ambiant)…
• Biologie caractéristique d’un syndrome infectieux.
Quel examen prescrivez-vous en priorité ?
→ Radiographie thoracique.
La radio met en évidence une opacité alvéolaire au niveau du lobe inférieur
droit, sans épanchement.
A quel diagnostic ce tableau clinique vous fait penser ?
→ Pneumonie franche lobaire aigue (lobe inférieur droit).
Quelles bactéries peuvent-être responsables de ce type d’infection ?
→ Les pneumonies franches lobaires aigues peuvent être provoquées
par plusieurs bactéries telles que les pneumocoques (35 à 85% des cas), les
staphylocoques dorés (< 5%), les legionellaceae (pneumonie à légionelle), les
entérobactéries ou encore les haemophilus.
On peut noter que les pneumocoques sont en cause dans environ 3/5 des cas.
Toutefois, il faut savoir que dans 1/3 des cas, on ne trouve aucune bactérie
lors de l’examen bactériologique et qu’on n’a donc pas d’informations sur le
germe responsable de l’infection.
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C- Généralités sur les pneumonies à pneumocoque
- Le pneumocoque est le pathogène le plus fréquemment retrouvé dans les
pneumonies.
- Les formes graves ne sont pas rares, même chez les sujets jeunes et sans
antécédents.
- Les facteurs de risque(2) : alcoolisme, BPCO, tabagisme, immunodépression
(VIH ++) et surtout les splénectomisés.
(2)
importants car : vaccination possible des sujets à risques + antiobioprophylaxie à vie.
- Signes associés : pleurésie, septicémie et méningite.
- Résistances aux antibiotiques(3) pourcentage de souches résistantes :
à la pénicilline G (18 à 22%, pourcentages en augmentation),
aux macrolides (25 à 32%),
aux céfotaxines (< 1%).
Normalement les souches de pneumocoques sont très sensibles aux -lactamines, à
l’amoxicilline et aux céphalosporines.
(3)
Remarque : il est important de distinguer les pneumonies à pneumocoques et les
pneumonies à légionelles qui s’observent généralement dans un contexte
épidémique, avec des formes d’atteintes plutôt bilatérales et très graves.
D- Les examens bactériologiques utiles au diagnostic (p.45)
Il existe de multiples examens permettant d’isoler la bactérie responsable de
la pneumonie. Ces examens sont presque tous basés sur l’étude de prélèvements
qui doivent donc être réalisés avec précaution.
Dans tous les cas, il est important de prendre en compte une éventuelle
antibiothérapie préalable dans l’interprétation de la culture.
1) Examen CytoBactériologique des expectorations/du Crachat
• Critères :
- de qualité ; l’ECBC n’est interprétable que si l’échantillon contient moins
de 10 cellules épithéliales/champs. Si on en dénombre plus, il faut suspecter une
contamination de l’échantillon par la flore buccale ou salivaire.
- d’infection ; si le nombre de Polynucléaires Neutrophiles est supérieur à
25/champs.
• Etapes :
- examens macro et microscopique (remarque : la coloration GRAM est difficile
mais permet de mettre en évidence l’espèce bactérienne majoritaire),
- mise en culture ; seuil de significativité(4) = pathogènes > 107 ufc/mL(5).
(4)
les échantillons étant souvent contaminés par la flore oro-pharyngée, tout examen est
caractérisé par un seuil basé sur le nombre de pathogènes et en dessous duquel il ne sera pas
interprétable.
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(5)
ufc = unité formant colonie = unité illustrant le nombre de bactéries dans l’échantillon.
2) Aspiration trachéale ou bronchique
L’aspiration trachéale ou bronchique s’effectue par voie trans-glottique et
nécessite parfois l’aide du kinésithérapeute respiratoire.
Mêmes étapes avec un seuil de significativité = pathogènes > 105 ufc/mL.
3) Prélèvements profonds (peu importants selon le prof)
3.1) Lavage Broncho-Alvéolaire (LBA)
Le prélèvement s’effectue sous fibroscopie bronchique.
Les étapes :
- examen macroscopique,
- cytologie (numération et formule)
- culture (seuil > 104 ufc/mL)
La formule est essentielle car l’interprétation est principalement basée sur le
pourcentage de cellules infectées (= leucocytes ayant phagocytés des bactéries)
→ seuil > 5%.
3.2) Prélèvement Distal Protégé (PDP) et brosse bronchique
Il s’effectue en général chez un patient intubé.
Les étapes sont toujours les mêmes ; ici le seuil d’interprétation de culture est :
pathogènes > 103 ufc/mL.
4) Prélèvement par ponction pleurale
La ponction pleurale se réalise en piquant derrière, en pleine matité, avec un
axe horizontale (perpendiculairement à la peau) et juste au niveau du bord
supérieur de la côte inférieure.
C’est un acte invasif très douloureux, il faut donc procéder en traversant plan par
plan, sous anesthésie locale.
Une fois le liquide pleural obtenu, on va procéder en plusieurs étapes :
- aspect macroscopique,
- examen direct et culture (pas de seuil car physiologiquement pas de germes
dans le liquide pleural),
- cytologie,
- biochimie.
Ce prélèvement a un double intérêt :
- diagnostique
- thérapeutique (si la pleurésie est purulente, un drainage sera nécessaire
alors que si ce n’est pas le cas, l’épanchement se « réparera » de lui-même avec
le traitement de l’infection)
5) Hémocultures
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Il s’agit d’un examen utile en urgence ; on peut effectuer 1 à 2 paires
d’hémoculture avant de débuter l’antibiothérapie.
On va effectivement trouver des bactéries dans le sang dans 25% des cas.
6) Recherche d’une antigènurie spécifique
Même s’il n’y a pas de septicémie, on peut parfois observer un passage (dans
les urines) d’antigènes spécifiques de la bactérie responsable de la
pneumonie.
Le principe est simple et permet notamment de différencier les pneumonies à
pneumocoques des pneumonies à légionelles ; on utilise deux types de
bandelettes qui donnent directement le résultat.
Cette technique est chère mais rentable et non invasive.
E- Le streptococcus pneumoniae ou pneumocoque (p.27)
1) Caractéristiques générales
- Cocci GRAM +,
- en diplocoques ou en courtes chaînettes,
- capsulés (rôle majeur de la capsule),
- anaérobies aéro-tolérants.
Il peut appartenir à la flore commensale pharyngée par « portage ».
Le pneumocoque a une virulence majeure grâce entre autre à sa capsule
polyosidique.
- sensibilité à l’optochine.
2) Principales infections à pneumocoques
- Infections ORL (otites moyennes aigues, sinusites),
- Pneumonie (+/- pleurésies purulentes),
- Méningites,
- Autre (péritonite, syndrome néphrotique, …)
On constate que les pneumocoques peuvent être responsables d’infections
profondes très graves et parfois mortelles.
3) Milieux de culture
Il s’agit d’un germe exigeant qui ne va pousser que sur des géloses au sang et
qui va former de petites colonies -hémolytiques (= hémolyse incomplète,
verdâtre) donc c’est une bactérie non groupable.
IV) Cas clinique : diagnostic bactériologique d’une angine
streptococcique (physiopathologie, diagnostic)
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A- Cas clinique : généralités sur l’angine streptoccique
• Un enfant de 10ans se présente chez son médecin avec une douleur pharyngée,
une dysphagie, une fièvre à 39°C, des céphalées et des ganglions cervicaux et
maxillaires.
Quel est votre diagnostic ?
→ Angine (pharyngo-amygdalite) : inflammation douloureuse et fébrile
des formations lymphoïdes de l’oropharynx (dysphagie, fièvre, céphalée).
Quel est votre examen clinique ?
→ Examen de gorge : pharynx et amygdales rouges (érythémateux),
avec +/- enduit blanchâtre (érythémato-pultacé = suintant et rouge).
Il existe d’autres aspects d’angine possibles : pseudo-membraneuse et
ulcéronécrotique.
A quel pathogène pensez-vous ?
→ Virus : on va trouver une angine d’origine virale dans 2/3 des cas. Il
faut alors penser à la mononucléose infectieuse qui ne dispose pas de traitement
spécifique.
→ Streptocoque A : les angines à streptocoque A représentent 1/3 des
angines et peuvent être traitées par une antibiothérapie. Elles touchent surtout
les enfants à partir de 4 ans et les jeunes adultes et se propagent par petites
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épidémies. Bien que le portage soit strictement humain, il existe des porteurs
sains.
Si la souche est productrice de toxine érythrogène, le patient sera atteint de
scarlatine à savoir une angine avec une éruption cutanéo-muqueuse suivie de
desquamation. Le streptocoque A se multipliant dans l’amygdale et le pharynx,
les enzymes et la toxine vont pouvoir disséminer par voie hématogène.
→ Autres : la diphtérie (angine pseudo-membraneuse) ou l’angine de
Vincent (ulcéro-nécrotique) qui est due à des anaérobies (fuso-spirilles).
Remarque : un test de diagnostic rapide des angines existe et permet d’entamer une
antibiothérapie dans le cas des angines à streptocoque A ou d’éviter justement l’utilisation
d’antibiotique dans le cas des angines virales.
Quelles autres infections à streptocoques A connaissez-vous ?
→ Il y a :
- les infections cutanées superficielles telles un impétigo, une surinfection de
plaies ou un érysipèle (dermo-épidermite),
- les infections invasives comme les cellulites, les septicémies compliquant une
infection cutanée et les infections puerpérales (= concernant les femmes en
couche) qui sont des infections suppurées graves avec thrombophlébite et
septicémie.
- le syndrome de choc toxique, secondaire à des infections localisées, de
pronostic sévère et associé à des souches virulentes possédant le gène codant
pour la toxine A.
Quel est l’intérêt du diagnostic d’une angine à streptocoque A ?
→ Ce diagnostic permet :
- d’éviter les traitements inutiles (si virus : pas de traitement) afin de limiter
l’extension de la résistance aux antibiotiques,
- d’éviter les complications de l’angine à streptocoque A.
Quelles sont les complications d’une angine à streptocoque A ?
→ Il y a plusieurs complications comme l’abcès ou les complications
post-streptococciques que sont le rhumatisme articulaire aigu(6), la
glomérulonéphrite aiguë (GNA) et l’érythème noueux.
(6)
Le Rhumatisme Articulaire Aigu (RAA) : il a pratiquement disparu des pays industrialisés
(0,5/100000) mais pas de pays en voie de développement (incidence forte dans les pays du
Maghreb : 90/100000). L’affection survient après un intervalle libre d’une à 6 semaines, elle
se traduit par l’apparition d’un rhumatisme inflammatoire et dans certains cas d’une atteinte
cardiaque pouvant laisser des atteintes valvulaires. Les lésions ne contiennent pas de
bactéries. C’est une maladie immunologique : les anticorps fabriqués contre le Strepto A vont
se fixer sur des tissus dont les récepteurs (myosine, synoviale) sont proches de constituants du
strepto A (protéine M).
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B- Diagnostic bactériologique d’une angine à streptocoque A
1) à J0
Sur l’échantillon, on va observer au microscope optique (grâce à la coloration
de Gram) de nombreux polynucléaires altérés ainsi que des cocci Gram+ en
chaînette.
A ce stade on ne peut pas être certain qu’il s’agit de strepto A ; c’est pourquoi
on va réaliser une culture sur gélose au sang en conditions d’anaérobiose.
2) à J1
• Lecture des cultures : au milieu de la flore, on va rechercher de petites
colonies blanches, entourées d’une zone d’hémolyse(7) (dite ) transparente
significative de la présence d’hémolysine (streptolysine).
(7)
L’hémolyse des globules rouges est due à une hémolysine (facteur de virulence) produite
par le streptocoque A. Comme on l’a vu précédemment, c’est cette hémolyse qui permet une
1ere classification des strepto.
• Coloration de Gram sur colonies : cocci à Gram + en chaînette.
• Identification sur colonies (→ groupage du polyoside C) : on extrait le
polyoside C de la bactérie puis l’on réalise un test d’agglutination avec
l’antisérum antipolyoside C de différents sérotypes (A, B, C, D, G, F).
• Identification par galerie : s’effectue dans le cas des streptocoques non
groupables et est basée sur les caractères biochimiques de la bactérie.
• Antibiogramme : permet d’étudier la sensibilité aux -lactamines, et à
d’autres antibiotiques (pouvant être utilisés en cas d’allergie à la pénicilline.)
C- Choix de l’antibiotique
Pour traiter les angines à streptocoque A, la pénicilline est l’antibiotique
principal mais en cas d’allergie, il est possible d’en utiliser d’autres :
- Pénicilline G : toujours sensible,
- Macrolides : en cas d’allergie à la péni (10 à 15% de souches résistantes),
- Autres antibiotiques actifs : glycopeptides, cyclines (15 à 20% de résistance
acquise), aminosides (résistance naturelle bas niveau).
D- Facteurs de pathogénicité du streptocoque A
Pouvoir pathogène : bactérie à multiplication extracellulaire, toxinogène et
invasive.
• Antigène externe :
- la protéine M à la surface de la bactérie est un facteur majeur de virulence qui
empêche la phagocytose (80 sérotypes dont M1, M3 et M8 sont les plus
virulents).
• Enzymes :
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- la hyaluronidase favorise la diffusion de la bactérie dans les tissus en
détruisant le tissu conjonctif,
- la streptokinase dégrade la fibrine,
- la streptodornase (immunogène et utile pour le diagnostic).
• Toxines :
- la streptolysine O est une hémolysine qui entraîne des lésions membranaires
in vivo (cytotoxicité) + (immunogène et utile pour le diagnostic),
- la streptolysine S a une action cytolytique et leucotoxique,
- la toxine érythrogène A et C (seulement certaines souches) provoque
l’éruption cutanée de la scarlatine en agissant sur les monocytes et les
polynucléaires neutrophiles.
E- Diagnostic indirect (non traité en TP)
On peut diagnostiquer ce genre d’infection à streptocoques A par la détection
d’antistreptolysines [ASLO] (apparition à J10, pic entre J21 et J28 puis taux
résiduel pendant 3 à 12 mois) ou d’antistreptodornases [ADO] (augmentées en
cas d’infections cutanées).
A RETENIR sur : Les streptocoques
Morphologie :
- cocci à Gram+ en diplocoques ou en chaînettes.
Caractères culturaux :
- géloses au sang, en anaérobiose ou micro-aérophilie.
Critères d’identification :
- hémolyse b (groupe A, B, C, G), a, ou non-hémolytique
- groupage : polyoside C (A, B, C, G, F)
- non groupable : identification biochimique
Pouvoir pathogène du streptocoque A :
- angine + scarlatine
- infection cutanée (érysipèle, infection invasive)
- complications post-streptococciques (RAA et GNA)
Facteur de pathogénicité du streptocoque A :
- protéine M, enzyme (streptodornase), toxine (hémolysines O et S),
toxine érythrogène A
Traitement des infections à streptocoque A :
- Pénicilline G
Diagnostic bactériologique :
- direct → isolement du streptocoque dans les prélèvements (gorge,
cutanés, sang) sur milieu approprié + identification
- sérodiagnostic → dosage ASLO et ASD
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